JP2020511931A5 - - Google Patents

Claims (15)

1. 向上した効率で１種類以上の遺伝子産物の発現を変化させる方法、および／または、向上した効率でのゲノム編集の方法であって、
   細胞内に、下記（ａ）〜（ｃ）を導入する工程を含み、
   （ａ）上記細胞の上記ゲノム内において上記遺伝子産物をコードする遺伝子内にある特定の標的配列に、２本鎖切断を導入する外来性酵素；
   （ｂ）上記２本鎖切断箇所において相同組み換えによって上記ゲノム内に挿入される、所定の核酸配列をコードする外来性核酸分子；および、
   （ｃ）外来性リコンビナーゼ；
   上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の要素は、上記細胞内で共発現しており、
   好ましくは、上記リコンビナーゼは、核酸ベクターによって導入され、
   好ましくは、上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の要素をコードする核酸配列は、真核細胞内での発現のためにコドン最適化されており、
   これにより、上記宿主細胞のゲノム内の標的箇所に２本鎖切断が導入される効率が向上し、
   上記所定の核酸配列をコードする上記核酸分子は、上記２本鎖切断箇所において相同組み換えによって挿入され、これによって、上記１種類以上（好ましくは２種類以上）の遺伝子産物の発現を変化させる、および／または、当該所定の遺伝子産物をコードする上記遺伝子をゲノム編集するものであり、
   上記遺伝子産物をコードする遺伝子内にある特定の標的配列に２本鎖切断を導入する上記酵素と、当該２本鎖切断箇所において上記ゲノム内に挿入される所定の核酸配列をコードする上記核酸分子とは、天然では一緒に生じないものである、
   方法。
2. 上記リコンビナーゼは、細菌性リコンビナーゼ、ウイルス性リコンビナーゼおよび哺乳動物性リコンビナーゼからなる群より選択され、
   好ましくは、上記リコンビナーゼは、Ｒａｄ５１リコンビナーゼ、ＲｅｃＡリコンビナーゼおよびＵｖｓＸリコンビナーゼからなる群より選択される、
   請求項１に記載の方法。
3. 上記細胞の上記ゲノム内において上記遺伝子産物をコードする遺伝子内にある特定の標的配列に２本鎖切断を導入する上記酵素は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＮＦヌクレアーゼ）、および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）からなる群より選択され、
   好ましくは、上記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの一部であり、
   上記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは上記標的配列とハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列をさらに含んでいる、
   請求項１に記載の方法。
4. 特定の標的配列に２本鎖切断を導入する上記酵素は、核酸ベクターによって導入され、
   好ましくは、下記（i）〜（iii）のいずれかを満たす、請求項１に記載の方法：
   （i）上記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに含んでいる；
   （ii）上記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、トランス活性化型ｃｒ配列（tracr配列）を含んでいる；
   （iii）上記ガイドＲＮＡは、tracr配列と融合したガイド配列を有している。
5. 下記（i）〜（iii）のいずれかを満たす、請求項１に記載の方法：
   （i）上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の要素は、同じまたは異なる調節要素と作動可能に関連付けられている；
   （ii）上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の要素は、ｍＲＮＡ分子にコードされている；
   （iii）上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の要素は、同じまたは異なる発現ベクター上に位置している；
   好ましくは、上記発現ベクターは、１つ以上のウイルス性発現ベクターであり、
   より好ましくは、上記１つ以上のウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルスベクターからなる群より選択される。
6. 上記細胞は真核細胞であり、
   好ましくは、上記真核細胞は哺乳動物細胞であり、
   より好ましくは、上記哺乳動物細胞はヒト細胞である、
   請求項１に記載の方法。
7. １種類以上の遺伝子産物の発現を増加または減少させる、請求項１に記載の方法。
8. 遺伝子産物の発現を変化させる効率を向上させるための、および／または、ゲノム編集の効率を向上させるための、改変された非天然のシステムであって、
