JP2020500553A - Sting経路を活性化する遺伝子アジュバントの発現のためのウイルスベクター構築物 - Google Patents
Sting経路を活性化する遺伝子アジュバントの発現のためのウイルスベクター構築物 Download PDFInfo
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Abstract
Description
1.抗原または抗原性エピトープをコードする第1の核酸配列、および細胞質内ドメインがヒトIPS1またはSTING経路を活性化することができるその変異体で置換されている、エプスタインバーウイルスの潜在膜タンパク質1(LMP1)の膜貫通部分を含む融合タンパク質をコードする第2の核酸配列を含むウイルスベクターであって、ベクターのコード配列がヒト発現のためにコドン最適化されている。
典型的な実施態様において、本技術は細胞膜内の2以上のLMP1タンパク質の凝集、および/または2以上のIPS1細胞質内シグナル伝達ドメインの凝集によって免疫応答の活性化を提供する。
本明細書で使用される場合、「ワクチン」は全ての予防用および治療用ワクチンを含む。
DNA配列
配列番号1(SEQ ID NO : 1 ):
ATGGATCTGGATCTCGAAAGAGGACCTCCTGGACCTAGACGGCCTCCTAGAGGACCACCTCTGAGCAGCTCTATTGGACTGGCCCTGCTGCTGCTTCTGCTGGCTCTGCTGTTCTGGCTGTACATCATCATGAGCAACTGGACCGGCGGAGCACTGCTGGTGCTGTATGCCTTTGCTCTGATGCTGGTCATCATCATCCTGATCATCTTCATCTTCCGGCGGGACCTGCTGTGTCCTCTGGGAGCACTTTGTCTGTTGCTGCTGATGATCACCCTCCTGCTGATCGCCCTGTGGAACCTGCATGGACAGGCCCTGTATCTGGGCATCGTGCTGTTCATCTTCGGCTGCCTGCTGGTTCTCGGCCTGTGGATCTACCTGCTGGAAATCCTTTGGAGACTGGGCGCCACCATCTGGCAGCTGCTGGCCTTTTTCCTGGCCTTCTTTCTGGATATCATCCTCCTCATCATTGCCCTGTACCTGCAGCAGAACTGGTGGACCCTGCTGGTGGATCTGCTTTGGCTGCTGCTCTTTCTGGCCATCCTGATTTGGATGTACTACCACGGCCAGCGGCCTTTCGCCGAGGACAAGACCTACAAGTACATCTGCCGGAACTTCAGCAACTTCTGCAACGTGGACGTGGTGGAAATTCTGCCCTACCTGCCTTGCCTGACCGCCAGAGATCAGGACAGACTGAGAGCCACATGTACCCTGAGCGGCAACAGAGACACACTGTGGCACCTGTTCAACACCCTGCAGAGAAGGCCTGGCTGGGTCGAGTACTTTATCGCCGCTCTGAGAGGCTGCGAGCTGGTCGATCTGGCTGATGAAGTGGCCAGCGTGTACCAGAGCTACCAGCCTAGAACCAGCGACCGGCCTCCTGATCCTCTCGAACCTCCATCTCTGCCCGCCGAAAGACCTGGACCTCCTACACCAGCTGCCGCTCACAGCATCCCTTACAACAGCTGCAGAGAGAAAGAACCTAGCTACCCCATGCCTGTGCAAGAGACACAGGCCCCAGAAAGCCCTGGCGAGAATAGCGAACAGGCTCTGCAGACACTGAGCCCCAGAGCCATTCCTAGAAACCCTGATGGCGGCCCTCTGGAAAGCTCTAGTGATCTGGCCGCTCTGTCCCCTCTGACAAGCTCTGGACACCAAGAGCAGGATACCGAGCTGGGCAGCACACATACAGCCGGCGCTACAAGCAGCCTGACACCTTCTAGAGGCCCCGTGTCTCCCAGCGTGTCATTTCAGCCTCTGGCCAGGTCTACCCCTAGGGCTTCTAGACTGCCTGGACCAACAGGCAGCGTGGTGTCTACCGGCACAAGCTTCAGCTCTAGCTCTCCTGGACTGGCTAGTGCCGGTGCCGCTGAGGGAAAACAAGGCGCCGAATCTGATCAGGCCGAGCCTATCATCTGTAGCAGCGGAGCAGAAGCCCCTGCCAATAGCCTGCCTAGCAAGGTGCCAACCACACTGATGCCCGTGAACACAGTGGCCCTGAAGGTGCCAGCTAATCCTGCCTCCGTGTCCACCGTGCCTTCTAAGCTGCCAACCAGCTCTAAGCCACCTGGCGCCGTGCCATCTAACGCCCTGACAAATCCTGCTCCAAGCAAGCTGCCCATCAACTCCACAAGAGCCGGCATGGTGCCCTCTAAGGTGCCCACATCTATGGTGCTGACCAAGGTGTCCGCCAGCACCGTGCCAACAGATGGCAGCTCCAGAAACGAGGAAACCCCTGCCGCTCCTACTCCTGCTGGCGCTACAGGCGGATCTTCTGCTTGGCTGGATAGCAGCAGCGAGAACAGAGGCCTGGGCAGCGAGCTTTCTAAACCTGGCGTGCTGGCTTCCCAGGTGGACAGCCCATTTTCCGGCTGCTTTGAGGACCTGGCTATCAGCGCCTCTACAAGCCTCGGCATGGGACCTTGTCACGGCCCCGAGGAAAACGAGTACAAGAGCGAGGGCACCTTCGGCATCCACGTGGCCGAGAATCCTAGCATCCAACTGCTGGAAGGCAACCCCGGACCTCCAGCTGATCCAGATGGCGGACCAAGACCTCAGGCCGACAGAAAGTTCCAAGAGCGCGAGGTGCCCTGCCACAGACCTTCTCCAGGTGCTCTGTGGCTGCAGGTTGCAGTGACAGGCGTCCTGGTGGTTACACTGCTCGTGGTCCTGTATAGACGGCGGCTGCACTGATGA
タンパク質配列
配列番号2(SEQ ID NO : 2 ):
MDLDLERGPPGPRRPPRGPPLSSSIGLALLLLLLALLFWLYIIMSNWTGGALLVLYAFALMLVIIILIIFIFRRDLLCPLGALCLLLLMITLLLIALWNLHGQALYLGIVLFIFGCLLVLGLWIYLLEILWRLGATIWQLLAFFLAFFLDIILLIIALYLQQNWWTLLVDLLWLLLFLAILIWMYYHGQRPFAEDKTYKYICRNFSNFCNVDVVEILPYLPCLTARDQDRLRATCTLSGNRDTLWHLFNTLQRRPGWVEYFIAALRGCELVDLADEVASVYQSYQPRTSDRPPDPLEPPSLPAERPGPPTPAAAHSIPYNSCREKEPSYPMPVQETQAPESPGENSEQALQTLSPRAIPRNPDGGPLESSSDLAALSPLTSSGHQEQDTELGSTHTAGATSSLTPSRGPVSPSVSFQPLARSTPRASRLPGPTGSVVSTGTSFSSSSPGLASAGAAEGKQGAESDQAEPIICSSGAEAPANSLPSKVPTTLMPVNTVALKVPANPASVSTVPSKLPTSSKPPGAVPSNALTNPAPSKLPINSTRAGMVPSKVPTSMVLTKVSASTVPTDGSSRNEETPAAPTPAGATGGSSAWLDSSSENRGLGSELSKPGVLASQVDSPFSGCFEDLAISASTSLGMGPCHGPEENEYKSEGTFGIHVAENPSIQLLEGNPGPPADPDGGPRPQADRKFQEREVPCHRPSPGALWLQVAVTGVLVVTLLVVLYRRRLH
DNA配列
配列番号3(SEQ ID NO : 3 ):
ATGGATCTGGATCTCGAAAGAGGACCTCCTGGACCTAGACGGCCTCCTAGAGGACCACCTCTGAGCAGCTCTATTGGACTGGCCCTGCTGCTGCTTCTGCTGGCTCTGCTGTTCTGGCTGTACATCATCATGAGCAACTGGACCGGCGGAGCACTGCTGGTGCTGTATGCCTTTGCTCTGATGCTGGTCATCATCATCCTGATCATCTTCATCTTCCGGCGGGACCTGCTGTGTCCTCTGGGAGCACTTTGTCTGTTGCTGCTGATGATCACCCTCCTGCTGATCGCCCTGTGGAACCTGCATGGACAGGCCCTGTATCTGGGCATCGTGCTGTTCATCTTCGGCTGCCTGCTGGTTCTCGGCCTGTGGATCTACCTGCTGGAAATCCTTTGGAGACTGGGCGCCACCATCTGGCAGCTGCTGGCCTTTTTCCTGGCCTTCTTTCTGGATATCATCCTCCTCATCATTGCCCTGTACCTGCAGCAGAACTGGTGGACCCTGCTGGTGGATCTGCTTTGGCTGCTGCTCTTTCTGGCCATCCTGATTTGGATGTACTACCACGGCCAGCGGCCTTTCGCCGAGGACAAGACCTACAAGTACATCTGCCGGAACTTCAGCAACTTCTGCAACGTGGACGTGGTGGAAATTCTGCCCTACCTGCCTTGCCTGACCGCCAGAGATCAGGACAGACTGAGAGCCACATGTACCCTGAGCGGCAACAGAGACACACTGTGGCACCTGTTCAACACCCTGCAGAGAAGGCCTGGCTGGGTCGAGTACTTTATCGCCGCTCTGAGAGGCTGCGAGCTGGTCGATCTGGCTGATGAAGTGGCCAGCGTGTACCAGAGCTACCAGCCTAGAACCAGCGACCGGCCTCCTGATCCTCTCGAACCTCCATCTCTGCCCGCCGAAAGACCTGGACCTCCTACACCAGCTGCCGCTCACAGCATCCCTTACAACAGCTGCAGAGAGAAAGAACCTAGCTACCCCATGCCTGTGCAAGAGACACAGGCCCCAGAAAGCCCTGGCGAGAATAGCGAACAGGCTCTGCAGACACTGAGCCCCAGAGCCATTCCTAGAAACCCTGATGGCGGCCCTCTGGAAAGCTCTAGTGATCTGGCCGCTCTGTCCCCTCTGACAAGCTCTGGACACCAAGAGCAGGATACCGAGCTGGGCAGCACACATACAGCCGGCGCTACAAGCAGCCTGACACCTTCTAGAGGCCCCGTGTCTCCCAGCGTGTCATTTCAGCCTCTGGCCAGGTCTACCCCTAGGGCTTCTAGACTGCCTGGACCAACAGGCAGCGTGGTGTCTACCGGCACAAGCTTCAGCTCTAGCTCTCCTGGACTGGCTAGTGCCGGTGCCGCTGAGGGAAAACAAGGCGCCGAATCTGATCAGGCCGAGCCTATCATCTGTAGCAGCGGAGCAGAAGCCCCTGCCAATAGCCTGCCTAGCAAGGTGCCAACCACACTGATGCCCGTGAACACAGTGGCCCTGAAGGTGCCAGCTAATCCTGCCTCCGTGTCCACCGTGCCTTCTAAGCTGCCAACCAGCTCTAAGCCACCTGGCGCCGTGCCATCTAACGCCCTGACAAATCCTGCTCCAAGCAAGCTGCCCATCAACTCCACAAGAGCCGGCATGGTGCCCTCTAAGGTGCCCACATCTATGGTGCTGACCAAGGTGTCCGCCAGCACCGTGCCAACAGATGGCAGCTCCAGAAACGAGGAAACCCCTGCCGCTCCTACTCCTGCTGGCGCTACAGGCGGATCTTCTGCTTGGCTGGATAGCAGCAGCGAGAACAGAGGCCTGGGCAGCGAGCTTTCTAAACCTGGCGTGCTGGCTTCCCAGGTGGACAGCCCATTTTCCGGCTGCTTTGAGGACCTGGCTATCAGCGCCTCTACAAGCCTCGGCATGGGACCTTGTCACGGCCCCGAGGAAAACGAGTACAAGAGCGAGGGCACCTTCGGCATCCACGTGGCCGAGAATCCTAGCATCCAACTGCTGGAAGGCAACCCCGGACCTCCAGCTGATCCAGATGGCGGACCAAGACCTCAGGCCGACAGAAAGTTCCAAGAGCGCGAGGTGCCCTGCCACAGACCTTCTCCA
タンパク質配列
配列番号4(SEQ ID NO : 4 ):
