JP2020513807A - 単一細胞の分析 - Google Patents

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Abstract

本発明は、単一細胞由来の核酸をバーコード化するためのプロセスおよび目的の表現型を有する単一細胞を遺伝子型決定するためのプロセスに関する。【選択図】 図７

Description

本発明は、単一細胞由来の核酸をバーコード化するためのプロセスおよび目的の表現型を有する単一細胞を遺伝子型決定するためのプロセスに関する。
集団内の単一細胞の多数のパラメーターを分析する方法は、様々なコンテキストにおいて興味深い。特に、細胞集団内の単一細胞ベースで、任意選択で１つまたは複数の他のパラメーターと組み合わせて核酸を分析する能力は、市場および学術的実験に対する幅広い興味である。さらに、生物学的および生化学的プロセスの動的挙動を明らかにするために、この分析がリアルタイムで行なわれることがしばしば必要である。
したがって、高度に並行した様式で異種混合物の個々の構成要素を単離、検出および定量化することのできる技術は、これらのチャレンジに見合う必要がある。ロボット分配システムを用いた高密度マイクロウェルプレートのような従来のハイスループットのプラットフォームが開発されていて、薬物スクリーニングのようなハイスループット分析に幅広く用いられている。しかしながら、それらは、高額で嵩張るロボット機械を必要として、サンプル蒸発および比較的大きい反応容量に悩まされて、貴重な生物学的サンプルまたは試薬を無駄にし得る。
最近になって、微細加工されたデバイスが、ハイスループットの様式で多種多様な範囲の生物学的および化学的アッセイを行なうための強力な実験的プラットフォームとして現れている。これらの技術は、嵩張る溶液を、多くの単離されたピコ〜ナノリットルのサイズのコンパートメント、またはマイクロリアクターに分割することによって、複合サンプルのハイスループット分析をしばしば可能にする。しかしながら、個々のサンプルの分析後の回収は達成が困難である。さらに、これらのデバイスにおける試薬の混合は、複雑な構成を必要として、または、コンパートメント化の前に大量になされることが多く、最初の反応産物が、それらの開始標的と共局在化するのを妨げ得る。
１つの手法は、反応を、非混和性担体流体によって囲まれた別々のミクロンサイズの液滴にコンパートメント化することである。液滴に基づくマイクロ流体は、流体の混合に対して正確な制御を提供して、貴重な試薬の無駄を最小限にして、デバイスの壁における分子の蒸発および吸着を減少させる。
Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１１ Ａｕｇ ２３；１０８（３４）：１３９９９−４００４）は、ランあたり何百もの単一細胞から遺伝子発現のＲＴ−ｑＰＣＲ測定を行なうことのできるマイクロ流体デバイスを記載し、細胞捕捉、細胞溶解、逆転写、および定量ＰＣＲを含む単一細胞のプロセッシングを実行する。しかしながら、より少ない反応容量を試すように促されると、Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１１ Ａｕｇ ２３；１０８（３４）：１３９９９−４００４）は、３００回の並行のＲＴ−ｑＰＣＲを行なって、試験された反応条件において５ｎＬよりも少ない容量でＲＴが阻害されることが示された。したがって研究者らは、ＲＴ反応を細胞あたり６７ｎＬで行なって、単一の反応におけるＲＴおよびｑＰＣＲの組み合わせが、大規模のトランスクリプトーム分析および／または先入観のない増幅を排除することをさらに主張した。
さらに、単純な軸対称の流れ収束（ｆｌｏｗ−ｆｏｃｕｓｉｎｇ）デバイスを用いた方法が、ＤｅＫｏｓｋｙ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔ Ｍｅｄ．２０１５ Ｊａｎ；２１（１）：８６−９１）によって、単一細胞のｍＲＮＡの捕捉に関して説明されている。当該方法のＲＴおよびＰＣＲ反応は、エマルション内で生じる。このプロセスは、効率的であるが、連続する３ステップのプロセスを行なうことを必要とするが証明されている。
同じラインに沿って、Ｅａｓｔｂｕｒｎ ｅｔ ａｌ．（Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．２０１３ Ａｕｇ ２０；８５（１６）：８０１６−２１）は、少ない液滴容量であるが時間のかかる３〜４ステップのプロセスでＲＴを行なった。細胞プロテイナーゼから、少ない容量でのＲＴ阻害にも言及した。この問題を克服するために、彼らは細胞をプロテイナーゼで処理して、細胞溶解物を希釈して、液滴を分割して、ＲＴ−ＰＣＲ試薬をピコ注入する。
Ｒｏｔｅｍ ｅｔ ａｌ．（ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１５ Ｍａｙ ２２；１０（５）：ｅ０１１６３２８）は、液滴集団内にオリゴをカプセル化して、ＲＴ酵素およびバッファーをピコ注入しながら、細胞を含む液滴にそれらを融合する。この３ステップのプロセスは、約１００ｐＬの液滴を生じさせて、３時間で１００．０００細胞のカプセル化を可能にする。この方法は、単一細胞のｃＤＮＡラベリングに依存するが、トランスクリプトームの配列データは、多数の表現型および遺伝子型が相関していない細胞の凝集体から生じる。
Ｍａｃｏｓｋｏ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ．２０１５ Ｍａｙ ２１；１６１（５）：１２０２−１４）は、液滴に基づくマイクロ流体を用いて溶解試薬と一緒に細胞をカプセル化して、ビーズをバーコード化して１ｎＬの液滴内にｍＲＮＡを捕捉した。しかしながら、ビーズは、ビーズ上に捕捉されたｍＲＮＡのｃＤＮＡへの転換を行なうためにオフチップで用いられて（ｕｓｅｄ ｏｆｆ ｃｈｉｐ）、それらは、形成された液滴中にほとんどロードせず、したがって、レアな細胞集団の分析を不可能にする。Ｍａｃｏｓｋｏらによって説明される方法の３番目のステップは、それから、ライブラリーの調製および増幅に向けられる。
国際特許出願ＷＯ２０１５／１６４２１２は、単一細胞の核酸をカプセル化およびバーコード化するための方法に言及する。ＷＯ２０１５／１６４２１２は、ｍＲＮＡのＲＴが、３ｎＬよりも少ない容量で強く阻害されることを開示する（ＷＯ２０１５／１６４２１２の実施例４）。
Ｌａｂａｎｉｅｈ ｅｔ ａｌ．２０１５は、浮力を用いて液滴を捕捉、分析および回収するための、マイクロ流体デバイスを用いたマイクロ流体のプロセスを記載する。しかしながら、Ｌａｂａｎｉｅｈらは、核酸が逆転写される単一細胞の核酸の分析を特定せず、したがって、単一細胞の遺伝子型は、この方法を用いて得ることはできない。
特許出願ＵＳ２０１３／０３２３７３２は、単一細胞を分析および単一細胞ｃＤＮＡをバーコード化するための方法およびデバイスに言及する。ＵＳ２０１３／０３２３７３２は、液滴がマイクロ流体チップ内で融合される方法を開示しない。
これに反して、本発明者らは、単一細胞の核酸をバーコード化するためのオンチップのマイクロ流体のプロセスに対する開発に成功して、単一細胞の液滴は、個々のコンパートメント内に捕捉される。単一細胞の液滴は、逆転写のために反応混合物を提供する液滴とさらに融合される。
上述のように、本発明者らによって開発されたオンチップのプロセスは、単一細胞の表現型にアクセスするのを可能にする。したがって、本発明者らは、遺伝子型または後成的情報と表現型情報（タンパク質発現レベル、細胞のパスウェイ活性化／活性、イオンチャネル／ＧＰＣＲ活性）を独自に結びつけるプロセスをさらに開発して、したがって、目的の表現型を有する単一細胞の遺伝子型を判定することを可能にした。
プロセスにおけるそれぞれのステップでアレイを画像化する能力は、従来の方法よりも定量的な単一細胞あたりのデータを得ることを可能にして、表現型スクリーニング中に動的データを作成するのを可能にして、それから、特定の単一細胞の遺伝子型と関連付けられ得る。
Ｒｏｔｅｍ ｅｔ ａｌ．では、例えば、多数の表現型および遺伝子型が相関していない細胞の凝集体をシーケンスすることによってゲノム情報が得られるので、このプロセスは、Ｒｏｔｅｍ ｅｔ ａｌ．のようなこれまでに知られている従来技術とは異なる。したがって、彼らの方法は、それぞれの単一細胞の遺伝子型に表現型情報を結び付けるステップ開示しない。
国際特許出願ＷＯ２０１６１４５４０９Ａ１は、目的のタンパク質の表現型および遺伝子型が相関し得る方法を開示する。この方法では、本発明者らの方法とは異なり、バーコードは、例えば、目的のタンパク質またはその結合パートナーに関連付けられて、同時に、前記の目的のタンパク質をコードする核酸に関連付けられる。それから、核酸が逆転写されてバーコード化ｃＤＮＡを得て、それから、バーコード化ｃＤＮＡがシーケンスされる。目的のタンパク質は、エマルションを破壊することによって、および、ＥＬＩＳＡのような表現型アッセイまたはアフィニティカラムを用いたアッセイ（ｅｓｓａｙ）を行なうことによって、並行して表現型決定される。所望の表現型を示すタンパク質については、バーコード配列は、それから、シーケンスによって解析される。それから、表現型は、目的の表現型を有する目的のタンパク質のバーコードを、同じバーコードを有するｃＤＮＡと合わせることによって、遺伝子型に関連付けられる。
しかしながら、当業者によって理解されるように、そのような方法は、単一細胞の全体的なトランスクリプトームを単一細胞の表現型と合わせることを可能にせず、または、ある特定の目的のタンパク質の存在と関連しない表現型を有する単一細胞の遺伝子型にアクセスすることを可能にしない。
これに反して、本発明者らの方法は、１ステップで、いくつかの単一細胞を表現型決定すること、それから、それらの核酸をプールすることによって、並行してこれらの単一細胞を遺伝子型決定することを可能にする。その後に、ゲノム情報が目的の表現型を有する単一細胞の表現型に関連付けられる。
さらに、本発明者らのプロセスは、単一の目的のタンパク質の存在と必ずしも関連しないが、例えば特定のパスウェイの活性の変化と関連し得る表現型を含む任意の表現型を決定することを可能にして、細胞の抗体分泌率、イオンチャネル活性、ＧＰＣＲ活性化、酸化還元の潜在性の変化のようなアッセイを用いて決定され得る任意の表現型をもたらす。
本発明の第１の態様は、目的の表現型を有する単一細胞を遺伝子型決定するためのプロセスに関し：
−複数のリザーバーを提供するステップ、および
ａ）複数のリザーバーに関して、少なくとも１つのバーコード配列および少なくとも１つの色素をそれぞれのリザーバーに関して提供するステップ（ここで前記の少なくとも１つのバーコード配列は、前記の少なくとも１つの色素の色および濃度と関連する）、および、アレイの画像を撮って、それにより、それぞれのリザーバーに関して前記の少なくとも１つの色素の色および強度をマッピングするステップ；および
ｂ）複数のリザーバーに関して、少なくとも１つの単一細胞をそれぞれのリザーバーに関して提供して、前記の少なくとも１つの単一細胞に対して表現型アッセイをそれぞれのリザーバーに関して行なうステップ、および、画像を撮って、それにより、それぞれのリザーバーに関して前記の少なくとも１つの単一細胞の表現型をマッピングするステップ；
ここでステップａ）はステップｂ）の前に行なわれる、または、ステップｂ）はステップａ）の前に行なわれる；それから、
ｃ）複数のリザーバーに関して、ステップｂ）において得られた単一細胞の表現型を、それぞれのリザーバーに関して、ステップａ）において得られた前記の少なくとも１つの色素の色および強度に対して関連付けるステップ；および
−複数のリザーバーに関して、前記の少なくとも１つの単一細胞の核酸をそれぞれのリザーバーに関して逆転写して、前記の少なくとも１つの色素の色および濃度と関連する前記の少なくとも１つのバーコード配列でバーコード化された単一細胞ｃＤＮＡを得るステップ；および
−前記の少なくとも１つの単一細胞の表現型と遺伝子型を関連付けるステップを含む。
本発明の第二の態様は、単一細胞の核酸をバーコード化するためのマイクロ流体のプロセスに関し、前記方法は、以下のステップを含む：
−少なくとも１つのマイクロ流体チャネルおよび複数のリザーバーを備えるチップを備えるマイクロ流体デバイスを提供するステップ、
−マイクロ流体チャネルの入口に、担体流体内に分散された第一のタイプの複数の液滴を含む担体流体を注入するステップ（ここで、第一のタイプの液滴は、単一細胞の液滴またはＲＴ液滴のいずれかであり、ここで、ＲＴ液滴の少なくとも一部は、逆転写酵素および少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含み、およびここで、単一細胞の液滴の少なくとも一部は、１つの単一細胞を含み、ここで、前記単一細胞は、単一細胞の核酸を含む）、
−複数のリザーバーに関して、第一の移行ステップ（ここで、複数の液滴のうちの第一のタイプの少なくとも１つの液滴は、浮力によって前記の複数のリザーバーの１つのリザーバー内に動かされる）、
−マイクロ流体チャネルの入口に、担体流体内に分散された第二のタイプの複数の液滴を含む担体流体を注入するステップ（ここで、第二のタイプの液滴は、単一細胞の液滴またはＲＴ液滴のいずれかであり、およびここで、第一のタイプの液滴が単一細胞の液滴である場合は第二のタイプの液滴はＲＴ液滴であり、または、第一のタイプの液滴がＲＴ液滴である場合は第二のタイプの液滴は単一細胞の液滴である、
−複数のリザーバーに関して、第二の移行ステップ（ここで、第二のタイプの少なくとも１つの液滴の少なくとも一部は、前記の複数のリザーバーの１つのリザーバーの中に入る）、
−複数のリザーバーに関して、前記の第一のタイプの少なくとも１つの液滴を、それぞれのリザーバー内、またはその縁で、前記の第二のタイプの少なくとも１つの液滴と融合して、それにより、融合液滴をもたらすステップ、
−および、以下のステップをさらに含む：
ａ）それぞれの融合液滴に関して、前記融合液滴内で、単一細胞の核酸の少なくとも一部を少なくとも１つのオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせるステップ、
ｂ）それぞれの融合液滴内で、前記融合液滴内に存在する単一細胞の核酸の少なくとも一部を逆転写して、それにより、単一細胞のｃＤＮＡをもたらすステップ、および
ｃ）ステップｂ）において得られた単一細胞のｃＤＮＡに、少なくとも１つのバーコード配列を付着させるステップ（ここで前記の少なくとも１つのバーコード配列は、前記単一細胞の同一性をコードする）、
または
−さらに以下のステップを含む：
ａ）それぞれの融合液滴に関して、前記の融合液滴内で、少なくとも１つの細胞由来の単一細胞の核酸の少なくとも一部を少なくとも１つのオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせるステップ（ここで前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのバーコード配列を含む）、
ｂ）それぞれの融合液滴内で、前記の融合液滴内に存在する単一細胞の核酸の少なくとも一部を逆転写して、それにより、バーコード化された単一細胞のｃＤＮＡをもたらすステップ（ここで前記の少なくとも１つのバーコード配列は、前記単一細胞の同一性をコードする）。
抗体依存−細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の同定のための、単一細胞の液滴に基づく表現型アッセイを示す。ＩｇＧ産生細胞（２）は、膜タンパク質を発現しているレポーター細胞（１）を標的化する抗体を分泌する。抗体が標的化細胞上に結合した後に（３）、死滅化細胞（４）が細胞Ｆｃ受容体を通って動員されて、（２）によって分泌された抗体の結合を通して仲介される細胞傷害性活性（１０）を誘導する。一部の適用では、死滅化細胞は、ＰＢＭＣから単離されて、または、細胞傷害性によって仲介される活性で知られる細胞株である。 相補依存性細胞毒性（ＣＤＣ）抗体の同定のための、単一細胞の液滴に基づく表現型アッセイを示す。ＩｇＧ産生細胞（２）は、膜タンパク質を発現しているレポーター細胞（１）を標的化する抗体を分泌する。抗体が標的化細胞上に結合した後に（３）、相補分子（６）が、細胞溶解（１０）を誘導する抗体に結合する。 細胞溶解、アポトーシス、内部移行、壊死を誘導する抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）（３）候補の同定のための、単一細胞の液滴に基づく表現型アッセイを示す。薬物が連結した抗体（５）は、異なるエマルションの中に、エマルションあたり１つの薬物が導入される。抗体の結合後（３）、効率的な薬物活性の場合に、標的細胞は、所定の例において、溶解される（１０）。 アゴニスト／アンタゴニスト抗体（３）の同定のための、単一細胞の液滴に基づく表現型アッセイを示す。ＩｇＧ産生細胞（２）は、膜タンパク質を発現しているレポーター細胞（１）を標的化する抗体を分泌する。抗体が標的化細胞（１）上に結合した後に、いくつかのパスウェイが活性化または阻害されて、生理学的改変をもたらす。細胞および受容体の特性によれば、これらの改変は、液滴における単一または多数の機能性アッセイとして用いられる。それと異なって、アンタゴニスト抗体（３）は、同一の液滴内でリガンドと競合する（７）。読み出しは、その結果、アゴニスト活性のブロックである。 リガンドのアゴニスト活性の同定のための、単一細胞の液滴に基づく表現型アッセイを示す。画像獲得は、落射蛍光に基づく顕微鏡を１０×倍率で用いて行なわれる。Ａ．アゴニストを含むエマルション（高い蛍光色素濃度）を、アゴニストを含まないエマルション（低い蛍光色素濃度）から区別するために、異なる濃度の蛍光色素が、リガンド濃度の関数で添加される。Ｂ．細胞は、細胞マーカーによって標識される。第二の液滴集団との融合後に（とりわけ、細胞内パスウェイの活性化検出の検出のための基質ならびにＲＴ（＋／−ＰＣＲ）に関する試薬を含む）、細胞が溶解して、液滴の内側に細胞マーカーのリークの拡散をもたらす。Ａ．は、Ｂ．合わせて、アッセイ条件の情報を与える。Ｃ．最後に、機能性の読み出しが第三の色で与えられて、この場合には、下流アゴニストの動員によって誘導された細胞内のシグナル伝達経路の活性化を示す。閾値よりも上では、液滴はポジティブと考えられて、条件Ａ．＋Ｂ．によって与えられる予測と一致する。この例は、分泌された抗体の複雑な表現型（下流シグナリングの細胞内カスケード活性化）を、そのシーケンス情報と関連付ける実施可能性を強調する。 アンタゴニスト／ブロック抗体（３）の同定のための、単一細胞の液滴に基づく表現型アッセイを示す。ＩｇＧ産生細胞（２）は、膜タンパク質を発現しているレポーター細胞（１）を標的化する抗体（３）を分泌する。抗体が標的化細胞（１）上に結合した後に、リガンドまたはアゴニストは、コアおよびシェルで構成された粒子（８）によって次第に放出される。粒子は、抗体産生と同様の動力学でリガンドを放出することができ、前記液滴における競合アッセイを可能にする。粒子は、細胞増殖ゲルによって構成されてよく、ゲル内部でのレポーター細胞の移行を可能にするリガンドの勾配を生じさせることができて、一般に細胞移動性アッセイと呼ばれる（９）。 表現型および遺伝子型の情報回収を組み合わせるための、マイクロ流体デバイス内で行なわれるＲＴ−ＰＣＲの例を示す。この例では、ＤＮＡインターカラントまたはＴａｑ−ｍａｎプローブが、ＲＴ−ＰＣＲ試薬の添加においてミックスに添加される。それぞれのサイクルに関して、コピー数は指数関数的に増大して、インターカレート剤またはプローブの枯渇に起因してプラトーに達する。それから、強度曲線がサイクルの関数でプロットされて、サイクル閾値（Ｃｔ）の値が計算される。それから、Ｃｔ値が、Ｌｏｇ［分子数］の関数でプロットされる。所定のサンプルに関する分子数は、検量線から計算される。検量線は、公知量の分子を含む液滴から作成されて、それに関して、Ｃｔが同様に計算される。標準サンプル由来のこれらのＣｔは、Ｌｏｇ［分子数］グラフの関数としてプロットされて、それから、線形回帰の等式が計算されて、細胞を含むサンプル液滴の定量分析に関して使用される。 液滴におけるＩｇＧ産生細胞のスクリーニングのために用いられる標準的な手順の例を示す。ステップ１、ｂ細胞およびレポーター細胞の調製を伴う。ｂ細胞集団は予備的な濃縮であり、他のタイプの無関係集団のうち、相対量のＩｇＧ分泌または産生細胞を増大する。ステップ２、単一のｂ細胞および１つの単一またはマルチのレポーター細胞の共カプセル化を誘発する。ステップ３、細胞を含むエマルションをインキュベートして、ＩｇＧ産生細胞が液滴において抗体を分泌するようにさせる。ステップ４Ａ、ソーティングが目的の集団に適用されて、特異的な表現型の機能（結合など）を誘導するＩｇＧ特異的抗体の単離を発展させる。ステップ４Ｂ、液滴における逆転写（ＲＴ）を行なうための試薬を含むエマルションが、４Ａステップと並行して調製される。ステップ５、ソーティングされた液滴は、複数のリザーバーを備えるマイクロ流体デバイスの内部で分配される。ソーティングされた液滴は、マイクロ流体デバイスの内部に、浮力によって捕捉される。ステップ６、細胞を含み目的の表現型を示す捕捉された液滴は、それから、落射蛍光に基づく顕微鏡または蛍光および／または発光獲得のための任意の他のデバイスを用いることによって画像化される。ステップ７、その後のステップにおいて、ステップ４Ｂで生産されたエマルションは、マイクロ流体デバイスの内部で分配されて、１つの単一のソーティングされた液滴が１つの単一のＲＴ液滴と融合されるように融合される。ステップ８、インキュベーションステップは、逆転写が、最終的にはＰＣＲ反応に連結されて生じるのを可能にするように行なわれる。ステップ９、インキュベーション後、マイクロ流体デバイスは、落射蛍光に基づく顕微鏡または蛍光および／または発光獲得のための任意の他のデバイスを用いることによって画像化される。ステップ１０、マイクロ流体デバイス内に捕捉されたエマルションが回収されて、最終的に、ＰＣＲによるライブラリー増幅のために処理される。ステップ１１、増幅されたライブラリーが、シーケンシングのために送られる。このプロセス全体を完了した後に、２ステップのデータ分析が行なわれる。ステップ６および９に関連して、画像は、３つの一般的なステップ、画像修正、それぞれの個々のウェル／シグナルの検出、および、シグナル分析（前記液滴の表現型を与える）に従って解析される。ステップ１１に関連して、シーケンスのデータは、３つの一般的なステップ、１）配列種のバーコード抽出、クラスタリングおよび特定、２）抗体配列の特性化およびＶＨ／ＶＬのペアリング、３）抗体クローンの割り当ておよび抗体候補の優先順位付けに従って解析される。ステップ１２、これらの２つの解析の組み合わせは、選択された抗体の深い特性化および表現型と遺伝子型の間の関連付けを可能にする。 １０６０の浮力に基づく捕捉ユニットを含む前記マイクロ流体デバイスの獲得された画像を示す。この設計では、捕捉ユニットの合計量を増大させるために２つの連続したチャンバーが用いられる。 目的の細胞の存在下での標的細胞の結合に基づく、ソーティング中の一部の獲得された画像を示す。Ａ．１つの標的細胞および目的の細胞がローディングされた２つのソーティングされた液滴を含む２つの捕捉ユニットの、明視野の獲得（Ｂｒｉｇｈｔ ｆｉｌｅｄ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ）。Ｂ．ＴＲＩＴＣフィルターを用いて獲得された画像。蛍光分子は液滴の内部で用いられて、マイクロ流体デバイスにおける検出を可能にする。Ｃ．Ｃｙ５フィルターを用いて獲得された画像は、標的細胞上に局在化された検出試薬（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅｇｅｎｔ）を示す。 ライブラリーの調製例およびコントロールを示す。２ステップＰＣＲ反応（ＰＣＲ１およびＰＣＲ２）の後に、ｃＤＮＡは、Ｉｌｌｕｍｉｎａに基づくシーケンシングライブラリー中へ増幅される。ＰＣＲ２は、通常、ＶＨおよびＶＬに関して増幅約５５０ｂｐの産物を示す。 ＮＧＳ配列解析中に行なわれるいくつかのステップを示す。それらの１つは、単一細胞ＩｇＧ産生細胞のＶＨ配列とＶＬのペアリング内に存する。グラフは、ＶＨおよびＶＬをペアリングするのに用いられるｌｏｇ（解読の豊富さ）を示す。
［定義］
別段の定義がない限り、本開示との関連で用いられる科学的および技術的用語は、当業者によって一般に理解される意味を有する。
さらに、文脈によって別段の要求がない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。
一般に、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、およびタンパク質およびオリゴ−またはポリヌクレオチド化学およびハイブリダイゼーションとの関連で使用される命名法およびそれらの技術は、よく知られたものであり、当該分野において一般に用いられるものである。
「マイクロ流体」によって、流体が循環する通路の寸法が、１ミリメートルよりも小さく、例えば、１μｍ〜１ｍｍに含まれることを一般に意味する。
「マイクロ流体のプロセス」は、一般に、少量の流体（１０−４〜１０−１８リットル）が１ミリリットルよりも小さい寸法を有するマイクロ流体チャネルを用いて操作されるプロセスを指す。これらのマイクロ流体チャネルは、通常、マイクロ流体デバイス内に、より具体的には、マイクロ流体デバイスのマイクロ流体チップ内に含まれる。本発明の文脈において用いられるマイクロ流体デバイスは、セクション「マイクロ流体デバイス」においてさらに後述される。
本発明の「プロセス（ｐｒｏｃｅｓｓ）」は、方法（ｍｅｔｈｏｄ）と呼ばれてもよい。
標準的な技術は、組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、および組織培養および形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）に用いられる。酵素反応および精製技術は、製造元の仕様書に従って、または当該分野において一般に達成されるとおりに、または本明細書において説明されるとおりに、行なわれる。本開示の実施は、逆のことが明確に指示されない限り、当該分野の技術内のウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学および組み換えＤＮＡ技術の従来の方法を用いて、その多くは以下に説明目的のために記載される。そのような技術は、文献において完全に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８４）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）を参照。
本明細書に記載の分析化学、合成有機化学、および医薬および調剤化学との関連で使用される命名法、およびそれらの実験手順および技術は、よく知られたものであり、当該分野において一般に用いられるものである。標準的な技術は、化学合成、化学分析、医薬品、製剤、および送達、および患者の治療のために用いられる。
本明細書において一般に用いられる用語「核酸」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡの少なくとも１つの分子または鎖、または、少なくとも１つの核酸塩基、例えば、ＤＮＡ内に見られる天然起源のプリンまたはピリミジン基（例えば、アデニン「Ａ」、グアニン「Ｇ」、チミン「Ｔ」、およびシトシン「Ｃ」）またはＲＮＡ（例えばＡ、Ｇ、ウラシル「Ｕ」、およびＣ）を含むそれらの誘導体または模倣体を指す。用語「核酸」は、用語「オリゴヌクレオチド」を包含する。
