JP2020517231A - 微生物減少のための促進酸化処理 - Google Patents
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Abstract
Description
2014年12月、米国での多州にわたるリステリア症大流行が、カラメルでコーティングされたリンゴの消費に結び付けられた。次の数ヶ月にわたって、調査から、リステリア属は、被害を受けたリンゴの表面上で発生し、その後、持ち手として使用される棒が生産中にリンゴに刺されたときにリンゴの内部へと導入されたことが明らかにされた。キャンディーアップルからのリステリア症のリスクは、依然として低いとみなすことができるが、カラメルリンゴ生産中に予防措置を適用することが必要とされている。
本明細書で使用されるとき、および別段に記載されていない限り、以下の用語の各々は、以下に記載される定義を有するものとする。
材料および方法
リステリアモノサイトゲネスの代用物としてのラクトバチルスフルクチボランスの適性
リステリアモノサイトゲネスと比較した、オゾンに対するラクトバチルス属の相対的抵抗が、抗菌ガスが導入されたバイオバブルの内部に置かれた接種されたリンゴを使用して評価された。オゾン処理によるラクトバチルス属およびリステリアモノサイトゲネスの不活性化の程度は、適用時間(オゾン濃度)に依存することがわかった。相対的に見れば、同じオゾン曝露を受けたラクトバチルス属と比較して、リステリアモノサイトゲネスの対数減少に有意差はなかった(P>0.05)。したがって、ラクトバチルス属の菌株は、オゾン処理の能力を評価するための商業的試験において適用可能なリステリアモノサイトゲネスの適切な代用物である。
リステリアモノサイトゲネスの接種用懸濁液は、以下のように調製された。リステリアモノサイトゲネス血清型4b(新鮮な農産物から分離された)およびラクトバチルスフルクチボランス(ワインから分離された)が、試験全体を通じて使用された。リステリアモノサイトゲネスは、50mlのトリプチックソイブロス(TSB)中で24時間30℃にて培養され、ラクトバチルス属は、MRSブロス中で30℃にて48時間培養された。細胞は遠心分離(5000gで10分間)によって採取され、ペレットは、8log cfu/mlの最終的な細胞密度まで生理食塩水中で再懸濁させられた。
UV反応器は、24”の長さであり、直径が15mmであり、8.5のUV出力をもち、254nmで発し、コンベア表面から16mlの距離のところに保持された4×23Wランプ(100時間および80℃で254nmにて測定される)を備える、紫外線器具(Sani−Ray(登録商標)−ステンレス鋼、24”×9”×5”、120v、50/60Hz)を含む。標準的なUVランプ(製造番号05−1348)およびオゾンランプ(番号05−1349,2.3のオゾン出力)が両方とも使用された(各々2つ)。UVXラジオメータ(製造業者の指示により±5%に較正されたUVP(登録商標))が、一貫性を保証するためにランプ強度をモニタするために使用された。
1:過酸化水素気化器。
2:UV光。
3:リンゴのトレイ。
4:加熱されたトンネル。
5:コンベア。
過酢酸
過酢酸(Sigma−Aldrich(登録商標)から入手された、酢酸:水において40%)が、20〜70ppmのさまざまな濃度に希釈され、洗浄液または噴霧液のどちらかとして使用された。
リンゴは、上記で説明されたように、リステリアモノサイトゲネスの5菌株カクテルをリンゴの萼にスポット接種された(5 log10 CFU/リンゴ)。リンゴは、低温の部屋に移され、処理の前に一晩保持された。13個のリンゴのバッチがオゾン反応器内に置かれ、40分間処理された。次いで、リンゴは、オゾンなしでさらに50分間乾燥され、次いで、AOPユニットに直接的に移された。萼がUV−C:オゾンランプに面した状態でチャンバ内にリンゴを置いて、AOP処理が実行された。過酸化水素蒸気が、48℃に予熱された6%v/v溶液から発生させられた。処理は30秒間実行され、その後、木製の棒が萼に挿入されてから、80℃に維持されたカラメルでコーティングされた。赤リンゴの場合、さらなるチョコレート層が追加された。次いで、リンゴは、22℃に維持された部屋の中のトレイ上で貯蔵された。リンゴの対照群は、処理されるリンゴと同時に準備され、同じ様式で貯蔵された。しかしながら、対照群は、オゾンおよび過酸化水素で処理される代わりに空気および水のみに曝露された(プロセスを模倣するために、他の点、流量および温度は同一)。