   下記（ａ）〜（ｃ）を有している１つ以上の核酸配列を含んでおり、
   （ａ）上記細胞の上記ゲノム内において上記遺伝子産物をコードする遺伝子内にある特定の標的配列に、２本鎖切断を導入する酵素をコードする外来性核酸分子；
   （ｂ）上記２本鎖切断箇所において上記ゲノム内に挿入される、所定の核酸配列をコードする外来性核酸分子；および、
   （ｃ）リコンビナーゼをコードする外来性核酸配列；
   上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の要素は、細胞内で共発現可能であり、
   好ましくは、上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の要素をコードする核酸配列は、真核細胞内での発現のためにコドン最適化されており、
   上記共発現により、上記細胞のゲノム内の標的箇所に２本鎖切断が導入される効率が向上し、
   上記所定の核酸配列をコードする上記核酸分子は、上記２本鎖切断箇所において相同組み換えによって挿入され、これによって、１種類以上（好ましくは２種類以上）の上記遺伝子産物の発現を変化させる（好ましくは、１種類以上の遺伝子産物の発現を増加または減少させる）、および／または、当該所定の遺伝子産物をコードする上記遺伝子をゲノム編集するものであり、
   上記遺伝子産物をコードする遺伝子内にある特定の標的配列に２本鎖切断を導入する上記酵素と、当該２本鎖切断箇所において上記ゲノム内に挿入される所定の核酸配列をコードする上記核酸分子とは、天然では一緒に生じないものである、
   システム。
9. 上記リコンビナーゼは、細菌性リコンビナーゼ、ウイルス性リコンビナーゼおよび哺乳動物性リコンビナーゼからなる群より選択され、
   好ましくは、上記細菌性リコンビナーゼは、Ｒａｄ５１リコンビナーゼ、ＲｅｃＡリコンビナーゼおよびＵｖｓＸリコンビナーゼからなる群より選択される、
   請求項８に記載のシステム。
10. 上記細胞の上記ゲノム内において上記遺伝子産物をコードする遺伝子内にある特定の標的配列に２本鎖切断を導入する上記酵素は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＮＦヌクレアーゼ）、および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）からなる群より選択され、
    好ましくは、下記（i）〜（iv）のいずれかを満たす、請求項８に記載のシステム：
    （i）上記Ｃａｓ９ヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの一部であり、当該ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、上記標的配列とハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列をさらに含んでいる；
    （ii）上記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに含んでいる；
    （iii）上記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、トランス活性化型ｃｒ配列（tracr配列）を含んでいる；
    （iv）上記ガイドＲＮＡは、tracr配列と融合したガイド配列を有している。
11. 下記（i）〜（iii）のいずれかを満たす、請求項８に記載のシステム：
    （i）上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の要素は、同じまたは異なる調節要素と作動可能に関連付けられている；
    （ii）上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の要素は、ｍＲＮＡ分子にコードされている；
    （iii）上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の要素は、同じまたは異なる発現ベクター上に位置している；
    好ましくは、上記発現ベクターは、１つ以上のウイルス性発現ベクターであり、
    より好ましくは、上記１つ以上のウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルスベクターからなる群より選択される。
12. 上記細胞は真核細胞であり、
    好ましくは、上記真核細胞は哺乳動物細胞であり、
    より好ましくは、上記哺乳動物細胞はヒト細胞である、
    請求項８に記載のシステム。
13. 上記２本鎖切断箇所において相同組み換えによって上記ゲノム内に挿入される所定の核酸配列をコードする上記核酸分子の長さは、２５０塩基以上、５００塩基以上または１０００塩基以上である、請求項８に記載のシステム。
14. 請求項８〜１３のいずれか１項に記載のシステムを含んでいる、細胞。
15. （i）標的細胞における遺伝子発現を変化させることによる、または（ii）標的細胞のゲノムを編集することによる、疾患の処置における使用のための、請求項８〜１３のいずれか１項に記載のシステム。