「ＲＮＡ」は、本明細書において、制限されないが、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡのような、機能性ＲＮＡを指す。１つの好ましい実施態様では、ＲＮＡはｍＲＮＡを指す。
当業者によって理解されるように、一本鎖の表現は、相補鎖の配列も定義する。したがって、核酸は、表わされた一本鎖の相補鎖も包含する。用語「核酸」は、したがって、相補ＤＮＡを包含する。また、当業者によって理解されるように、核酸の多くの変異体が、所定の核酸として同一目的のために用いられ得る。したがって、核酸は、実質的に同一の核酸およびその相補も包含する。また、当業者によって理解されるように、プライマーのような一本鎖核酸は、ハイブリダイゼーション条件、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下で、標的配列にハイブリダイズし得る。したがって、核酸は、ハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズするプライマーも包含する。
用語「オリゴヌクレオチド」は、約３〜約５００個の核酸塩基の長さの少なくとも１つの分子を指す。例えば、オリゴヌクレオチドは、少なくとも３個の核酸塩基、少なくとも１０個の核酸塩基、少なくとも３０個の核酸塩基、少なくとも５０個の核酸塩基、少なくとも１００個の核酸塩基、少なくとも３００個の核酸塩基、または少なくとも４００個の核酸塩基の長さを有してよい。場合によっては、オリゴヌクレオチドは、５００個以内の核酸塩基、３００個以内の核酸塩基、１００個以内の核酸塩基、５０個以内の核酸塩基などの長さを有してよい。任意のこれらの組み合わせも可能であり、例えば、オリゴヌクレオチドの長さは、３〜３００個の核酸塩基、好ましくは３〜２００個の核酸塩基、より好ましくは３〜１００個の核酸塩基であってよい。
これらの定義は、少なくとも１つの一本鎖分子を指すが、一部の実施態様では、少なくとも１つの一本鎖分子と部分的に、実質的に、または完全に相補である少なくとも１つのさらなる鎖も包含する。したがって、一部の実施態様では、前記定義は、二本鎖分子を指す。
したがって、一部の実施態様では、核酸は、１つまたは複数の相補鎖（単数または複数）または分子の鎖を含む特定の配列の「相補（単数または複数）」を含む、少なくとも１つの二本鎖分子を指す。
本明細書において用いられる「遺伝子」は、転写および／または翻訳調節配列および／またはコード領域および／または非翻訳配列（例えば、イントロン、５’−および３’−非翻訳配列）を含むゲノム遺伝子であってよい。遺伝子のコード領域は、アミノ酸配列または機能性ＲＮＡ、例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡに関してコードしているヌクレオチド配列であってよい。遺伝子は、コード領域（例えば、エクソンおよびｍｉＲＮＡ）に対応するｍＲＮＡまたはｃＤＮＡであってもよく、任意選択で、それに結合した５’−または３’−非翻訳配列を含んでよい。遺伝子は、インビトロで生産された増幅された核酸分子であってもよく、コード領域の全てまたは一部および／またはそれに結合した５’−または３’−非翻訳配列を含む。
本明細書において用いられる用語「ストリンジェント条件」または「高ストリンジェンシー条件」は、決定されたレベルの相補性を有する核酸間の結合ペアを生じさせるのに適切であるが、前記の決定されたレベルに劣っている相補性を示す核酸間の結合ペアの形成には不適切である条件に相当する。ストリンジェント条件は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件の両方の組み合わせであり、配列依存性である。これらの条件は、当業者に公知の方法に従って改変され得る（Ｔｉｊｓｓｅｎ，１９９３，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ」，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。一般に、高ストリンジェンシー条件は、熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択されて、好ましくは、完全に塩基が対になったデュプレックスのＴｍに近い温度である（Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，１９９９，ｐ．５４）。ハイブリダイゼーション手順は当技術分野でよく知られていて、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．，Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｄ．Ｄ．，Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊ．Ｇ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ａ．，Ｓｔｒｕｈｌ，Ｋ．ｅｄｓ．（１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｖ．Ｂ．Ｃｈａｎｄａ，ｓｅｒｉｅｓ ｅｄ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓにおいて説明される。
高ストリンジェンシー条件は典型的に、約５０℃〜約６８℃でのハイブリダイズを含み、ここで前記温度は典型的に、５×ＳＳＣ／５×デンハート液／１．０％ＳＤＳ中、および、約６０℃〜約６８℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中の洗浄で、標的配列とハイブリダイズされる核酸の最も高い融解温度ＴＭに相当する。例えば、本発明との関連では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド内に含まれるプライマー配列は、相補ＲＮＡ配列のような相補核酸と、約５０℃〜約６８℃で、典型的にリザーバー、または液滴または複数の液滴、例えばいわゆる融合液滴または複数の融合液滴内で、典型的にハイブリダイズする。したがって、一例では、前記融合液滴または前記リザーバーは、逆転写酵素組成物および任意選択で溶解組成物をさらに含み、ここで、逆転写酵素組成物は、本明細書において以下のセクション「逆転写」において定義されて、溶解組成物は、以下のセクション「細胞溶解」において定義される。
用語「抗体」は、免疫グロブリン分子、および、免疫グロブリン分子の免疫学的に活性の部分、すなわち、免疫特異的に抗原に結合する抗原結合部位を含む分子を指す。したがって、用語「抗体」は、抗体分子全体だけでなく、抗体フラグメントならびにヒト化抗体のような誘導体を含む抗体の変異体も包含する。従来の抗体では、２本の重鎖は、ジスルフィド結合によって互いに結合されて、それぞれの重鎖は、ジスルフィド結合によって軽鎖に結合される。２つのタイプの軽鎖、ラムダ（λ）およびカッパ（κ）が存在する。抗体分子の機能的活性を決定する５つの主な重鎖クラス（またはアイソタイプ）：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥが存在する。それぞれの鎖は、別個の配列ドメインを含む。軽鎖は、２つのドメイン、可変ドメイン（ＶＬ）および定常ドメイン（ＣＬ）を含む。重鎖は、４つのドメイン、可変ドメイン（ＶＨ）および３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３、ＣＨと総称される）を含む。軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）の両方の可変領域は、抗原に対する結合認識および特異性を決定する。軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ）の定常領域ドメインは、抗体鎖の関連性、分泌、経胎盤移動性、相補結合、およびＦｃ受容体（ＦｃＲ）に対する結合のような、重要な生物学的特性を与える。Ｆｖフラグメントは、免疫グロブリンのＦａｂフラグメントのＮ末部分であり、１本の軽鎖と１本の重鎖の可変部分からなる。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原性決定因子の間の構造的相補性にある。抗体結合部位は、主に高頻度可変性または相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基で構成される。時折、非高頻度可変性またはフレームワーク領域（ＦＲ）由来の残基は、ドメイン構造全体（したがって結合部位）に影響を及ぼす。相補性決定領域（ＣＤＲ）はアミノ酸配列を指し、それは共に、ネイティブの免疫グロブリン結合部位の天然のＦｖ領域の結合親和性および特異性を規定する。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖は、それぞれ３つのＣＤＲを有し、それぞれ、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、Ｌ−ＣＤＲ３およびＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３と指定される。したがって、抗原結合部位は、重鎖および軽鎖Ｖ領域のそれぞれ由来のＣＤＲセットを含む６個のＣＤＲを含む。フレームワーク領域（ＦＲ）は、ＣＤＲ間に挿入されたアミノ酸配列、すなわち、Ｋａｂａｔら（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１）によって定義されるように、単一種における異なる免疫グロブリン間で相対的に保存されている免疫グロブリン軽鎖および重鎖可変領域の部分を指す。
「抗体フラグメント」は、無傷の抗体の部分、好ましくは、無傷の抗体の抗原結合または可変領域を含む。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；ダイアボディ；線形抗体（米国特許番号５，６４１，８７０；Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２［１９９５］を参照）；単鎖抗体分子；および、抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体を含む。したがって、用語「抗体」は、単鎖抗体、例えばラクダ科抗体、またはナノボディまたはＶＨＨをさらに表わす。
用語「Ｔ細胞受容体」は、本明細書において、Ｔ細胞（すなわち、Ｔリンパ球）の表面上に存在する抗原認識分子を指す。この定義は、当技術分野で知られている用語の理解を明示的に含み、例えば、不変ＣＤ３鎖との複合体として細胞膜において発現された非常に可変のαまたはβ鎖のジスルフィド結合ヘテロ二量体を含むまたはからなる受容体、または、Ｔ細胞のサブセット上にＣＤ３との複合体として細胞膜において発現された可変γおよびδ鎖を含むまたはからなる受容体を含む。
「抗体遺伝子」および「Ｔ細胞受容体遺伝子」は、ＴおよびＢ細胞成熟の初期段階中に、発達リンパ球においてのみ生じる、Ｖ（Ｄ）Ｊ組み換えと呼ばれる遺伝子組み換えの独特なメカニズムを受ける。それは、体細胞組み換えを含み、Ｂ細胞およびＴ細胞上にそれぞれ見られる抗体／免疫グロブリン（Ｉｇ）およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の非常に広範なレパートリーをもたらす。
用語「複数」は、本明細書において、１よりも多い任意の数の関連する物、例えば、５００よりも多い、１０００よりも多い、２０００よりも多い、５０００よりも多い、１０００００よりも多い、例えば、１〜１０００００、例えば１〜１００００、１〜１００００、１０〜１０００、５０〜１０００、１００〜１０００、１０〜５００の関連する物を指す。
［マイクロ流体デバイス］
本発明のマイクロ流体のプロセスは、チップを備えるマイクロ流体デバイス内で行なわれる。
「マイクロ流体チップ」は、一般に、材料（ガラス、シリコンまたはポリマー、例えばＰＤＭＳ、ＰＭＭＡまたはＣＯＣ）への摩砕、エッチング、アブレーションまたは成形によって作られるマイクロチャネルのセットを指す。マイクロ流体チップは通常、少なくとも１つのチャネルを共に規定する基材および支持体を備える。
本発明の一部の実施態様では、本発明の文脈において用いられるマイクロ流体デバイスは、複数のリザーバーを備えるチップを備える。
本発明の一部の実施態様では、本発明の文脈において用いられるマイクロ流体デバイスは、少なくとも１つのマイクロ流体チャネルおよび複数のリザーバーを備えるチップを備える。
関連する実施態様では、前記の少なくとも１つのマイクロ流体チャネルは、入口と出口の間に長手方向（Ｘ）で伸長する。
関連する実施態様では、複数のリザーバーのそれぞれのリザーバーは、長手方向（Ｘ）と０でない角度を形成する上昇方向（Ｚ）に沿って伸長して、それぞれのリザーバーは、長手方向（Ｘ）に伸長している前記の少なくとも１つのチャネルの中に開く。
したがって、一部の実施態様では、マイクロ流体デバイスは、
−入口と出口の間に長手方向（Ｘ）で伸長している、少なくとも１つのマイクロ流体チャネル、
−複数のリザーバー（それぞれのリザーバーは、長手方向（Ｘ）と０でない角度を形成する上昇方向（Ｚ）に沿って伸長して、それぞれのリザーバーは、前記の少なくとも１つのチャネルの中に開く）
を備えるチップを備える。
一部の実施態様では、「少なくとも１つのマイクロ流体チャネル」は、本明細書において、少なくとも１〜１００、１〜８０、１〜５０、１〜４０、１〜３０、１〜２０、１〜１０、例えば、１〜６、１〜４、１〜３のチャネルを指す。
一部の実施態様では、上昇方向（Ｚ）と長手方向（Ｘ）の間に形成される０でない角度は、８５度〜９５度、好ましくは９０度である。
チャネルの入口は通常、少なくとも１つの流体を注入するために用いられて、チャネルの出口は通常、少なくとも１つの流体を集めるために用いられる。チャネルは通常、入口から出口に向かう主方向に沿って前記の少なくとも１つの流体が流れるのを可能にすることが意図される。
チャネルの入口は、チャネル内を流れることが意図される流体の、少なくとも１つのリザーバー、例えば１〜５、好ましくは１〜４、より好ましくは、１〜３、例えば、１、２または３個のリザーバーと接続され得る。
チャネルの出口は、チャネルから来る流体を集めるために、少なくとも１つのリザーバー、好ましくは１または２個のリザーバーに接続され得る。
一部の実施態様では、チップは、液滴アレイ、より具体的には、フローティング液滴アレイである。
一部の実施態様では、前記マイクロ流体デバイスは、前記の少なくとも１つの流体の流速を制御するための少なくとも１つの注入デバイスをさらに備える。
「少なくとも１つの流体」は、本明細書において、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５または５よりも多い流体を指してよい。入口で注入される「少なくとも１つの流体」および出口で集められる「少なくとも１つの流体」は、同一の流体または異なる流体であってよい。
注入デバイスは、圧力制御装置またはシリンジ駆動装置を備えてよい。
一部の実施態様では、入口の前記の少なくとも１つの流体は、１、２、３または４つの流体、例えば３つの流体を指す。
したがって、一例では、１つの流体は、例えば、第一のタイプの液滴を含み、１つの第二の流体は、例えば、第二のタイプの液滴を含み、第三の流体は、第一のタイプまたは第二のタイプの液滴の複数を除去してチャンバーを浄化するためのものである。第一のタイプおよび第二のタイプの液滴は、本発明のプロセスの関連で本明細書において以下に定義されるとおりである。前記の例によれば、前記マイクロ流体デバイスは、前記の３つの流体の流速を制御するための注入デバイスをさらに備える。
一部の実施態様では、デバイスは、少なくとも１つの電気システム、好ましくは、チップの特定の領域において電場を誘導するように適合された、１つの電気システムを備える。前記の少なくとも１つの電気システムは、発電機、アノードおよびカソードを備えてよい。
一部の実施態様では、本発明の文脈におけるマイクロ流体デバイスは、デバイスアセンブリにおいて用いられる。
前記デバイスアセンブリは、液滴、例えば、第一のタイプまたは第二のタイプの液滴、例えば、本明細書において以下にさらに定義される単一細胞の液滴またはＲＴ液滴を生産するためのユニットまたは細胞ソーターをさらに備える。
したがって、１つの代替の実施態様では、チップは、第一のタイプまたは第二のタイプの液滴、例えば、本明細書において以下にさらに定義される単一細胞の液滴またはＲＴ液滴を生産するためのユニットを備える。
これらの液滴は、それから、前記の少なくとも１つのマイクロ流体チャネルの中に入口を経由して注入される。
「複数のリザーバー」は、本明細書において、任意の数のリザーバーを指す。リザーバーおよびしたがって複数のリザーバーの数は、好ましくは、１〜１０００００のリザーバー、例えば１〜１００００のリザーバー、例えば、１０〜８０００、１０〜７０００、１０〜６０００、１０〜５０００、１０〜４０００、１０〜３０００、１０〜２０００、１０〜１０００、例えば、１０００〜１００００、１０００〜９０００、２０００〜８０００、３０００〜７０００、４０００〜６０００、例えば４５００〜５５００を指す。
本発明の文脈において、言及は、マイクロ流体デバイスの１つのリザーバーに対してなされてよい。しかしながら、当業者は、１つのリザーバーに関して説明されるプロセスは、用いられるチップ内に存在する複数のリザーバーに同時に当てはまることを理解している。
一部の実施態様では、チップのリザーバーは、シリンダーの形状を有する。一部の実施態様では、複数のリザーバーの、リザーバーのサイズは同質である。
マイクロ流体デバイス、より具体的には、マイクロ流体デバイスのチップは、その幾何学的パラメーター、例えば、複数のリザーバーの１つのリザーバーの直径、ｄｒｅｓｅｒｖｏｉｒ、リザーバーの深さ、ｈｒｅｓｅｒｖｏｉｒ、注入チャネルの高さ、ｈｃｈａｎｎｅｌ、注入チャネルの幅、ｗｃｈａｎｎｅｌ、および、複数のリザーバーの個々のリザーバーの間の空間、ｘによって特徴付けられ得ることが、当業者によって理解される。
［液滴］
「液滴」は一般に、容量の測定を指す。「液滴」は、本発明の文脈において、第二の流体によって囲まれた第一の流体の単離された部分を指す。液滴は必ずしも球状ではないが、例えば外的環境に依存して他の形状も同様に推定され得ることに注意する。
本明細書のプロセスの文脈において用いられる用語「液滴」は、第一のタイプの液滴、第二のタイプの液滴、例えば、単一細胞の液滴またはＲＴ液滴、および融合液滴、または複数の前記液滴を含む。
液滴を調製および注入するための方法は当業者に公知であり、本明細書において以下のセクション「液滴の調製」においてさらに説明される。液滴の調製に関して、液滴のサイズは、ガウス分布のような確率分布に従うことが当業者によって理解される。マイクロ流体の液滴の調製に用いられるパラメーターが、特定の容量を有する複数のマイクロ流体の液滴を得るために選択され得ることがさらに理解される。
一部の実施態様では、本発明のプロセスの文脈における液滴、特に、第一のタイプの液滴または第二のタイプの液滴は、好ましくは、実質的に、単分散である。
「単分散」は、本明細書において、実質的に同一の形状および／またはサイズを有する液滴を指す。
本明細書において上述されて、当業者に公知であるように、液滴は、形状およびサイズの分布に従う。したがって、液滴は、断面径の均一な分布を有してよく、すなわち、液滴は、液滴の約５％以内、約２％以内、または約１％以内が、複数の液滴の全体的な平均直径または容量の約９０％未満（または約９５％未満、または約９９％未満）の、および／または、約１１０％よりも大きい（または約１０５％よりも大きい、または約１０１％よりも大きい）、直径または容量を有するような、直径または容量の分布を有してよい。均一な分布の断面径の液滴を生産するための一部の技術は、２００４年４月９日に出願された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１０９０３、表題「Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｆｌｕｉｄｉｃ Ｓｐｅｃｉｅｓ」（Ｌｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ２００４／０９１７６３として２００４年１０月２８日に公表）に開示されていて、参照により本明細書中に援用される。本明細書において液滴の容量またはサイズに対して言及がなされる場合は、この容量またはサイズは、複数の液滴の平均の容量またはサイズを指すことが当業者によって理解される。当業者は、例えば、レーザー光散乱または他の公知技術を用いて、液滴の集団の平均直径を決定することができる。本発明の文脈において形成される液滴は球状であってよく、または特定の場合には非球状であってよい。液滴、特に非球状の液滴の直径は、非球状の液滴と同一の容量を有する完全な数学的球体の直径として得られてよい。
「液滴」または「複数の液滴」、例えば、「複数のＲＴ液滴」または「複数の単一細胞の液滴」は、５ｎＬ未満、例えば４ｎＬ未満、３ｎＬ未満、好ましくは３ｎＬ未満の平均容量を有する。一部の実施態様では、前記の複数のマイクロ流体の液滴は、３ｎＬ未満、２．５ｎＬ未満、２ｎＬ未満、１．５ｎＬ未満、１ｎＬ未満、０．５ｎＬ未満、例えば０．１ｎＬ〜３ｎＬ、０．５ｎＬ〜３ｎＬ、１ｎＬ〜３ｎＬ、典型的に、１０ｐＬ、２０ｐＬ、３０ｐＬ、５０ｐＬ、０．１ｎＬ、０．５ｎＬ、１ｎＬ、１．２ｎＬ、１．４ｎＬ、１．６ｎＬ、１．８ｎＬ、２．０ｎＬ、２．２ｎＬ、２．４ｎＬ、２．６ｎＬ、２．８ｎＬ、３ｎＬの平均容量を有する。
一部の実施態様では、複数のマイクロ流体の液滴の、液滴は、１ｐＬ〜５０００ｐＬ、１０ｐＬ〜５０００ｐＬまたは１０ｐＬ〜３０００ｐＬの平均容量を有する。
一部の実施態様では、複数のマイクロ流体の液滴の、液滴は、１ｎＬと等しいまたはそれ未満の平均容量を有する。
したがって、「融合液滴」または「複数の融合液滴」は、１０ｎＬ未満の平均容量を有する。一部の実施態様では、前記複数の融合液滴は、９ｎＬ未満、８ｎＬ未満、７ｎＬ未満、６ｎＬ未満、５ｎＬ未満、４ｎＬ未満、３ｎＬ未満、２ｎＬ未満、１ｎＬ未満、０．５ｎＬ未満、例えば０．１ｎＬ〜１０ｎＬ、０．１ｎＬ〜８ｎＬ、０．１ｎＬ〜６ｎＬ、０．１ｎＬ〜５ｎＬ、例えば０．１ｎＬ〜３ｎＬ、０．５ｎＬ〜５ｎＬ、０．５ｎＬ〜３ｎＬ、１ｎＬ〜３ｎＬ、典型的に、０．１ｎＬ、０．５ｎＬ、１ｎＬ、１．２ｎＬ、１．４ｎＬ、１．６ｎＬ、１．８ｎＬ、２．０ｎＬ、２．２ｎＬ、２．４ｎＬ、２．６ｎＬ、２．８ｎＬ、３ｎＬ、４ｎＬまたは５ｎＬ、例えば１１ｐＬ〜８０００ｐＬの平均容量を有する。
一部の実施態様では、第一のタイプまたは第二のタイプ、好ましくは第一のタイプの複数の液滴は、注入チャネルの高さ（ｈｃｈａｎｎｅｌ）よりも小さな平均直径を有する。
一部の実施態様では、第一のタイプまたは第二のタイプ、好ましくは第一のタイプの複数の液滴は、注入チャネルの高さ（ｈｃｈａｎｎｅｌ）の３０％〜１００％、例えば、注入チャネルの高さ（ｈｃｈａｎｎｅｌ）の、６０％〜１００％、７０％〜１００％；８０％〜１００％、９０％〜１００％、９２％〜９８％、９４％〜９８％、例えば９５％である平均直径を有する。
当業者によって理解されるように、複数の液滴のうちの第一のタイプの少なくとも１つの液滴が、浮力によって、前記の複数のリザーバーの１つのリザーバーの中に移動する場合、特に、第一のタイプの複数の液滴は、上述した注入チャネルの高さ（ｈｃｈａｎｎｅｌ）の３０％〜１００％である平均直径を有する。
一部の実施態様では、第一のタイプまたは第二のタイプ、好ましくは第一のタイプの複数の液滴は、リザーバーの直径（ｄｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）の６０％〜９５％、例えば７０％〜９０％、７５％〜８５％、または７５％〜８０％、好ましくは７５〜８０％である平均直径を有する。
一部の実施態様では、第二のタイプの複数の液滴は、注入チャネルの高さ（ｈｃｈａｎｎｅｌ）よりも大きな平均直径、例えば、１００％〜２５０％、１２０％〜２５０％、１５０％〜２５０％、２００〜２５０、好ましくは２００％〜２５０％である平均直径を有する。
当業者によって理解されるように、移行ステップにおいて、第二のタイプの１つの液滴の少なくとも一部が、表面エネルギーの違いに起因して前記の複数のリザーバーの１つのリザーバーの中に入る場合、第二のタイプの複数の液滴は、本明細書において上述した注入チャネルの高さ（ｈｃｈａｎｎｅｌ）よりも大きな平均直径を有する。
一部の実施態様では、第二のタイプの複数の液滴は、第一のタイプの液滴よりも小さい、または同じ大きさの、平均直径を有する。
一部の好ましい実施態様では、第一のタイプまたは第二のタイプの複数の液滴、好ましくは第一のタイプの複数の液滴は、１ｐＬ〜５０００ｐＬ、典型的に１ｐＬ〜４０００ｐＬ、１ｐＬ〜３０００ｐＬ、例えば１ｐＬ〜５００ｐＬ、１ｐＬ〜４００ｐＬ、１ｐＬ〜３００ｐＬ、１ｐＬ〜２００ｐＬまたは１ｐＬ〜１００ｐＬ、好ましくは１ｐＬ〜１００ｐＬの平均容量を有する。
一部の実施態様では、第二のタイプの複数の液滴は、第一のタイプの複数の液滴の平均容量と等しい平均容量またはそれよりも高い平均容量を有する。
一部の好ましい実施態様では、第二のタイプの複数の液滴は、１０ｐＬ〜５０００ｐＬ、１０ｐＬ〜４０００ｐＬ、１０ｐＬ〜３０００ｐＬ、例えば１００ｐＬ〜４０００ｐＬ、１００ｐＬ〜３０００ｐＬ、１００ｐＬ〜２０００ｐＬまたは１００〜１０００ｐＬ、好ましくは、１００ｐＬ〜１０００ｐＬの平均容量を有する。
一部の実施態様では、第二のタイプの複数の液滴は、リザーバーの深さ（ｈｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）の１００％〜２５０％、例えば１５０％〜２５０％、１７０％〜２３０％、１８０％〜２２０％、１９０％〜２１０％、例えば、リザーバーの深さ（ｈｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）の２００％である平均直径を有する。
一部の実施態様では、第二のタイプの複数の液滴は、リザーバーの直径（ｄｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）の７０％〜１３０％、例えば、リザーバーの直径の８０％〜１２０％、９０％〜１２０％、１００％〜１２０％、９５％〜１１５％、９５％〜１１０％、好ましくは、リザーバーの直径（ｄｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）の１００〜１２０％である平均直径を有する。
一部の実施態様では、第二のタイプの液滴がリザーバーの中に部分的に入る場合、第二のタイプの複数の液滴は、リザーバーの直径（ｄｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）よりも大きな平均直径を有する。
本発明の文脈において、マイクロ流体の液滴または複数のマイクロ流体の液滴は、水性組成物を含む。
本発明の文脈における「水性組成物」は、単一細胞の液滴の場合、典型的に、用いられる細胞に適用されて、典型的に、本明細書において以下に定義されるように緩衝された溶液を含む。水性組成物は、ＲＴ液滴の場合、例えば逆転写酵素、逆転写組成物および／または溶解組成物をさらに含んでよい。
［液滴の調製］
本発明のプロセスの文脈において、一方のステップでは、第一のタイプの複数の液滴を含む担体流体が、別のステップでは、第二のタイプの複数の液滴を含む担体流体が、前記の少なくとも１つのマイクロ流体チャネル、好ましくは１つのマイクロ流体チャネルの、入口へ注入される。