レタス
処理後、レタスの玉は刻まれ、500mlの生理食塩水中に懸濁させられ、1分間ストマッキング処理され(stomached)、希釈系列が生理食塩水中で調製された。STECを計数するために、次いで、試料が、24時間37℃でインキュベートされたソルビトールマッコンキー寒天培地(CT−SMAC)および発色培地(CHROMagar)上に塗抹平板法で塗抹(spread plate)された。リステリアモノサイトゲネスは、35℃で24〜48時間インキュベートされたMOX寒天培地上に塗抹された。
レタスと同じ様式でリンゴから病原体を回収する難題を抱えた後、リンゴの表面からリステリア属を回収するのに最適な方法を決定するために、ベースライン試験が実行された。リンゴは、100μlのリステリア属[8−log CFU]をスポット接種され、次いで、4時間にわたって付着させられた。次いで、リステリア属が、各方法の能力を評価するために、3つの方法のうちの1つによって回収された。方法は、以下のとおりであった。方法(1)リンゴ全体が、滅菌プラスチックパウチ内に置かれ、100mlの生理食塩水中に懸濁させられ、手で1分間こすられた。方法(2)の場合、皮むき器が、リンゴの果皮を除去するために使用され、次いで、リンゴの果皮が、50mlの生理食塩水中に置かれ、1分間激しく振り混ぜられた。最後に、方法(3)は、ラボトップブレンダ(lab top blender)を使用して果皮がホモジナイズされたことを除いて、(2)に関して説明されたのと同じであった。回収の方法に関係なく、希釈系列は、生理食塩水中で調製され、次いで、35℃で24〜48時間インキュベートされたMOX寒天培地上に塗抹平板法で塗抹された。推定陽性コロニーがカウントされ、log CFUが報告された。
リステリア属のインキュベーション温度がリンゴへのリステリア属の付着に重要であるかどうかを決定するために、細菌は、25℃(リステリア属が鞭毛を発現した)と37℃(すなわち、鞭毛は発現しなかった)の両方で培養された。細菌は、上記で説明されたように、除去される前にリンゴに固着する時間を与えられた(方法1)。
各実験は、少なくとも3回繰り返され、3つ組の試料が分析された。細菌数は、チューキー検定とANOVAを併用して実行された平均間の差によってlog10値へと変換された。
ベースライン試験によって、リステリアモノサイトゲネスを接種されたリンゴの除染に対する、時間、過酸化水素濃度(1〜1.5%)、および温度(22℃〜48℃)の影響が決定された。アッセイの感受性を増加させ、外形の影響を回避するために、リンゴ全体の代わりに、リンゴの半分が使用された。結果から、UV単独では、低濃度の過酸化水素において使用されたときと比較して、リステリア属の高い対数減少が裏付けられた(表1)ことがわかった。結果は、遮光効果がない場合のリステリア属の直接的な不活性化に帰することができる。
オゾンは、UV−Cランプのうちの1つを、174nmで発するランプに置き換えることによって発生させられ、過酸化水素は、48℃で蒸気を介して導入された。30秒の処理時間の場合、リンゴの表面上のリステリア属の減少は、UV:オゾン:過酸化物が適用されたとき、UV:オゾン処理と比較して、著しくより高かったことがわかった。より長い処理時間が適用されたとき、リンゴの表面上のリステリア属の不活性化の程度は、UV:オゾン:過酸化物とUV:オゾンの間で有意差はなかった(図3)。リンゴの表面上のリステリア属の対数減少は処理時間に依存せず、残留する残存物が保護されたくぼみにおけるものであることを示唆した。
48℃で6%H2O2を60秒間使用するUV:過酸化水素処理は、リンゴの表面上および芯内のリステリアモノサイトゲネスを著しく減少させることができる。処理は、UV:過酸化物をオゾンと組み合わせることを通じて向上させることができた。
この実験の目的は、リンゴ上のリステリアモノサイトゲネスを制御するためのオゾンとAOP(UV:過酸化水素:オゾン)の組み合わせられた効果と、22℃で貯蔵されたキャンディーアップル上の残存物の死滅を評価することである。
