CN109843071A - 用于微生物减少的高级氧化法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于灭活细菌和/或减少产品上微生物数量的系统，特别是易受到微生物存在的影响的食品，所述系统包括处理室，其可操作地连接到i)用于产生UV‑C光的装置，ii)用于产生过氧化氢蒸汽的装置和/或用于产生臭氧的装置，和iii)热源。还公开了一种用于灭活细菌和/或减少产品上微生物数量的方法，特别是易受到微生物存在的影响的食品，所述方法包括将所述食品置于处理室中以暴露于紫外线C(UV‑C)光和过氧化氢蒸汽和/或臭氧以及热，处理时间为5‑120秒，其中过氧化氢蒸汽以高达12％v/v的溶液存在，并且处理室内的温度保持约22℃至60℃。

Description

用于微生物减少的高级氧化法
技术领域
本发明主要涉及减少食物中微生物数量的方法和系统。为了便于理解本发明，本文中参照苹果描述了本发明的方法和系统。但是，本领域技术人员应该清楚，所述方法和系统的适用性不限于苹果。相反，所述方法和系统可以适用于减少易受到有害微生物存在的影响的其他产品中的微生物数量，例如其他水果和蔬菜。
与相关现有技术的讨论和比较
2014年12月，李斯特菌病在美国多个州爆发，其与涂覆有焦糖的苹果的消费有关。在接下来的几个月里，一项调查显示李斯特菌来源于受影响的苹果表面，在生产过程中，当使用签子作为手柄刺破苹果时，随之将李斯特菌引入苹果内部。虽然由糖苹果引起李斯特菌病的风险仍然被认为比较低，但是仍有需要在焦糖苹果的生产过程中采取预防措施。
在消毒水中清洗苹果是预防措施的例子之一。但是，由于成本和空间限制以及将水引入生产设施的顾虑，水洗系统并不总是实用的。此外，这种消毒方式被发现在去除污染方面效力有限(减少量<1log cfu)并且可能导致交叉污染(Perez-Rodriguez et al.,2014,“Study of the cross-contamination and survival of Salmonella in freshapples”,International Journal of Food Microbiology,184,92-97，其全部公开内容通过引用并入本文)。此外，苹果上残留的水分阻碍了苹果上焦糖的涂覆，从而在生产过程中产生困难。因此，无水方法(例如，过氧化氢蒸汽)更适合糖苹果的生产，并且与传统的收获后的清洗方法相比，无水方法已被证明能有效净化产品(Back et al.,2014,“Effect ofhydrogen peroxide vapor treatment for inactivating Salmonella Typhimurium,Escherichia coli 0157:H7and Listeria monocytogenes on organic fresh lettuce”Food Control,44,78-85，其全部公开内容通过引用并入本文)。
臭氧具有抗微生物活性，并已被美国食品药品管理局指定为一般认为安全(GRAS)。(参见，例如，Sharma and Hudson,“Ozone gas is an effective and practicalantibacterial agent”,Am J Infect Control.2008Oct；36(8):559-63，其全部公开内容通过引用并入本文)。例如美国专利号6,485,769和6,162,477描述了使用含有臭氧的溶液对食品进行净化的方法。但是，水通常是食品生产设施中的污染源。此外，如上文所述的无水方法适用于某些类型的食品(包括糖苹果)兼容。
最近，建议使用臭氧气体。(参见，例如，Khadre et al.,2001,“Microbiologicalaspects of ozone applications in food:A review”,Journal of Food Science,66,1262-1252，其全部公开内容通过引用并入本文)。之前的研究已经表明，在储藏室的气氛中引入臭氧可以减少水果上的微生物量(Yaseen et al.,2015,“Ozone for post-harvesttreatment of apple fruits”,Phytopathologia Mediterranea,54,94-103，其全部公开内容通过引用并入本文)。但是，在储藏室中以较低水平(0.5-2ppm)施加臭氧，以防止设备过度腐蚀并减少对工人的危害。因此，需要延长暴露时间来实现微生物的减少，虽然与每个单独的苹果接触具有挑战。
作为臭氧的替代物，已知UV通过光子引发抗微生物活性，直接损伤目标微生物的DNA。虽然UV已广泛用于水和其他透明液体的消毒，但迄今为止，由于不规则轮廓和/或存在于生物膜或细胞团块中的阴影效应，食品表面的UV处理仍然存在问题。
本发明通过将UV处理与氧化剂(如臭氧或过氧化氢或其组合物)组合，克服了现有技术方法和系统的上述缺点。例如，发明人提出将臭氧处理与称为高级氧化法(AOP)(过氧化氢和UV的组合)的方法组合，该方法可用于处理浊水和包装纸盒。