第一のタイプの液滴は、単一細胞の液滴またはＲＴ液滴のいずれかであり、これらの液滴の特徴は、本明細書において以下のそれぞれ、セクション「単一細胞の液滴をバーコード化するためのマイクロ流体のプロセス」、「単一細胞」および「逆転写」においてさらに定義されて、ここで、第二のタイプの液滴は、第一のタイプの液滴が単一細胞の液滴である場合はＲＴ液滴であり、または、第二のタイプの液滴は、第一のタイプの液滴がＲＴ液滴である場合は単一細胞の液滴である。
当業者は、マイクロ流体の液滴を調製するための技術を知っている。マイクロ流体の液滴内に細胞をカプセル化する技術は、例えば米国特許番号７，７０８，９４９、８，３３７，７７８、８，７６５，４８５、または国際特許出願公開番号ＷＯ２００４／０９１７６３およびＷＯ２００６／０９６５７１、ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０８０３４１に記載されて、それぞれ参照により本明細書中に援用される。逆転写酵素および少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含むＲＴ液滴を調製する技術は、同一の開示、例えばＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０８０３４１から、当業者によって容易に得ることができる。
一例では、単一細胞の液滴またはＲＴ液滴は、別個のマイクロ流体デバイスにおいて、注入前に調製される。この例では、単一細胞の液滴またはＲＴ液滴は、典型的に、液滴担体油（担体流体）のための１つの入口、および、液滴水相の構成要素のためのさらなる入口を有するマイクロ流体デバイス内で調製される。担体油については、典型的に、例えば０．７５％（ｗ／ｗ）界面活性剤（２つのペルフルオロポリエーテルブロック（ＰＦＰＥ）および１つのポリ（エチレン）グリコール（ＰＥＧ）ブロックを含むＰＦＰＥ−ＰＥＧ−ＰＦＰＥトリブロック共重合体）を含むフッ素化油（例えばＨＦＥ−７５００）が典型的に用いられる。界面活性剤は典型的に、液滴が融合するのを防ぐために用いられて、量は、例えば、用いられる界面活性剤の物理化学的特性に基づいて調節されてよい。乳化に用いられる担体油は、フッ素化液体に制限されず、炭化水素に基づく流体のような代替の流体（例えば鉱油、ヘキサンなど）、シリコン油および他のタイプの油が成功的に用いられ得る。
単一細胞の液滴の調製に関して、液滴担体油のための１つの入口および、通常はもう１つの入口が、分離された細胞の懸濁液を送達するために用いられる。
ＲＴ液滴の調製に関して、一例では、液滴担体油のための１つの入口および、典型的に、２つのさらなる入口が用いられて、（１）逆転写酵素および（２）前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを送達する。
一部の実施態様では、ＲＴ液滴の調製に関して、例えば本発明のプロセスの文脈において、ＲＴ液滴は、さらなる成分、例えば、少なくとも１つのバーコード配列および少なくとも１つの色素を含む他の液滴と融合され得る。流れている液滴を融合する方法は、当業者に公知であり、例えばＷＯ２０１０１２８１５７Ａ１に記載される。
当業者によって理解されるように、例えば、単一細胞の液滴の場合、１つの液滴内にカプセル化される細胞の数および液滴のサイズは、ポアソンまたはガウス分布のような確率分布に従い、細胞の濃度、主なチャネルの形状、細胞懸濁液および担体流体の注入パラメーターに依存する。
したがって、パラメーターは、その中に１または０個の細胞を有する液滴を得るように適合され得て、したがって、数個の細胞を含む液滴を回避する。
したがって、本発明の文脈において、単一細胞の液滴の少なくとも一部は、１つの単一細胞を含む。
細胞は、本発明の文脈において核酸を含み、したがって、単一細胞を含む本発明の文脈における単一細胞の液滴は、したがって、単一細胞の核酸を含むことが、当業者によって理解される。
単一細胞の液滴の調製と同様に、ＲＴ液滴の場合、逆転写酵素および少なくとも１つのオリゴヌクレオチドのカプセル化もポアソンまたはガウス分布のような確率分布に従い、逆転写酵素の濃度、前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの濃度、主なチャネルの形状、逆転写酵素、前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドおよび担体流体の注入パラメーターに依存することが、当業者によって理解される。さらに、同様の実施態様では、ＲＴ液滴内に含まれる前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、第一のタイプの少なくとも１つの粒子に結合する。
したがって、１つの液滴内にカプセル化される第一のタイプの粒子の数も同様に、ポアソン分布のような確率分布に従い、粒子の濃度、主なチャネルの形状、粒子懸濁液および担体流体の注入パラメーターに依存する。
したがって、パラメーターは、その中に０、１または２個の粒子を有する液滴を得るように適合され得る。したがって、一部の実施態様では、ＲＴ液滴の少なくとも一部は、好ましくは、第一のタイプの１つの粒子を含む。
「担体流体」は、液滴の水溶液と非混和性である。
液滴の調製のために用いられる「担体流体」は、当業者に公知であり、通常はフッ素化油である。
したがって、一部の実施態様では、担体流体は、ＨＦＥ−７５００のようなフッ素化油である。
さらに、液滴が融合するのを防ぐために、担体流体は、界面活性剤をさらに含んでよい。
したがって、一部の実施態様では、担体流体は、界面活性剤をさらに含む。
界面活性剤は、界面活性剤の物理化学的特性に応じて、通常、０．１％〜１０％、例えば０．１％〜１％または１％〜１０％、２％で存在する。一例では、担体流体は、１．５％、１％または０．７５％（ｖ／ｖ）の界面活性剤、例えば、２つのペルフルオロポリエーテルブロック（ＰＦＰＥ）および１つのポリ（エチレン）グリコール（ＰＥＧ）ブロックを含むＰＦＰＥ−ＰＥＧ−ＰＦＰＥトリブロック共重合体を含む。
界面活性剤は、好ましくは、フッ素化流体中に非常に可溶性であり、水相中にほぼ不溶性である。
しかしながら、ＲＴおよび単一細胞の液滴は、後のステップにおいて融合されるので、液滴の調製のために用いられる界面活性剤の選択および濃度は、好ましくは、前記の液滴の融合を妨げない。
［単一細胞］
本明細書において、上記セクション「液滴の調製」において説明されるように、カプセル化条件（単一細胞の液滴を調製するための条件）は、単一細胞の液滴が０または１個の細胞を含む方法で好ましくは選択される。単一細胞を含む液滴のパーセンテージを増大するために、複数の単一細胞の液滴は、複数の単一細胞の液滴を注入するステップの前にスクリーニングおよびソートされる。
さらに、一部の実施態様では、前記の複数の単一細胞の液滴は、複数の単一細胞の液滴を注入する前に、目的の表現型に関してスクリーニングされてよい。
代替の実施態様によれば、前記の複数の単一細胞の液滴は、複数の単一細胞の液滴を注入した後に、第一および／または第二の目的の表現型に関してスクリーニングされてよい。
目的の表現型の例は、生物学的応答の検出である。これらのうち、免疫応答の検出は、抗原特異的抗体の分泌によって誘導されるＡＤＣＣ（抗体依存−細胞媒介細胞傷害性）（３）を検出することによって監視され得る（図１を参照）。
生物学的イベントのうち、免疫応答の検出は、抗原特異的抗体の分泌によって誘導される相補依存性細胞毒性（ＣＤＣ）（６）を検出することによって監視され得る（図２を参照）。
生物学的イベントのうち、薬物効果の検出は、抗原特異的抗体の分泌によって誘導されるＡＤＣ（抗体薬物コンジュゲート）を検出することによって監視され得る（図３を参照）。
生物学的イベントのうち、抗原特異的抗体の分泌によって誘導されるアゴニスト／アンタゴニスト抗体のような薬物機能の検出が含まれる（図４、５を参照）。
生物学的イベントのうち、競合アッセイの実施のような薬物機能の検出が含まれる（図６を参照）。
生物学的イベントのうち、抗体の分泌によって仲介されるレポーター細胞の細胞移動性の検出のような薬物機能の検出が含まれる（図６を参照）。そのようなアッセイは、前記液滴の内部のレポーター細胞の挙動の改変をトラックするために用いられ得る。目的の抗原を発現していて、放出されない検出可能なラベルがロードされた標的細胞（１）は、単一細胞の液滴として、ＩｇＧ産生細胞（２）および粒子と共カプセル化される。液滴は、抗体分泌を可能にする条件でインキュベートされる。分泌された特定の抗体は、標的細胞上に再局在する。その間に、リガンド／アゴニストは、ＩｇＧ生産と（ｔｈａｎ）同様の動力学で粒子から拡散して、リガンドの勾配を作り出す。レポーター細胞は、リガンド濃度の関数で粒子の内部に移行する（９）。ブロック抗体（３）の場合、レポーター細胞の進行は変化される。移行はその結果、抗体のブロック／中和活性を評価するために用いられ得る。
したがって、一部の実施態様では、単一細胞の液滴は、複数の単一細胞の液滴を注入する前にスクリーニングおよびソートされる。
マイクロ流体細胞ソーティング技術は当業者に公知であり、例えば、Ｗｙａｔｔ Ｓｃｈｉｅｌｄｓ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（Ｌａｂ Ｃｈｉｐ．２０１５ Ｆｅｂｒｕａｒｙ １６；１５（５）：１２３０−１２４９）に記載される。
マイクロ流体細胞ソーティング技術の例は、限定されないが、電気泳動、誘電泳動（ＤＥＰ）、電気浸透流、音響泳動（ａｃｏｕｓｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）、光マニピュレーション、機械システム、磁気泳動、電気運動的メカニズム、光ピンセットおよび受動型細胞ソーティングを含む。一部の方法は、これらの技術のいくつかを組み合わせてもよい。
受動型細胞ソーティングは、本明細書において、生来の違いに依拠する方法を指し、慣性力、流体力学的な伝播、決定論的な横変位、濾過、一過的な細胞の接着、および細胞の固定化を用いて細胞をソートする。
好ましい実施態様では、単一細胞の液滴は、複数の単一細胞の液滴を注入する前に、音響泳動を用いて、または誘電泳動によって、ソートされる。
一例では、好ましくは、音響泳動、特に、表面弾性波は、例えばＵＳ２０１３０２１３４８８Ａ１において説明されるように、選択された液滴を異なるソーティングビンの中に移動させるために用いられる。
さらに好ましい実施態様では、単一細胞の液滴は、例えば、ＷＯ２０１６０５９１８２に記載の方法を用いて、注入する前にソートされる。
当業者に公知であるように、これらの方法の一部（例えば、磁気泳動、音響泳動または電気運動的メカニズム）は、単一細胞の標識化を必要とする。しかしながら、ラベルのタイプは、ラベルが必要な場合、分析される細胞に依存する。例を提供すると、磁気泳動に関しては、例えば、細胞は磁性粒子によって標識されるが、例えば赤血球は、それらの天然の鉄含有量に基づいてソートされ得る。あるいは、一部の例では、一部のタイプの細胞は強磁性流体または常磁性溶液を用いて操作される。
ほとんどの実施態様では、単一細胞の液滴は、蛍光色素をさらに含む。
「蛍光色素」は、本明細書において、光励起の際に再発光することのできる蛍光物質を指す。
一部の実施態様では、例えば、細胞ソーティングの文脈において用いられる場合、蛍光色素は、細胞上または細胞内の標的特性を認識する抗体にコンジュゲートされて；色素は、細胞膜または別の細胞構造に関して親和性を有する化学物質に付着されてもよい。一部の実施態様では、蛍光色素は、細胞構造を認識する。
一部の実施態様では、蛍光色素は、制限されないが、反応性およびコンジュゲートされた色素、核酸色素、細胞機能色素、および蛍光タンパク質または蛍光ナノ粒子を含む。
「反応性およびコンジュゲートされた色素」は、限定されないが、キサンテン（例えばフルオレセイン）、ローダミン、クマリンおよびシアニン色素またはＡｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ色素のようなそれらの誘導体を含む。
「核色素（Ｎｕｃｌｅｉｃ ｄｙｅ）」は、限定されないが、Ｓｙｔｏｘ色素、ＤＲＡＱ７、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、および７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）を含む。
「アミン色素」は、細胞のタンパク質のアミン基に結合する。これらの色素は、細胞表面のタンパク質または死滅細胞の細胞内タンパク質に結合する。
「細胞機能色素」は、細胞の特定の代謝条件において蛍光になる色素であり、例えば、カルセインを含む。カルセインは、細胞内Ｃａ２＋に結合すると蛍光になる。
「蛍光タンパク質」は当業者に公知であり、限定されないが、ＧＦＰまたはＥＢＦＰを含む。
「蛍光ナノ粒子」は、限定されないが、例えば、ＰＡＮ粒子を含む。
当業者によって理解されるように、上述の一部のソーティング技術は、単一細胞の液滴内への粒子の導入を必要とする。
したがって、一部の実施態様では、単一細胞の液滴は、第二のタイプの少なくとも１つの粒子をさらに含む。
一部の実施態様では、前記の第二のタイプの少なくとも１つの粒子は、本明細書において、少なくとも１、少なくとも２ 少なくとも３、例えば１よりも多い、例えば１〜１０、１〜５、１〜３個の粒子を指す。
一部の実施態様では、第二のタイプの粒子は、蛍光である。
一部の実施態様では、前記の第二のタイプの粒子は、エラストマー粒子、ヒドロゲル粒子、ポリマー粒子または磁性粒子、好ましくはヒドロゲル粒子または磁性粒子からなる群より選択されて、ここで磁性粒子およびヒドロゲル粒子は、本明細書において以下のセクション「オリゴヌクレオチド」において定義される。
一部の実施態様では、磁性粒子は、常磁性粒子または超常磁性粒子である。
「エラストマー粒子」は、本明細書において、例えば、シリコーンエラストマー粒子を指す。
一部の実施態様では、第二のタイプの粒子は、タンパク質、核酸または小分子のような他の分子が付着することができるように官能化される。粒子を官能化する方法は当業者に公知である。
一部の実施態様では、第二のタイプの粒子は、抗体によって官能化される。第二のタイプの粒子は、本明細書において以下に、第一のタイプの粒子との関連でＲＴ液滴のセクションにおいて説明するように、例えば、ストレプトアビジン−ビオチンの結合を用いて、抗体によって官能化され得る。
一部の実施態様では、前記抗体は、単一細胞の構成要素に対して向けられる。
本発明の文脈における「細胞」は、生物学において用いられるように、その通常の意味が与えられて、例えば、細胞は、例えば単細胞生物に関しては生命の機能性非依存性単位として、または、植物および哺乳類のような多細胞生物においてはサブ単位として、存在し得る自律的自己複製単位を指し、全体として、特定の機能を生物の原因に向けて行なうように特殊化される。しかしながら、「細胞」は、有糸分裂の刺激が加えられた場合に細胞分裂が典型的にまだ可能である静止細胞をさらに指してよい。
一部の実施態様では、細胞は、原核生物細胞または真核生物細胞、好ましくは、真核生物細胞を指す。
原核生物細胞から「真核生物細胞」を区別するための定義する特徴は、遺伝物質を含み、核エンベロープによって囲まれた、膜結合型オルガネラ（特に核）を有することである。
本発明の文脈における「真核生物細胞」は、哺乳類細胞、植物細胞および真菌細胞からなる群より選択されて、好ましくは哺乳類の細胞である。
「哺乳類」は、本明細書において、ヒト、飼育動物および家畜、および、動物園、スポーツ、またはペットの動物、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどを含む、任意の哺乳類を指す。好ましくは、哺乳類はヒトである。
したがって、一部の実施態様では、細胞は、哺乳類細胞、改変された哺乳類細胞または細胞株または哺乳類免疫細胞である。
一部の実施態様では、哺乳類細胞は、免疫細胞である。
一部の実施態様では、免疫細胞は、制限されないが、Ｂ細胞、Ｔ細胞、またはハイブリドーマであってよく、好ましくはＢ細胞である。
一部の実施態様では、細胞または複数の細胞は、本明細書において、異なるタイプの細胞または異なる条件に曝された同一タイプまたは起源の細胞を指す。
１つの特定の実施態様では、細胞は、非哺乳類細胞である。
１つのさらなる特定の実施態様では、非哺乳類細胞は、酵母細胞、鳥類細胞またはサメ細胞である。
上述のように、単一細胞の液滴は通常、水性組成物を含み、前記水性組成物は、用いられる細胞に典型的に適合されて、本明細書において以下に定義される緩衝された溶液を典型的に含む。
当業者に公知であるように、細胞は核酸を含み、ここで核酸は、本明細書において上記に定義されるとおりである。
本発明のプロセスの文脈における細胞は、好ましくは生細胞である。死滅細胞から生きた細胞を分離する方法は当業者に公知である。
［細胞溶解］
当業者に公知であるように、単一細胞内に存在する核酸は、前記細胞が溶解したときに放出される。
本発明の文脈において用いられる「細胞溶解」は、酵素的、物理的、および／または化学的手段、またはそれらの任意の組み合わせ、特に、酵素的、物理的、および／または化学的手段によって達成され得る。他の細胞破壊の方法が用いられてもよい。後述する細胞溶解方法は、単一細胞の液滴または融合液滴のような液滴内に存在する場合に、または液滴を含まないリザーバー内に存在する場合に、細胞の溶解に適用する。
したがって、一部の実施態様では、単一細胞または細胞は、酵素的、物理的、および／または化学的細胞溶解を用いて、本発明のプロセスの文脈における溶解ステップにおいて溶解される。
細胞壁を除去するための「酵素的方法」は、当該分野において十分に確立されている。酵素は一般に市販されていて、ほとんどの場合、生物学的由来から元々は単離されたものである。一般的に用いられる酵素は、リゾチーム、リゾスタフィン、ジモラーゼ（ｚｙｍｏｌａｓｅ）、ムタノリシン、グリカナーゼ、プロテアーゼ、およびマンノースを含む。
当業者によって知られるように、「化学的細胞溶解」は、脂質−脂質、脂質−タンパク質およびタンパク質−タンパク質の相互作用を破壊することによって、細胞を取り囲んでいる脂質バリアを破壊する、洗浄剤のような化学物質を用いて達成される。細胞溶解のための理想的な洗浄剤は、細胞のタイプおよび由来に依存する。非イオン性および双性イオン性洗浄剤は、より穏やかな洗浄剤である。非イオン洗剤のトリトンＸシリーズおよび３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−ｌ−プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳ）、双性イオン性洗浄剤は、これらの目的のために一般に用いられる。対照的に、イオン性洗浄剤は強力な可溶化剤であり、タンパク質を変性させる傾向があり、それにより、タンパク質の活性および機能を破壊する。ＳＤＳは、タンパク質に結合して変性させるイオン性洗浄剤であり、細胞を破壊するために当該分野において広く用いられる。
「物理的細胞溶解」は、超音波処理、ヒートショック、アイスショックまたはエレクトロポレーションの使用を指す。
一例では、細胞は、コールドショックを用いて溶解される。これは、本発明のプロセスの文脈において、例えば、複数のリザーバーにおいて単一細胞を含むチップを冷却することによって達成される。
本明細書において以下に述べられるように、一部の実施態様では、ＲＴ液滴または複数のＲＴ液滴、融合液滴または複数の融合液滴、または複数のリザーバーは、溶解組成物を含む。
一部の実施態様では、溶解組成物は、リゾチーム、リゾスタフィン、ジモラーゼ、ムタノリシン、グリカナーゼ、プロテアーゼ、およびマンノースからなる群より選択される酵素を含む。
好ましい一実施態様では、本発明の文脈における溶解組成物は、塩化マグネシウム、洗浄剤、緩衝された溶液およびＲＮａｓｅ阻害剤を含む。
一部の実施態様では、洗浄剤は、トリトン−Ｘ−１００、ＮＰ−４０、ノニデットＰ４０、およびＴｗｅｅｎ−２０およびＩＧＥＰＡＬ ＣＡ ６３０からなる群より選択される。
緩衝された溶液の非限定的な例は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ、Ｐｉｐｅｓ−ＮａＯＨ、マレイン酸、リン酸、クエン酸、リンゴ酸、ギ酸、乳酸、コハク酸、酢酸、ピバル酸（トリメチル酢酸）、ピリジン、ピペラジン、ピコリン酸、Ｌ−ヒスチジン、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−トリス、ｂｉｓ−トリスプロパン、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＰＩＰＥＳ、イミダゾール、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＡ（トリエタノールアミン）、Ｎ−エチルモルホリニウム、ＰＯＰＳＯ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＰＳ、ＨＥＰＰＳＯ、トリス、トリシン、グリシルグリシン、ビシン、ＴＡＰＳ、モルホリン、Ｎ−メチルジエタノールアミン、ＡＭＰＤ（２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール）、ジエタノールアミン、ＡＭＰＳＯ、ホウ酸、ＣＨＥＳ、グリシン、ＣＡＰＳＯ、エタノールアミン、ＡＭＰ（２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール）、ピペラジン、ＣＡＰＳ、１，３−ジアミノプロパン、ＣＡＢＳ、またはピペリジンを含んでよい（ｗｗｗ．ｒｅａｃｈｄｅｖｉｃｅｓ．ｃｏｍ／Ｐｒｏｔｅｉｎ／ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｆｆｅｒｓ．ｈｔｍｌも参照）。ＲＮａｓｅ阻害剤の非限定的な例は、ＲＮａｓｅ ＯＵＴ、ＩＮ、ＳｕｐｅｒＩＮ Ｒｎａｓｅ、および、広範囲のＲＮＡｓｅを標的化する阻害剤（例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、１およびＴ１）を含んでよい。
本明細書において以下のセクション「単一細胞の核酸をバーコード化するためのマイクロ流体のプロセス」において述べられるように、化学的溶解は、液滴に適用される場合、典型的にＲＴ液滴と単一細胞の液滴を融合した後に生じる。一部の実施態様では、細胞溶解は、好ましくは表現型アッセイを行なった後に、例えば、目的の表現型を有する単一細胞を遺伝子型決定するためのプロセスのステップｂ）の後に生じる。
当業者によって理解されるように、逆転写酵素および逆転写酵素組成物および溶解組成物のような構成要素は、さらなる構成要素が添加されると希釈されて、例えば、溶解組成物は、一例では、ＲＴおよび単一細胞の液滴が融合されると、希釈される。
したがって、溶解組成物の成分に関して与えられる濃度は、好ましくは、例えば液滴融合後の最終濃度として与えられる。したがって、当業者は、リザーバー、またはＲＴ液滴内に存在する最初の濃度を適合させることを理解している。
一部の実施態様では、塩化マグネシウムの濃度は、１ｍＭ〜２０ｍＭである。
一部の実施態様では、洗浄剤の濃度は、０．１％〜１０％である。
一例では、溶解組成物は、典型的に０．２％トリトン、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）である。
［逆転写（ＲＴ）］
本発明のプロセスの文脈における１つのステップにおいて、複数のＲＴ液滴が注入されて、ここでＲＴ液滴の少なくとも一部は、逆転写酵素（ＲＴ）および少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む。
目的の表現型を有する単一細胞を遺伝子型決定するためのマイクロ流体のプロセスの文脈において、逆転写酵素（ＲＴ）および少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、複数のリザーバーのそれぞれのリザーバー内に提供される。
「逆転写酵素（ＲＴ）」は、逆転写と呼ばれるプロセスにおいて、核酸テンプレート、特にＲＮＡテンプレートから、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生産するために用いられる酵素である。
一部の実施態様では、逆転写酵素は、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｉ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＩＩ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＩＩＩ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＩＶ、Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ ＲＴ、ＳｍａｒｔＳｃｒｉｂｅ ＲＴまたはＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ ＲＴからなる群より選択される。
一部の実施態様では、逆転写酵素は、テンプレートスイッチ活性を有する。
テンプレートスイッチ活性は、ユニバーサル配列によってｃＤＮＡを独特に標識化することを可能にする。テンプレートスイッチ活性を用いることは、前記のユニバーサル配列によってその５’末端が独特に標識化されたｃＤＮＡをもたらす。ユニバーサル配列は、本明細書において、５’Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄ（ＲＡＣＥ）のために典型的に用いられる配列を指す。どのようにして５’ＲＡＣＥを行なうか、および、どのユニバーサル配列が用いられ得るか、当業者は一般に知っている。
本発明のプロセスの文脈において、逆転写は、第一のタイプの少なくとも１つの液滴を第二のタイプの少なくとも１つの液滴と融合した後に、または任意選択で、目的の表現型を有する単一細胞を遺伝子型決定するプロセスのステップｃ）の後に液滴を伴わずにプロセスが行なわれた場合に生じる。
したがって、本明細書において溶解組成物の文脈において上述したように、逆転写酵素のような成分は、溶解組成物、逆転写酵素または逆転写組成物のような異なる成分が混合されると希釈されることが、当業者によって理解される。したがって、本明細書において以下に任意の成分に関して与えられる濃度は、好ましくは、例えば液滴融合後に存在する最終濃度として与えられる。
一部の実施態様では、逆転写酵素の濃度は、１〜５０Ｕ／μｌ、好ましくは５〜２５Ｕ／μｌ、例えば１２．５Ｕ／μｌである。
「逆転写」または「ＲＴ反応」は、全細胞のＲＮＡまたはポリ（Ａ）ＲＮＡ、逆転写酵素、プライマー、ｄＮＴＰおよびＲＮａｓｅ阻害剤を用いることによって、一本鎖ＲＮＡが一本鎖相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写されるプロセスである。逆転写の産物は、そのテンプレートＲＮＡにハイブリダイズした一本鎖ｃＤＮＡを含むＲＮＡ／ＤＮＡデュプレックスであることが、当業者によって理解される。さらに理解されるように、前記ＲＮＡ／ＤＮＡデュプレックスは、逆転写に用いられるプライマー配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドにさらに結合される。
したがって、例えば、単一細胞の核酸をバーコード化するためのマイクロ流体のプロセスのステップｂ）において、核酸を逆転写することは、単一細胞のｃＤＮＡをもたらすことが、当業者によって理解される。
したがって、一部の実施態様では、融合液滴の少なくとも一部は、単一細胞溶解物由来の核酸の逆転写によって生産された単一細胞ｃＤＮＡをさらに含む。
