JP2020515827A - 代謝性障害 - Google Patents
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Abstract
Description
2型糖尿病には、この疾患の発症の一因であるかもしれない変化した腸内微生物叢が伴っている。腸内微生物叢は、アミノ酸由来のシグナル伝達分子のレベルを変化させることが知られており、しかし、アミノ酸代謝の微生物叢依存的調節が宿主代謝に影響しているか、また、どのように影響しているかは明らかでない。本明細書中において、微生物によりアップレギュレーションされたヒスチジン由来代謝産物のイミダゾールプロピオン酸が、2型糖尿病罹患被験者ではより高い濃度で存在することが明らかにされる。2型糖尿病罹患個体及び2型糖尿病非罹患個体からの便微生物叢を使用して、イミダゾールプロピオン酸の劇的に増大した産生が、糖尿病関連の微生物叢が存在する場合にだけインビトロで明らかにされる。イミダゾールプロピオン酸がインスリン受容体基質タンパク質レベルを低下させ、かつ、それにより、mTORC1の代替p38マイトジェン活性化プロテインキナーゼ媒介活性化を介してインスリンシグナル伝達を損なうこともまた明らかにされる。まとめると、これらの知見は、微生物代謝産物のイミダゾールプロピオン酸が2型糖尿病の病理発生の一因であることを示している。
腸において産生される細菌代謝産物は門脈を通って肝臓に到達し、その後、体循環に入る。したがって、インスリン抵抗性及び2型糖尿病の一因となっているかもしれない、微生物によりアップレギュレーションされたアミノ酸由来代謝産物を特定するために、5名の2型糖尿病罹患の肥満被験者(ボディーマス指数(BMI)>40)、及び10名の2型糖尿病非罹患のBMI一致被験者の門脈血に対して非標的メタボロミクスを最初に行った。表2を参照のこと。4つのアミノ酸由来代謝産物(硫酸ドパミン、グルタミン酸、イミダゾールプロピオン酸及びN−アセチルプトレシン)のみが、2型糖尿病罹患被験者の門脈血では有意により高かった(すなわち、偽発見率(FDR)<0.1)(表3を参照のこと)。
イミダゾールプロピオン酸がグルコース代謝に影響を及ぼし得るであろうかどうかを直接的に調べるために、イミダゾールプロピオン酸を3日間にわたってGFマウスに腹腔内注射した。この処置は、およそ13nMのイミダゾールプロピオン酸の循環濃度を、ウロカニン酸のレベルに影響を与えることなくもたらした(図3aを参照のこと)。重要なことに、イミダゾールプロピオン酸のこれらの低い濃度は、著しいグルコース不耐性を誘発するために十分であり(図3bを参照のこと)、このことは、インビボでの損なわれたグルコース代謝のもっともらしい一因としてイミダゾールプロピオン酸が果たす役割を裏づけていた。G6pアーゼ及びPepck(重要な糖生成律速酵素の遺伝子)の肝臓での発現が、コントロールと比較して、イミダゾールプロピオン酸が注射されたGFマウスでは有意に増大したこともまた認められた(図3cを参照のこと)。しかしながら、イミダゾールプロピオン酸はSrebp1c及びFasn(重要な脂質生成酵素の遺伝子)の肝臓での発現に影響を及ぼさなかった(図3cを参照のこと)。
イミダゾールプロピオン酸をIRS低下に結びつけることができるであろう潜在的な経路には、c−Jun N末端キナーゼ(JNK)又はラパマイシン標的タンパク質複合体1(mTORC1)を伴う経路が含まれる。最初に、JNK阻害剤のSP600125又はBI78D3はイミダゾールプロピオン酸誘発のIRS1低下を初代肝細胞において回復させないことが示され(図5を参照のこと)、これにより、JNK経路についての役割が除外された。対照的に、mTORC1阻害剤のラパマイシン及びトリン1はこれらの細胞におけるIRSのイミダゾールプロピオン酸誘発低下を阻害することが示された(図6a及び図6iを参照のこと)。さらに、S6K1リン酸化(これはmTORC1活性化のマーカーである)が、イミダゾールプロピオン酸とインキュベーションされる初代肝細胞において増大し、この応答がラパマイシン及びトリン1によって取り消された(図6a及び図6iを参照のこと)。これらの結果から、イミダゾールプロピオン酸はIRSタンパク質レベルを、mTORC1の上流側のシグナル伝達分子に影響を及ぼすことによって低下させることが示唆される。イミダゾールプロピオン酸によるGFマウスの3日間の処置は、肝臓において、mTORC1 S2481の自己リン酸化に影響を与えることなく、S6K1リン酸化を増大させることもまた示された(図6bを参照のこと)。mTOR S2481の自己リン酸化は、全細胞溶解物で測定されるとき、インスリンによって増大し、しかし、アミノ酸によって増大しないことが知られているので、本発明者らの結果は、イミダゾールプロピオン酸によるアミノ酸感知経路の活性化を示唆する。
以前の研究では、アミノ酸によるmTORC1活性化は、アダプタータンパク質p62(活性なRagヘテロ二量体RagB−GTP/RagC−GDP)、Raptor及びmTORC1の間での複合体の形成によって媒介されるmTORC1のリソソーム局在化を必要とすることが示されている。今回、イミダゾールプロピオン酸がmTORのリソソーム局在化を誘発することが示された(図6fを参照のこと)。したがって、イミダゾールプロピオン酸がこの活性複合体の形成を促進し得るであろうかどうかを次に調べた。FLAGタグ化されたmTORとの免疫沈降を行い、HAタグ化されたRaptor、Mycタグ化されたRag GTPアーゼ、及びp62との相互作用をモニターすることによって、イミダゾールプロピオン酸はmTORC1−Ragヘテロ二量体複合体−p62の形成を、構成的に活性なRagB−GTP/RagC−GDPを発現する細胞において達成されるレベルに匹敵するレベルに誘発することが示された(図6gを参照のこと)。次に、イミダゾールプロピオン酸誘発のS6K1活性化におけるRag GTPアーゼの関与が明らかにされた。RagA/B−GDP及びRagC/D−GTP(これらは不活性なRag GTPアーゼである)はイミダゾールプロピオン酸誘発のS6K1リン酸化を阻止することが示された(図6hを参照のこと)。そのうえ、活性なRag GTPアーゼ(RagA/B−GTP)はS6K1リン酸化をさらに増大させず(図6hを参照のこと)、このことから、イミダゾールプロピオン酸はRag GTPアーゼの活性化を介してmTORを活性化することが示唆された。