发明内容
本发明提供了一种用于灭活易受到(表面、次表面和内部)微生物存在的影响的食品上的细菌的方法，其包括将待处理食品与紫外线C(UV-C)光、过氧化氢和/或臭氧以及热接触，该方法可以包括系统的使用，该系统包括提供每种所述的UV-C光、过氧化氢和/或臭氧以及热的装置(means)。
附图说明
图1：实验1和实验2设置的UV：过氧化氢反应器的示意图。
图2：显示通过UV：1-6％的过氧化氢对苹果上和苹果内的单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)的灭活。将接种的苹果放在腔室中并输送不同浓度的过氧化氢。所有处理均在48℃下进行60秒。
图3：显示在使用具有或不具有6％过氧化氢的UV：臭氧的情况下对苹果表面和果心的单核细胞增多性李斯特菌的灭活，在48℃下进行30至120秒。
图4A和4B：在22℃储存的糖苹果表面和果心的单核细胞增多性李斯特菌数量。接种李斯特菌的苹果用臭氧(高达50ppm)和AOP的组合进行处理。然后用焦糖-巧克力涂覆的红苹果(图4A)或用焦糖涂覆的青苹果(图4B)，每个均在不同的采样点取出3个单位。
图5：显示经过氧化氢蒸汽(2％和4％)处理30、60和120秒的整个莴苣头上大肠杆菌的对数减少值(log count reduction)。通过从未经处理的水果上回收的平均生存数量的对数中减去平均生存数量的对数(average log survivors)(每个均在不同的采样点取出3个单位)来计算对数减少值(LCR)。
图6：显示在高湿度和低湿度的条件下用臭氧和AOP处理的整个莴苣头上大肠杆菌的对数减少值。通过从未经处理的水果上回收的平均生存数量的对数中减去平均生存数量的对数(每个均在不同的采样点取出3个单位)来计算对数减少值(LCR)。
图7：显示经臭氧气体单独处理5分钟和与H2O2、UV和二氧化氯组合处理的整个莴苣头上大肠杆菌的平均对数减少值。通过从未经处理的水果上回收的平均生存数量的对数中减去平均生存数量的对数(每个均在不同的采样点取出3个单位)来计算对数减少值(LCR)。
图8：显示存储天数为0、2、5、8和10天的经臭氧气体单独处理5分钟和与H2O2、UV和二氧化氯组合处理(图7)以及未经处理的对照组接种了大肠杆菌的整个莴苣头的储存期限。
具体实施方式
虽然本发明的各方面都是参考减少水果(特别是苹果)中的微生物数量来描述的，但应理解，所述的方法、系统和相关组件也可用于减少其他类型的食品或产品中的微生物数量。
此外，本文中描述的方法和系统的具体实施方案和实施例是说明性的，并且可以在不脱离本发明的精神或所附权利要求的范围的情况下对这些实施方案和实施例引入许多变化。在本发明和所附权利要求的范围内，不同的说明性的实施方案和/或实施例的要素和/或特征可彼此组合和/或彼此替换。
定义
如本文所用，并且除非另有说明，否则以下每一个术语应具有下文所述的定义。
如本文所用，在数值或范围的上下文中的“约”表示所述或要求保护的数值或范围的±10％。本文公开的任何范围是指该范围内的所有百分之一、十分之一和整数单位量，其被具体公开作为本发明的一部分。因此，“约”所述值具体包括所述值。例如，约20分钟的范围是指在20±10％分钟的范围内的所有测量值，包括20分钟。
为了克服现有技术中处理食物减少微生物数量的上述缺点，本发明提出将UV处理与氧化剂(如臭氧或过氧化氢或其组合物)组合。在所提出的AOP方法中，过氧化氢被UV光子降解，形成短寿命的抗微生物自由基，其可以渗透到待处理食物表面上的阴影区域。
AOP经证明可以净化新鲜产品。温度和过氧化氢浓度是支持AOP方法的关键参数。具体地，产生自由基的反应倾向于48℃，而在通常的室温(约22℃)下则产生较少。此外，AOP方法具有最佳的过氧化氢浓度，因为过低的过氧化氢水平将导致自由基产生不足，而过量的过氧化氢会导致自由基的密度过高而使它们最终结合，进而被中和。
当使用臭氧和过氧化氢蒸汽的组合时，获得了额外的优点。由于腔室中存在过氧化氢蒸汽，待处理水果周围的相对湿度增加，因此预计微生物细胞对臭氧致死作用的敏感性也会增加(Miller et al.,2013,“A review on ozone-based treatments for fruitand vegetables preservation”,Food Engineering Reviews,5,77-106和de Candia etal.,2015,“Eradication of high viable loads of Listeria monocytogenescontaminating food-contact surfaces.Frontiers in Microbiology,6,12，其全部公开内容通过引用并入本文)。