したがって、一部の実施態様では、液滴が用いられない場合、リザーバーは、単一細胞溶解物由来の核酸の逆転写によって生産された単一細胞ｃＤＮＡをさらに含む。
一部の実施態様では、前記ｃＤＮＡは、一本鎖相補ＤＮＡを指す。
さらなる実施態様では、前記ｃＤＮＡは、ＲＮＡ／ＤＮＡデュプレックスで含まれる。
一部の実施態様では、ＲＮＡ／ＤＮＡデュプレックスは、逆転写されていて、合成されたｃＤＮＡおよび／または少なくとも１つのオリゴヌクレオチドのプライマー配列に部分的または全長にわたって、まだなおハイブリダイズするＲＮＡを指す。
当業者によって理解されるように、一部の実施態様では、ＲＮＡ／ＤＮＡデュプレックスは、ハイブリダイゼーションステップ、例えばステップａ）において、核酸（好ましくはｍＲＮＡ）がハイブリダイズされて、逆転写ステップ、例えばステップｂ）において、逆転写に用いられた、プライマー配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに結合される。
当業者によって理解されるように、一部の実施態様では、前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドおよびしたがってＲＮＡ／ＤＮＡデュプレックスは、第一のタイプの粒子に結合される。
一部の実施態様では、複数のリザーバー、ＲＴ液滴または複数のＲＴ液滴または融合液滴または複数の融合液滴は、逆転写酵素組成物を含む。
一部の実施態様では、逆転写酵素組成物は、プロテアーゼ阻害剤、ｄＮＴＰおよび／またはＤＴＴ、好ましくはプロテアーゼ阻害剤、ｄＮＴＰおよびＤＴＴを含む。
一部の実施態様では、プロテアーゼ阻害剤は、複数のプロテアーゼ阻害剤を含む。
一部の実施態様では、プロテアーゼ阻害剤は、ロイペプチンヘミ硫酸塩、ペプスタチンＡ、ＡＥＢＳＦ、アプロチニン、ベスタチン塩酸塩、Ｅ−６４およびＰＭＳＦからなるリストより選択される。
例えば、プロテアーゼ阻害剤は、ロイペプチンヘミ硫酸塩、ペプスタチンＡ、ＡＥＢＳＦ、アプロチニン、ベスタチン塩酸塩、Ｅ−６４およびＰＭＳＦの１つまたは複数を含んでよい。
本明細書において用いられる用語「ｄＮＴＰ」は、デオキシヌクレオシド三リン酸、例えばデオキシアデノシン−５’−三リン酸（ｄＡＴＰ、「Ａ」）、デオキシシチジン−５’−三リン酸（ｄＣＴＰ、「Ｃ」）、デオキシグアノシン−５’−三リン酸（ｄＧＴＰ、「Ｇ」）、デオキシチミジン−５’−三リン酸（ｄＴＴＰ、「Ｔ」）またはデオキシウリジン−５’−三リン酸（ｄＵＴＰ、「Ｕ」）を指す。用語「ｄＮＴＰ」は、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、またはＵの塩基対合を模倣することのできる、または、縮重モードで塩基対合することのできる、改変塩基および塩基類似体、例えば、ＡまたはＧ、ＣまたはＴ、ＡまたはＣ、ＧまたはＴ、ＧまたはＣ、またはＡまたはＴと対になる塩基（ヌクレオチド類似体と呼ばれる）を含むデオキシヌクレオシド三リン酸も指すことが意図される。前記ヌクレオチド類似体は、本明細書において以下にさらに説明されるように、例えば精製のために用いられ得る。
逆転写酵素組成物の成分に関して与えられる濃度は、好ましくは、例えば、液滴融合後の融合液滴内に存在する最終濃度として与えられることを、当業者は理解する。
一部の実施態様では、ＤＴＴの濃度は、１ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは５ｍＭである。
一部の実施態様では、ｄＮＴＰの濃度は、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは０．１〜１ｍＭ、より好ましくは０．５ｍＭである。
一部の実施態様では、逆転写酵素組成物は、ＲＮａｓｅ阻害剤をさらに含む。ＲＮａｓｅ阻害剤は、本明細書において上記のセクション「細胞溶解」において定義される。
［オリゴヌクレオチド］
用語「オリゴヌクレオチド」は、本明細書において上記に定義されるとおりである。
本発明のマイクロ流体のプロセスの文脈における「少なくとも１つのオリゴヌクレオチド」は、プライマー配列を含む。
「プライマー配列」は、典型的に、目的の核酸と完全にまたはほぼ完全に一致するように設計された１０〜５０ヌクレオチドの長さの短い一本鎖核酸であり、捕捉されて、それから、典型的にＰＣＲによって増幅または典型的にＲＴによって逆転写される。プライマー配列は、それらがハイブリダイズする、すなわち、好ましくはストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下、より好ましくは高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でそれらがハイブリダイズする核酸に「特異的」であり、または、それらがハイブリダイズする核酸（標的配列とも呼ばれる）に相補またはほぼ相補である。
「ストリンジェント条件」または「高ストリンジェンシー条件」は、本明細書において上記に定義されるとおりである。
典型的に、プライマー配列は、核酸合成に関する開始点としての役割を果たし、核酸ポリメラーゼのようなポリメラーゼ酵素がプライマー配列を伸長させて相補鎖を複製するのを可能にする。プライマー配列は、標的核酸に相補であってよく、それにハイブリダイズしてよい。一部の実施態様では、プライマー配列は、合成のプライマー配列である。
一部の実施態様では、プライマー配列は、非天然起源のプライマー配列である。プライマー配列は典型的に、１０〜５０個のヌクレオチドの長さを有する。例えば、プライマー配列は、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２０、２５〜５０、１５〜４０、１５〜３０、２０〜５０、２０〜４０、または２０〜３０個のヌクレオチドの長さを有してよい。一部の実施態様では、プライマー配列は、１８〜２４個のヌクレオチドの長さを有する。
一部の実施態様では、プライマー配列は、ポリＴ配列、ランダムＤＮＡ配列、および遺伝子特異的配列からなる群より選択される。
本明細書において言及される「ポリＴ配列」は、１０〜５０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２０、２５〜５０、１５〜４０、１５〜３０、２０〜５０、２０〜４０、または２０〜３０個のチミン「Ｔ」を含む配列である。ポリＴ配列は、ｍＲＮＡ内に存在するポリＡテールとハイブリダイズする。
一部の実施態様では、ランダムＤＮＡ配列は、６〜５０、６〜５０、６〜４０、６〜３０、６〜２０、１０〜５０、１０〜４０、２５〜５０、１５〜４０、１５〜３０、２０〜５０、２０〜４０、または２０〜３０個のヌクレオチドのような、任意の適切な長さであってよい。
特定の一実施態様では、プライマー配列は、遺伝子特異的配列であり、遺伝子は、抗体重鎖可変遺伝子、抗体重鎖定常遺伝子、抗体軽鎖可変遺伝子、抗体軽鎖定常遺伝子、αＴ細胞受容体遺伝子（可変または定常）、βＴ細胞受容体遺伝子（可変または定常）、δＴ細胞受容体遺伝子（可変または定常）、または、トランスクリプトーム分析に関するパネルのために選択される遺伝子からなる群より選択される。
表現「抗体重鎖可変遺伝子」、「抗体重鎖定常遺伝子」、「抗体軽鎖可変遺伝子」および「抗体軽鎖定常遺伝子」における用語「抗体」は、本明細書において上記に定義されるとおりである。
表現「αＴ細胞受容体遺伝子」、「βＴ細胞受容体遺伝子」および「δＴ細胞受容体遺伝子」または「γＴ細胞受容体遺伝子」における用語「Ｔ細胞受容体」は、本明細書において上記に定義されるとおりである。
単語「遺伝子」は、本明細書において上記に定義されるとおりである。
複数のリザーバーのそれぞれのリザーバー内または１つのＲＴ液滴内に存在する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの数は、１つの単一細胞から転写およびバーコード化される、異なる核酸の数、特に、ＲＮＡの数に適合することを、当業者は理解している。
したがって、表現「少なくとも１つのオリゴヌクレオチド」における「少なくとも１つ」は、１つの液滴またはリザーバー内に存在する異なるオリゴヌクレオチドの数を指し、ここで、前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの１つのオリゴヌクレオチドは、そのプライマー配列が別のオリゴヌクレオチドとは異なる。
一部の実施態様では、表現「少なくとも１つのオリゴヌクレオチド」における「少なくとも１つ」は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９少なくとも１０個のオリゴヌクレオチドを指す。一部の実施態様では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、１〜１００個のオリゴヌクレオチド、１〜８０、１〜６０、１〜４０、１〜３０、１〜２０、１〜１０、好ましくは、１、２、３、４、５、６、７、８、９個のオリゴヌクレオチドを指す。
「少なくとも１つのオリゴヌクレオチド」は、したがって、ＲＴ液滴内またはそれぞれのリザーバー内に特定の濃度で存在する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを指し、したがって、前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチド由来の１つのオリゴヌクレオチドは、その結果、同一配列の複数のオリゴヌクレオチドを指すことが理解される。
例えば、細胞のトランスクリプトームが転写およびバーコード化される場合は、本明細書において以下にさらに定義されるように、ポリＴプライマー配列のような全てのｍＲＮＡに特異的なプライマー配列を有するオリゴヌクレオチドが用いられて、一方で、遺伝子特異的トランスクリプトームが転写およびバーコード化される場合は、本明細書において以下にさらに定義されるように、遺伝子特異的プライマー配列を含むオリゴヌクレオチドが用いられることが、当業者によってさらに理解される。
オリゴヌクレオチドの数は、トランスクリプトームが転写およびバーコード化される特異的遺伝子の少なくとも数に対応することが理解される。
特定の一実施態様では、前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドであり、前記の少なくとも２つのオリゴヌクレオチドの一方は、抗体重鎖可変遺伝子のような一方の遺伝子に特異的なプライマー配列を含み、他方のオリゴヌクレオチドは、抗体軽鎖可変遺伝子のような別の遺伝子に特異的なプライマー配列を含む。
別の特定の実施態様では、前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドであり、前記の少なくとも２つのオリゴヌクレオチドの一方は、例えば、αＴ細胞受容体遺伝子またはβＴ細胞受容体遺伝子またはγＴ細胞受容体に特異的なプライマー配列を含み、前記の少なくとも２つのオリゴヌクレオチドの他方は、例えば、δＴ細胞受容体遺伝子に特異的なプライマー配列を含む。
別の特定の実施態様では、前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、少なくとも３つのオリゴヌクレオチドであり、前記の少なくとも３つのオリゴヌクレオチドの１番目は、例えば、αＴ細胞受容体遺伝子に特異的なプライマー配列を含み、前記の少なくとも３つのオリゴヌクレオチドの２番目は、例えば、βＴ細胞受容体遺伝子に特異的なプライマー配列を含み、前記の少なくとも３つのオリゴヌクレオチドの３番目は、例えば、ポリＡｍＲＮＡに特異的なプライマー配列を含む。
「トランスクリプトーム」は一般に、１つの細胞または細胞集団内の全てのメッセンジャーＲＮＡ分子のセットを指す。したがって、「細胞のトランスクリプトーム」または「単一細胞のトランスクリプトーム」は、本明細書において、１つの細胞内の全てのメッセンジャーＲＮＡ分子のセットを指す。
当業者によって理解されるように、遺伝子特異的トランスクリプトームは、したがって、１つの遺伝子から得られる全てのメッセンジャーＲＮＡ分子のセットを指す。
当業者によって知られるように、異なる遺伝子産物（いわゆるアイソフォーム）は、１つの遺伝子によってコードされてよい。したがって、遺伝子特異的トランスクリプトームは、１つの特異的遺伝子の少なくとも１つの特異的アイソフォームのメッセンジャーＲＮＡ分子、例えば、１つの特異的遺伝子の１、２、３、４またはより多くの特異的アイソフォームのメッセンジャーＲＮＡ分子、または、１つの特異的遺伝子の全てのアイソフォームのメッセンジャーＲＮＡ分子をさらに指してよい。
したがって、一部の実施態様では、本発明の文脈における単一細胞の核酸はＲＮＡであり、ここでＲＮＡは、本明細書において上記に定義されるとおりである。
さらなる実施態様では、ｍＲＮＡは、ポリＡ配列（ポリＡテールとも呼ばれる）を含む。
さらに、一部の特定の実施態様では、本発明の文脈における「核酸の少なくとも一部」は、少なくとも１つの核酸、好ましくは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５個の核酸またはそれよりも多くを指す。ある特定では、ステップａ）およびｂ）の核酸は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の核酸を指す。
本発明のプロセスは、単一細胞の全ての核酸までの１つの特異的核酸から逆転写するために用いられ得る。
したがって、さらなる実施態様では、本明細書の文脈における「核酸の少なくとも一部」は、１〜１０００００個の核酸、例えば１〜８００００、１〜６００００、１〜４００００、例えば１、１０００、２０００、４０００、６０００、８０００、１００００、１２０００、１４０００、１６０００、２００００、２５０００、３００００、４５０００、５００００個の核酸を指す。したがって、一部の実施態様では、本明細書における核酸は、全ての遺伝子のＲＮＡを指す。
上述のように、本発明のプロセスは、遺伝子特異的トランスクリプトームのレトロ転写（ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｃｒｉｂｉｎｇ）も指す。
したがって、一部の実施態様では、本明細書における核酸は、少なくとも１つの特異的遺伝子のＲＮＡを指す。
前記の少なくとも１つの特異的遺伝子は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、例えば１〜１０、１〜５個の遺伝子、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の遺伝子であってよい。
一部の実施態様では、前記の少なくとも１つの特異的遺伝子は、抗体重鎖可変遺伝子、抗体重鎖定常遺伝子、抗体軽鎖可変遺伝子、抗体軽鎖定常遺伝子、αＴ細胞受容体遺伝子、βＴ細胞受容体遺伝子、およびδＴ細胞受容体遺伝子およびγＴ細胞受容体遺伝子からなる群より選択される。
一部の実施態様では、特異的遺伝子は、細胞表現型の情報をさらに得るように、および、遺伝子発現に基づいて細胞を分類するように選択されてもよい。
一部の実施態様では、前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、プロモーターおよび／またはスペーサー配列をさらに含む。
プロモーターおよび／またはスペーサー配列は、好ましくは５’末端に向かって位置して、または、プライマー配列の５’末端に位置する。プロモーター配列の例は、限定されないが、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、またはＳＰ６プロモーターを含む。
一部の実施態様では、オリゴヌクレオチドは、バーコード配列をさらに含む。
したがって、一部の実施態様では、オリゴヌクレオチドは、５’から３’に、バーコード配列およびプライマー配列を含む。
本明細書における「バーコード配列」（または単に「バーコード」と呼ばれる）は、その配列によって別の核酸配列から区別され得る独特の核酸配列を指し、したがって、別のバーコード配列を保有している別の核酸から区別することができるように核酸配列を独特に標識することを可能にする。
一部の実施態様では、バーコード配列は、例えば、核酸が一緒にプールされた後でさえ、他の細胞から放出された核酸から、単一細胞によって放出された核酸を独特に同定する。
一部の実施態様では、バーコード配列は、例えば、異なる細胞または他の由来から生じる、何十、何百、または実に何千もの核酸を区別するために用いられる。
一部の実施態様では、バーコード配列は任意の適切な長さである。バーコード配列は、好ましくは、バーコード配列を他のバーコード配列から区別するのに十分な長さである。一部の実施態様では、バーコード配列は、１〜５、１〜１０、５〜１５、または１５個よりも多いヌクレオチド、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８５、９０またはそれよりも多くのヌクレオチド、例えば５０〜８５、６０〜８０、７０〜８０個のヌクレオチドの長さを有する。
一部の実施態様では、バーコード配列は、１よりも多いバーコード配列からなり、したがって、「少なくとも１つのバーコード配列」と呼ばれてよい。
関連する実施態様では、異なるバーコード配列は、潜在的バーコード配列の「プール」から得てよく、それら自体、ｓｐｌｉｔ ａｎｄ ｐｏｌｌ合成によって典型的に生産されたものである。バーコード配列が１よりも多いバーコード配列からなる場合、バーコード配列は、潜在的バーコード配列の同一または異なるプールから得てよい。配列のプールは、例えば、ランダムに、または、例えば、バーコード配列を解読する際のエラーが検出され得て場合によっては修正され得るように特定の距離（例えば、Ｈａｍｍｉｎｇ距離）で分離されることにより、配列がエラーの検出および／または修正を可能にするように、任意の適切な技術を用いて選択されてよい。プールは、任意の数の潜在的バーコード配列、例えば、少なくとも１００、少なくとも３００、少なくとも５００、少なくとも１，０００、少なくとも３，０００、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも３０，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも３００，０００、少なくとも５００，０００、または少なくとも１，０００，０００個のバーコード配列を有してよい。
１つの「プール」または１よりも多いプールから得られた異なるバーコード配列を結合するための方法は、当業者に公知であり、限定されないが、リガーゼの使用および／またはアニーリングまたはプライマー伸長方法の使用を含む。
リガーゼの非限定的な例は、ＤＮＡリガーゼＩ、ＤＮＡリガーゼＩＩ、ＤＮＡリガーゼＩＩＩ、ＤＮＡリガーゼＩＶ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３ ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼなどのようなＤＮＡリガーゼを含む。多くのそのようなリガーゼは、商業的に購入され得る。
一部の実施態様では、バーコード配列は、二本鎖または一本鎖核酸である。
一部の実施態様では、オリゴヌクレオチドは、ｕｎｉｑｕｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ（ＵＭＩ）をさらに含む。ＵＭＩは、バーコード配列の３’末端または５’末端に位置する。
「Ｕｎｉｑｕｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ」（ＵＭＩ）配列は、当業者によく知られていて、例えば、Ｋｉｖｉｏｊａ ｅｔ ａｌ（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄ，２０１２，ｖｏｌ９，Ｎ°１）に記載される。ＵＭＩ配列は、重複した解読の生物情報学の除去を可能にする。
一部の実施態様では、前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、はじめに、前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを第一のタイプの少なくとも１つの粒子に結合することによって、リザーバーまたは液滴、特にＲＴ液滴内に導入される。
前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを一時的に粒子に結合することは、大量のオリゴヌクレオチドを有する粒子を提供することを可能にすることが、当業者によって理解される。さらに、前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを、はじめに粒子に結合することは、特に液滴が用いられる場合、それぞれの液滴、例えばＲＴ液滴への前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの導入を促進する。
したがって、一部の実施態様では、リザーバーまたはＲＴ液滴は、前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが結合する第一のタイプの少なくとも１つの粒子をさらに含む。
本明細書における第一のタイプの少なくとも１つの粒子は、第一のタイプの少なくとも１、２、３、４、５またはそれよりも多くの粒子、好ましくは第一のタイプの１つの粒子を指す。
当業者によって理解されて、本明細書において上記に説明されるように、１つのＲＴ液滴内にカプセル化される第一のタイプの粒子の数および液滴のサイズは、ポアソン分布のような確率分布に従い、第一のタイプの粒子の濃度、逆転写組成物または溶解組成物のような水性組成物の注入パラメーター、主なチャネルの形状、第一のタイプの粒子および担体流体の注入パラメーターに依存する。
したがって、一部の実施態様では、パラメーターは、第一のタイプの２、１または０個の粒子をその中に有するＲＴ液滴を得るように適合され得て、したがって、第一のタイプの２個よりも多い粒子を含む液滴を回避する。
関連する実施態様では、パラメーターは、第一のタイプの１または０個の粒子をその中に有するＲＴ液滴を得るように適合され得て、したがって、第一のタイプの１個よりも多い粒子を含む液滴を回避する。
一部の実施態様では、第一のタイプの少なくとも１つの粒子は、第一のタイプの約２個以内の粒子／液滴でＲＴ液滴内にカプセル化されて、好ましくは、さらなる実施態様では、第一のタイプの少なくとも１つの粒子は、約１個以内の粒子／液滴で液滴内にカプセル化されて、または、第一のタイプの少なくとも１つの粒子は、優先的に１粒子／液滴で液滴内にカプセル化されて、または、第一のタイプの少なくとも１つの粒子は、平均して１粒子／液滴で液滴内にカプセル化される。
同様に、液滴が用いられない場合、一部の実施態様では、それぞれのリザーバーは、好ましくは、第一のタイプの約２個以内の粒子／リザーバー、好ましくは、約１個以内の粒子／リザーバー、または１粒子／リザーバー、または平均して１粒子／リザーバーを含む。
第一のタイプの粒子または第二のタイプの粒子のような「粒子」は、本発明の文脈において、微粒子を指す。
一部の実施態様では、粒子は、ヒドロゲル粒子、ポリマー粒子または磁性粒子である。
粒子は、不規則または規則的な形状を有してよい。例えば、粒子は、球状、楕円体、または立方体であってよい。
一部の実施態様では、本発明の文脈における粒子は、ヒドロゲル粒子である。
「ヒドロゲル粒子」は、例えば、国際特許出願番号ＷＯ２００８／１０９１７６、表題「Ａｓｓａｙ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ ｄｒｏｐｌｅｔｓ」に記載される。ヒドロゲルの例は、限定されないが、アガロース、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート、またはアクリルアミド系のゲル、例えば、ビス−アクリルアミド、ポリアクリルアミド、ストレプトアビジンアクリルアミド、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、またはポリＮ−イソプロピルポリアクリルアミドまたはそれらの混合物を含む。一例では、ヒドロゲル粒子は、アクリルアミド、ビス−アクリルアミドおよびストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｔｖｉｄｉｎｅ）アクリルアミドを含む。
別の実施態様のセットでは、粒子は、１つまたは複数のポリマーを含み、したがって、本明細書において「ポリマー粒子」と呼ばれる。例示的なポリマーは、限定されないが、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリイソプレン（ＰＩＰ）、ポリ（乳酸）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリロニトリル、ポリイミド、ポリアミド、および／または、これらおよび／または他のポリマーの混合物および／またはコポリマーを含む。
加えて、一部の実施態様では、粒子は磁性であり、したがって「磁性粒子」と呼ばれて、粒子の磁性操作を可能にし得る。
例えば、磁性粒子は、鉄または他の磁性材料を含んでよい。
粒子、特に第一のタイプまたは第二のタイプの粒子は、タンパク質、核酸または小分子のような他の分子が付着することができるように官能化されてもよい。したがって、本発明の一部の実施態様は、例えば、核酸、タンパク質、小分子、または本明細書に記載されるもののような他の種のライブラリーを定義する粒子のセットに関する。一例では、前記粒子は、抗体によって官能化される。一部の実施態様では、前記抗体は、細胞の構成要素に対して向けられる。
一部の実施態様では、粒子、特に第一のタイプの粒子は、蛍光である。
一部の実施態様では、粒子は、ストレプトアビジンを含む。ストレプトアビジンは、本明細書において上記に定義した粒子の表面に連結され得る。
一部の実施態様では、第一または第二のタイプの粒子は、０，１ｐＬ〜１００ｐＬ、例えば０，１ｐＬ〜５００ｐＬ、０，１ｐＬ〜４００ｐＬ、０，１ｐＬ〜４００ｐＬ、０，１ｐＬ〜３００ｐＬ、例えば０，５ｐＬ〜３００ｐＬ、０，５ｐＬ〜２５０ｐＬ、０，５ｐＬ〜２００ｐＬ、１ｐＬ〜２５０ｐＬ、１ｐＬ〜２００ｐＬ、好ましくは１ｐＬ〜２００ｐＬ．、典型的に１００ｐＬ〜２００ｐＬ、例えば１５０ｐＬのサイズを有する。
一部の実施態様では、前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、第一のタイプの少なくとも１つの粒子に共有結合または非共有結合されて、第一のタイプの少なくとも１つの粒子は、本明細書において上記に定義される。
「非共有結合」は、本明細書において、例えば、ストレプトアビジン−ビオチン結合を指す。他の非共有結合は当業者に公知であり、例えば、アビジンビオチン結合またはヒスタグおよびニッケル結合である。
「共有結合」は、本明細書において、例えばアミノ結合またはアクリルホスホラミダイト結合を指す。
「ストレプトアビジン」は一般に、細菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｎｉｉから精製された５２．８ｋＤａタンパク質を指す。ストレプトアビジンホモ−四量体は、約１０−１４ｍｏｌ／Ｌの解離定数（Ｋｄ）でビオチンに関して異常に高い親和性を有し、ストレプトアビジンに対するビオチンの結合は、天然に知られる最も強力な非共有相互作用の１つである。
好ましい実施態様では、非共有結合は、ストレプトアビジン−ビオチン結合である。
ストレプトアビジン−ビオチン結合は、当業者に公知である。