T269及びS272でのアダプタータンパク質p62のリン酸化は最近、リソソームでのmTORC1活性化のアミノ酸誘発のために非常に重要であることが示されている。今回、p62リン酸化がイミダゾールプロピオン酸とのインキュベーションによって初代肝細胞において誘発されることが示された(図7aを参照のこと)。さらに、この応答はmTORC1阻害剤のラパマイシンによって影響されず(図7aを参照のこと)、このことは、mTORC1はp62リン酸化の下流側であることを示した。
最近の研究では、p38マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)p38δが、p62/mTORC1のアミノ酸誘発活性化を媒介するために要求されることが報告された。したがって、p38δもまた、p62/mTORC1のイミダゾールプロピオン酸誘発活性化に関与するかどうかを調べた。p38δは、哺乳動物細胞に存在する4つのp38 MAPKイソ型の1つであり、これらのイソ型は、p38α/p38β及びp38γ/p38δ(これは代替p38 MAPKとも呼ばれる)の2つのサブセットに分けることができる。p38γ/p38δではなく、p38α/p38βが、ピリジニルイミダゾール系阻害剤のSB20219037によって阻害され、これに対して、BIRB796はp38サブファミリー全体を阻害する。今回、SB202190ではなくBIRB796がp62及びS6K1のイミダゾールプロピオン酸誘発リン酸化を阻害することが示され(図7dを参照のこと)、このことは、p38α/p38βではなく、p38γ/p38δがイミダゾールプロピオン酸の下流側標的であることを示した。
Aktキナーゼは、残基S473及び残基T308の両方がリン酸化されたときに完全に活性化され得る。しかしながら、インスリン刺激されたAkt T308リン酸化ではなく、インスリン刺激されたAkt S473リン酸化を肝臓又は脂肪において特異的に除くことが、耐糖能を損なうために十分であり、このことは、Akt S473リン酸化が、インスリンの有益な応答を媒介することにおいて重要であることを示唆する。対照的に、Akt S473リン酸化ではなく、Akt T308リン酸化が、急性骨髄性白血病患者の生存、及びヒト非小細胞肺ガンにおけるAktキナーゼ活性と相関づけられており、このことはおそらくは、細胞成長及び生存を媒介することにおけるそのAkt T308を示唆する。イミダゾールプロピオン酸はS473及びT308での基礎的Aktリン酸化を初代肝細胞において増大させた(図3e)。しかしながら、S473でのインスリン誘発のAktリン酸化は、おそらくは低下したIRS1チロシンリン酸化のために、イミダゾールプロピオン酸にさらされる初代肝細胞では低くなっていた(図3e)。
ロイシンは、アミノ酸感知経路におけるmTORC1の強力な活性化剤の1つである。ロイシン誘発のmTORC1活性化はアミノ酸の非存在下において迅速であり(15分以内)、しかし、一過性であった。対照的に、イミダゾールプロピオン酸誘発のmTORC1活性化は30分のインキュベーションまでは認められず、しかし、2時間の処置の後では強くなっていた。アミノ酸の非存在下において、mTORC1は細胞質に局在化し、アミノ酸誘発のmTORC1活性化のためのすべての機構が見出されるリソソームには局在化していない6。アミノ酸の存在下において、イミダゾールプロピオン酸はまた、おそらくはリソソームにおける事前に局在化したmTORC1に起因して、S6K1リン酸化をインキュベーションの30分以内に誘発した。このことは、イミダゾールプロピオン酸は、mTORC1をリソソームに動員することにおいてアミノ酸ほど効率的でないかもしれないことを示唆する。
イミダゾールプロピオン酸はアミノ酸感知経路を活性化するので、mTOR調節に対するその影響をさらに調べた。mTOR、mTORのS2448及びS2481のリン酸化は、mTORC1及びmTORC2に関連することがそれぞれ知られている7。(Raptor免疫沈降によって単離される)mTORC1におけるmTOR S2448リン酸化がイミダゾールプロピオン酸又はアミノ酸によって強く誘発され、しかし、mTORC1におけるmTOR S2481リン酸化のためではなかった。しかしながら、(Rictor免疫沈降法によって単離される)mTORC2におけるmTORのS2448リン酸化又はS2481リン酸化はイミダゾールプロピオン酸による影響を受けず、また、Aktに対するインビトロmTORC2キナーゼ活性もイミダゾールプロピオン酸によって変化しなかった。これらのデータから、イミダゾールプロピオン酸は、mTORC1経路に対する特異性がmTORC2経路よりも大きいことが示唆される。