通过一系列实验，本文所述方法和系统的发明人表明，通过用UV-C光、过氧化氢、热和臭氧的各种组合方式进行处理，可以杀死产品(特别是苹果)上的李斯特菌。在这一系列实验中，杀死范围的结果为0-log到6-log。每个“log”减少表明杀死程度为10倍。也就是说，杀死99％(2-log)至99.999％(5-log)的李斯特菌。在这些实验中使用的系统包括反应器，该反应器具有处理室，处理室内存在UV-C和/或臭氧灯，以及用于向处理室提供过氧化氢蒸汽和热的装置。与灯的距离、酸的浓度、酸的流速、温度和停留时间均受控制。最初的阳性实验室结果表明，有必要进行商业规模的应用测试。因此，构建了用于运输苹果穿过处理室的连续传送带单元，以取代密封室设计。
因此，在本发明的一个实施例中，提供了一种用于灭活细菌和/或减少易受到表面和内部微生物存在的影响的食品上的微生物数量的系统，所述系统包括腔室，其可操作地连接到用于产生和/或向食物提供UV-C光、过氧化氢和/或臭氧以及热中的每一种的装置。在优选的实施例中，系统包括用于产生和/或向食品提供UV-C光、过氧化氢和臭氧中的每一种的装置。可以使用臭氧气体或甚至引入含有过氧化物的臭氧水。在本文所述的系统的一实施例中，系统进一步包括用于运输待处理产品的装置，例如，传送带和/或温度传感器。连续传送带可以允许待处理食品连续地流过处理室，使得处理可以是小规模的(1-5磅/小时)、中等规模的(5-500磅/小时)或大规模的(>500磅/小时)。在另一实施例中，本文所述的方法和系统可以用于从食品中除去农药。
在一实施例中，腔室能容纳至少1、至少10、至少100或至少200磅食品。
在本文所述的方法的一实施例中，细菌是李斯特菌。在另一实施例中，细菌是沙门氏菌或大肠杆菌。
在一个实施例中，食品是水果或蔬菜。在另一实施例中，食品是苹果、甜瓜、莴苣、蘑菇、西葫芦(zucchini)或黄瓜(整体或果心)。在另一实施例中，食品是鳄梨(avocado)、桃、柠檬、哈密瓜、胡椒、番茄或芒果。在又一实施例中，食品是种子、香料、茶叶或谷物。
在一个实施例中，处理室在食品处理期间保持预定的湿度，该湿度为约60-100％。在另一实施例中，系统配置成使产品在处理室中的停留时间为5秒至2分钟或更长。
在一实施例中，要求保护的用于灭活易受到微生物存在的影响的食品上的细菌的方法的工艺参数如下：
UV灯：总瓦数可达10,000W。例如，UV灯可以配置如下：高达400x UV-C 23W灯，发射波长为254nm(波长范围为290nm-100nm)；或总共3x17W＝51W，或4个灯泡x46W+侧面2个灯泡x每个灯泡34W＝总共252W。
臭氧：(如果存在)高达400x臭氧灯泡，发射波长为174nm(波长范围±50％)。发明人使用的杀菌灯发射的大约95％的紫外线能量处于254纳米的汞共振波长。该波长处于最大杀菌效果的区域，并且对病毒、细菌、原生动物和霉菌具有高度致命性。短于200纳米的紫外线波长能够从空气中的氧气(O2)中产生臭氧。发明人使用的臭氧灯除了发射254纳米波长的杀菌紫外线输出之外，还发射产生185纳米波长射线的臭氧。
虽然只有7％的灯的总能量输出，但185纳米波长能量具有将有机物氧化成二氧化碳气体来破坏有机物的独特能力。微生物减少的程度取决于紫外线净化器的大小(ultraviolet purifizer sizing)(表示为微瓦-秒/平方厘米的剂量水平单位)。
食品与灯泡的距离：1cm-200cm。
过氧化氢浓度：(如果存在)1％-12％体积/体积的水溶液，优选1-6％，更优选2-4％。
过氧化氢流速：(如果存在)0-10升/分钟。
处理室中的温度：22℃-60℃，优选40-55℃，最优选约48℃。
处理室的停留时间：5秒至2分钟。
处理室内的湿度：60％至100％。
处理室的尺寸：1’x6”x6”至60’x30’x20’。
可以在房间内任选地安装臭氧监控器，如果检测到0.1ppm的臭氧，其程序可以自动关闭腔室并启动排气扇。
本发明的系统和方法优于先前已知的消毒方法，因为它是环保的。具体地，本发明的方法不使用水，从而保存淡水并避免产生具有苛刻的消毒化学物质(如氯或氨)的化学水流出物。此外，臭氧气体分解成氧气，不会留下危险或有害的副产物。
最后，本文提及的任何实施例或特征与任何其他另外提及的实施例或特征中的一个或多个的组合均预期在本发明的范围内。
实验
材料和方法
食果糖乳杆菌(Lactobacillus fructivorans)作为单核细胞增多性李斯特菌替代物的适用性
使用置于生物气泡内的接种苹果评估乳杆菌对臭氧的相对抗性(相比于单核细胞增多性李斯特菌)，生物气泡内引入抗微生物气体。发现经臭氧处理对乳杆菌和单核细胞增多性李斯特菌的灭活程度取决于施用的时间(臭氧浓度)。相对而言，与接受相同臭氧暴露的乳杆菌相比，单核细胞增多性李斯特菌的对数减少没有显著性差异(P>0.05)。因此，乳杆菌属菌株是单核细胞增多性李斯特菌的合适替代物，其可用于商业试验以获得臭氧处理的效力。
使用的细菌和苹果接种