したがって、一部の実施態様では、第一のタイプの粒子は、例えば、ストレプトアビジンを含み、同一の実施態様において、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、ビオチンを含む。換言すれば、少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドは、ビオチンによって官能化される。
少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドを第一のタイプの粒子に結合するために用いられる結合のタイプとは独立に、少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのリンカー配列をさらに含んでよい。
したがって、さらなる実施態様では、「少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチド」または単に「オリゴヌクレオチド」は、少なくとも１つのリンカー配列をさらに含み、前記リンカー配列は、好ましくは５’末端付近に含まれる。
場合によっては、オリゴヌクレオチドは、上述のプライマー配列に対して、シーケンシングのための１つまたは複数のプライマー配列をさらに含んでよい。シーケンシングのためのそのようなプライマー配列の例は、限定されないが、Ｐ５プライマー、Ｐ７プライマー、ＰＥ１プライマー、ＰＥ２プライマー、Ａ１９プライマー、または本明細書において議論される他のプライマーを含む。
したがって、一部の実施態様では、少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドは、５’から３’に、任意選択でリンカー配列、任意選択でプロモーター配列、任意選択でシーケンシングのためのプライマー配列、任意選択でバーコード配列、任意選択でＵＭＩおよびプライマー配列を含んでよい。
一部の実施態様では、したがって、前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、５’末端を介して第一のタイプの粒子に結合されることが、当業者によって理解される。
しかしながら、一部の代替の実施態様では、前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、３’末端を介して第一のタイプの粒子に結合されてよい。
一部の実施態様では、「リンカー配列」は、それによって、前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが第一のタイプの粒子に任意選択で結合される配列である。
「本明細書において、任意選択で結合される」は、粒子に結合された前記の少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドがＲＴ液滴または複数のＲＴ液滴またはリザーバー内にロードされた時点で、ＲＴ液滴または融合液滴またはリザーバーが第一のタイプの粒子および前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含み、前記の少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドが前記の第一のタイプの粒子に結合されないように、前記の少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドが放出される可能性を指す。
好ましくは、リンカー配列は、例えば、酵素および／または光切断のような適切な刺激の適用の際に切断され得る切断可能なリンカー配列である。
「切断可能なリンカー」は、限定されないが、ＴＥＶ、トリプシン、トロンビン、カテプシンＢ、カテプシン（ｃａｔｈｅｓｐｉｎ）Ｄ、カテプシンＫ、カスパーゼｌｕｍａｔｒｉｘメタロプロテイナーゼ配列、ホスホジエステル、リン脂質、エステル、−ガラクトース、ジアルキルジアルコキシシラン、シアノエチル基、スルホン、エチレングリコリルジコハク酸、２−Ｎ−アシルニトロベンゼンスルホンアミド、ａ−チオフェニルエステル、不飽和ビニルスルフィド、活性化後のスルホンアミド、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）−インドール誘導体、レブリノイルエステル、ヒドラゾン、アシルヒドラゾン、アルキルチオエステル、ジスルフィド架橋、アゾ化合物、２−ニトロベンジル誘導体、フェナシルエステル、８−キノリニルベンゼンスルホン酸、クマリン、ホスホトリエステル、ビス−アリールヒドラゾン、ビマン ビ−チオプロピオン酸誘導体、パラメトキシベンジル誘導体、ｔｅｒｔ−ブチルカルバメート類似体、ジアルキルまたはジアリールジアルコキシシラン、オルトエステル、アセタール、アコニチル、ヒドラゾン、ｂ¬チオプロピオネート、ホスホロアミデート、イミン、トリチル、ビニルエーテル、ポリケタル、アルキル２−（ジフェニルホスフィノ）ベンゾエート誘導体、アリルエステル、８−ヒドロキシキノリンエステル、ピコリン酸エステル、ビシナルジオール類、およびセレニウム化合物（例えば、Ｌｅｒｉｃｈｅ Ｇ、Ｃｈｉｓｈｏｌｍ Ｌ、Ｗａｇｎｅｒ Ａを参照）を含んでよい。
切断可能なリンカーは、当業者によく知られていて、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、例えばＬｅｒｉｃｈｅ Ｈ．ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｒｎ．１５；２０（２）：５７１−８２．２０１２）にさらに記載される。切断条件および試薬は、限定されないが、酵素、求核／塩基性試薬、還元剤、光照射、求電子／酸性試薬、有機金属および金属試薬、および酸化試薬を含む。
一部の実施態様では、本発明のプロセスは、例えば、ＲＴ液滴内に取り込まれた後またはリザーバー内に提供された後に、前記の粒子由来の第一のタイプの少なくとも１つの粒子に結合された少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを放出するステップをさらに含む。
さらに、一部の実施態様では、はじめに第一のタイプの少なくとも１つの粒子に結合された前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、単一細胞の核酸を逆転写する前に、前記の第一のタイプの少なくとも１つの粒子から放出される。
一部の実施態様では、前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを放出するステップは、単一細胞およびＲＴ液滴を融合する前または後、細胞を溶解した後、および／または、単一細胞の核酸を逆転写する前に生じてよい。
当業者は、オリゴヌクレオチドの少なくとも一部を放出するために選択される時点に応じて、用語「オリゴヌクレオチドの少なくとも一部」は、例えば、本明細書において上記に定義されるように、細胞によって放出された核酸またはＤＮＡ／ＲＮＡデュプレックスにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの少なくとも一部を指すことを理解している。
一部の実施態様では、オリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、酵素、求核／塩基性試薬、還元剤、光照射、求電子／酸性試薬、有機金属および金属試薬、および酸化試薬のような任意の手段を用いて放出され得る。
一部の実施態様では、前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、酵素および／または光切断を用いて放出され得る。例えば、エンドヌクレアーゼは、リンカー配列または任意の他の配列を切断して、第一のタイプの粒子からオリゴヌクレオチドの少なくとも一部を放出するために用いられてよい。
さらなる実施態様では、オリゴヌクレオチドの放出は、ストレプトアビジンビオチン結合のような結合を破壊することを指す。ストレプトアビジンビオチン結合を破壊する方法は当業者に公知であり、ストレプトアビジンの酵素消化および／またはストレプトアビジンの変性を含む。
一部の実施態様では、オリゴヌクレオチドは、ストレプトアビジンの酵素消化によって放出される。
前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの濃度は、少なくとも１０ｎＭ、好ましくは少なくとも１００ｎＭである。
一部の実施態様では、前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの濃度は、少なくとも１５０ｎＭ、少なくとも２００ｎＭ、少なくとも３００ｎＭ、少なくとも４００ｎＭ、少なくとも５００ｎＭ、少なくとも６００ｎＭ、少なくとも７００ｎＭ、少なくとも８００ｎＭ、少なくとも９００ｎＭおよび少なくとも１μＭ、例えば、１００ｎＭ〜５μＭ、１００ｎＭ〜４μＭ、１００ｎＭ〜３μＭ、１００ｎＭ〜２μＭ、１００ｎＭ〜１μＭ、好ましくは１００ｎＭ〜５００ｎＭである。
一例では、プライマー配列はポリＴプライマー配列であり、前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの濃度は、１００ｎＭ〜３３００ｎＭ（３．３μＭに相当）である。
さらなる例では、プライマー配列は、遺伝子特異的なプライマー配列であり、前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの濃度は、１００ｎＭまたは１０００ｎＭ（１μＭに相当）である。
一部の実施態様では、マイクロ流体の液滴内の前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドのそれぞれのオリゴヌクレオチドの濃度は、少なくとも１０ｎＭ、好ましくは少なくとも１００ｎＭである。
一部の実施態様では、前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドのそれぞれのオリゴヌクレオチドの濃度は、少なくとも１５０ｎＭ、少なくとも２００ｎＭ、少なくとも３００ｎＭ、少なくとも４００ｎＭ、少なくとも５００ｎＭ、少なくとも６００ｎＭ、少なくとも７００ｎＭ、少なくとも８００ｎＭ、少なくとも９００ｎＭおよび少なくとも１μＭ、例えば、１００ｎＭ〜５μＭ、１００ｎＭ〜４μＭ、１００ｎＭ〜３μＭ、１００ｎＭ〜２μＭ、１００ｎＭ〜１μＭ、好ましくは１００ｎＭ〜５００ｎＭである。
上記によれば、一部の実施態様では、リザーバー、ＲＴ液滴または複数のＲＴ液滴は、溶解組成物をさらに含み、前記溶解組成物は、本明細書において上記のセクション「細胞溶解」において定義される。
一部の実施態様では、前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの濃度は、リザーバー内、ＲＴ液滴内または融合液滴内の濃度を指す。
一部の実施態様では、ＲＴ液滴は、複数のＲＴ液滴を注入する前にスクリーニングおよびソートされてよい。
したがって、一部の実施態様では、ＲＴ液滴は、第二のタイプの粒子をさらに含み、前記の第二のタイプの粒子は、セクション「単一細胞」において定義されるとおりである。
したがって、一部のさらなる実施態様では、ＲＴ液滴は、本明細書において上記に定義される色素をさらに含む。
［増幅およびシーケンシング］
一部の実施態様では、本発明のプロセスは、前記のバーコード化された単一細胞ｃＤＮＡを回収した後に、バーコード化された単一細胞ｃＤＮＡを増幅するステップをさらに含む。一部の実施態様では、前記増幅ステップは、取り込まれなかったオリゴヌクレオチドを除去した後に行なわれる。一部の実施態様では、前記増幅ステップは、本明細書において以下に定義されるシーケンシングステップの前に行なわれる。
一部の実施態様では、増幅ステップは、多重反応、別個のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（図１１を参照）、等温増幅、または線形増幅で行なわれる。
一部の実施態様では、線形増幅は、インビトロ転写である。
一部の実施態様では、本発明のプロセスにおいて生産されるバーコード化された単一細胞ｃＤＮＡは、シンプレックスおよび／またはマルチプレックスｑＰＣＲ反応のようなｑＰＣＲを用いて定量化される。
さらなる実施態様では、本発明のプロセスは、バーコード化された単一細胞ｃＤＮＡをシーケンスするステップをさらに含む。
本発明の文脈において、一部の実施態様では、バーコード化された単一細胞ｃＤＮＡをシーケンスするステップは、本明細書において、バーコード化された単一細胞ｃＤＮＡをシーケンシングライブラリーに最初に接触させて、シーケンシングライブラリーから、バーコード化された単一細胞ｃＤＮＡに対応する目的の配列をそれぞれ増幅することを指す。
一部の実施態様では、バーコード化された単一細胞ｃＤＮＡをシーケンスするステップは、シーケンシングライブラリーに対して次世代シーケンシング（ＮＧＳ）プロトコルを行なうステップを含んでよい（図１２を参照）。
特定の実施態様では、ＮＧＳプロトコルは、試薬キットのフローセルあたり４ｐＭ〜２０ｐＭのシーケンシングライブラリーの量をローディングするステップを含む。
一部の実施態様では、ＮＧＳシーケンシングプロトコルは、シーケンシングライブラリーの量または試薬キットのフローセルに対して、５〜６０％のＰｈｉＸを加えるステップをさらに含む。
［単一細胞の核酸をバーコード化するためのマイクロ流体のプロセス］
「バーコード化」は、本明細書において、遺伝子配列（本明細書において上記のセクション「オリゴヌクレオチド」において定義されるいわゆるバーコード配列）を核酸に付加して、別の付加された遺伝子配列（すなわち別の独特のバーコード配列）を有する核酸から前記バーコード核酸を区別するのを可能にすることを指す。
本発明者らはプロセスを開発して（図８を参照）、ここで、チップを備えるマイクロ流体デバイスにおいて、核酸を含む１つの単一細胞の液滴は、プライマー配列を有するオリゴヌクレオチドおよび逆転写酵素を含む液滴と特異的に融合する。それから、核酸が逆転写されて、最終的に、逆転写中またはその後にバーコード化される。このプロセスの１つの利点は、１つの単一細胞の液滴が１つのＲＴ液滴と特異的に融合されるので、無駄になる材料の量が少ないことである。さらなる利点は、使用されなかったバーコードが除去されること、およびしたがって、ｃＤＮＡがシーケンスされるときにシグナル対ノイズ比が改善されることである。
さらなる利点は、単一細胞のＲＴ−ＰＣＲを続けるためのプライマーとして、バーコード自体が用いられ得ることである（図７を参照）。
したがって、本発明は、単一細胞の核酸をバーコード化するためのマイクロ流体のプロセスに言及し、前記方法は、以下のステップを含む：
−少なくとも１つのマイクロ流体チャネルおよび複数のリザーバーを備えるチップを備えるマイクロ流体デバイスを提供するステップ、
−マイクロ流体チャネルの入口に、担体流体内に分散された第一のタイプの複数の液滴を含む担体流体を注入するステップ（ここで、第一のタイプの液滴は、単一細胞の液滴またはＲＴ液滴のいずれかであり、ここで、ＲＴ液滴の少なくとも一部は、逆転写酵素および少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含み、およびここで、単一細胞の液滴の少なくとも一部は、１つの単一細胞を含み、ここで、前記単一細胞は、単一細胞の核酸を含む）、
−複数のリザーバーに関して、第一の移行ステップ（ここで、複数の液滴のうちの第一のタイプの少なくとも１つの液滴は、浮力によって前記の複数のリザーバーの１つのリザーバー内に動かされる）、
−マイクロ流体チャネルの入口に、担体流体内に分散された第二のタイプの複数の液滴を含む担体流体を注入するステップ、ここで、第二のタイプの液滴は、単一細胞の液滴またはＲＴ液滴のいずれかであり、およびここで、第一のタイプの液滴が単一細胞の液滴である場合は第二のタイプの液滴はＲＴ液滴であり、または、第一のタイプの液滴がＲＴ液滴である場合は第二のタイプの液滴は単一細胞の液滴である）、
−複数のリザーバーに関して、第二の移行ステップ（ここで、第二のタイプの少なくとも１つの液滴の少なくとも一部は、前記の複数のリザーバーの１つのリザーバーの中に入る）、
−複数のリザーバーに関して、前記の第一のタイプの少なくとも１つの液滴を、それぞれのリザーバー内、またはその縁で、前記の第二のタイプの少なくとも１つの液滴と融合して、それにより、融合液滴をもたらすステップ、
−および、以下のステップをさらに含む：
ａ）それぞれの融合液滴に関して、前記融合液滴内で、単一細胞の核酸の少なくとも一部を少なくとも１つのオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせるステップ、
ｂ）それぞれの融合液滴内で、前記融合液滴内に存在する単一細胞の核酸の少なくとも一部を逆転写して、それにより、単一細胞のｃＤＮＡをもたらすステップ、および
ｃ）ステップｂ）において得られた単一細胞のｃＤＮＡに、少なくとも１つのバーコード配列を付着させるステップ（ここで前記の少なくとも１つのバーコード配列は、前記単一細胞の同一性をコードする）、
または
−さらに以下のステップを含む：
ａ）それぞれの融合液滴に関して、前記の融合液滴内で、少なくとも１つの細胞由来の単一細胞の核酸の少なくとも一部を少なくとも１つのオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせるステップ（ここで前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのバーコード配列を含む）、
ｂ）それぞれの融合液滴内で、前記の融合液滴内に存在する単一細胞の核酸の少なくとも一部を逆転写して、それにより、バーコード化された単一細胞のｃＤＮＡをもたらすステップ（ここで前記の少なくとも１つのバーコード配列は、前記単一細胞の同一性をコードする）。
単一細胞の液滴またはＲＴ液滴を調製および注入する技術は、当業者によく知られていて、セクション「液滴の調製」においてさらに説明される。
一部の実施態様では、第一のタイプの液滴は、単一細胞の液滴である。実施態様の別のセットでは、第一のタイプの液滴は、ＲＴ液滴である。単一細胞の液滴およびＲＴ液滴に関する特性は、本明細書において上記に、以前のセクション、特に、セクション「液滴」、「単一細胞」、「逆転写」および「オリゴヌクレオチド」において説明される。したがって、これらのセクションにおいて提供される「単一細胞の液滴」または「ＲＴ液滴」に対して言及する説明は、「単一細胞の核酸をバーコード化するためのマイクロ流体のプロセス」と呼ばれるこのセクションに完全に当てはまる。
本発明のマイクロ流体のプロセスの文脈における「少なくとも１つのオリゴヌクレオチド」は、プライマー配列を含む。前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドおよびプライマー配列は、本明細書において上記のセクション「オリゴヌクレオチド」において定義される。
一部の実施態様では、第一の移行ステップにおいて、「第一のタイプの少なくとも１つの液滴」は、第一のタイプの１、２または３、好ましくは１または２、より好ましくは１つの液滴を指す。
したがって、好ましい実施態様では、第一の移行ステップにおいて、複数のリザーバーに関して、第一のタイプの１つの液滴は、浮力によってそれぞれのリザーバー内に受け入れられる。
「浮力」は一般に、流体によって発揮される、沈められた物体の重量に対抗する上向きの力を指す。本発明の文脈において、浮力は、担体流体によって発揮される、前記担体流体内に沈められた液滴の重量に対抗する上向きの力を指す。
したがって、一部の実施態様では、マイクロ流体デバイスは、複数のリザーバーがチャネルの上であって、第一のタイプの少なくとも１つの液滴が、浮力によって、上に配向されたリザーバー内に入るように配向される。この実施態様では、担体流体は、水溶液の密度よりも高い密度を有する。
一部の実施態様では、第一のタイプの少なくとも１つの液滴の第一の移行ステップは、複数のリザーバーの５０％〜１００％、例えば６０％〜１００％、７０％〜１００％、９０％〜１００％、例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％の占有をもたらし、好ましくは少なくとも１つの液滴の移行ステップは、複数のリザーバーの９０％〜１００％の占有をもたらす。
「占有」は、本明細書において、少なくとも１つの液滴によって占有されるリザーバーの合計数と比較したリザーバーの数を指す。５０％の占有は、例えば、リザーバーの５０％が少なくとも１つの液滴によって占有されることを意味する。
一部の実施態様では、第一のタイプの少なくとも１つの液滴の第一の移行ステップは、注入された液滴の１０％〜１００％、例えば、２０％〜１００％、３０％〜１００％、４０％〜１００％、５０％〜１００％、６０％〜１００％、７０％〜１００％、８０％〜１００％；９０％〜１００％、好ましくは８０％〜１００％の捕捉効率をもたらす。
「捕捉効率」は、リザーバー内に捕捉される、入口に注入された液滴の合計数と比較した液滴の数を指す。５０％の捕捉効率は、例えば、提供された複数の液滴の合計数の５０％がリザーバー内に捕捉されることを意味する。
一部の実施態様では、第二のタイプの少なくとも１つの液滴の第二の移行ステップにおいて、第二のタイプの１、２または３、好ましくは１または２、より好ましくは１つの液滴を指す。
第二の移行ステップにおいて、第二のタイプの少なくとも１つの液滴は、リザーバーの寸法、第二のタイプの液滴の寸法および第二のタイプの液滴の寸法に応じて、リザーバーの中に完全にまたは部分的にのみ移行する。これらの寸法は、セクション「液滴」および「マイクロ流体デバイス」においてさらに定義される。
したがって、一部の実施態様では、第二のタイプの少なくとも１つの液滴の少なくとも一部は、第二のタイプの少なくとも１つの液滴の合計容量の５０％〜１００％、例えば、６０％〜１００％、６５％〜１００％、７０％〜１００％、７５％〜１００％、８０％〜１００％、８５％〜１００％、９０％〜１００％、９５％〜１００％、好ましくは９０％〜１００％を指す。
したがって、代替の実施態様では、第二のタイプの少なくとも１つの液滴の少なくとも一部は、第二のタイプの少なくとも１つの液滴の合計容量の１〜５０％、１％〜４０％、１％〜３０％、例えば、２％〜３０％、５％〜３０％、１０％〜３０％、好ましくは１０％〜３０％を指す。
一部の実施態様では、複数のリザーバーに関して、第二の移行ステップにおいて、第二のタイプの少なくとも１つの液滴の少なくとも一部は、浮力または表面エネルギーの違い、好ましくは表面エネルギーの違いに起因して、前記の複数のリザーバーの１つのリザーバーの中に入る。
一部の実施態様では、第二のタイプの少なくとも１つの液滴の第二の移行ステップは、複数のリザーバーの５０〜１００％、例えば６０％〜１００％、７０％〜１００％、９０％〜１００％、例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％の占有をもたらし、好ましくは、第二のタイプの少なくとも１つの液滴の移行ステップは、複数のリザーバーの９０％〜１００％の占有をもたらす。
一部の実施態様では、第二のタイプの少なくとも１つの液滴の第二の移行ステップは、注入された液滴の１０％〜１００％、例えば２０％〜１００％、３０％〜１００％、４０％〜１００％、５０％〜１００％、６０％〜１００％、７０％〜１００％、８０％〜１００％；９０％〜１００％、好ましくは８０％〜１００％の捕捉効率をもたらす。
「占有」および「捕捉効率」は、本明細書において上記に定義したとおりである。
一部の実施態様では、第一のタイプの液滴または第二のタイプの液滴は、第二のタイプの少なくとも１つの粒子をさらに含み、第二のタイプの前記の少なくとも１つの粒子は本明細書において上記のセクション「単一細胞」において定義されて、粒子は、本明細書において上記のセクション「オリゴヌクレオチド」において定義される。
一部の実施態様では、プロセスは、複数のリザーバーに関して、前記の少なくとも１つの単一細胞に対する表現型アッセイをそれぞれのリザーバーに関して行なうステップをさらに含む。
当業者によって理解されるように、一部の実施態様では、表現型アッセイを行なうステップは、細胞を試薬に曝露するステップをさらに要する。したがって、一部の実施態様では、単一細胞は、パラメーター測定前、測定中、または測定後に、１つまたは複数の試薬に曝される。
したがって、一部の実施態様では、単一細胞の液滴は、前記の単一細胞アッセイを行なうのに必要な１つまたは複数の試薬をさらに含む。
したがって、一部の実施態様では、前記の１つまたは複数の試薬は、単一細胞の液滴内に取り込まれる。
一部の実施態様では、表現型アッセイは、液滴を融合するステップの前に行なわれる。一部の実施態様では、表現型アッセイは、細胞を溶解する前に行なわれる。表現型アッセイは、画像を撮って、それにより、それぞれのリザーバーに関して前記の少なくとも１つの単一細胞の表現型をマッピングするステップをさらに含む。「表現型アッセイ」および「画像を撮る」ステップは、本明細書において以下のセクション「目的の表現型を有する単一細胞を遺伝子型決定するためのプロセス」において定義される。
本発明のプロセスの文脈において、融合するステップは、複数のリザーバーに関して行なわれる。当業者によって理解されるように、融合は、例えば、特に液滴を融合するために電場が用いられる場合、チップの選択領域において行なわれる。したがって、融合ステップに関する一部の実施態様では、複数のリザーバーは、チップの複数のリザーバーの一部のリザーバーを指す。
当業者によって理解されるように、一例では、表現型アッセイの結果に基づき、当業者は、ＲＴ液滴および単一細胞の液滴が融合される複数のリザーバーを選択する。
一部の実施態様では、融合するステップにおいて、それぞれのリザーバーに関して、第一のタイプの少なくとも１つの液滴は、温度、電場、抗乳化剤またはイオン力、好ましくは、電場を用いて、第二のタイプの少なくとも液滴と融合される。液滴を融合する方法は当業者に公知であり、例えば、ＷＯ２０１０１２８１５７Ａ１に記載される。
一部の実施態様では、第一のタイプの少なくとも１つの液滴は、電場を用いて第二のタイプの少なくとも１つの液滴と融合されて、電場は、少なくとも１秒、例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０秒、典型的に８秒間、１０ｋＨｚおよび５００Ｖである。
一部の実施態様では、融合ステップは、第一のタイプの液滴および第二のタイプの液滴の間の８０％〜１００％、例えば、８５％〜１００％、９０％〜１００％、９２％〜１００％；９３％〜１００％、９４％〜１００％、９５％〜１００％、９６％〜１００％、９７％〜１００％、９８％〜１００％、例えば、第一のタイプの液滴および第二のタイプの液滴の間の９８％、９９％、１００％、好ましくは９０％〜１００％の融合効率をもたらす。
「第一のタイプの液滴および第二のタイプの液滴の間の融合効率」は、本明細書において、イベントの数を指し、第一のタイプの１つの液滴および第二のタイプの１つの液滴の提供は、イベントの合計数に対する比較で融合液滴をもたらし、第一のタイプおよび第二のタイプの１つの液滴は、一緒に与えられる。
一部の実施態様では、プロセスは、複数のリザーバーに関して、例えば、少なくとも１つの単一細胞の液滴または融合液滴の細胞を溶解して、単一細胞から単一細胞の液滴または融合液滴へ核酸を放出するステップをさらに含む。
したがって、本発明のプロセスの一部の実施態様では、ハイブリダイズするステップａ）のようなハイブリダイズするステップにおいて、および、逆転写ステップｂ）のような逆転写ステップにおいて、言及される核酸は、放出された核酸である。
細胞を溶解するステップは、第一のタイプの少なくとも１つの液滴を前記の第二のタイプの少なくとも１つの液滴と融合するステップの前または前記液滴を融合するステップの後に生じてよい。細胞を融解するために用いられ得る方法は、本明細書において上記のセクション「細胞溶解」において記載される。