mTORC1媒介のIRSのセリンリン酸化は十分に研究されているにもかかわらず、mTORC1自身又はmTORC1活性化S6K1がこの事象の原因であるかどうかは明らかではなかった。したがって、mTORC1又はS6K1を、Raptor siRNA又はS6K1 siRNAを介してそれぞれ枯渇させた。これらは、Raptorサイレンシングが、IRS S636/S639リン酸化の阻害と、IRS移動度シフトの部分的阻止とを引き起こしたので、mTORC1がIRSのイミダゾールプロピオン酸誘発調節の原因であることを示した。イミダゾールプロピオン酸がIRS S636/S639リン酸化及びユビキチン化を引き起こすことが明らかにされたにもかかわらず、このS636/S639リン酸化がユビキチン化の原因であるかどうかをさらに調べる必要がある。また、イミダゾールプロピオン酸がIRSの他の調節を誘発し得ることも依然として可能である。
ヒト研究集団
2つのヒトコホートを本研究において使用した。第1のコホートは、Slotervaart病院(アムステルダム、オランダ)で腹腔鏡下Roux−and−Y胃バイパス手術を順次受ける5名の2型糖尿病罹患の肥満被験者及び10名の2型糖尿病非罹患のBMI一致被験者を含んでいた(表2を参照のこと)。被験者は手術の朝まで一晩絶食させられ、末梢静脈サンプルを、患者が手術室に入る直前に採取した。人体計測測定値及び便サンプルもまた手術前に得た。手術中に、門脈サンプル(静脈穿刺)を前述[1]のように採取した。空腹時血糖(グルコース計(Roche Diagnostics)によって)、インスリン(電気化学発光免疫アッセイ(Roche Modular System)によって)及びHbA1c(Menarini Diagnostic)を末梢血において測定した。すべての参加者がインフォームドコンセントを手術前に与え、プロトコルがSlotervaart病院(アムステルダム、オランダ)の医療倫理委員会によって承認された。
15週齢のオスのC57BL/6JのGFマウス又はCONVRマウスを動物実験のすべてのために使用した。GFマウスを、厳密な12時間の光周期のもと、柔軟な薄膜隔離飼育器において維持した。GF状態を、プライマー27F(5’−GTTTGATCCTGGCTCAG−3’、配列番号19)及びプライマー1492R(5’−CGGCTACCTTGTTACGAC−3’、配列番号20)を使用する細菌16S rDNAについてのPCRによって定期的に確認した。PCR反応を、95℃での5分間のプレインキュベーション、続いて、94℃での30秒間、52℃での45秒間、及び72℃での90秒間の30サイクルにより行い、その後、PCR反応を72℃で7分間保った。すべてのマウスには、オートクレーブ処理された固形飼料(Labdiet)を自由に摂らせた。微生物代謝産物を測定するために、血液を4時間の絶食の後でGFマウス及びCONVRマウスの門脈及び大静脈から採取した。
(1)2型糖尿病罹患の肥満者及び2型糖尿病非罹患の肥満者からの門脈血、ならびに(2)C57BL/6JのGFマウス及びCONVRマウスの門脈及び大静脈からの血液に対する包括的代謝産物プロファイリング分析が、超高速液体クロマトグラフィー及び質量分析(UPLC−MS/MS)を使用してMetabolon(ダーラム、NC州)によって行われた。簡単に記載すると、サンプルが、自動化されたMicroLab STAR(登録商標)システム(Hamilton Company)を使用して調製された。回収標準物が品質管理のために抽出プロセスにおける最初の工程の前に加えられた。タンパク質が、2分間にわたる激しい振とうのもと(Glen Mills GenoGrinder 2000)、メタノールにより沈殿させられ、その後、遠心分離が行われた。得られた抽出物が5つの画分に分けられた:1つが、陽イオンモードのエレクトロスプレーイオン化を用いたUPLC−MS/MSによる分析のためであり、1つが、陰イオンモードのエレクトロスプレーイオン化を用いたUPLC−MS/MSによる分析のためであり、1つがLC極性プラットフォームのためであり、1つがGC−MSによる分析のためであり、そして、1つのサンプルがバックアップのために残された。サンプルは、有機溶媒を除くために短時間、TurboVap(登録商標)(Zymark)に置かれた。LCのために、サンプルは、分析のための調製の前に窒素下で一晩貯蔵された。GCのために、それぞれのサンプルが、分析のための調製の前に一晩、真空下で乾燥された。
模擬されたヒト腸レドックスモデル(SHIRM)を、イミダゾールプロピオン酸が微生物産生の代謝産物であり得るであろうかどうかを直接的に調べるために使用した。SHIRMは、CMI−7000Sメンブラン(Membrane International、NJ州)によって隔てられ、窒素及び酸素がそれぞれ連続してパージされる嫌気性管腔チャンバー及び酸素供給装置を有する2チャンバー発酵槽である。酸素チャンバーは100mMリン酸カリウム緩衝液を含有した。管腔チャンバーのための供給物は、(g/lで)アラビノガラクタン(1.0)、ペクチン(2.0)、キシロース(1.5)、デンプン(4.0)、グルコース(0.4)、酵母エキス(3.0)、ペプトン(3.0)、II型ムチン(4.0)及びシステイン(0.5)からなった。消化過程を模擬するために、供給物を、6M HClにより2前後のpHに酸性化し、模擬膵液[(g/lで)NaHCO3(12.5)、Ox胆胆汁酸塩(6.0)及びパンクレアチン(0.9)]によりpH6.9に中和した。管腔チャンバーには、SHIRM供給物(上記で記載される供給物及び膵液の70:30混合物)が、24時間前後の滞留時間を与える速度で連続的に与えられ、pHを、pH制御装置及び投与ポンプ(Black Stone BL7912、Hanna Instruments、英国)を使用して6.6〜6.9で維持した。