单核细胞增多性李斯特菌接种悬浮液的制备方法如下：在整个研究中使用单核细胞增多性李斯特菌血清型4b(从新鲜产品中分离)和食果糖乳杆菌(从葡萄酒中分离)。将单核细胞增多性李斯特菌在50ml胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)中在30℃下培养24h，而乳杆菌在MRS肉汤中在30℃下培养48h。通过离心(5000g，10分钟)收获细胞，并将其重新悬浮在盐水中至最终细胞密度为8log cfu/ml。
对于一组实验，将整个水果切成苹果片(30g)，并在表皮接种0.1ml李斯特菌培养物，获得最终细胞密度为7log cfu。将苹果片在4℃下孵育16h，然后进行UV或UV和过氧化氢处理。处理后，通过浸泡在盐水中从苹果片中回收李斯特菌，得到最终1:10的比例，然后通过搅拌进行均质化。用盐水进行一系列稀释，然后涂布到改良的牛津(MOX)配方琼脂上，将其在30℃下孵育48h。
对于整个苹果，将水果浸泡在含有7log cfu/ml的悬浮液中接种20min。然后取出苹果并置于真空室中，然后进行3x30s循环以将李斯特菌渗入果心次表面。取出苹果并在4℃下储存过夜，然后在第二天使用。为了从经过处理的苹果中回收细胞，首先使用无菌去心器除去果心，并将其与盐水一起置于无菌袋中，得到1:10的稀释物。搅拌30s使果心均质化，然后用盐水进行一系列稀释。将剩余的苹果放入另一个含有100ml盐水的无菌袋中，并通过揉搓释放李斯特菌。再次，用盐水进行一系列稀释，然后涂布在MOx琼脂上，并在30℃下孵育48h。
UV反应器
UV反应器包括紫外线固定装置(Sani-RayTM-不锈钢，24”x9”x5”，120v 50/60Hz)，包括4x23W灯(在254nm、80℃下测量100小时)，该灯长24”，直径为15mm，紫外线输出量为8.5，发射波长为254nm，与传送带表面相距16mm。使用标准UV灯(序列号#05-1348)和臭氧灯(#05-1349，臭氧输出量为2.3)(各2个)。使用UVX辐射计(UVPTM，根据制造商的说明校准至+/-5％)来监测灯强度以确保一致性。
将过氧化氢(获得自Sigma-AldrichTM，30％溶液)配制成不同浓度(2-4％v/v)，并在热水浴中预热至22或48℃，然后置于雾化器/蒸发器中储存。用风扇加热器预热处理室，在将接种的苹果放入单元之前关闭风扇加热器。为了减少在相对端的分配时间段，将苹果保持在单元的中心。从图1可以看出机构的示意图。
参考图1，图中的标记表示以下元素：
1：过氧化氢蒸发器。
2：UV光。
3：苹果托盘。
4：加热通道。
5：传送带。
过氧乙酸
将过氧乙酸(获得自Sigma-AldrichTM，乙酸：水为40％)稀释至20-70ppm的各种浓度，用作清洗剂或喷雾剂。
臭氧和AOP方法组合控制单核细胞增多性李斯特菌的验证
将上述五株单核细胞增多性李斯特菌菌株混合液点样接种于苹果的花萼处(5log10CFU/苹果)。将苹果转移到冷室中并在处理前放置过夜。将13批苹果放入臭氧反应器中并处理40分钟。然后将苹果在没有臭氧的情况下再干燥50分钟，然后直接转移到AOP单元中。将苹果置于处理室内进行AOP处理，花萼面向UV-C：臭氧灯。从预热至48℃的6％v/v溶液中产生过氧化氢蒸汽。处理30秒后将木签插入花萼中，然后维持在80℃涂覆焦糖。对于红苹果，额外添加巧克力层。将苹果储存在托盘上，保持室内温度为22℃。在处理苹果的同时制备苹果对照组，并以相同的方式储存。但是，它们不是用臭氧和过氧化氢处理，而是仅暴露于空气和水中(否则以相同的流速和温度来模拟该方法)。
定期转移糖苹果(n＝3)进行微生物分析。在此，使用无菌去心器取出果心并置于无菌袋中，然后重新悬浮于一步增菌肉汤中，进行1:10稀释。在搅拌器中均质化果心60秒。在匀浆中手动按摩嵌入苹果中的签子部分，以释放任何附着的李斯特菌。将剩余的苹果浸泡在100ml一步增菌肉汤中，并手动按摩以释放糖：焦糖层。
将样品涂布在MOX配方培养基上，在30℃下孵育48小时。平行地，在37℃下富集匀浆24小时，然后在MOx琼脂上划线，在30℃下孵育48小时。使用API试纸对来自每个平板的假定阳性菌落进行确认。
细菌回收和计数
莴苣
将处理后的莴苣头切碎，悬浮在500ml盐水中并均质化1分钟，用盐水进行一系列稀释。为了计数STEC，然后将样品涂布于麦康凯山梨醇琼脂(CT-SMAC)和显色培养基(CHROMagar)上，在37℃下孵育24小时。将单核细胞增多性李斯特菌涂布在MOX琼脂上，在35℃下孵育24-48小时。
苹果
在以与莴苣相同的方式从苹果中回收病原体遇到了挑战之后，进行基线研究以确定从苹果表面回收李斯特菌的最佳方法。将100μl李斯特菌[8-log CFU]点样接种于苹果，然后使其附着4小时。然后分别通过三种方法回收李斯特菌，以评估每种方法的效率。方法如下：方法(1)，将整个苹果放入无菌塑料袋中，并悬浮在100ml盐水中，并手动摩擦1分钟。方法(2)，使用剥皮器除去苹果皮，然后将苹果皮置于50ml盐水中，并剧烈摇晃1分钟。最后，方法(3)与方法(2)所述的相同，除了使用实验室顶部搅拌器(lab top blender)将果皮均质化。无论如何，在回收方法中，均用盐水进行一系列稀释，然后涂布在MOX琼脂上，在35℃下孵育24-48小时。以log CFU计数假定阳性菌落。