リンゴは、リステリアモノサイトゲネスの5菌株カクテルをリンゴの萼にスポット接種された(5 log cfu/リンゴ)。リンゴは、低温の部屋に移され、処理の前に一晩保持された。13個のリンゴのバッチがオゾン反応器内に置かれ、40分間処理された。次いで、リンゴは、オゾンなしでさらに50分間乾燥させられ、次いで、AOPユニットに直接的に移された。萼がUV−C:オゾンランプに面した状態でチャンバ内にリンゴを置いて、AOP処理が実行された。過酸化水素蒸気が、48℃に予熱された6%v/v溶液から発生させられた。処理は30秒間実行され、その後、木製の棒が萼に挿入されてから、80℃に維持されたカラメルでコーティングされた。赤リンゴの場合、さらなるチョコレート層が追加された。次いで、リンゴは、22℃に維持された部屋の中のトレイ上で貯蔵された。
この実験の結果は、図4ならびに以下の表2Aおよび表2Bに示されている。
表2Aおよび2B:19日の貯蔵寿命にわたって22℃でキャンディーアップルから回収されたリステリアモノサイトゲネス。データは、図4からである。
研究手法の理論的根拠は、汚染が表面に限定されるであろうという仮定の下にレタスの玉の上の病原体を不活性化することであった。これは実際、収穫後洗浄に頼ることを減少させ、加工ラインを通して病原体をばらまくリスクも最小にするであろう。評価された2つの処理は、オゾンと、過酸化水素とUVの組み合わせを使用することに基づいた処理(AOP)であった。
レタスの玉は、UV反応器チャンバ内に置かれ、UV−Cを用いた照射がある場合とない場合で過酸化水素(2または4%)が噴霧された。対照群として、接種されたリンゴは、H2O2の代わりにH2O蒸気で処理された。農産物が通過しているところに上から蒸気がチャンバに入る、農産物コンベアタイプシステムの性質ゆえに、製品と接触する蒸気の正確な量を正確に示すことは不可能である。しかしながら、プロセスが終了した後、農産物は、サーキュレーションファンによって乾燥させられる。より短期間の処理の場合、レタスの玉全体の上の糞便系大腸菌群を減少させるのに4%のH2O2の方がより効果的であるが、2%は、2分後により高い減少を達成した(図5)。対照として、H2O2を水と置き換えると、処理は同程度に効果的である。UV単独での照射は、最も低い対数減少を裏付け、>60秒の処理時間では、能力は増加しなかった。処理されたリンゴをカタラーゼアッセイで試験すると、検出可能な過酸化水素の残留はなかった(検出のレベル>10ppm)。
高い湿度条件の下で適用されたオゾンは、最も高い対数減少(ちょうど1log CFU/gを超える)をもたらし、これは、同じ湿度条件下でのAOPプロセスよりもわずかに高かった(図6)。全体的に、処理は、最小の対数減少を達成した。
レタスを除染するための、UV、過酸化水素、オゾン、および二酸化塩素の組み合わせの能力
オゾン、6%H2O2、および50ppm二酸化塩素の組み合わせられた逐次処理は、ほぼ4log CFU/g減少を達成した(図7)。組み合わせられた処理プロセス(図8)は、安定したレベルの病原体を維持した処理されていないグループと比較したとき、10日の貯蔵寿命全体を通じて維持された、非常に低い糞便系大腸菌群レベルをもつレタスをもたらした(図8)。
リステリア属を接種されたが処理されなかったリンゴから作られたキャンディーアップル上で、病原体レベルは、22℃での19日の貯蔵期間中、減少したか、著しく変化しなかったか、または増加した。リステリアモノサイトゲネスは、処理されていない赤リンゴの芯内で増加し、>6log cfu/リンゴのレベルに達することがわかった。
この実験は、異なる農産物タイプに導入され、UV/オゾン/過酸化水素の組み合わせで処理されたリステリアモノサイトゲネスのlog数減少を決定するために行われた。
細菌および培養の条件
リステリアモノサイトゲネス(血清型4a、4b、1/2b、1/2a、および3a)はTSB中で37℃にて一晩培養され、細胞は遠心分離によって採取された。ペレットは、生理食塩水中で、8log cfu/ml(OD600−0.2)の最終的な細胞密度まで懸濁させられた。細胞懸濁液は、使用前に4℃で最長12時間保持された。
UV反応器は、24”の長さであり、直径が15mmであり、8.5のUV出力をもち、コンベア表面から16cmの距離のところに保持された、4×25Wランプ(100時間および80℃で254nmにて測定される)を備える、紫外線器具(Sani−Ray(登録商標)−ステンレス鋼、24”×9”×5”、120v、50/60Hz)からなった。標準的なUVランプ(製造番号05−1348)およびオゾンランプ(番号05−1349,2.3のオゾン出力)が両方とも使用された(各々2つ)。UVXラジオメータ(製造業者の指示により±5%に較正されたUVP(登録商標))が、一貫性を保証するためにランプ強度をモニタするために使用された。過酸化水素(Sigma−Aldrich(登録商標)から入手された、30%溶液)が、さまざまな濃度(2〜4%v/v)で調製され、湯浴器中で22℃または48℃に予熱され、次いで、噴霧器/気化器のリザーバ内に置かれた。処理チャンバは、接種されたリンゴをユニットの中へと置く直前にスイッチが切られたファンヒータを用いて予熱された。リンゴは、割り当てられた時間期間にわたってユニットの中心に保持され、反対側の端で除去された。