当業者によって理解されるように、細胞を溶解するために選択される方法は、溶解に関して選択される時点、すなわち液滴融合の前または後に依存し得る。
例えば、酵素的溶解または化学的溶解は、酵素的または化学的溶解に必要な構成要素が典型的にＲＴ液滴内に含まれるので、典型的に融合ステップ後に用いられる。
好ましい一実施態様では、細胞溶解ステップは、本発明の文脈において用いられる液滴を破壊しない。
したがって、一部の実施態様では、ＲＴ液滴または複数のＲＴ液滴は、溶解組成物を含み、溶解組成物は、本明細書において上記のセクション「細胞溶解」において定義される。
一部の実施態様では、本発明の方法は、少なくとも１回のパージするステップをさらに含む。
本発明の文脈における「少なくとも１回のパージするステップ」は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４回のパージするステップを指す。
例えば、デバイスは典型的に、残りの空気を除去するために、第一のタイプの複数の液滴を注入する前にパージされ得る。
例えば、デバイスは典型的に、複数のリザーバー内に移行しなかった第一のタイプの液滴を除去するために、第一のタイプの複数の液滴を注入した後にパージされ得る。
例えば、デバイスは典型的に、複数のリザーバー内に少なくとも部分的に移行しなかった第二のタイプの液滴を除去するために、第二のタイプの複数の液滴を注入した後にパージされ得る。
本発明のプロセスのステップａ）は、それぞれの融合液滴に関して、単一細胞の核酸の少なくとも一部を、前記融合液滴内の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするステップを指す。
「ハイブリダイゼーション」は、本明細書において、プライマー配列、例えば前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチド内に存在するプライマー配列が、核酸の相補核酸配列にアニールする現象を指し、したがって、当業者に知られるように、ハイブリダイゼーションに用いられる温度は、用いられるプライマー配列および／またはＲＴ酵素に依存する。
一例では、ハイブリダイゼーションステップ、例えば、ハイブリダイゼーションステップａ）またはｂ）は、例えば１時間、５５℃〜６０℃で、液滴をインキュベートすることによって行なわれる。
ステップｂ）における単一細胞の核酸の少なくとも一部の逆転写は、本明細書において上記のセクション「逆転写」においてさらに定義される。
一部の実施態様では、前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、プライマー配列および少なくとも１つのバーコード配列を含み、ここで、「少なくとも１つのオリゴヌクレオチド」、「少なくとも１つのバーコード配列」および「プライマー配列」は、本明細書において上記のセクション「オリゴヌクレオチド」において定義される。
関連する実施態様において、例えばステップｂ）の逆転写は、したがって、バーコード化されたｃＤＮＡをもたらす。本明細書において上記に説明される異なる実施態様によれば、前記のバーコード化されたｃＤＮＡは、第一のタイプの粒子に結合されてよく、またはされなくてよい。
一部の実施態様では、本発明のプロセスは、逆転写ステップの後に、チャネルの出口において融合液滴を回収するステップをさらに含む。
「回収するステップ」は、本明細書において、逆転写によって生産されたｃＤＮＡまたはバーコード化ｃＤＮＡを含むマイクロ流体の液滴を集めるステップを指す。
一部の実施態様では、融合液滴を回収するステップは、Ｘ軸の周りで４５度〜１３５度、好ましくは９０度、デバイスを回転させるステップ、および、デバイスをパージするステップを含む。融合液滴は、それから、出口において集められ得る。
一部の実施態様では、逆転写ステップの後にチャネルの出口において融合液滴を回収するステップは、少なくとも１回の洗浄ステップを含む。
融合液滴を洗浄した後、融合液滴の下流プロセスは、バーコード化されていないｃＤＮＡを含む液滴と比較して、バーコード化ｃＤＮＡを含む液滴に関して異なってよい。
当業者は、バーコード化ｃＤＮＡは、バーコード配列が原因でｃＤＮＡが区別され得るため、１つの細胞から得られるバーコード化単一細胞ｃＤＮＡは別の細胞のバーコード化単一細胞ｃＤＮＡと混合され得るので、異なって処理されてよいことを理解している。これに反して、バーコード化されていないｃＤＮＡは、粒子に結合された場合に混合され得るだけである。
したがって、一部の実施態様では、ｃＤＮＡはバーコード化されず、関連する実施態様では、ステップｂ）の逆転写によって生産されたｃＤＮＡが回収されて、それから、少なくとも１つのバーコードがステップｃ）において付着される。ステップｃ）においてバーコードを付着した後に、バーコード化ｃＤＮＡは、典型的に、その後の増幅およびシーケンシングライブラリー調製のためにさらに用いられる（図１１を参照）。
一部の実施態様では、ｃＤＮＡはバーコード化されて、関連する実施態様では、ステップｂ）の逆転写によって生産されたバーコード化ｃＤＮＡが回収されて、典型的に、その後の増幅およびシーケンシングライブラリー調製のためにさらに用いられる。
その後の増幅およびシーケンシングライブラリー調製は、本明細書において上記のセクション「増幅およびシーケンシング」において定義されるとおりである（図１１を参照）。
したがって、一部の実施態様では、本発明のプロセスは、融合液滴の少なくとも一部において逆転写によって生産されたバーコード化単一細胞ｃＤＮＡを回収するステップをさらに含む。
より正確には、関連する実施態様において、回収するステップは、逆転写によって生産されたバーコード化ｃＤＮＡを含むマイクロ流体の液滴を集めるステップ、マイクロ流体の液滴を破壊するステップ、および、前記のマイクロ流体の液滴の油相から、水性組成物内に含まれるバーコード化ｃＤＮＡを分離するステップを指す。
核酸、特にバーコード化ｃＤＮＡを、液滴から単離する方法は、当業者に公知であり、例えば、マイクロ流体の液滴を集めるステップ、および、典型的にペルフルオロ−オクタノール（ｖ／ｖエマルション）を用いてマイクロ流体の液滴を破壊するステップを含む。それから、水相と油相が分離されるまで、以前のステップにおいて得られたエマルションをインキュベートする。一例では、水相は、典型的に、例えば、４℃にて１０，０００ｇで１０分間、遠心分離されて、ｃＤＮＡを含む上清が回収される。
一部の実施態様では、プロセスは、取り込まれなかったオリゴヌクレオチドを除去するステップをさらに含む。
「取り込まれなかったオリゴヌクレオチドを除去するステップ」は、ｃＤＮＡおよび最終的に取り込まれなかったオリゴヌクレオチドを含む水性組成物を、精製基質と接触させるステップを含み、精製基質は、取り込まれなかったオリゴヌクレオチドを除去する。当業者によって理解されるように、取り込まれなかったオリゴヌクレオチドを除去するステップに供されるｃＤＮＡは、好ましくはバーコード化ｃＤＮＡである。
一部の実施態様では、精製基質は、ビーズまたは粒子を含み、任意選択でカラムを形成してよい。さらなる例では、取り込まれなかったオリゴヌクレオチドは、例えばアクリルアミドアミドゲルを用いたサイズ選択によって除去される。
一部の実施態様では、「取り込まれなかったオリゴヌクレオチドを除去する」ステップは、ｃＤＮＡを含む水性組成物をエキソヌクレアーゼと接触させて、液滴の少なくとも一部の水性組成物において取り込まれなかったオリゴヌクレオチドを分解するステップを含む。
関連する実施態様では、エキソヌクレアーゼは、ｃＤＮＡを含む水性組成物から、一本鎖核酸配列を分解する。
例えば、ステップｂ）またはｃ）において得られるバーコード化ｃＤＮＡのようなｃＤＮＡは、典型的にＲＮＡ／ＤＮＡ複合体の形態で存在し、したがって前記エキソヌクレアーゼから保護されることが、当業者によって理解される。
一部の実施態様では、本明細書において上記に定義される、１つまたは複数のヌクレオチドアナログを含むｃＤＮＡは、ｃＤＮＡ配列または分子の精製を促進する。
当業者によって理解されるように、特定の実施態様では、精製されたｃＤＮＡは、取り込まれなかったオリゴヌクレオチドを含まない。
一部の実施態様では、ｃＤＮＡは、ＲＮＡｓｅ Ａによってさらに処理される。
「ＲＮＡｓｅ Ａ」は、一本鎖ＲＮＡをＣおよびＵ残基において特異的に分解するエンドリボヌクレアーゼである。
一部の実施態様では、ＲＮＡｓｅ Ａは、１０〜１０００μｇ／μＬ、好ましくは５０〜２００μｇ／μＬ、例えば１００μｇ／μＬの濃度である。
一部の実施態様では、ｃＤＮＡは、プロテイナーゼＫによってさらに処理される。
「プロテイナーゼＫ」は、広範囲に使用されるセリンプロテアーゼであり、優先的に疎水性アミノ酸の後ろでタンパク質を消化する。
一部の実施態様では、プロテイナーゼＫは、０．１〜５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．１〜１ｍｇ／ｍＬ、例えば０．８ｍｇ／ｍＬの濃度である。
回収されたｃＤＮＡは、それから、典型的に、本明細書において上記のセクション「増幅およびシーケンシング」において定義される、その後の増幅およびシーケンシングライブラリー調製にさらに用いられる（図５も参照）。
本明細書において上記のセクション「オリゴヌクレオチド」において説明されるように、前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが第一のタイプの少なくとも１つの粒子に結合される実施形態では、融合液滴内に存在する核酸を逆転写することは、ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体の形態で第一のタイプの少なくとも１つの粒子に結合した単一細胞ｃＤＮＡをもたらす。
さらに、前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドがバーコード配列を含まない実施態様では、逆転写によって得られて前記の第一のタイプの少なくとも１つの粒子に結合されたｃＤＮＡは、バーコード化されない。
したがって、関連する実施態様では、単一細胞ｃＤＮＡを回収するステップは、本明細書において、マイクロ流体の液滴を破壊するステップ、および、水性組成物内に含まれる第一のタイプの少なくとも１つの粒子に結合した単一細胞ｃＤＮＡを前記のマイクロ流体の液滴の油相から分離するステップを指す。
マイクロ流体の液滴を破壊する方法は当業者に公知であり、ペルフルオロ−オクタノール（ｖ／ｖエマルション）の使用を典型的に含む。
粒子に結合したｃＤＮＡは、当業者に公知の方法を用いて油相から分離され得る。例えば、粒子が磁性粒子である場合は、ｃＤＮＡは磁石を用いて分離され得る。別の例では、粒子がヒドロゲル粒子である場合は、ｃＤＮＡは沈降によって分離される。
第一のタイプの少なくとも１つの粒子に結合したｃＤＮＡを油相から分離するステップは、第一のタイプの複数の粒子を含むプールをもたらし、それぞれの粒子に、１つの細胞のｃＤＮＡが結合されている。
関連する実施態様では、前記の少なくとも１つのバーコード配列を、例えばステップｃ）において、単一細胞ｃＤＮＡに付着するために、本発明のプロセスは、第一のタイプの少なくとも１つの粒子に結合した単一細胞ｃＤＮＡを、複数のリザーバー内に分配するステップをさらに含み、ここで第一のタイプの少なくとも１つの粒子、好ましくは第一のタイプの１つの粒子（単一細胞のｃＤＮＡが結合している）は、それぞれのリザーバー内に受け入れられる。そのようなリザーバーは、例えばウェル、典型的に、９６ウェルプレートのようなウェルプレートであってよい。
一部の関連する実施態様では、本発明のプロセスは、バーコード配列を、ステップｂ）において得られた単一細胞ｃＤＮＡに付着させるステップｃ）をさらに含み、前記の少なくとも１つのバーコード配列は、前記単一細胞の同一性をコードする。
前記の少なくとも１つのバーコード配列は、本明細書において上記のセクション「オリゴヌクレオチド」において定義されるとおりである。好ましい実施態様では、前記の少なくとも１つのバーコードが転写ステップの後に付着される場合は、前記の少なくとも１つのバーコード配列は、好ましくは一本鎖核酸である。１つのバーコード配列または１よりも多いバーコード配列が付着されてよいことが、当業者によって理解される。１よりも多いバーコード配列が付着される場合、互いに付着される個々のバーコード配列は、結局のところ１つの最終的なバーコード配列となる。これらの個々のバーコード配列は、その後のサイクルにおいて付着されてよい。
一部の実施態様では、バーコード配列を付着するステップｃ）は、ＵＭＩ配列を付着するステップをさらに含み、前記ＵＭＩ配列は、本明細書において上記のセクション「オリゴヌクレオチド」において定義されるとおりである。
バーコード配列またはＵＭＩ配列を付着させる方法は当業者に公知であり、例えば、リガーゼの使用を含み、および／またはアニーリングまたはプライマー伸長方法を用いる。
一部の実施態様では、バーコード配列を付着するステップｃ）は、単一細胞ｃＤＮＡに付着しなかったバーコードを除去するための洗浄ステップが後に続いてよい。
一部の実施態様では、プロセスは、取り込まれなかったオリゴヌクレオチドを除去するステップをさらに含む。取り込まれなかったオリゴヌクレオチドを除去する方法は、本明細書において上記にさらに記載される。
ｃＤＮＡが第一のタイプの少なくとも１つの粒子に付着される実施態様では、プロセスは、前記の第一のタイプの少なくとも１つの粒子からｃＤＮＡまたはバーコード化ｃＤＮＡを放出するステップをさらに含む。オリゴヌクレオチドを放出する方法は、本明細書において上記のセクション「オリゴヌクレオチド」において記載されて、ｃＤＮＡは前記オリゴヌクレオチドを介して粒子に結合されるので、必要な変更を加えてｃＤＮＡの放出に当てはまる。
好ましくは、ｃＤＮＡを放出するステップは、ステップｃ）においてバーコード配列を付着した後に生じる。
一部の実施態様では、バーコード配列を付着するステップｃ）の後に、バーコード化ｃＤＮＡを回収するステップが続く。
バーコード化ｃＤＮＡを回収するステップは、本明細書において、バーコード化ｃＤＮＡを集めるステップを指す。
回収されたバーコード化ｃＤＮＡは、それから、典型的に、本明細書において上記のセクション「増幅およびシーケンシング」において定義されるその後の増幅およびシーケンシングライブラリー調製のためにさらに用いられる（図１１を参照）。
さらに、一部の実施態様では、前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、粒子を伴わずにＲＴ液滴内に導入されたものであり、または、任意選択で、逆転写の前に前記粒子から放出されたものである。
したがって、本発明のプロセスのこれらの実施態様は、転写後に、粒子に付着されていないｃＤＮＡをもたらすことが、当業者によって理解される。さらに、前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドがバーコード配列を含まない実施態様では、前記ｃＤＮＡはバーコード化されない。
したがって、関連する実施態様では、ＲＴ液滴は、ポリマーをさらに含む。
したがって、一部の実施態様では、融合液滴は前記ポリマーを含むことが当業者によって理解される。
一部の実施態様では、前記ポリマーは、溶液の形態である。
一部の実施態様では、前記ポリマーは、アルギン酸、アガロース、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート、またはアクリルアミド系ゲル、例えば、ビス−アクリルアミド、ポリアクリルアミド、ストレプトアビジンアクリルアミド、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、またはポリＮ−イソプロピルポリアクリルアミドまたはそれらの混合物からなる群より選択される。
さらなる実施態様では、ポリマーは、核酸を捕捉するように官能化される。
核酸を捕捉するようにポリマーを官能化する方法は当業者に公知であり、限定されないが、ストレプトアビジン、ヒスチジンタグ、ビオチン、カルモジュリン、ＳＮＡＰ−ｔａｇ、ビオチン、Ａｃｒｙｄｉｔｅを含む。
関連する実施態様では、融合液滴は、本明細書において上記に記載されるように回収される。
関連する実施態様では、本明細書において上記に定義される融合液滴を回収するステップは、融合液滴を重合するステップをさらに含む。
例えば、アルギン酸のようなヒドロゲルは、カルシウムイオンの添加によって重合され得る。他の場合では、クロスリンカーとも呼ばれる重合イニシエーター（例えば、アクリルアミドに関してＴＥＭＥＤおよび過硫酸アンモニウム）が、液滴に添加されてよい。
融合液滴を重合する場合、ステップｂ）において生産された単一細胞ｃＤＮＡが、前記の重合された液滴内に含まれることが当業者によって理解される。
一部の実施態様では、重合は、架橋によって得られる。
一部の実施態様では、クロスリンカーが、例えば拡散によって融合液滴に添加される。
代替の実施態様では、ＲＴ液滴はクロスリンカーを含む。したがって、一部の実施態様では、融合液滴も前記クロスリンカーを含むことが、当業者によって理解される。
一部の実施態様では、クロスリンカーは、重合のために活性化される。
特に、ＲＴ液滴がクロスリンカーを含む場合、前記クロスリンカーは、重合のための活性化を必要とする。
一部の実施態様では、クロスリンカーは、熱またはＵＶによって活性化される。
関連する実施態様では、ステップｃ）においてｃＤＮＡにバーコードを付着させるために、本発明のプロセスは、単一細胞ｃＤＮＡを含む重合液滴を複数のリザーバー内に分配するステップをさらに含み、ここで、好ましくは、１つの重合液滴は、それぞれのリザーバー内に受け入れられる。リザーバーは、ウェル、典型的に、９６ウェルプレートである。
小さな核酸、例えばバーコード配列、ならびに酵素、例えばリガーゼは、本明細書において上記に定義されるポリマー内に移行し得ることが、当業者に公知である。
したがって、バーコード配列を付着させるステップｃ）は、粒子に付着したｃＤＮＡに関して本明細書において上記に説明したのと同一の方法で、前記ポリマー内に含まれるｃＤＮＡに当てはまる。バーコードをｃＤＮＡに付着するステップは、したがって、本明細書において上記に定義されるように、粒子に付着されたｃＤＮＡに対して言及する実施態様において当てはまる。
したがって、バーコードは、３’または５’末端に付着されてよい。
一部の実施態様では、バーコード配列を付着するステップｃ）は、本明細書において上記に定義されるＵＭＩ配列を付着するステップをさらに含む。
一部の実施態様では、バーコード配列を付着するステップｃ）は、ｃＤＮＡに付着しなかったバーコードを除去するための洗浄ステップが後に続く。
一部の実施態様では、プロセスは、取り込まれなかったオリゴヌクレオチドを除去するステップをさらに含む。取り込まれなかったオリゴヌクレオチドを除去するステップは、本明細書において上記に定義される。
一部の実施態様では、プロセスは、バーコード化ｃＤＮＡを、重合液滴から放出するステップをさらに含む。ｃＤＮＡは、単純な拡散、光切断または電気泳動によって、重合液滴から放出され得る。
好ましくは、ｃＤＮＡを放出するステップは、ステップｃ）においてバーコード配列を付着するステップの後に生じる。
一部の実施態様では、バーコード配列を付着するステップｃ）は、バーコード化ｃＤＮＡを回収するステップが後に続く。回収されたバーコード化ｃＤＮＡは、それから、典型的に、本明細書において上記のセクション「増幅およびシーケンシング」において定義されるその後の増幅およびシーケンシングライブラリー調製のためにさらに用いられる（図１１を参照）。
［目的の表現型を有する単一細胞を遺伝子型決定するためのプロセス］
「遺伝子型決定」は一般に、生化学的方法を用いて個々の核酸配列を決定するプロセスを指す。本発明の文脈における遺伝子型決定は、単一細胞、特に、目的の単一細胞の核酸配列を決定するステップを指す。
「表現型」は通常、生物の観察することのできる特性または形質、例えばその形態、発達、生化学的または生理学的特性の混成を指す。表現型は、生物の遺伝子コードの発現、その遺伝子型、ならびに、環境因子および２つの間の相互作用の影響から生じる。本発明の文脈において、単一細胞の表現型は、特定の特性の存在または不存在、例えば、特定の抗体の存在または不存在、または、特定の抗原の存在または不存在または特定の活性の存在または不存在を指し、それは、典型的に、表現型アッセイを用いて観察または同定される。
目的の表現型の例は、生物学的応答の検出である。これらのうち、免疫応答の検出は、抗原特異的抗体の分泌によって誘導されるＡＤＣＣ（抗体依存−細胞媒介細胞傷害性）（３）を検出することによって監視され得る（図１を参照）。
生物学的イベントのうち、免疫応答の検出は、抗原特異的抗体の分泌によって誘導される相補依存性細胞毒性（ＣＤＣ）（６）を検出することによって監視され得る（図２を参照）。
生物学的イベントのうち、薬物効果の検出は、抗原特異的抗体の分泌によって誘導されるＡＤＣ（抗体薬物コンジュゲート）を検出することによって監視され得る（図３を参照）。
生物学的イベントのうち、抗原特異的抗体の分泌によって誘導されるアゴニスト／アンタゴニスト抗体のような薬物機能の検出が含まれる（図４、５を参照）。
生物学的イベントのうち、競合アッセイの実施のような薬物機能の検出が含まれる（図６を参照）。
生物学的イベントのうち、抗体の分泌によって仲介されるレポーター細胞の細胞移動性の検出のような薬物機能の検出が含まれる（図６を参照）。そのようなアッセイは、前記液滴の内部のレポーター細胞の挙動の改変をトラックするために用いられ得る。目的の抗原を発現していて、放出されない検出可能なラベルがロードされた標的細胞（１）は、単一細胞の液滴として、ＩｇＧ産生細胞（２）および粒子と共カプセル化される。液滴は、抗体分泌を可能にする条件でインキュベートされる。分泌された特定の抗体は、標的細胞上に再局在する。その間に、リガンド／アゴニストは、ＩｇＧ生産と（ｔｈａｎ）同様の動力学で粒子から拡散して、リガンドの勾配を作り出す。レポーター細胞は、リガンド濃度の関数で粒子の内部に移行する（９）。ブロック抗体（３）の場合、レポーター細胞の進行は変化される。移行はその結果、抗体のブロック／中和活性を評価するために用いられ得る。
したがって、単一細胞を遺伝子型決定するためのプロセスの文脈において、複数のリザーバー内、例えば、典型的に９６ウェルプレートのリザーバー内、またはマイクロ流体デバイスのリザーバー内に存在する単一細胞は、最初に表現型決定されて、それから遺伝子型決定される。発明者らは、色素と組み合わせて特定のバーコードの使用に基づき、シーケンシング後に、バーコード化された単一細胞ｃＤＮＡの遺伝子配列を前記単一細胞に関して観察される表現型と関連付けることが可能なプロセスを開発した。
したがって、本発明は、目的の表現型を有する単一細胞を遺伝子型決定するためのプロセスに対して言及し、前記方法は、
−複数のリザーバーを提供するステップ、および
ａ）複数のリザーバーに関して、少なくとも１つのバーコード配列および少なくとも１つの色素をそれぞれのリザーバーに関して提供するステップ（ここで前記の少なくとも１つのバーコード配列は、前記の少なくとも１つの色素の色および濃度と関連する）、および、アレイの画像を撮って、それにより、それぞれのリザーバーに関して前記の少なくとも１つの色素の色および強度をマッピングするステップ；および
ｂ）複数のリザーバーに関して、少なくとも１つの単一細胞をそれぞれのリザーバーに関して提供して、前記の少なくとも１つの単一細胞に対して表現型アッセイをそれぞれのリザーバーに関して行なうステップ、および、画像を撮って、それにより、それぞれのリザーバーに関して前記の少なくとも１つの単一細胞の表現型をマッピングするステップ；
ここでステップａ）はステップｂ）の前に行なわれる、または、ステップｂ）はステップａ）の前に行なわれる；それから、
ｃ）複数のリザーバーに関して、ステップｂ）において得られた単一細胞の表現型を、それぞれのリザーバーに関して、ステップａ）において得られた前記の少なくとも１つの色素の色および強度に対して関連付けるステップ；および
−複数のリザーバーに関して、前記の少なくとも１つの単一細胞の核酸をそれぞれのリザーバーに関して逆転写して、前記の少なくとも１つの色素の色および濃度と関連する前記の少なくとも１つのバーコード配列でバーコード化された単一細胞ｃＤＮＡを得るステップ；および
−前記の少なくとも１つの単一細胞の表現型と遺伝子型を関連付けるステップを含む。
好ましい一実施態様では、前記プロセスは、マイクロ流体のプロセスである。
一部の好ましい実施態様では、複数のリザーバーは、少なくとも１つのマイクロ流体チャネルを備えるマイクロ流体デバイス内に含まれる。したがって、一実施態様では、プロセスは、少なくとも１つのマイクロ流体チャネルおよび複数のリザーバーを備えるチップを備えるマイクロ流体デバイスを提供するステップを含む、マイクロ流体のプロセスである。
したがって、本発明は、目的の表現型を有する単一細胞を遺伝子型決定するためのマイクロ流体のプロセスに対してさらに言及し、前記方法は、
−複数のリザーバーを備えるチップを備えるマイクロ流体デバイスを提供するステップ、および
ａ）複数のリザーバーに関して、少なくとも１つのバーコード配列および少なくとも１つの色素をそれぞれのリザーバーに関して提供するステップ（ここで前記の少なくとも１つのバーコード配列は、前記の少なくとも１つの色素の色および濃度と関連する）、および、アレイの画像を撮って、それにより、それぞれのリザーバーに関して前記の少なくとも１つの色素の色および強度をマッピングするステップ；および
ｂ）複数のリザーバーに関して、少なくとも１つの単一細胞をそれぞれのリザーバーに関して提供するステップ、および、前記の少なくとも１つの単一細胞に対して表現型アッセイをそれぞれのリザーバーに関して行なうステップ、および、画像を撮って、それにより、それぞれのリザーバーに関して前記の少なくとも１つの単一細胞の表現型をマッピングするステップ；
ここでステップａ）はステップｂ）の前に行なわれる、または、ステップｂ）はステップａ）の前に行なわれる；それから、
ｃ）複数のリザーバーに関して、ステップｂ）において得られた単一細胞の表現型を、それぞれのリザーバーに関して、ステップａ）において得られた前記の少なくとも１つの色素の色および強度に対して関連付けるステップ；および
−複数のリザーバーに関して、前記の少なくとも１つの単一細胞の核酸をそれぞれのリザーバーに関して逆転写して、前記の少なくとも１つの色素の色および濃度と関連する前記の少なくとも１つのバーコード配列でバーコード化された単一細胞ｃＤＮＡを得るステップ；および
−前記の少なくとも１つの単一細胞の表現型と遺伝子型を関連付けるステップを含む。
目的の表現型を有する単一細胞を遺伝子型決定するためのマイクロ流体のプロセスの文脈において、「マイクロ流体のプロセス」および「マイクロ流体デバイス」は、本明細書において上記のセクション「定義」において定義されるとおりである。
「バーコード配列」は、本明細書において上記のセクション「オリゴヌクレオチド」において定義されるとおりである。
「複数のリザーバー」は、本明細書において上記のセクション「マイクロ流体デバイス」において定義されるとおりである。
一部の実施態様では、「少なくとも１つのバーコード配列」における「少なくとも１つ」および「少なくとも１つの色素」における「少なくとも１つ」は、１よりも多い、２よりも多い、３よりも多い、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個のバーコード配列および／または色素、好ましくは２、３、４、または５個のバーコード配列および／または色素、より好ましくは、２、３または４個のバーコード配列および／または色素、さらにより好ましくは、２または３個のバーコード配列および／または色素、例えば、２個のバーコード配列および／または色素を指す。