(第1のコホートからの)2型糖尿病罹患ドナー及び2型糖尿病非罹患ドナーからの便サンプル(100mg)を5mlのBHI培地(上記の通り)に接種し、Coyチャンバーにおける厳密な嫌気性条件のもと、37℃で一晩インキュベーションした。インキュベーション後、1%(v/v)のそれぞれのBHI前培養物を、10mMのヒスチジンが補充されるSHIRM供給物(上記)に接種した。36時間のインキュベーションの後、上清をイミダゾールプロピオン酸及びウロカニン酸の定量のために使用した。消費されたウロカニン酸のレベルを、産生されたイミダゾールプロピオン酸のレベルを調整するために使用し、0時間に対する対数変換された変化倍数を、これらの調整された値を使用して計算した。
UrdAは、フマル酸レダクターゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ及びL−アスパラギン酸オキシダーゼのFAD結合ドメイン及びFMN結合ドメインに対するその高い配列相同性のために、フマル酸レダクターゼをコードすると以前には予測されていた。しかしながら、UrdAからのFAD結合ドメインの構造モデリングにより、フマル酸レダクターゼにおけるアミノ酸配列からのアミノ酸配列における違いで、ウロカニン酸に対する基質選択性を与える可能性がある違いが特定された。可能性のあるイミダゾールプロピオン酸産生細菌についてスクリーニングするために、シェワネラ・オネイデンシス由来のフマル酸レダクターゼにおいて保存されており、しかし、可能性のあるUrdAでは置換されているアミノ酸配列に注目した。酵素の活性部位における保存された「H」は様々な酵素における触媒作用のために重要であるので4〜6、UrdAのFAD活性部位におけるチロシン373(Y373)に注目した(Y373はフマル酸レダクターゼにおけるヒスチジン(H)に対応する)。広範囲にわたるタンパク質スクリーニング、続いての正確なドメインアラインメントにより、812個のUrdAホモログが670種の細菌ゲノムにおいて存在することが確認された。それらのうち、639個が、「H」残基をその活性部位に有することが確認された;これに対して、173個が非「H」残基(例えば、「Y」又は「M」など)を有する。
マウス肝臓を、TissueLyser(Qiagen、ヒルデン、ドイツ)を使用して、β−メルカプトエタノールを含むRLT緩衝液においてホモジナイズした。RNAを、RNeasy Minikit(Qiagen)を使用して単離し、High Capacity cDNA逆転写キット(Applied Biosystems、フォスターシティー、CA州、米国)を製造者のプロトコルに従って使用してcDNAを合成するために逆転写した。リアルタイムPCRを、以下のプライマーを使用して、1X SYBR Green Master Mix(Thermo Scientific、ウォルサム、MA州、米国)を使用して行った。
L32:5’−CCTCTGGTGAAGCCCAAGATC−3’(配列番号1)及び5’−TCTGGGTTTCCGCCAGTTT−3’(配列番号2);
Pepck:5’−GGCCACAGCTGCTGCAG−3’(配列番号3)及び5’−GGTCGCATGGCAAAGGG−3’(配列番号4);
G6pアーゼ:5’−CTGTGAGACCGGACCAGGA−3’(配列番号5)及び5’−GACCATAACATAGTATACACCTGCTGC−3’(配列番号6);
Fasn:5’−CGGAAACTTCAGGAAATGTCC−3’(配列番号7)及び5’−TCAGAGACGTGTCACTCCTGG−3’(配列番号8);
Srebp1c:5’−AGCCATGGATTGCACATTTGA−3’(配列番号9)及び5’−CAAATAGGCCAGGGAAGTCA−3’(配列番号10);
Irs1:5’−GTGAACCTCAGTCCCAACCATAAC−3’(配列番号11)及び5’−CCGGCACCCTTGAGTGTCT−3’(配列番号12);
Irs2:5’−TCCCACATCGGGCTTGAA−3’(配列番号13)及び5’−CTGCACGGATGACCTTAGCA−3’(配列番号14)。
急速凍結された肝臓及び採取された細胞を、50mM Tris−HCl(pH7.4)、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM Na3VO4、20mM NaF、10mMグリセロリン酸、1mM PMSF、10%グリセロール、1%Triton X−100、及びプロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する緩衝液において溶解した。免疫沈降のために、細胞溶解物を、0.3%のCHAPSを含有する溶解緩衝液において得て、超音波処理し、4℃で15分間にわたって20,000gで遠心分離し、上清を、穏やかな撹拌のもと、4℃で4時間、20μlの抗FLAGビーズ(Sigma)とインキュベーションした。
初代肝細胞を、以前に記載されたように(2)、肝臓をIV型コラゲナーゼの灌流により消化することによってC57BL/6Jマウスから単離した。灌流後、16×105個の細胞を、ウシ胎児血清(FBS)、ペニシリン/ストレプトマイシン及び100nMデキサメタゾンが補充されるダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)/F12においてコラーゲン被覆の60mmディッシュに置床した。4時間後、培地を、ペニシリン/ストレプトマイシンを含有するDMEM/F12に交換した。