孵育温度对李斯特菌附着性的影响
为了确定李斯特菌的孵育温度对其与苹果的附着性是否重要，将细菌在25℃(李斯特菌表达鞭毛)和37℃(即没有表达鞭毛)下进行培养。如上所述，在被除去(方法1)之前允许细菌有时间附着到苹果上。
统计分析
每个实验重复至少三次，每次分析三份样品。将细菌数量转化为log10值，使用ANOVA结合Tukey检验进行平均值之间的差异分析。
实验1：UV：过氧化氢处理
基线研究确定了时间、过氧化氢浓度(1-1.5％)和温度(22℃至48℃)对接种单核细胞增多性李斯特菌的苹果的净化效果。为了增加测试的灵敏度并避免几何效应，使用半个苹果代替整个苹果。从结果发现，与使用低浓度的过氧化氢相比，单独的UV支持较高的李斯特菌对数减少值(表1)。该结果是由于阴影效应的缺失导致李斯特菌的直接灭活。
只使用过氧化氢，观察到的李斯特菌的对数减少值可忽略不计，尽管与22℃相比，通过控制单元温度为48℃可提高效力。当UV与过氧化氢组合时，观察到更明显的温度效应(表1)。这里，与22℃相比，当单元在48℃下运行时，对数减少值明显更高。当在48℃的单元中引入浓度为1.5％v/v的过氧化氢停留时间为30s时，可获得最高的对数减少值。该结果可以解释为：与22℃相比，AOP在48℃下进行得更充分。在更低浓度的过氧化氢条件下，观察到更低的致死率，这是由于UV分解H2O2形成的自由基不足导致的。然而，过氧化氢的存在足以吸收UV光子，从而为苹果表面上的李斯特菌提供保护作用。
表1：通过使用不同的UV：过氧化氢组合使接种的半个苹果的单核细胞增多性李斯特菌灭活。
在整个苹果上和内部引入的单核细胞增多性李斯特菌的灭活
实际上，除了李斯特菌可能存在于果心次表面之外，由于苹果的物理形状引起的阴影，使得整个苹果的处理是具有挑战性的。由于上述阴影效应，仅使用UV的效果将是有限的。在目前的情况下确实发现了这种情况，其中施用UV处理接种的整个苹果，导致苹果表面上的李斯特菌减少量<1log cfu，并且果心内的病原体平均水平没有减少(-0.21±0.69)。当UV和过氧化氢组合使用时，李斯特菌的LCR增加，当超过4％v/v H2O2时，病原体减少没有提高(图2)。但是，过氧化氢浓度与引入苹果果心组织的李斯特菌的减少之间有相关性(图2)。在此发现，6％过氧化氢和UV组合使用可以支持李斯特菌水平降低0.86log cfu，这表示起始种群减少了84％。
实验2：UV、过氧化氢和臭氧组合来净化苹果的效力
通过用一个发射174nm的灯替换其中一个UV-C灯产生臭氧，过氧化氢通过48℃的蒸汽引入。结果发现，当处理时间为30s时，与UV：臭氧处理相比，施用UV：臭氧：过氧化物的苹果表面上的李斯特菌减少得显著更多。当施用的处理时间更长时，施用UV：臭氧：过氧化物和UV：臭氧的苹果表面上的李斯特菌的灭活程度之间没有显著性差异(图3)。苹果表面上的李斯特菌的对数减少值与处理时间无关，表明残留的存活者处于保护性生态位。
与苹果表面上的对数减少值的趋势类似，当处理30s时，与UV：臭氧相比，施用UV：臭氧：过氧化物的果心内的病原体的灭活显著更多(图12)。但是，李斯特菌的灭活程度不随UV：臭氧：过氧化物处理的时间延长而增加。相反，果心内的李斯特菌的对数减少值确实随UV：臭氧处理的时间延长而增加，并且在120s时，与UV：臭氧：过氧化物相比没有显著性差异。
结果表明，与施用UV：臭氧(没有H2O2)相比，UV：臭氧：过氧化物的作用导致李斯特菌的快速灭活。
结论
使用6％H2O2的UV：过氧化氢在48℃下处理60秒可以显著减少苹果表面上和果心内的李斯特菌。通过将UV：过氧化物与臭氧组合可以增强处理。
实验3：臭氧和AOP方法组合控制糖苹果上的单核细胞增多性李斯特菌的验证
该实验的目的是评估臭氧和AOP(UV：过氧化氢：臭氧)对控制苹果上的单核细胞增多性李斯特菌和在22℃下储存的糖苹果上的存活者命运的综合影响。
材料和方法
将五株单核细胞增多性李斯特菌菌株混合液点样接种于苹果的花萼处(5logcfu/苹果)。将苹果转移到冷室中并在处理前放置过夜。将13批苹果放入臭氧反应器中并处理40分钟。然后将苹果在没有臭氧的情况下再干燥50分钟，然后直接转移到AOP单元中。将苹果置于腔室内进行AOP处理，花萼面向UV-C：臭氧灯。从预热至48℃的6％v/v溶液中产生过氧化氢蒸汽。处理30秒后将木签插入花萼中，然后维持在80℃涂覆焦糖。对于红苹果，额外添加巧克力层。将苹果储存在托盘上，保持室内温度为22℃。
定期转移糖苹果(n＝3)进行微生物分析。在此，使用无菌去心器取出果心并置于无菌袋中，然后重新悬浮于一步增菌肉汤中，进行1:10稀释。在搅拌器中均质化果心60秒。在匀浆中手动按摩嵌入苹果中的签子部分，以释放任何附着的李斯特菌。将剩余的苹果浸泡在100ml一步增菌肉汤中，并手动按摩以释放糖：焦糖层。
将样品涂布在MOX配方培养基上，在30℃下孵育48小时。平行地，在37℃下富集匀浆24小时，然后在MOx琼脂上划线，在30℃下孵育48小时。使用API试纸对来自每个平板的假定阳性菌落进行确认。