一部の実施態様では、色素は蛍光色素を指す。蛍光色素は、本明細書において上記のセクション「単一細胞」において定義されるとおりである。
一部の好ましい実施態様では、前記の少なくとも１つのバーコードおよび前記の少なくとも１つの色素は、１つの溶液において提供される。
一部の実施態様では、前記の少なくとも１つのバーコードおよび前記の少なくとも１つの色素は、互いに結合されない。
一部の実施態様では、前記の少なくとも１つのバーコードおよび前記の少なくとも１つの色素は、互いに共有結合されない。
一部の実施態様では、前記の少なくとも１つのバーコードおよび前記の少なくとも１つの色素は、非共有結合を用いて意図的に結合されない。
「意図的に」は、本明細書において、一部の実施態様では、前記の少なくとも１つのバーコードおよび前記の少なくとも１つの色素が、非共有結合を誘導するための特定の条件に曝されない、すなわち、例えばストレプトアビジンおよびビオチンを用いて、非共有結合を用いて互いに結合するように改変されないという事実を指す。しかしながら、前記の少なくとも１つの色素の性質および前記の少なくとも１つのバーコード配列の核酸の性質に起因して、場合によっては、前記の少なくとも１つの色素および前記の少なくとも１つのバーコード配列は、非共有相互作用によって互いに関連し得ることが、当業者によって理解される。これらの「非共有相互作用」は、静電気効果、π効果、ファンデルワールス力、および疎水性効果を含む。
一部の実施態様では、前記の少なくとも１つのバーコードは、少なくとも１つの色素と一緒に提供されて、前記の少なくとも１つの色素は、公知濃度で提供される。
一部の実施態様では、前記の少なくとも１つの色素は、０．１ｎＭ〜１００μＭ、例えば１ｎＭ〜５０μＭ、１ｎＭ〜３０μＭ、１μＭ〜５０μＭ、１μＭ〜３０μＭ、好ましくは１ｎＭ〜３０μＭである。用いられる濃度は、前記の少なくとも１つの色素の性質に依存することが、当業者によって理解される。
一部の好ましい実施態様では、２つのバーコード配列が提供される場合は２つの色素が提供されて、３つのバーコード配列が提供される場合は３つの色素が提供される。
少なくとも１つのバーコード配列が１つのバーコード配列を指して、少なくとも１つの色素が１つの色素を指す場合は、第一のリザーバー内に提供されるバーコード配列は、別のリザーバー内に提供されるバーコード配列とは異なり、第一のリザーバー内にバーコード配列と一緒に提供される色素は、別のリザーバー内にバーコード配列と一緒に提供される色素とは異なり、および／または、これらの色素の濃度は異なることが、当業者によって理解される。
少なくとも１つのバーコード配列が２つのバーコード配列を指し、好ましくは、少なくとも１つの色素が２つの色素を指す場合、その結果、第一のリザーバー内に提供される２つのバーコード配列の少なくとも１つは、他のリザーバー内に提供される２つのバーコード配列の少なくとも１つとは異なり、第一のリザーバー内に２つのバーコード配列と一緒に提供される２つの色素の少なくとも１つは、他のリザーバー内に２つのバーコード配列と一緒に提供される２つの色素の少なくとも１つの色素とは異なり、および／または、第一のリザーバー内に２つのバーコード配列と一緒に提供される２つの色素の少なくとも１つの濃度は、他のリザーバー内に２つのバーコード配列と一緒に提供される２つの色素の少なくとも１つの色素の濃度とは異なることが、当業者によってさらに理解される。
ステップａ）における「画像を撮るステップ」は、本明細書において、当業者に公知の任意の方法、例えば、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡または蛍光イメージング技術によって、画像を撮るステップを指す。
さらに理解しやすいステップａ）が、それぞれのリザーバーにおいて２つのバーコードおよび２つの色素を用いて、２つのリザーバー（ＡおよびＢ）に関して本明細書において以下に例示され、ステップａ）をこの例に限定しない。例えば、バーコード１は、典型的に１０μＭの濃度で、溶液中に典型的にＡｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ４０５（紫）と一緒に提供される。バーコード２は、典型的に１５μＭの濃度で、溶液中に典型的にＡｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ５３２（緑）と一緒に提供される。バーコード１は、１０μＭの濃度でＡｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ４０５と関連して、バーコード２は、１５μＭの濃度でＡｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ５３２と関連する。両方のバーコード、バーコード１およびバーコード２が、１つのリザーバー（リザーバーＡ）内に一緒に提供される場合は、バーコードに付随する２つの色素の色および濃度は混合される。典型的に、蛍光顕微鏡画像を考慮すると、蛍光シグナルの強度および色は、それぞれのリザーバー（リザーバーＡを含む）に関して記録される。その結果、参照スケールに基づいて、リザーバーＡ内に存在する２つの色素の混合物に関して記録された色および強度は、バーコード１および２の組み合わせと関連すると結論付けることが可能である。
ここで、別のリザーバー（リザーバーＢと呼ばれる）内に、バーコード１が１０μＭの濃度でＡｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ４０５と一緒に提供されて、バーコード３が２０μＭの濃度で例えばＡｌｅｘａ ５４６と一緒に提供された場合、リザーバーＢは、リザーバーＡとは別の色および強度を有する。したがって、ステップａ）において撮られる画像に基づいて、参照スケールを用いて、リザーバーＢにおける色素の混合物に関して記録された色および強度は、バーコード１および３の組み合わせと関連すると結論付けることが可能である。
したがって、ステップａ）においてアレイの画像を撮ることは、複数のリザーバーのそれぞれのリザーバーに関して、それぞれのリザーバー内に存在する前記の少なくとも１つの色素の色および強度をマッピングするのを可能にする。さらに、それぞれのリザーバーに関してマッピングされる色および強度は、これらのリザーバー内に存在する前記の少なくとも１つのバーコード配列と関連する。したがって、当業者は、複数のリザーバーのそれぞれのリザーバーに関してステップａ）において得られた画像から、どちらの少なくとも１つのバーコード配列が前記リザーバー内に提供されたのか、結論付けることができる。
ステップａ）における前記の少なくとも１つのバーコード配列および前記の少なくとも１つの色素は、当業者に公知の任意の方法によって提供され得る。
一部の実施態様では、複数のリザーバーに関して、前記の少なくとも１つのバーコード配列は、複数のリザーバーのそれぞれのリザーバーの表面に対して結合される。
関連する実施態様では、前記の少なくとも１つのバーコード配列をリザーバーの表面に結合するステップは、溶液内の前記の少なくとも１つの色素に影響を与えない。語句「溶液内の前記の少なくとも１つの色素に影響を与えない」は、色素が溶液内に残ることを意味する。
少なくとも１つのバーコード配列のような核酸を表面に結合する方法は、当業者に公知であり、例えばＵＳ５４１２０８７に記載される。これらの方法は、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを第一のタイプの少なくとも１つの粒子に結合するステップの文脈において、本明細書において上記のセクション「オリゴヌクレオチド」にさらに記載される。
したがって、一部の実施態様では、複数のリザーバーに関して、前記の少なくとも１つのバーコード配列は、リザーバーの表面に共有結合または非共有結合される。「非共有結合」、「共有結合」、「ストレプトアビジン」は、本明細書において上記のセクション「オリゴヌクレオチド」において定義されるとおりである。
好ましい実施態様では、非共有結合はストレプトアビジン−ビオチン結合である。
ストレプトアビジン−ビオチン結合は、当業者に公知である。したがって、一例では、リザーバーの表面は、例えば、本明細書において上記のセクション「オリゴヌクレオチド」において定義されるヒドロゲルによってコーティングされて、前記ヒドロゲルは、ストレプトアビジンによって官能化されてよく、前記の少なくとも１つのバーコード配列は、ビオチンによって官能化される。
一部の実施態様では、前記の少なくとも１つのバーコード配列が１よりも多いバーコード配列を指す場合、一部の実施態様では、バーコード配列は、リザーバーの表面に連続して結合されることが当業者によって理解される。したがって、第一のバーコード配列は、本明細書において上記に記載のリザーバーの表面に結合して、それから、第二のバーコード配列が第一のバーコード配列に付着して、バーコード配列の数に応じて、最終的に、第三のバーコード配列が第二のバーコード配列に付着されるなどである。
代替の実施態様では、バーコード配列は互いに付着されて、前記（少なくとも１つ）のバーコード配列をリザーバーの表面に結合する前に、１つのバーコード配列をもたらす。
一部のさらなる実施態様では、前記の少なくとも１つのバーコード配列は、ＵＭＩ配列にさらに付着されて、ここで前記ＵＭＩ配列は、本明細書において上記のセッション「オリゴヌクレオチド」において定義されるとおりである。
核酸を互いに付着させる方法、または、２つのバーコード配列またはＵＭＩ配列をバーコード配列に付着させる方法は、当業者に公知であり、限定されないが、リガーゼの使用を含み、および／または、アニーリングまたはプライマー伸長方法を用いる。
したがって、一部の実施態様では、前記の少なくとも１つのバーコード配列および前記の少なくとも１つの色素が提供される溶液は、リガーゼをさらに含む。リガーゼの例は、本明細書において上記のセクション「オリゴヌクレオチド」に与えられる。
前記の少なくとも１つのバーコードをリザーバーの表面に結合するために用いられる結合タイプとは独立に、バーコード配列は、少なくとも１つのリンカー配列をさらに含んでよい。
一部の実施態様では、バーコード配列は、５’末端または３’末端、好ましくは５’末端を用いて、好ましくは表面に結合される。
一部の実施態様では、前記の少なくとも１つのバーコード配列が１よりも多いバーコード配列を指す場合、ウェルの表面に結合されている第一のバーコード配列（すなわち、５’末端または３’末端、好ましくは５’末端に位置するバーコード配列）は、その５’末端または３’末端、好ましくは５’末端に、少なくとも１つのリンカー配列を含むことが、当業者によって理解される。
一部の実施態様では、「リンカー配列」は、それを用いて前記の少なくとも１つのバーコードが任意選択でリザーバーの表面に結合されている配列である。
「本明細書において、任意選択で結合される」は、本明細書において以下にさらに説明されるように、少なくとも１つのバーコード配列が少なくとも１つのプライマー配列に好ましく付着されるように、少なくとも１つのバーコード配列が放出される可能性を指す。
好ましくは、リンカー配列は、本明細書において上記のセクション「オリゴヌクレオチド」において定義されるように、切断可能なリンカー配列である。
したがって、一部の実施態様では、本発明のプロセスは、リザーバーの表面に結合された少なくとも１つのバーコード配列を放出するステップをさらに含む。
一部の実施態様では、当該方法が、本明細書において以下にさらに説明されるように液滴内で行なわれる場合、前記の少なくとも１つのバーコード配列は、特に、少なくとも１つのＲＴ液滴内に放出される。
一部の実施態様では、前記の少なくとも１つのバーコード配列は、ＲＴ液滴をリザーバーの表面と接触させることにより、少なくとも１つのＲＴ液滴内に放出される。
一部の実施態様では、ＲＴ液滴は、濡らすステップによって表面と接触される。
したがって、一部の実施態様では、前記の少なくとも１つのバーコード配列は、濡らすステップによって少なくとも１つのＲＴ液滴内に放出される。
「濡らすステップ」は、本明細書において、半固形または固相上の液相の表面エネルギーの変化を指す。
さらに、一部の実施態様では、リザーバーの表面に結合された前記の少なくとも１つのバーコード配列は、単一細胞の核酸を逆転写する前に前記表面から放出される。
さらに、一部の実施態様では、リザーバーの表面に結合された前記の少なくとも１つのバーコード配列は、少なくとも１つの単一細胞を溶解する前に前記表面から放出される。
液滴内で行なわれる場合、一部の実施態様では、リザーバーの表面に結合された前記の少なくとも１つのバーコード配列は、少なくとも１つの単一細胞の液滴およびＲＴ液滴を融合する前に、前記表面から放出される。
一部の実施態様では、前記の少なくとも１つのバーコードは、酵素、求核／塩基性試薬、還元剤、光照射、求電子／酸性試薬、有機金属および金属試薬、および酸化試薬のような任意の手段を用いて放出され得る。
一部の実施態様では、前記の少なくとも１つのバーコードは、酵素および／または光切断を用いて放出され得る。例えば、エンドヌクレアーゼは、リンカー配列または任意の他の配列を切断してリザーバーの表面から前記の少なくとも１つのバーコード配列を放出するために用いられ得る。
さらなる実施態様では、前記の少なくとも１つのバーコード配列を放出するステップは、本明細書において上記のセクション「オリゴヌクレオチド」において記載されるストレプトアビジンビオチン結合のような結合を破壊するステップを指す。
一部の実施態様では、前記の少なくとも１つのバーコードは、ストレプトアビジンの酵素的消化によって放出される。
バーコード配列を放出するのに必要な構成要素は、複数のリザーバーのそれぞれにおいて、または、液滴内、例えばＲＴ液滴内で行なわれる場合、典型的に、ＲＴ液滴が表面と接触された場合に前記の少なくとも１つのバーコード配列が放出されるように、当業者に公知の任意の方法によって提供され得ることが、当業者によって理解される。
プロセスのステップｂ）において、複数のリザーバーに関して、少なくとも１つの単一細胞は、それぞれのリザーバー内に提供される。
「少なくとも１つの単一細胞」は、本明細書において上記のセクション「単一細胞」において定義されて、好ましくは、１つの単一細胞を指す。
「表現型アッセイ」は、本明細書において、細胞の表現型、より具体的には単一細胞の表現型を同定することを可能にする方法を指す。「表現型」は、本明細書において上記に定義されるとおりである。
一部の実施態様では、表現型アッセイは、ＤＮＡ配列の検出；ＲＮＡ配列の検出；タンパク質、炭水化物、脂質、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される分子の検出；小分子の検出；活性の検出；イオン濃度の検出；イオン潜在性の検出；還元−酸化の潜在性の検出から選択される。
表現型アッセイに応じて、前記の少なくとも１つの単一細胞は、任意の適切なアッセイ方法を用いて選択パラメーターに関して分析され得て、定性的および／または定量的であってよい。適切な検出方法は、とりわけ、分光学的方法、電気的方法、流体力学的方法、イメージング方法、および／または生物学的方法、特に、単一細胞の分析に適用されるものまたは適用可能なものを含んでよい。これらの方法は、とりわけ、単一または多数の値、時間依存的または時間非依存性（例えば、安定状態またはエンドポイント）値、および／または、平均または（時間的および／または空間的に）分散した値の検出を含んでよい。これらの方法は、アナログおよび／またはデジタル値を測定および／または出力し得る。
「分光学的方法」は一般に、光（または波状粒子）の任意の特性、特に、サンプルとの相互作用を介して変更される特性の検出を含んでよい。適切な分光学的方法は、とりわけ、吸収、発光（光発光、化学発光、および電気化学発光を含む）、磁気共鳴（核および電子スピン共鳴を含む）、散乱（光散乱、電子散乱、および中性子散乱を含む）、回折、円偏光二色性、および旋光を含んでよい。
適切な「光発光方法」は、とりわけ、生物発光共鳴エネルギー伝達（ＢＲＥＴ）、蛍光強度（ＦＬＩＮＴ）、蛍光偏光（ＦＰ）、蛍光共鳴エネルギー伝達（ＦＲＥＴ）、蛍光寿命（ＦＬＴ）、全内反射蛍光（ＴＩＲＦ）、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）、光漂白後蛍光回復法（ＦＲＡＰ）、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、およびそれらのリン光および他のアナログを含んでよい。
当業者によって理解されるように、一部の実施態様では、表現型アッセイの実施は、細胞を試薬に曝露するステップをさらに必要とする。
したがって、一部の実施態様では、単一細胞は、パラメーター測定前、測定中、または測定後に、１つまたは複数の試薬に曝される。
一部の実施態様では、単一細胞は、ステップｂ）において提供される前に、１つまたは複数の試薬に曝される。
一部の実施態様では、言及される試薬は、限定されないが、化学的／生物学的細胞モジュレーター、検出／アッセイ試薬、溶媒、バッファー、培地、洗浄溶液を含む。
「化学的モジュレーターまたは生物学的モジュレーター」は、細胞との相互作用に関して試験される任意の試薬を含んでよい。相互作用は一般に、粒子に対する特異的な結合および／または粒子（またはモジュレーター）に対する任意の検出可能な遺伝子型および／または表現型の効果を含む。化学的／生物学的モジュレーターは、受容体と相互作用するリガンド（例えば、アンタゴニスト、アゴニスト、ホルモンなど）、イオン、気体、炭水化物、脂質、有機物、ポリマー、タンパク質、小分子、または核酸、特にｓｉＲＮＡを含んでよい。
「検出／アッセイ試薬」は、とりわけ、染料、色素、ラベル、酵素、基質、補助因子、および／または特異的結合パートナー（ＳＢＰ）を含んでよい。
一部の実施態様では、ステップｂ）における「画像を撮るステップ」は、用いられる表現型アッセイに適用される当業者に公知の任意の方法、典型的に、分光学的方法を用いて、画像を撮るステップを指す。特に、画像を撮るステップは、アレイまたはラインカメラを備えた明視野顕微鏡または蛍光顕微鏡を用いて画像を撮るステップを指す。
当業者は、用いられる試薬と用いられる表現型アッセイの適用の仕方、および、画像を撮るための技術を知っている。
ステップｂ）における画像を撮るステップは、それぞれのリザーバーに関して、それぞれのリザーバー内に含まれる単一細胞の表現型のマッピングをもたらす。
したがって、ステップａ）において得られた画像およびステップｂ）において得られた画像に基づいて、ステップｃ）において、当業者は、複数のリザーバーに関して、１つのリザーバー内でステップｂ）において得られた表現型を、同一のリザーバーに関してステップａ）において得られた前記の少なくとも１つの色素の色および強度に関連付けることができ、ステップａ）において得られた前記の少なくとも１つの色素の色および強度は、前記の同一のリザーバー内に提供された少なくとも１つのバーコード配列と関連する。
したがって、当業者はしたがって、ステップｃ）において、複数のリザーバーに関して、１つのリザーバー内で観察される少なくとも１つの単一細胞の表現型を、前記の同一のリザーバー内に提供された少なくとも１つのバーコード配列と関連付けることができる。
一部の実施態様では、プロセスは、以下のステップから選択される少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１のステップをさらに含む：
−少なくとも１回のパージするステップ、
−複数のリザーバーに関して、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドをそれぞれのリザーバーに関して提供するステップ（ここで前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、プライマー配列を含む）、
−複数のリザーバーに関して、前記の少なくとも１つのバーコード配列をそれぞれのリザーバーに関して前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに付着させるステップ、
−複数のリザーバーに関して、溶解組成物をそれぞれのリザーバーに関して提供するステップ、
−複数のリザーバーに関して、前記の少なくとも１つの単一細胞をそれぞれのリザーバーに関して溶解させるステップ、
−複数のリザーバーに関して、逆転写酵素および逆転写酵素組成物をそれぞれのリザーバーに関して提供するステップ、
−複数のリザーバーに関して、単一細胞の核酸の少なくとも一部をそれぞれのリザーバーに関して前記の少なくとも１つのバーコード化されたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするステップ、
−バーコード化された単一細胞ｃＤＮＡを回収するステップ、
−前記のバーコード化されたｃＤＮＡから、取り込まれていないオリゴヌクレオチドを除去するステップ、
−バーコード化された単一細胞ｃＤＮＡを増幅するステップ、
−バーコード化された単一細胞ｃＤＮＡをシーケンスするステップ。
これらのさらなるステップは、「単一細胞の核酸をバーコード化するためのマイクロ流体のプロセス」の文脈で、本明細書において上記に説明した。したがって、上述のステップに関する説明全体における実施態様および特徴は、それらの全体でこれらのステップに適用可能であることが、当業者によって理解される。
例えば、セクション「液滴の調製」、「オリゴヌクレオチド」、「逆転写」および「単一細胞の核酸をバーコード化するためのマイクロ流体のプロセス」における、「少なくとも１つのオリゴヌクレオチド」に対して言及する説明は、「目的の表現型を有する単一細胞を遺伝子型決定するためのプロセス」と呼ばれるセクションに完全に適用可能である。セクション「定義」、「逆転写」、「オリゴヌクレオチド」および「単一細胞の核酸をバーコード化するためのマイクロ流体のプロセス」における「プライマー」または「プライマー配列」に対して言及する説明は、「目的の表現型を有する単一細胞を遺伝子型決定するためのプロセス」と呼ばれるセクションに完全に適用可能である。
当業者によって理解されるように、「それぞれのリザーバーにおいて、前記の少なくとも１つのバーコード配列を前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに付着させる」ために用いられる方法は、単一細胞の核酸をバーコード化するためのプロセスにおけるステップｃ）の文脈で説明した「単一細胞のｃＤＮＡにバーコード配列を付着させる」ために用いられる方法、または、本明細書において上記に説明した「少なくとも１つのバーコード配列をＵＭＩ配列に付着させるステップ」または「バーコード配列を互いに付着させる」における方法と同一である。したがって、少なくとも１つのバーコード配列を少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに付着させるための方法は当業者に公知であり、典型的に、限定されないが、リガーゼの使用および／またはアニーリングまたはプライマー伸長方法の使用を含む。リガーゼの例は、本明細書において上記のセクション「オリゴヌクレオチド」に与えられる。一部の実施態様では、バーコード配列は、好ましくは、前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの５’末端において前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに付着されて、５’から３’にバーコード配列およびプライマー配列を含むオリゴヌクレオチドをもたらす。したがって、前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが少なくとも１つの粒子に結合される場合、前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、好ましくは、前記の少なくとも１つのバーコード配列を付着する前に放出される。
さらに、セクション「定義」、「細胞溶解」、「逆転写」、「オリゴヌクレオチド」および「単一細胞の核酸をバーコード化するためのマイクロ流体のプロセス」において「溶解組成物」に対して言及する説明は、「目的の表現型を有する単一細胞を遺伝子型決定するためのプロセス」と呼ばれるセクションに完全に適用可能である。同様に、セクション「細胞溶解」、「逆転写」、「オリゴヌクレオチド」および「単一細胞の核酸をバーコード化するためのマイクロ流体のプロセス」において、「少なくとも１つの単一細胞を溶解する」ステップに対して言及する説明は、「目的の表現型を有する単一細胞を遺伝子型決定するためのプロセス」と呼ばれるセクションに完全に適用可能である。
セクション「定義」、「ＲＴ液滴の調製」、「逆転写」、「オリゴヌクレオチド」および「単一細胞の核酸をバーコード化するためのマイクロ流体のプロセス」における、「逆転写酵素」および「逆転写酵素組成物」または「逆転写のステップ」に対して言及する説明は、「目的の表現型を有する単一細胞を遺伝子型決定するためのプロセス」と呼ばれるセクションに完全に適用可能である。
セクション「定義」および「単一細胞の核酸をバーコード化するためのマイクロ流体のプロセス」における、「ハイブリダイズするステップ」に対して言及する説明は、「目的の表現型を有する単一細胞を遺伝子型決定するためのプロセス」と呼ばれるセクションに完全に適用可能である。
一部の実施態様では、バーコード化された単一細胞ｃＤＮＡを回収するステップは、本明細書において、リザーバーから、逆転写によって生産されたバーコード化ｃＤＮＡを単離するステップを指す。
セクション「単一細胞の核酸をバーコード化するためのマイクロ流体のプロセス」における「取り込まれなかったオリゴヌクレオチドを除去する」ステップに対して言及する説明は、「目的の表現型を有する単一細胞を遺伝子型決定するためのプロセス」と呼ばれるセクションに完全に適用可能である。
セクション「増幅およびシーケンシング」における、「バーコード化された単一細胞ｃＤＮＡを増幅する」ステップおよび「バーコード化された単一細胞ｃＤＮＡをシーケンスする」ステップに対して言及する説明は、「目的の表現型を有する単一細胞を遺伝子型決定するためのプロセス」と呼ばれるセクションに完全に適用可能である。
ステップｂ）における単一細胞は核酸を含むことが、当業者によって理解される。
本明細書において上記に記載のように、１つのリザーバー内で少なくとも１つの単一細胞を溶解するステップは、前記リザーバー内に、単一細胞由来の核酸の放出をもたらすことが、当業者によって理解される。
一部の実施態様では、細胞を溶解するステップは、転写ステップの前に生じる。一部の好ましい実施態様では、細胞を溶解するステップは、表現型アッセイを行なうステップｂ）の後に生じる。
上記によれば、一部の実施態様において、目的の表現型を有する単一細胞を遺伝子型決定するためのマイクロ流体のプロセスは、以下を含む：
−複数のリザーバーを備えるチップを備えるマイクロ流体デバイスを提供するステップ、および
１．複数のリザーバーに関して、少なくとも１つのバーコード配列および少なくとも１つの色素をそれぞれのリザーバーに関して提供するステップ（ここで前記の少なくとも１つのバーコード配列は、前記の少なくとも１つの色素の色および濃度と関連する）、および、アレイの画像を撮って、それにより、それぞれのリザーバーに関して色素の色および強度をマッピングするステップ；および
２．複数のリザーバーに関して、少なくとも１つの単一細胞をそれぞれのリザーバーに関して提供するステップ、および、前記の少なくとも１つの単一細胞に対して表現型アッセイをそれぞれのリザーバーに関して行なうステップ、および、画像を撮って、それにより、それぞれのリザーバーに関して前記の少なくとも１つの単一細胞の表現型をマッピングするステップ；