HEK293細胞(ATCC CRL−1573)を、10%(v/v)のFBSを含む高グルコース(4.5g/lのグルコース)DMEMにおいて成長させ、維持した。すべてのHEK293細胞実験を血清飢餓かつアミノ酸枯渇の条件で行った。(示されるようなプラスミド又はsiRNAによる)トランスフェクションの24時間後、ポリ−L−リシン被覆の60mmディッシュで培養されるHEK293細胞を、FBSを含まないDMEMにより2回すすぎ、血清非含有DMEMにおいて18時間インキュベーションした。その後、HEK293細胞をEBSSにより1回洗浄し、EBSSにおいて1時間インキュベーションした。インスリン刺激のために、血清飢餓かつアミノ酸飢餓のHEK293細胞をEBSSにおいて2時間又は8時間にわたってイミダゾールプロピオン酸とプレインキュベーションし、EBSSにおいて5nMのインスリンにより処理した。
ホスホ−Akt(S473、T308)、ホスホ−S6K1(T389)、ホスホ−IRS(S636/S639)、ホスホ−p62(T269/S272)、ホスホ−mTOR(S2481)、mTOR、DEPTOR、p62、IR、IRS−2、p38γ、Akt、GAPDH及びアクチンに対する抗体を、Cell Signaling(ダンバース、MA州)から購入した。抗IRS−1をMillipore(ダルムシュタット、ドイツ)から得た。p38δ、Myc及びHAに対する抗体を、Santa Cruz Biotechnology(サンタクルーズ、CA州、米国)から入手した。抗FLAGをSigma−Aldrich(セントルイス、MO州、米国)から購入した。抗LAMP2をAbcamから得た(ab25631)。イミダゾールプロピオン酸(デアミノヒスチジン、CAS 1074−59−5、sc294276)、ウロカニン酸(4−イミダゾールアクリル酸、CAS 104−89−3、sc214246)、ヒスチジン(CAS 71−00−1、sc394101)及びインドールプロピオン酸(CAS 830−96−6、sc255215)を、Santa Cruz Biotechnologyから購入した。グルタミン酸、インスリン及びSP600125をSigma−Aldrichから得た。ラパマイシン及びBIRB796をMerck Milliporeから得て、BI78D3をTocrisから入手した。
FLAG mTOR及びHA Raptorは厚意によりSung Ho Ryu博士(浦項工科大学校、浦項、韓国)によって提供された。Myc−Rag GTPアーゼ構築物はDo−Hyung Kim博士(ミネソタ大学、MN州、米国)からの譲渡物であった。AllStars陰性コントロールsiRNA、p38δ siRNA1(CCGGAGTGGCATGAAGCTGTA(配列番号15)を標的とするHs_MAPK13_5)、p38δ siRNA2(CGGGATGAGCCTCATCCGGAA(配列番号16)を標的とするHs_MAPK13_6)、p38γ siRNA1(CTGGACGTATTCACTCCTGAT(配列番号17)を標的とするHs_MAPK12_5)、p38γ siRNA2(CTGGGAGGTGCGCGCCGTGTA(配列番号18)を標的とするHs_MAPK12_8)、p38α siRNA(AACTGCGGTTACTTAAACATA(配列番号21)を標的とするHs_MAPK14_5)、p38β siRNA(CTGAGCGACGAGCACGTTCAA(配列番号22)を標的とするHs_MAPK11_6)、S6K1 siRNA(GGGAGTTGGACCATATGAACT(配列番号23)を標的とするHs_RPS6KB1_5)、及びRaptor siRNA(GACACGGAAGATGTTCGACAA(配列番号24)を標的とするHs_RPTOR_1)(Qiagen、バレンシア、CA州)を、Lipofectamin 2000を製造者の説明書に従って使用してHEK293細胞にトランスフェクションした。
細胞をポリ−L−リシン(Sigma)被覆の4ウエル・チャンバースライドの上で成長させ、4%パラホルムアルデヒドにより37℃で15分間、固定処理し、その後、グリシン−PBSにより洗浄し、0.3%のTriton X−100により10分間にわたって透過処理した。PBSにおける3%BSAによるブロッキング処理の後、細胞をmTOR及びLAMP2について染色した。画像を共焦点顕微鏡によって得た。
細胞を、2%のSDSを含有する100μlの緩衝液Aを用いて変性条件下で溶解し、細胞溶解物を1.5mlの微量遠心分離チューブに移した。チューブをホットプレートに直ちに95℃で10分間置いた。細胞溶解物を超音波処理し、SDSを含まない700μlの緩衝液Aを加えた。サンプルを4℃で30分間インキュベーションし、その後、遠心分離を行った(20,000g、20分)。上清を、穏やかな撹拌のもと、4℃で4時間、20μlの抗FLAGビーズ(Sigma)とインキュベーションした。
HEK293細胞をmTORC2活性アッセイのために1μgのHA Rictor及び0.5μgのFlag mTORによりトランスフェクションし、0.3%のCHAPSを含有する溶解緩衝液において溶解し、超音波処理し、4℃で15分間にわたって20,000gで遠心分離し、上清を、穏やかな撹拌のもと、4℃で一晩、2μgの抗HA抗体とインキュベーションした。その後、免疫複合体をプロテインA−セファロースビーズ(RepliGen、ニーダム、MA州)を用いて4℃で2時間にわたって集め、0.3%のCHAPSを含有する溶解緩衝液により3回洗浄した。免疫沈降物を、キナーゼアッセイ緩衝液[12.5mM MOPS(pH7.2)、10mMベータ−グリセロール−リン酸、12.5mM MgCl2、2.5mM EGTA、及び1mM EDTA]において450ngの不活性Akt1(abcam、ab116412)と氷上で10分間プレインキュベーションした。キナーゼ反応を、100μMのATPを37℃で15分間加えることによって開始させ、5×Laemmli緩衝液を加えることによって停止させた。