結果は、以下の表3に示されている。
Claims (17)
- 微生物の存在の影響を受けやすい食品上で細菌を不活性化するおよび/または微生物数を減少させるための方法であって、
前記食品を処理チャンバに連続的に通過させ、前記食品を、5〜120秒の前記処理チャンバ内処理時間にわたって、紫外線C(UV−C)光、過酸化水素蒸気、オゾン、および熱との曝露に供するステップ
を含み、
前記過酸化水素蒸気が最大12%v/v溶液で存在し、
前記処理チャンバ内部の温度が約22℃から60℃の間に維持される、方法。 - 前記細菌がリステリア属である、請求項1に記載の方法。
- 前記食品が果実、好ましくはリンゴである、請求項1または2に記載の方法。
- 前記オゾンおよび前記過酸化水素蒸気が2つの別個の供給源によって提供される、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記UV−C光の波長範囲が290nmから100nmの間である、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記過酸化水素蒸気の濃度が2〜6%v/vである、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記過酸化水素蒸気の流量が毎分0から10リットルの間である、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- オゾンが、125〜225nmの範囲の波長で発するオゾン電球によって提供される、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 過酸化水素蒸気が過酸化水素の噴霧器または気化器によって提供される、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記処理チャンバ内部の湿度が、60%から100%の相対湿度で維持される、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、オゾン含有液を前記食品と接触させるステップを除外する、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 微生物の存在の影響を受けやすい食品上で細菌を不活性化するおよび/または微生物数を減少させるためのシステムであって、
処理チャンバと、前記処理チャンバを通して前記食品を連続的に搬送するための手段と、
i)UV−C光を生成するための手段と、ii)過酸化水素蒸気を生成するための手段と、iii)オゾンを生成するための手段と、iv)熱源と
を備え、
i)〜iv)の各々が、前記処理チャンバに動作可能に接続される、システム。 - 前記過酸化水素蒸気を生成するための手段と前記オゾンを生成するための手段が別個である、請求項12に記載のシステム。
- 前記チャンバ内の湿度を維持するための手段をさらに備える、請求項12から13のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記処理チャンバが約1’×6”×6”〜60’×30’×20’のサイズを有する、請求項12から14のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記処理チャンバ内のUV−C光を発生させるための前記手段に対する前記食品の距離が1cmから200cmの間であるように構成された、請求項12から15のいずれか一項に記載のシステム。
- UVを発生させるために290nmから100nmの間の波長範囲を発するランプと、オゾンを発生させるために20nm未満、好ましくは約185nmの波長を発するランプとを備える、請求項12から16のいずれか一項に記載のシステム。
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