结果
该实验的结果显示在下面的图4和表2A和2B中。
表2A和2B：在22℃下、在19天的保质期内，从糖苹果中回收的单核细胞增多性李斯特菌。数据来自图4。
表2A(焦糖巧克力-红苹果)
表2B(焦糖-青苹果)
对照未经处理的苹果(青色和红色)的李斯特菌水平为5log cfu，经过焦糖涂覆过程，其数量减少0.4-0.9log cfu。在由未经处理的青苹果制备的糖苹果中，与第1天相比，在第19天保质期结束时的李斯特菌数量没有显著的变化(P>0.05)(图4A；表2A)。但是，未经处理的苹果果心内的李斯特菌水平在3天滞后期后确实增加，并且在第19天保质期结束时显著更高(P<0.05)(图4A；表2A)。
未经处理的青苹果制备的糖苹果，其表面上的李斯特菌数量在最初的3天保质期内减少约1log cfu，但在剩余的16天储存期内保持恒定(图4B；表2B)。与第1天相比，在22℃保存的糖苹果果心内的单核细胞增多性李斯特菌数量在19天的保质期内波动，最终数量上没有总体的显著性变化(图4B；表2B)。
从先用臭氧后用AOP处理的青色或红色水果制备的糖苹果中没有回收到李斯特菌(图4；表2)。对于红苹果和青苹果的果心样品，在经过臭氧和AOP处理后富集，三个重复样中的两个对李斯特菌的测试均显阴性(图4；表2)。因此，在两种糖苹果的情况下，李斯特菌的整体对数减少值为4-5log cfu/苹果。
在储存过程中，从经过处理的红苹果制备的糖苹果表面偶尔能回收到李斯特菌，但病原体数量没有增加。红苹果果心内的李斯特菌在19天的储存期内偶尔被回收，观察到的数量没有总体增加(图4A；表2A)。对于经过处理的青苹果，在储存第5天后，糖苹果表面上的数量增加，在第19天储存期结束时达到1log cfu/苹果(图4B；表2B)。相反，在青苹果果心内存活的李斯特菌在保质期内降低，所以在第8天之后没有采集样品进行病原体阳性测试(图4B；表2B)。
使用气相干预法对莴苣头进行净化
研究方法的基本原理是灭活莴苣头上的病原体，并假设污染仅限于表面。这实际上将减少对收获后清洗的依赖性，并且也最小化通过加工线传播病原体的风险。评估的两种处理是臭氧和基于使用过氧化氢和UV(AOP)的组合处理。
过氧化氢：紫外线
将莴苣头置于UV反应器腔室中，并喷入过氧化氢(2或4％)，伴有或不伴有UV-C照射。作为对照组，接种的苹果用H2O蒸汽代替H2O2进行处理。由于产品传送带系统类型的性质，当产品通过时蒸汽从上方进入腔室，因此不可能精确确定与产品接触的确切蒸汽量。但是，在该过程完成后，用循环风扇干燥产品。虽然对于短期处理，4％H2O2能更有效减少整个莴苣头上的大肠杆菌，但在2分钟之后，2％减少得更多(图5)。当用水代替H2O2作为对照时，处理同样有效。单独用UV照射支持最低的对数减少值，且当处理时间>60秒时效力没有增加。将经过处理的苹果进行过氧化氢酶测试，没有检测到过氧化氢残留物(检测水平>10ppm)。臭氧
在高湿度条件下施用臭氧导致最高的对数减少值(正好超过1log CFU/g)，略高于在相同湿度条件下的AOP方法(图6)。总体而言，处理实现了最小的对数减少值。
紫外线、过氧化氢、臭氧和二氧化氯的组合净化莴苣的效力
用臭氧、6％H2O2和50ppm二氧化氯的组合依次进行处理实现了近4log CFU/g减少(图7)。组合处理方法(图8)导致莴苣具有非常低的大肠杆菌水平，与保持稳定水平的病原体的未经处理组相比，其在整个10天的保质期内保持不变(图8)。
结论/讨论
在由接种李斯特菌但未经处理的苹果制备的糖苹果上，病原体水平降低，在22℃的19天储存期内没有显著变化或增加。在未经处理的红苹果果心中发现单核细胞增多性李斯特菌增加，达到>6log cfu/苹果的水平。
通过使用臭氧和AOP的组合，可能实现单核细胞增多性李斯特菌4-5log cfu减少。对于由红苹果制备的糖苹果，当糖苹果在22℃下储存19天时，糖苹果果心内或表面上的李斯特菌数量没有显著变化。以类似的方式，经过处理的青苹果果心内的李斯特菌在保质期内减少。有证据表明，由经过处理的青苹果制备的糖苹果表面上可以回收到李斯特菌。但是，其水平很低，只能通过富集样品来检测。
从其他人发表的研究结果来看，糖苹果上的单核细胞增多性李斯特菌的命运取决于几个因素。具体而言，单核细胞增多性李斯特菌引起的最大风险是被引入果心而不是苹果表面。
单核细胞增多性李斯特菌在糖苹果上/内部生长的程度更取决于病原体是否预加压(pre-pressed)，而不是储存温度。在这方面，臭氧气体和AOP的应用将导致单核细胞增多性李斯特菌的压力增加，这可以解释室温下储存的糖苹果的病原体的限制性生长。
总之，通过实施臭氧气体处理和AOP，可以减少用于糖应用生产的苹果上和内的单核细胞增多性李斯特菌水平。基于两种干预措施都是无水的事实，活跃生长的单核细胞增多性李斯特菌污染产品的风险很小。因此，总体而言，所提供的证据表明，将苹果储存在4℃而不是室温下并不会对单核细胞增多性李斯特菌的控制带来显著益处。因此，如上所述制备的糖苹果可以在室温下储存，而没有任何额外的污染或支持单核细胞增多性李斯特菌生长的风险。