400ngの組換えp62(Abcam、ab95320)及び200ngの組換えp38γ(Abcam、ab125651)を、キナーゼアッセイ緩衝液[25mM MOPS(pH7.2)、12.5mMベータ−グリセロール−リン酸、25mM MgCl2、5mM EGTA、2mM EDTA、及び1mM DTT]において氷上で15分間インキュベーションした。別個のチューブにおいて、キナーゼアッセイ緩衝液で希釈される1mMのATPをDMSO又はイミダゾールプロピオン酸とインキュベーションした(キナーゼ反応におけるATPの最終濃度は50μM又は200μMであった)。キナーゼ反応を、DMSO又はイミダゾールプロピオン酸を伴うATPをp38γ及びp62の混合物に30℃で10分間加えることによって開始させ、5×Laemmli緩衝液を加えることによって停止させた。
ウィルコクソン順位和検定を使用して、門脈血における代謝産物は存在量が2型糖尿病罹患被験者と2型糖尿病非罹患被験者との間で異なるかどうかを調べた(非標的化メタボロミクス)。未処理のP値を、0.1のFDRを用いてベンジャミニ・ホフバーグ法[3]によって調整した。クラスカル・ウォリス順位和検定、それに続くダネットの多重比較を、大規模なスウェーデン人コホートからの、耐糖能のレベルが異なる群の中におけるイミダゾールプロピオン酸の標的化比較のために使用した。交絡因子(BMI、年齢及び性別)についての補正を伴う重回帰及び分散分析をこのより大規模なスウェーデン人コホートのために使用した。マウス及びヒトからの多数の測定値を含むデータセットの分析(門脈血及び大静脈血の血漿における代謝産物が比較される)を、反復測定による二元配置ANOVA分散分析を用いて行った。ウィルコクソン片側検定を、2型糖尿病関連の微生物叢がヒスチジンからより多いイミダゾールプロピオン酸を産生するかを確かめるために行った。チューキー検定を伴う一元配置ANOVAを、3つ以上の群を比較するときには行った。種々の代謝産物の濃度又は明暗周期に依存するマウスの生理学(エネルギー消費又は自発運動活動)に対するイミダゾールプロピオン酸の影響の分析を、シダクの多重比較検定を伴う二元配置ANOVAを用いて行った。それ以外の場合には、示されるように、対応のない両側スチューデントt検定を使用した。
参考文献:
配列表19〜20 <223>PCRプライマー
Claims (29)
- 対象が2型糖尿病(T2D)もしくは耐糖能障害(IGT)に罹患しているか、又は2型糖尿病(T2D)もしくは耐糖能障害(IGT)に罹患する危険性を有しているかどうかを判定する方法であって、
対象からの身体サンプルにおけるイミダゾールプロピオン酸の量を決定すること、及び
対象が2型糖尿病もしくは耐糖能障害に罹患しているか、又は2型糖尿病もしくは耐糖能障害に罹患する危険性を有しているかどうかをイミダゾールプロピオン酸の決定された量に基づいて判定すること
を含む、上記方法。 - イミダゾールプロピオン酸の量を決定することが、対象からの体液サンプルにおける、好ましくは、対象からの血液サンプル、血漿サンプル、血清サンプル、尿サンプル及び便サンプルからなる群から選択される体液サンプルにおける、より好ましくは、対象からの血液サンプル、血漿サンプル及び血清サンプルからなる群から選択される体液サンプルにおけるイミダゾールプロピオン酸の量を決定することを含む、請求項1に記載の方法。
- イミダゾールプロピオン酸の量を決定することが、身体サンプルにおけるイミダゾールプロピオン酸の濃度を決定することを含み、かつ、
対象が2型糖尿病もしくは耐糖能障害に罹患しているか、又は2型糖尿病もしくは耐糖能障害に罹患する危険性を有しているかどうかを判定することが、
イミダゾールプロピオン酸の濃度を10.7nMから13.8nMまでの区間の範囲内の閾値濃度と比較すること、及び
イミダゾールプロピオン酸の濃度が閾値濃度以上であるならば、該対象は2型糖尿病に罹患している、又は2型糖尿病に罹患する危険性を有していると判定すること
を含む、請求項1又は2に記載の方法。 - 身体サンプルにおけるウロカニン酸の量を決定することをさらに含み、対象が2型糖尿病もしくは耐糖能障害に罹患しているか、又は2型糖尿病もしくは耐糖能障害に罹患する危険性を有しているかどうかを判定することが、対象が2型糖尿病もしくは耐糖能障害に罹患しているか、又は2型糖尿病もしくは耐糖能障害に罹患する危険性を有しているかどうかをイミダゾールプロピオン酸の決定された量及びウロカニン酸の決定された量に基づいて、好ましくは、イミダゾールプロピオン酸の決定された量と、ウロカニン酸の決定された量との間における比に基づいて判定することを含む、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 対象が2型糖尿病もしくは耐糖能障害に罹患しているか、又は2型糖尿病もしくは耐糖能障害に罹患する危険性を有しているかどうかを判定することが、
比を0.15〜0.325の区間の範囲内の閾値比と、好ましくは0.17〜0.3の区間の範囲内の閾値比と、より好ましくは0.2〜0.3の区間の範囲内の閾値比と比較すること、及び
比が閾値比以上であるならば、該対象は2型糖尿病に罹患している、又は2型糖尿病に罹患する危険性を有していると判定すること
を含む、請求項4に記載の方法。 - 対象が2型糖尿病(T2D)もしくは耐糖能障害(IGT)に罹患しているか、又は2型糖尿病(T2D)もしくは耐糖能障害(IGT)に罹患する危険性を有しているかどうかを判定する方法であって、
対象からの身体サンプルにおけるイミダゾールプロピオン酸産生細菌の量を決定すること、及び
対象が2型糖尿病もしくは耐糖能障害に罹患しているか、又は2型糖尿病もしくは耐糖能障害に罹患する危険性を有しているかどうかをイミダゾールプロピオン酸産生細菌の決定された量に基づいて判定すること