ここでステップａ）はステップｂ）の前に行なわれる、または、ステップｂ）はステップａ）の前に行なわれる；それから
３．複数のリザーバーに関して、ステップｂ）において得られた表現型をそれぞれのリザーバーに関して、ステップａ）において得られた色素の色および強度に関連付けるステップ；および
−任意選択で、複数のリザーバーに関して、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドをそれぞれのリザーバーに関して提供するステップ（ここで前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、プライマー配列を含む）、
−任意選択で、複数のリザーバーに関して、前記の少なくとも１つのバーコード配列をそれぞれのリザーバーに関して前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに付着させるステップ、
−任意選択で、複数のリザーバーに関して、溶解組成物をそれぞれのリザーバーに関して提供するステップ、
−任意選択で、複数のリザーバーに関して、前記の少なくとも１つの単一細胞をそれぞれのリザーバーに関して溶解させるステップ、
−任意選択で、複数のリザーバーに関して、逆転写酵素および逆転写酵素組成物をそれぞれのリザーバーに関して提供するステップ、
−任意選択で、複数のリザーバーに関して、前記の単一細胞の核酸の少なくとも一部をそれぞれのリザーバーに関して前記の少なくとも１つのバーコード化されたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするステップ、
−複数のリザーバーに関して、前記の少なくとも１つの単一細胞の核酸をそれぞれのリザーバーに関して逆転写して、前記の少なくとも１つの色素の色および濃度と関連する前記の少なくとも１つのバーコード配列によってバーコード化された単一細胞のｃＤＮＡを得るステップ；
−任意選択で、バーコード化された単一細胞ｃＤＮＡを回収するステップ、
−任意選択で、前記のバーコード化されたｃＤＮＡから、取り込まれていないオリゴヌクレオチドを除去するステップ、
−任意選択で、バーコード化された単一細胞ｃＤＮＡを増幅するステップ、
−任意選択で、バーコード化された単一細胞ｃＤＮＡをシーケンスするステップ、および
−前記の少なくとも１つの単一細胞の表現型と遺伝子型を関連付けるステップ。
一部の実施態様では、目的の表現型を有する単一細胞を遺伝子型決定するためのプロセスは、液滴内で行なわれる。液滴は、本明細書において上記のセクション「液滴」において定義されるとおりである。
したがって、少なくとも１つの単一細胞は、単一細胞の液滴と呼ばれる液滴内に提供される。「液滴」、「単一細胞」および「単一細胞の核酸をバーコード化するためのマイクロ流体のプロセス」のような以前のセクションにおける、「単一細胞の液滴」に対して言及する説明は、「目的の表現型を有する単一細胞を遺伝子型決定するためのプロセス」と呼ばれるセクションに完全に適用可能である。
関連する実施態様では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドおよび逆転写酵素は、本明細書においてＲＴ液滴と呼ばれる液滴内に提供される。したがって、「定義」、「液滴」、「液滴の調製」、「単一細胞」、「細胞溶解」、「逆転写」、「オリゴヌクレオチド」および「単一細胞の核酸をバーコード化するためのマイクロ流体のプロセス」のような先行するセクションにおける、「ＲＴ液滴」に対して言及する説明は、「目的の表現型を有する単一細胞を遺伝子型決定するためのプロセス」と呼ばれるセクションに完全に適用可能である。
当業者によって理解されるように、特定の実施態様では、ＲＴ液滴または単一細胞の液滴は、「単一細胞の核酸をバーコード化するためのマイクロ流体のプロセス」の文脈において本明細書において上記に説明されるように、最初に提供され得る。したがって、一部の実施態様では、プロセスは、以下のステップを含む：
−マイクロ流体チャネルの入口に、担体流体内に分散された第一のタイプの複数の液滴を含む担体流体を注入するステップ（ここで、第一のタイプの液滴は、単一細胞の液滴またはＲＴ液滴のいずれかであり、ここで、ＲＴ液滴の少なくとも一部は、逆転写酵素および少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含み、およびここで、単一細胞の液滴の少なくとも一部は、１つの単一細胞を含み、ここで、前記単一細胞は、単一細胞の核酸を含む）、
−複数のリザーバーに関して、第一の移行ステップ（ここで、複数の液滴のうち、第一のタイプの少なくとも１つの液滴は、前記の複数のリザーバーの１つのリザーバーの中に入る）、
−マイクロ流体チャネルの入口に、担体流体内に分散された第二のタイプの複数の液滴を含む担体流体を注入するステップ（ここで、第二のタイプの液滴は、単一細胞の液滴またはＲＴ液滴のいずれかであり、およびここで、第一のタイプの液滴が単一細胞の液滴である場合は第二のタイプの液滴はＲＴ液滴であり、または、第一のタイプの液滴がＲＴ液滴である場合は第二のタイプの液滴は単一細胞の液滴である）、
−複数のリザーバーに関して、第二の移行ステップ（ここで、第二のタイプの１つの液滴の少なくとも一部は、前記の複数のリザーバーの１つのリザーバー内に入る）。
セクション「単一細胞の核酸をバーコード化するためのマイクロ流体のプロセス」におけるこれらのステップに対して言及する説明は、「目的の表現型を有する単一細胞を遺伝子型決定するためのマイクロ流体のプロセス」と呼ばれるセクションに完全に適用可能である。
一部の実施態様では、これらのステップは、それぞれのリザーバーに関して前記の少なくとも１つの単一細胞に対する表現型アッセイを行なうステップｂ）の前に行なわれてよい。当業者によって理解されるように、本明細書において上記に記載されるステップｂ）の表現型アッセイは、液滴内に存在する場合は単一細胞に対して行なわれ得る。
当業者によってさらに理解されるように、表現型アッセイは、単一細胞の液滴が複数のリザーバー内に提供される場合、または、単一細胞の液滴およびＲＴ液滴の両方が複数のリザーバー内に提供される場合に行なわれ得る。
一部の実施態様では、第一の移行ステップにおいて、複数の液滴のうち、第一のタイプの少なくとも１つの液滴は、浮力、流体力学的な力によって、または物理場（ｐｈｙｃｓｉｃａｌ ｆｉｅｌｄ）、好ましくは浮力によって、前記の複数のリザーバーの１つのリザーバーの中に入る。
当業者によってさらに理解されるように、プロセスが液滴内で行なわれる場合、当該方法は、
−複数のリザーバーに関して、前記の第一のタイプの少なくとも１つの液滴を、それぞれのリザーバー内、またはその縁で、前記の第二のタイプの少なくとも１つの液滴と融合して、それにより、融合液滴をもたらすステップをさらに含む。
好ましい一実施態様では、融合するステップは、表現型アッセイを行なうステップｂ）の後に好ましくは行なわれる。
「単一細胞の核酸をバーコード化するためのマイクロ流体のプロセス」のような以前のセクションにおける融合するステップに対して言及する説明は、「目的の表現型を有する単一細胞を遺伝子型決定するためのマイクロ流体のプロセス」と呼ばれるセクションに完全に適用可能である。
一部の実施態様では、プロセスが液滴内で行なわれる場合、前記の少なくとも１つのバーコード配列および前記の少なくとも１つの色素は、本明細書において上記に定義されるそれぞれのリザーバー内に提供される。したがって、一部の実施態様では、ステップａ）において前記の少なくとも１つの色素の画像を撮った後に、前記の少なくとも１つのバーコード配列は、例えば本明細書において上述した濡らすステップによって、ＲＴ液滴内に取り込まれる。
あるいは、一部の実施態様では、前記の少なくとも１つのバーコード配列および前記の少なくとも１つの色素は、逆転写酵素および複数のＲＴ液滴のＲＴ液滴内の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドと一緒に提供される。
関連する実施態様では、前記の少なくとも１つのバーコード配列は、ＲＴ液滴内に存在する前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに付着されて、少なくとも１つのバーコード化されたオリゴヌクレオチドをもたらす。バーコード配列をオリゴヌクレオチドに付着する方法は、本明細書において上記に記載される。一部の関連する実施態様では、ＲＴ液滴は、リガーゼをさらに含む。
「目的の表現型を有する単一細胞を遺伝子型決定するためのプロセス」が液滴内で行なわれる場合、プロセスは、ステップｃ）の後に、以下のステップをさらに含む：
−それぞれの融合液滴に関して、少なくとも１つの細胞由来の単一細胞の核酸の少なくとも一部を、前記の少なくとも１つのバーコード化されたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせるステップ、
−それぞれの融合液滴において、前記融合液滴内に存在する単一細胞の核酸の少なくとも一部を逆転写して、それにより、バーコード化された単一細胞のｃＤＮＡをもたらすステップ（ここで前記バーコード配列は、前記単一細胞の同一性をコードする）。
「単一細胞の核酸をバーコード化するためのマイクロ流体のプロセス」のような以前のセクションにおける、ハイブリダイズおよび逆転写のステップに対して言及する説明は、「目的の表現型を有する単一細胞を遺伝子型決定するためのマイクロ流体のプロセス」と呼ばれるセクションに完全に適用可能である。
液滴内で行なわれる場合、本発明のプロセスは、逆転写ステップの後にチャネルの出口において融合液滴を回収するステップをさらに含む。「融合液滴を回収するステップ」は、本明細書において、セクション「単一細胞の核酸をバーコード化するためのマイクロ流体のプロセス」において本明細書において上記に記載のバーコード化ｃＤＮＡを含むマイクロ流体の液滴を集めるステップを指す。
「少なくとも１つのオリゴヌクレオチド」に関して、一部の実施態様では、前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、第一のタイプの少なくとも１つの粒子に結合される。一部の実施態様では、前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、はじめに前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを第一のタイプの少なくとも１つの粒子に結合することによって、リザーバーまたは液滴、特にＲＴ液滴内に導入される。
したがって、セクション「オリゴヌクレオチド」および「単一細胞の核酸をバーコード化するためのマイクロ流体のプロセス」のような以前のセクションにおける、第一のタイプの少なくとも１つの粒子に結合した少なくとも１つのオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｉｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）に対して言及する説明は、「目的の表現型を有する単一細胞を遺伝子型決定するためのマイクロ流体のプロセス」と呼ばれるセクションに完全に適用可能である。
したがって、一部の実施態様では、前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、前記の第一のタイプの少なくとも１つの粒子に共有結合または非共有結合されて、ここで、「共有結合」または「非共有結合」および「第一のタイプの少なくとも１つの粒子」は、本明細書において上記のセクション「オリゴヌクレオチド」において定義される。
第一のタイプの粒子に少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドを結合するために用いられる結合のタイプとは独立に、前記の少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのリンカー配列をさらに含んでよく、前記リンカー配列は、本明細書において上記のセクション「オリゴヌクレオチド」において定義されるとおりである。
したがって、さらなる実施態様では、「少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチド」または単に「オリゴヌクレオチド」は、少なくとも１つのリンカー配列をさらに含み、前記リンカー配列は、好ましくは５’末端または３’末端、より好ましくは５’末端に含まれる。
したがって、一部の実施態様では、前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、３’末端または５’末端、好ましくは５’末端を介して、第一のタイプの粒子に結合されることが、当業者によって理解される。
一部の実施態様では、本発明のプロセスは、第一のタイプの少なくとも１つの粒子に結合した前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを、リザーバーまたはＲＴ液滴内に取り込まれた後に、前記粒子から放出するステップをさらに含む。
さらに、一部の実施態様では、はじめに第一のタイプの少なくとも１つの粒子に結合された前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、単一細胞の核酸を逆転写する前に、前記の第一のタイプの少なくとも１つの粒子から放出される。
さらに、一部の実施態様では、はじめに第一のタイプの少なくとも１つの粒子に結合された前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、前記の少なくとも１つのバーコードに付着する前または後に、前記の第一のタイプの少なくとも１つの粒子から放出される。
前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを放出するステップは、単一細胞およびＲＴ液滴を融合する前または後；好ましくは、液滴を融合する前に生じ得る。
前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを放出するステップは、単一細胞を溶解した後であるが単一細胞の核酸を逆転写する前に生じ得る。
１つのリザーバーまたは液滴内に存在するオリゴヌクレオチドの数は、１つの単一細胞から転写およびバーコード化される異なる核酸の数、特にＲＮＡの数に適合されることが、当業者によって理解される。リザーバーまたは液滴内のオリゴヌクレオチドの数は、セクション「オリゴヌクレオチド」においてＲＴ液滴内のオリゴヌクレオチドの適合に関して説明したのと同一の様式で適合される。したがって、表現「少なくとも１つのオリゴヌクレオチド」における「少なくとも１つ」は、１つのリザーバーまたは液滴内に存在する異なるオリゴヌクレオチドの数を指し、ここで、前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの１つのオリゴヌクレオチドは、そのプライマー配列によって別のオリゴヌクレオチドとは異なる。表現「少なくとも１つのオリゴヌクレオチド」における「少なくとも１つ」は、セクション「オリゴヌクレオチド」において定義されるとおりである。
前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの濃度は、本明細書において上記のセクション「オリゴヌクレオチド」において定義されるとおりである。
前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの濃度は、少なくとも１０ｎＭ、好ましくは少なくとも１００ｎＭである。
本出願全体を通して、用語「および／または」は、それが繋ぐ１つまたは複数のケースが生じ得ることを包含するものとして解釈される文法的接続詞である。例えば、語句「配列がエラーの検出および／または修正を可能にする」における表現「エラーの検出および／または修正」は、配列がエラーの検出を可能にし得ることおよび配列がエラーの修正を可能にし得ること、または、配列がエラーの検出を可能にし得ることまたは配列がエラーの修正を可能にし得ることを示す。
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が明確に別段の指示をしない限り、複数の言及、例えば言及される複数の物を含む。
本出願全体を通して、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、全ての、明示して述べられた特徴、ならびに、任意選択の、さらなる、明示していないものも包含すると解釈されるべきである。本明細書において用いられる用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の使用は、明示して述べられた特徴以外の特徴が存在しない実施態様（すなわち「からなる」）も開示する。
説明全体において、１つのセクションにおいて説明される特徴は、本説明の他のセクションに完全に適用可能である。したがって、本発明は、説明の異なるセクションにおいて説明される実施態様の組み合わせをさらに含む。

Claims (15)

  1. 目的の表現型を有する単一細胞を遺伝子型決定するためのプロセスであって：
    −複数のリザーバーを提供するステップ、および
    ａ）複数のリザーバーに関して、少なくとも１つのバーコード配列および少なくとも１つの色素をそれぞれのリザーバーに関して提供するステップ、ここで前記の少なくとも１つのバーコード配列は、前記の少なくとも１つの色素の色および濃度と関連する、および、アレイの画像を撮って、それにより、それぞれのリザーバーに関して前記の少なくとも１つの色素の色および強度をマッピングするステップ；および
    ｂ）複数のリザーバーに関して、少なくとも１つの単一細胞をそれぞれのリザーバーに関して提供して、前記の少なくとも１つの単一細胞に対して表現型アッセイをそれぞれのリザーバーに関して行なうステップ、および、画像を撮って、それにより、それぞれのリザーバーに関して前記の少なくとも１つの単一細胞の前記表現型をマッピングするステップ；
    ここでステップａ）はステップｂ）の前に行なわれる、または、ステップｂ）はステップａ）の前に行なわれる；それから、
    ｃ）複数のリザーバーに関して、ステップｂ）において得られた単一細胞の表現型を、それぞれのリザーバーに関して、ステップａ）において得られた前記の少なくとも１つの色素の色および強度に対して関連付けるステップ；および
    −複数のリザーバーに関して、前記の少なくとも１つの単一細胞の核酸をそれぞれのリザーバーに関して逆転写して、前記の少なくとも１つの色素の色および濃度と関連する前記の少なくとも１つのバーコード配列でバーコード化された単一細胞ｃＤＮＡを得るステップ；および
    −前記の少なくとも１つの単一細胞の表現型と前記遺伝子型を関連付けるステップ、を含む、
    プロセス。
  2. 請求項１に記載のマイクロ流体のプロセスであって、
    前記方法は：
    −少なくとも１回のパージするステップ、
    −複数のリザーバーに関して、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドをそれぞれのリザーバーに関して提供するステップ、ここで前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、プライマー配列を含む、
    −複数のリザーバーに関して、前記の少なくとも１つのバーコード配列をそれぞれのリザーバーに関して前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに付着させるステップ、
    −複数のリザーバーに関して、溶解組成物をそれぞれのリザーバーに関して提供するステップ、
    −複数のリザーバーに関して、前記の少なくとも１つの単一細胞をそれぞれのリザーバーに関して溶解させるステップ、
    −複数のリザーバーに関して、逆転写酵素および逆転写酵素組成物をそれぞれのリザーバーに関して提供するステップ、
    −複数のリザーバーに関して、前記の単一細胞の核酸の少なくとも一部をそれぞれのリザーバーに関して前記の少なくとも１つのバーコード化されたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするステップ、
    −前記のバーコード化された単一細胞ｃＤＮＡを回収するステップ、
    −前記のバーコード化されたｃＤＮＡから、取り込まれていないオリゴヌクレオチドを除去するステップ、
    −前記のバーコード化された単一細胞ｃＤＮＡを増幅するステップ、
    −前記のバーコード化された単一細胞ｃＤＮＡをシーケンスするステップ、
    からなる群より選択される少なくとも１つのステップをさらに含む、
    プロセス。
  3. 請求項１または２に記載のマイクロ流体のプロセスであって、
    前記プロセスは、少なくとも１つのマイクロ流体チャネルおよび複数のリザーバーを備えるチップを備えるマイクロ流体デバイスを提供するステップを含むマイクロ流体のプロセスである、
    プロセス。
  4. 請求項３に記載のマイクロ流体のプロセスであって、
    それぞれのリザーバーに関して、前記の少なくとも１つの単一細胞が、単一細胞の液滴において提供される、
    プロセス。
  5. 請求項３または４に記載のマイクロ流体のプロセスであって、
    それぞれのリザーバーに関して、前記の逆転写酵素、前記の逆転写酵素組成物および前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、ＲＴ液滴において提供される、
    プロセス。
  6. 請求項１から５のいずれか一項に記載のマイクロ流体のプロセスであって、
    複数のリザーバーに関して、前記の少なくとも１つのバーコード配列は、前記の複数のリザーバーのそれぞれのリザーバーの表面に結合される、
    プロセス。
  7. 請求項６に記載のマイクロ流体のプロセスであって、
    前記の少なくとも１つのバーコード配列は、転写の前に放出される、
    プロセス。
  8. 単一細胞の核酸をバーコード化するためのマイクロ流体のプロセスであって、
    前記方法は：
    −少なくとも１つのマイクロ流体チャネルおよび複数のリザーバーを備えるチップを備えるマイクロ流体デバイスを提供するステップ、
    −前記マイクロ流体チャネルの入口に、担体流体内に分散された第一のタイプの複数の液滴を含む担体流体を注入するステップ、ここで、前記の第一のタイプの液滴は、単一細胞の液滴またはＲＴ液滴のいずれかであり、ここで、前記ＲＴ液滴の少なくとも一部は、逆転写酵素および少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含み、およびここで、前記の単一細胞の液滴の少なくとも一部は、１つの単一細胞を含み、ここで、前記単一細胞は、単一細胞の核酸を含む、
    −複数のリザーバーに関して、第一の移行ステップ、ここで、前記の複数の液滴のうちの前記の第一のタイプの少なくとも１つの液滴は、浮力によって前記の複数のリザーバーの１つのリザーバー内に動かされる、
    −前記マイクロ流体チャネルの入口に、担体流体内に分散された第二のタイプの複数の液滴を含む担体流体を注入するステップ、ここで、前記の第二のタイプの液滴は、単一細胞の液滴またはＲＴ液滴のいずれかであり、およびここで、前記の第一のタイプの液滴が単一細胞の液滴である場合は前記の第二のタイプの液滴はＲＴ液滴であり、または、前記の第一のタイプの液滴がＲＴ液滴である場合は前記の第二のタイプの液滴は単一細胞の液滴である、
    −複数のリザーバーに関して、第二の移行ステップ、ここで、前記の第二のタイプの少なくとも１つの液滴の少なくとも一部は、前記の複数のリザーバーの１つのリザーバーの中に入る、
    −複数のリザーバーに関して、前記の第一のタイプの少なくとも１つの液滴を、それぞれのリザーバー内、またはその縁で、前記の第二のタイプの少なくとも１つの液滴と融合して、それにより、融合液滴をもたらすステップ、を含み、
    −および、以下のステップをさらに含む：
    ａ）それぞれの融合液滴に関して、前記融合液滴内で、前記の単一細胞の核酸の少なくとも一部を前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせるステップ、
    ｂ）それぞれの融合液滴内で、前記融合液滴内に存在する前記の単一細胞の核酸の少なくとも一部を逆転写して、それにより、単一細胞のｃＤＮＡをもたらすステップ、および
    ｃ）ステップｂ）において得られた単一細胞のｃＤＮＡに、少なくとも１つのバーコード配列を付着させるステップ、ここで前記の少なくとも１つのバーコード配列は、前記単一細胞の同一性をコードする、
    または
    −以下のステップをさらに含む：
    ａ）それぞれの融合液滴に関して、前記の融合液滴内で、少なくとも１つの細胞由来の単一細胞の核酸の少なくとも一部を前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせるステップ、ここで前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのバーコード配列を含む、
    ｂ）それぞれの融合液滴内で、前記の融合液滴内に存在する前記の単一細胞の核酸の少なくとも一部を逆転写して、それにより、バーコード化された単一細胞のｃＤＮＡをもたらすステップ、ここで前記の少なくとも１つのバーコード配列は、前記単一細胞の同一性をコードする、
    プロセス。
  9. 請求項８に記載のマイクロ流体のプロセスであって、
    前記ＲＴ液滴は、前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが結合した第一のタイプの少なくとも１つの粒子をさらに含む、
    プロセス。
  10. 請求項８または９に記載のマイクロ流体のプロセスであって、
    前記ＲＴ液滴は、ポリマーをさらに含む、
    プロセス。
  11. 請求項８から１０のいずれか一項に記載のマイクロ流体のプロセスであって、
    前記の第一のタイプの複数の液滴は、１ｐＬ〜３０００ｐＬの平均容量を有する、
    プロセス。
  12. 請求項８から１１のいずれか一項に記載のマイクロ流体のプロセスであって、
    前記の第二のタイプの複数の液滴は、１０ｐＬ〜５０００ｐＬの平均容量を有する、
    プロセス。
  13. 請求項８から１２のいずれか一項に記載のマイクロ流体のプロセスであって、
    前記の第一のタイプの少なくとも１つの液滴の前記の第一の移行ステップは、リザーバーの合計数の９０％〜１００％の占有をもたらす、および／または、前記の第一のタイプの注入された液滴の８０％〜１００％の捕捉効率をもたらす、
    プロセス。
  14. 請求項８から１３のいずれか一項に記載のマイクロ流体のプロセスであって、
    前記の第二のタイプの少なくとも１つの液滴の少なくとも一部は、前記の第二のタイプの少なくとも１つの液滴の合計容量の９０％〜１００％または前記の第二のタイプの少なくとも１つの液滴の合計容量の１０％〜３０％を指す、
    プロセス。
  15. 請求項８から１４のいずれか一項に記載のマイクロ流体のプロセスであって、
    前記融合ステップは、前記の第一のタイプの液滴および前記の第二のタイプの液滴の間の９０％〜１００％の融合効率をもたらす、
    プロセス。
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