实验4：使用UV/臭氧/过氧化氢的组合对不同的水果和蔬菜进行净化
进行该实验以确定引入不同类型并用UV/臭氧/过氧化氢的组合处理的产品中的李斯特菌的对数减少值。
方法
细菌和培养条件
将单核细胞增多性李斯特菌(血清型4a、4b、1/2b、1/2a和3a)在TSB中于37℃培养过夜，并通过离心收获细胞。将沉淀物悬浮在盐水中至最终细胞密度为8log cfu/ml(OD600-0.2)。使用前，将细胞悬浮液放置在4℃下最多12小时。
在测试的蔬菜和水果的顶部周围的表皮上点样接种100μl浓度为8-log 10CFU/ml的测试细菌。然后将苹果在生物安全柜中干燥20分钟至4小时，然后转移至4℃储存最多24小时。为了使细菌内化，将1ml悬浮液加入到茎隙(stem crevice)中并在真空下放置1分钟，从真空中取出并放置1分钟，然后再抽真空一分钟。
反应器
UV反应器包括紫外线固定装置(Sani-RayTM-不锈钢，24”x9”x5”，120v 50/60Hz)，包括4x25W灯(在254nm、80℃下测量100小时)，该灯长24”，直径为15mm，紫外线输出量为8.5，与传送带表面相距16mm。使用标准UV灯(序列号#05-1348)和臭氧灯(#05-1349，臭氧输出量为2.3)(各2个)。使用UVX辐射计(UVPTM，根据制造商的说明校准至+/-5％)来监测灯强度以确保一致性。将过氧化氢(获得自Sigma-AldrichTM，30％溶液)配制成不同浓度(2-4％v/v)，并在热水浴中预热至22或48℃，然后置于雾化器/蒸发器中储存。用风扇加热器预热处理室，在将接种的苹果放入单元之前关闭风扇加热器。为了减少在相对端的分配时间段，将苹果放在单元的中心。
结果
结果如下表3所示。
表3
Log cfu/单位 Log cfu/单位
产品类型 起始数量 处理后 对数减少值 ％减少
鳄梨 5.74±0.13
蒸汽 ＜1 ＞5.74 100
雾 ＜1 ＞5.74 100
桃 6.84±0.29
蒸汽 4.71±0.31 2.16±0.91 99.259
雾 1.33±0.58 5.51±0.58 99.999
柠檬 7.10±0.06
蒸汽 2.98±0.25 4.12±0.25 99.992
雾 ＜1 ＞6.10 99.999
黄瓜 7.03±0.09
蒸汽 4.26±0.23 2.76±0.23 99.830
雾 3.91±0.16 3.12±0.16 99.924
黄瓜果心 5.34±0.16
蒸汽 5.18±0.08 0.18±0.08 30.820
雾 5.12±0.03 0.22±0.03 39.744
西葫芦 6.69±0.07
蒸汽 5.62±0.08 1.07±0.08 59.262
雾 5.34±0.32 1.35±0.32 74.296
哈密瓜 7.10±0.04
蒸汽 3.89±0.29 3.71±0.29 99.938
雾 2.10±0.17 5.00±0.17 99.999
西葫芦(果心) 6.52±0.17
蒸汽 6.30±0.31 0.22±0.31 39.74
雾 6.10±0.38 0.42±038 61.981
辣椒 6.97±0.23
蒸汽 5.08±0.21 1.89±0.21 98.712
雾 4.79±0.06 2.18±0.06 99.339
番茄 4.83±0.04
蒸汽 4.53±0.45 0.48±0.45
雾 3.61±0.26 1.22±0.26
番茄(果心) 6.52±0.20
蒸汽 6.37±0.10 0.15±0.10
雾 6.20±0.49 0.32±0.49
芒果 5.42±0.21
蒸汽 2.50±0.26 2.50±0.26
雾 ＜1 ＞4.42
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种用于灭活细菌和/或减少易受到微生物存在的影响的食品中的微生物数量的方法，所述方法包括
使所述食品连续通过处理室以使食品暴露于紫外线C(UV-C)光、过氧化氢蒸汽、臭氧以及热，在处理室中的处理时间为5-120秒，
其中
所述过氧化氢蒸汽以高达12％v/v的溶液存在，
并且处理室内的温度保持约22℃至60℃。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细菌是李斯特菌。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述食品是水果，优选苹果。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述臭氧和过氧化氢蒸汽由两种独立的来源提供。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中UV-C光的波长范围在290nm和100nm之间。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述过氧化氢蒸汽的浓度为2-6％v/v。