を含む、上記方法。 - 2型糖尿病もしくは耐糖能障害を対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的である薬剤を特定する方法であって、
薬剤が、少なくとも1つのウロカニン酸レダクターゼ、ヒスチジンアンモニアリアーゼ、p38γマイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)、p38δ MAPK、及び代替p38 MAPK活性化経路を阻害し得るかどうかを判定すること、及び
薬剤が、ウロカニン酸レダクターゼ、ヒスチジンアンモニアリアーゼ、p38γ MAPK、p38δ MAPK、及び代替p38 MAPK活性化経路の少なくとも1つを阻害し得ると判定されるならば、該薬剤を、2型糖尿病もしくは耐糖能障害を対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的であるとして特定すること
を含む、上記方法。 - 薬剤が阻害し得るかどうかを判定することが、薬剤がウロカニン酸レダクターゼを阻害し得るかどうかを、好ましくは、ウロカニン酸レダクターゼによるウロカニン酸のイミダゾールプロピオン酸への転換を阻害し得るかどうかを判定することを含み、かつ
薬剤を特定することが、薬剤がウロカニン酸レダクターゼを阻害し得ると判定されるならば、好ましくは、ウロカニン酸レダクターゼによるウロカニン酸のイミダゾールプロピオン酸への転換を阻害し得ると判定されるならば、該薬剤を、2型糖尿病もしくは耐糖能障害を対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的であるとして特定することを含む、
請求項7に記載の方法。 - 薬剤が阻害し得るかどうかを判定することが、薬剤がヒスチジンアンモニアリアーゼを阻害し得るかどうかを、好ましくは、ヒスチジンアンモニアリアーゼによるヒスチジンのウロカニン酸への転換を阻害し得るかどうかを判定することを含み、かつ
薬剤を特定することが、薬剤がヒスチジンアンモニアリアーゼを阻害し得ると判定されるならば、好ましくは、ヒスチジンアンモニアリアーゼによるヒスチジンのウロカニン酸への転換を阻害し得ると判定されるならば、該薬剤を、2型糖尿病もしくは耐糖能障害を対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的であるとして特定することを含む、
請求項7に記載の方法。 - 薬剤が阻害し得るかどうかを判定することが、薬剤がp38γ MAPKを阻害し得るかどうかを、好ましくは、セクエストソーム−1(p62)、リボソームタンパク質S6キナーゼβ−1(S6K1)、インスリン受容体基質1(IRS1)、プロテインキナーゼB(PKB)、及びp38γ MAPKのうちの少なくとも1つをリン酸化する際にp38γ MAPKを阻害し得るかどうかを判定することを含み、かつ
薬剤を特定することが、薬剤がp38γ MAPKを阻害し得ると判定されるならば、好ましくは、p62、S6K1、IRS1、PKB、及びp38γ MAPKのうちの少なくとも1つをリン酸化する際にp38γ MAPKを阻害し得ると判定されるならば、該薬剤を、2型糖尿病もしくは耐糖能障害を対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的であるとして特定することを含む、
請求項7に記載の方法。 - 薬剤が阻害し得るかどうかを判定することが、薬剤がp38δ MAPKを阻害し得るかどうかを、好ましくは、セクエストソーム−1(p62)、リボソームタンパク質S6キナーゼβ−1(S6K1)、インスリン受容体基質1(IRS1)、プロテインキナーゼB(PKB)、及びp38δ MAPKのうちの少なくとも1つをリン酸化する際にp38δ MAPKを阻害し得るかどうかを判定することを含み、かつ
薬剤を特定することが、薬剤がp38δ MAPKを阻害し得ると判定されるならば、好ましくは、p62、S6K1、IRS1、PKB、及びp38δ MAPKのうちの少なくとも1つをリン酸化する際にp38δ MAPKを阻害し得ると判定されるならば、該薬剤を、2型糖尿病もしくは耐糖能障害を対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的であるとして特定することを含む、
請求項7に記載の方法。 - 薬剤が阻害し得るかどうかを判定することが、薬剤が代替p38 MAPK活性化経路を阻害し得るかどうかを判定することを含み、かつ
薬剤を特定することが、薬剤が代替p38 MAPK活性化経路を阻害し得ると判定されるならば、該薬剤を、2型糖尿病もしくは耐糖能障害を対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的であるとして特定することを含む、
請求項7に記載の方法。 - 2型糖尿病もしくは耐糖能障害を対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的である薬剤を特定する方法であって、
薬剤を、ヒスチジン及び/又はウロカニン酸による暴露を受けたインビトロ模擬ヒト腸モデルに加えること、
インビトロ模擬ヒト腸モデルによって産生されるイミダゾールプロピオン酸の量を測定すること、及び
薬剤を、イミダゾールプロピオン酸の量に基づいて、2型糖尿病もしくは耐糖能障害を防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的であるとして特定すること
を含む、上記方法。 - 薬剤を加えることが、2型糖尿病もしくは耐糖能障害に罹患している対象からの便のアリコートが接種されるインビトロ模擬ヒト腸モデルに薬剤を加えることを含む、請求項13に記載の方法。
- 薬剤を、2型糖尿病もしくは耐糖能障害を防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的であるとして特定することが、
イミダゾールプロピオン酸の量を、ヒスチジン及び/又はウロカニン酸による暴露を薬剤添加後に受けた参照用インビトロ模擬ヒト腸モデルによって産生されるイミダゾールプロピオン酸の参照量と比較すること(ただし、参照用インビトロ模擬ヒト腸モデルはウロカニン酸レダクターゼ産生細菌をどれも欠いており、又は、正常な耐糖能を有する対象からの便のアリコートが接種される)、及び
薬剤を、イミダゾールプロピオン酸の量と、イミダゾールプロピオン酸の参照量との比較に基づいて、2型糖尿病もしくは耐糖能障害を防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的であるとして特定すること
を含む、請求項13又は14に記載の方法。 - 薬剤を、2型糖尿病もしくは耐糖能障害を防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的であるとして特定することが、
イミダゾールプロピオン酸の量を、薬剤の非存在下であることを除いてヒスチジン及び/又はウロカニン酸による暴露を受けたインビトロ模擬ヒト腸モデルによって産生されるイミダゾールプロピオン酸の参照量と比較すること、及び
薬剤を、イミダゾールプロピオン酸の量と、イミダゾールプロピオン酸の参照量との比較に基づいて、2型糖尿病もしくは耐糖能障害を防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的であるとして特定すること
を含む、請求項13又は14に記載の方法。 - インビトロ模擬ヒト腸モデルにおいて蓄積されるウロカニン酸の量を測定することをさらに含み、薬剤を、2型糖尿病もしくは耐糖能障害を防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的であるとして特定することが、薬剤を、イミダゾールプロピオン酸の量及びウロカニン酸の量に基づいて、好ましくは、イミダゾールプロピオン酸の量と、ウロカニン酸の量との比に基づいて、2型糖尿病もしくは耐糖能障害を防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて効果的であるとして特定することを含む、請求項13〜16のいずれかに記載の方法。
- 2型糖尿病もしくは耐糖能障害を対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて使用するためのウロカニン酸レダクターゼ阻害剤。
- 2型糖尿病もしくは耐糖能障害を対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて使用するためのヒスチジンアンモニアリアーゼ阻害剤。
- 2型糖尿病もしくは耐糖能障害を対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて使用するための、イミダゾールプロピオン酸産生細菌の阻害剤。
- 2型糖尿病もしくは耐糖能障害を対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて使用するための、p38γマイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)の阻害剤。
- 1−(5−tert−ブチル−2−p−トリル−2H−ピラゾール−3−イル)−3−[4−(2−モルホリン−4−イル−エトキシ)ナフタレン−1−イル]尿素(BIRB796)、ピルフェニドン及びRNAi分子からなる群から選択される、請求項21に記載の使用のためのp38γ MAPKの阻害剤。
- 2型糖尿病もしくは耐糖能障害を対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて使用するための、p38δマイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)の阻害剤。
- 1−(5−tert−ブチル−2−p−トリル−2H−ピラゾール−3−イル)−3−[4−(2−モルホリン−4−イル−エトキシ)ナフタレン−1−イル]尿素(BIRB796)及びRNAi分子からなる群から選択される、請求項23に記載の使用のためのp38δ MAPKの阻害剤。
- 2型糖尿病もしくは耐糖能障害を対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて使用するための、代替p38マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)活性化経路の阻害剤。
- 2型糖尿病もしくは耐糖能障害を対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて使用するための、ラパマイシン標的タンパク質複合体1(mTORC1)の阻害剤。
- ラパマイシン、エベロリムス、AZD8055、テムシロリムス、PP242(トルキニブ)、トリン1及びWYE−125132からなる群から選択される、請求項26に記載の使用のためのmTORC1の阻害剤。
- 2型糖尿病もしくは耐糖能障害を対象において防止すること、抑制すること、又は処置することにおいて使用するためのイミダゾールプロピオン酸誘導体。
- クロロイミダゾールプロピオン酸である、請求項28に記載の使用のためのイミダゾールプロピオン酸誘導体。
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