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述过氧化氢蒸汽的流速为0至10升/分钟。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中臭氧由发射波长范围为125-225nm的臭氧灯泡提供。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中过氧化氢蒸汽由过氧化氢雾化器或蒸发器提供。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述处理室内的湿度保持60％至100％相对湿度。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，所述方法不包括使含臭氧的液体与食品接触的步骤。
12.一种用于灭活细菌和/或减少易受到微生物存在的影响的食品的微生物数量的系统，所述系统包括
处理室和用于连续运输食品通过处理室的装置，
i)用于产生UV-C光的装置，ii)用于产生过氧化氢蒸汽的装置，iii)用于产生臭氧的装置，v)热源，
其中i)-iv)中每一项可操作地连接到处理室。
13.根据权利要求12所述的系统，其中用于产生过氧化氢蒸汽的装置和用于产生臭氧的装置是独立的。
14.根据权利要求12-13中任一项所述的系统，还包括用于维持腔室内湿度的装置。
15.根据权利要求12-14中任一项所述的系统，其中所述处理室的尺寸为约1’x6”x6”至60’x30’x20’。
16.根据权利要求12-15中任一项所述的系统，配置为使得处理室中食品与用于产生UV-C光的装置的距离为1cm至200cm。
17.根据权利要求12-16中任一项所述的系统，包括发射波长范围在290nm和100nm之间的用于产生UV的灯，和发射波长小于20nm，优选约185nm，用于产生臭氧的灯。

Claims (17)

1.一种用于灭活细菌和/或减少易受到微生物存在的影响的食品中的微生物数量的方法，所述方法包括将所述食品置于处理室中以暴露于紫外线C(UV-C)光和过氧化氢蒸汽和/或臭氧以及热，处理时间为5-120秒，其中所述过氧化氢蒸汽以高达12％v/v的溶液存在，并且处理室内的温度保持约22℃至60℃。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细菌是李斯特菌。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述食品是水果，优选苹果。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中UV-C光的波长范围在290nm和100nm之间。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述过氧化氢蒸汽的浓度为2-6％v/v。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述过氧化氢蒸汽的流速为0至10升/分钟。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中臭氧由发射波长范围为125-225nm的臭氧灯泡提供。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述处理室内的湿度保持在60％至100％相对湿度。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，所述方法不包括使含臭氧的液体与食品接触的步骤。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，包括使所述食品暴露于UV-C光、过氧化氢蒸汽和臭氧。
11.一种用于灭活细菌和/或减少易受到微生物存在的影响的食品的微生物数量的系统，所述系统包括处理室，所述处理室可操作地连接到i)用于产生UV-C光的装置，ii)用于产生过氧化氢蒸汽的装置和/或产生臭氧的装置，和iii)热源。
12.根据权利要求11所述的系统，其包括用于产生过氧化氢蒸汽的装置和用于产生臭氧的装置。
13.根据权利要求11或12所述的系统，其还包括v)用于将食品运输通过处理室的装置。
14.根据权利要求11-13中任一项所述的系统，还包括用于维持腔室内湿度的装置。
15.根据权利要求11-14中任一项所述的系统，其中所述处理室的尺寸为约1’x6”x6”至60’x30’x20’。
16.根据权利要求11-15中任一项所述的系统，配置为使得处理室中食品与用于产生UV-C光的装置的距离为1cm至200cm。
17.根据权利要求11-16中任一项所述的系统，包括发射波长范围在290nm和100nm之间的用于产生UV的灯，和发射波长小于20nm，优选约185nm，用于产生臭氧的灯。
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