MDLDLERGPPGPRRPPRGPPLSSSIGLALLLLLLALLFWLYIIMSNWTGGALLVLYAFALMLVIIILIIFIFRRDLLCPLGALCLLLLMITLLLIALWNLHGQALYLGIVLFIFGCLLVLGLWIYLLEILWRLGATIWQLLAFFLAFFLDIILLIIALYLQQNWWTLLVDLLWLLLFLAILIWMYYHGQRPFAEDKTYKYICRNFSNFCNVDVVEILPYLPCLTARDQDRLRATCTLSGNRDTLWHLFNTLQRRPGWVEYFIAALRGCELVDLADEVASVYQSYQPRTSDRPPDPLEPPSLPAERPGPPTPAAAHSIPYNSCREKEPSYPMPVQETQAPESPGENSEQALQTLSPRAIPRNPDGGPLESSSDLAALSPLTSSGHQEQDTELGSTHTAGATSSLTPSRGPVSPSVSFQPLARSTPRASRLPGPTGSVVSTGTSFSSSSPGLASAGAAEGKQGAESDQAEPIICSSGAEAPANSLPSKVPTTLMPVNTVALKVPANPASVSTVPSKLPTSSKPPGAVPSNALTNPAPSKLPINSTRAGMVPSKVPTSMVLTKVSASTVPTDGSSRNEETPAAPTPAGATGGSSAWLDSSSENRGLGSELSKPGVLASQVDSPFSGCFEDLAISASTSLGMGPCHGPEENEYKSEGTFGIHVAENPSIQLLEGNPGPPADPDGGPRPQADRKFQEREVPCHRPSP
DNA配列
配列番号5(SEQ ID NO : 5 ):
ATGGATCTGGATCTCGAAAGAGGACCTCCTGGACCTAGACGGCCTCCTAGAGGACCACCTCTGAGCAGCTCTATTGGACTGGCCCTGCTGCTGCTTCTGCTGGCTCTGCTGTTCTGGCTGTACATCATCATGAGCAACTGGACCGGCGGAGCACTGCTGGTGCTGTATGCCTTTGCTCTGATGCTGGTCATCATCATCCTGATCATCTTCATCTTCCGGCGGGACCTGCTGTGTCCTCTGGGAGCACTTTGTCTGTTGCTGCTGATGATCACCCTCCTGCTGATCGCCCTGTGGAACCTGCATGGACAGGCCCTGTATCTGGGCATCGTGCTGTTCATCTTCGGCTGCCTGCTGGTTCTCGGCCTGTGGATCTACCTGCTGGAAATCCTTTGGAGACTGGGCGCCACCATCTGGCAGCTGCTGGCCTTTTTCCTGGCCTTCTTTCTGGATATCATCCTCCTCATCATTGCCCTGTACCTGCAGCAGAACTGGTGGACCCTGCTGGTGGATCTGCTTTGGCTGCTGCTCTTTCTGGCCATCCTGATTTGGATGTACTACCACGGCCAGCGGCCTTTCGCCGAGGACAAGACCTACAAGTACATCTGCCGGAACTTCAGCAACTTCTGCAACGTGGACGTGGTGGAAATTCTGCCCTACCTGCCTTGCCTGACCGCCAGAGATCAGGACAGACTGAGAGCCACATGTACCCTGAGCGGCAACAGAGACACACTGTGGCACCTGTTCAACACCCTGCAGAGAAGGCCTGGCTGGGTCGAGTACTTTATCGCCGCTCTGAGAGGCTGCGAGCTGGTCGATCTGGCTGATGAAGTGGCCAGCGTGTACCAGAGCTACCAGCCTAGAACCAGCGACCGGGGCGAGAATAGCGAACAGGCTCTGCAGACACTGAGCCCCAGAGCCATTCCTAGAAACCCTGATGGCGGCCCTCTGGAAAGCTCTAGTGATCTGGCCGCTCTGTCCCCTCTGACAAGCTCTGGACACCAAGAGCAGGATACCGAGCTGGGCAGCACACATACAGCCGGCGCTACAAGCAGCCTGACACCTTCTAGAGGCCCCGTGTCTCCCAGCGTGTCATTTCAGCCTCTGGCCAGGTCTACCCCTAGGGCTTCTAGACTGCCTGGACCAACAGGCAGCGTGGTGTCTACCGGCACAAGCTTCAGCTCTAGCTCTCCTGGACTGGCTAGTGCCGGTGCCGCTGAGGGAAAACAAGGCGCCGAATCTGATCAGGCCGAGCCTATCATCTGTAGCAGCGGAGCAGAAGCCCCTGCCAATAGCCTGCCTAGCAAGGTGCCAACCACACTGATGCCCGTGAACACAGTGGCCCTGAAGGTGCCAGCTAATCCTGCCTCCGTGTCCACCGTGCCTTCTAAGCTGCCAACCAGCTCTAAGCCACCTGGCGCCGTGCCATCTAACGCCCTGACAAATCCTGCTCCAAGCAAGCTGCCCATCAACTCCACAAGAGCCGGCATGGTGCCCTCTAAGGTGCCCACATCTATGGTGCTGACCAAGGTGTCCGCCAGCACCGTGCCAACAGATGGCAGCTCCAGAAACGAGGAAACCCCTGCCGCTCCTACTCCTGCTGGCGCTACAGGCGGATCTTCTGCTTGGCTGGATAGCAGCAGCGAGAACAGAGGCCTGGGCAGCGAGCTTTCTAAACCTGGCGTGCTGGCTTCCCAGGTGGACAGCCCATTTTCCGGCTGCTTTGAGGACCTGGCTATCAGCGCCTCTACAAGCCTCGGCATGGGACCTTGTCACGGCCCCGAGGAAAACGAGTACAAGAGCGAGGGCACCTTCGGCATCCACGTGGCCGAGAATCCTAGCATCCAACTGCTGGAAGGCAACCCCGGACCTCCAGCTGATCCAGATGGCGGACCAAGACCTCAGGCCGACAGAAAGTTCCAAGAGCGCGAGGTGCCCTGCCACAGACCTTCTCCA
タンパク質配列
配列番号6(SEQ ID NO: 6):
MDLDLERGPPGPRRPPRGPPLSSSIGLALLLLLLALLFWLYIIMSNWTGGALLVLYAFALMLVIIILIIFIFRRDLLCPLGALCLLLLMITLLLIALWNLHGQALYLGIVLFIFGCLLVLGLWIYLLEILWRLGATIWQLLAFFLAFFLDIILLIIALYLQQNWWTLLVDLLWLLLFLAILIWMYYHGQRPFAEDKTYKYICRNFSNFCNVDVVEILPYLPCLTARDQDRLRATCTLSGNRDTLWHLFNTLQRRPGWVEYFIAALRGCELVDLADEVASVYQSYQPRTSDRGENSEQALQTLSPRAIPRNPDGGPLESSSDLAALSPLTSSGHQEQDTELGSTHTAGATSSLTPSRGPVSPSVSFQPLARSTPRASRLPGPTGSVVSTGTSFSSSSPGLASAGAAEGKQGAESDQAEPIICSSGAEAPANSLPSKVPTTLMPVNTVALKVPANPASVSTVPSKLPTSSKPPGAVPSNALTNPAPSKLPINSTRAGMVPSKVPTSMVLTKVSASTVPTDGSSRNEETPAAPTPAGATGGSSAWLDSSSENRGLGSELSKPGVLASQVDSPFSGCFEDLAISASTSLGMGPCHGPEENEYKSEGTFGIHVAENPSIQLLEGNPGPPADPDGGPRPQADRKFQEREVPCHRPSP
DNA配列
配列番号7(SEQ ID NO: 7):
ATGGATCTGGATCTCGAAAGAGGACCTCCTGGACCTAGACGGCCTCCTAGAGGACCACCTCTGAGCAGCTCTATTGGACTGGCCCTGCTGCTGCTTCTGCTGGCTCTGCTGTTCTGGCTGTACATCATCATGAGCAACTGGACCGGCGGAGCACTGCTGGTGCTGTATGCCTTTGCTCTGATGCTGGTCATCATCATCCTGATCATCTTCATCTTCCGGCGGGACCTGCTGTGTCCTCTGGGAGCACTTTGTCTGTTGCTGCTGATGATCACCCTCCTGCTGATCGCCCTGTGGAACCTGCATGGACAGGCCCTGTATCTGGGCATCGTGCTGTTCATCTTCGGCTGCCTGCTGGTTCTCGGCCTGTGGATCTACCTGCTGGAAATCCTTTGGAGACTGGGCGCCACCATCTGGCAGCTGCTGGCCTTTTTCCTGGCCTTCTTTCTGGATATCATCCTCCTCATCATTGCCCTGTACCTGCAGCAGAACTGGTGGACCCTGCTGGTGGATCTGCTTTGGCTGCTGCTCTTTCTGGCCATCCTGATTTGGATGTACTACCACGGCCAGCGGCCTTCTCCAAGACACTGCCCAGTGGAAAGAGAGCAGTTCAAGAGGGACGCCCAGCCTAGACCTGGCGGAGATCCTGATGCTCCACCTGGACCAAATGGCGAGCTGCTGCAGATCAGCCCTAATGAGGCCGTGCACATCGGCTTCACCGGCGAGTCTAAGTACGAGAACGAGGAACCCGGCCACTGTCCTGGCATGGGCCTTTCTACATCTGCCTCTATCGCCCTGGACGAGTTCTGCGGCAGCTTTCCATCTGATGTGCAGTCTGCCCTCGTGGGCCCTAAGTCTCTGGAATCTGGCCTGGGCAGAAACGAGAGCAGCTCCGATCTGTGGGCTAGCTCTGGTGGAACAGCTGGCGCTCCTACACCAGCCGCTCCTACCGAAGAGAATAGAAGCAGCGGCGACACCCCTGTGACAAGCGCCTCTGTGAAAACCCTGGTCATGAGCACCCCAGTGAAGTCCCCAGTGATGGGCGCCAGAACCTCCAACATTCCCCTGAAGTCTCCCGCTCCTAACACACTGGCCAACTCTCCAGTGGCTGGCCCTCCTAAGTCTAGCACCCCTCTGAAAAGCCCCGTGACCTCTGTGTCTGCCCCTAACGCTCCTGTGAAACTGGCCGTGACCAACGTGCCCATGCTGACCACACCTGTGAAATCCCCACTGAGCAATGCCCCTGCCGAGGCCGGAAGCTCTTGTATCATTCCCGAGGCTCAGGATAGCGAGGCTGGCCAAAAAGGCGAAGCTGCAGGCGCTTCTGCTCTGGGCCCTAGCTCTAGCTCTTTTAGCACCGGCACCAGCGTGGTGTCTGGCACACCAGGACCTCTGAGAAGCGCCAGACCTACCTCTAGAGCCCTGCCTCAGTTTAGCGTGTCCCCTAGTGTGCCTGGCAGAAGCCCTACACTGTCTAGTACAGCCGGCGCTACACACACCAGCGGACTGGAAACAGACCAAGAACAGCATGGCAGCAGCACCCTGCCTTCTCTGGCTGCCCTTGATTCTAGCAGCGAACTGCCAGGCGGCGACCCCAATAGACCTATCGCTAGACCTAGCCTGACACAGCTGGCCCAAGAGAGCAATGAGGGCCCTTCTGAGCCTGCTCAGACCGAACAGGTGCCAATGCCTTACAGCCCCGAGAAAGAGCGGTGCAGCAACTACCCTATCAGCCATGCCGCTGCTCCCACACCTCCTGGTCCAAGAGAAGCTCCTCTGAGCCCTCCTGAGCTGCCCGATCCTCCAAGAGATAGCACCAGACCTCAGTACTCCCAGTACGTGTCCGCCGTGGAAGATGCCCTGGATGTGCTGGAATGTGGCAGACTGGCCGCCATCTTCTACGAAGTGTGGGGCCCTAGAAGGCAGCTGACCAACTTTCTGCACTGGCTGACCGACAGAAACGGCAGCCTGACATGTACCGCCAGACTGAGAGATCAGGACCGGGCCACACTGTGCCCTCTGTATCCTCTGATCGAGGTGGTGGACGTGAACTGCTTCAACAGCTTCAACCGGTGCATCTACAAGTACACCAAGGACGAGGCTTTCCCTATG
タンパク質配列
配列番号8(SEQ ID NO : 8 ):
MDLDLERGPPGPRRPPRGPPLSSSIGLALLLLLLALLFWLYIIMSNWTGGALLVLYAFALMLVIIILIIFIFRRDLLCPLGALCLLLLMITLLLIALWNLHGQALYLGIVLFIFGCLLVLGLWIYLLEILWRLGATIWQLLAFFLAFFLDIILLIIALYLQQNWWTLLVDLLWLLLFLAILIWMYYHGQRPSPRHCPVEREQFKRDAQPRPGGDPDAPPGPNGELLQISPNEAVHIGFTGESKYENEEPGHCPGMGLSTSASIALDEFCGSFPSDVQSALVGPKSLESGLGRNESSSDLWASSGGTAGAPTPAAPTEENRSSGDTPVTSASVKTLVMSTPVKSPVMGARTSNIPLKSPAPNTLANSPVAGPPKSSTPLKSPVTSVSAPNAPVKLAVTNVPMLTTPVKSPLSNAPAEAGSSCIIPEAQDSEAGQKGEAAGASALGPSSSSFSTGTSVVSGTPGPLRSARPTSRALPQFSVSPSVPGRSPTLSSTAGATHTSGLETDQEQHGSSTLPSLAALDSSSELPGGDPNRPIARPSLTQLAQESNEGPSEPAQTEQVPMPYSPEKERCSNYPISHAAAPTPPGPREAPLSPPELPDPPRDSTRPQYSQYVSAVEDALDVLECGRLAAIFYEVWGPRRQLTNFLHWLTDRNGSLTCTARLRDQDRATLCPLYPLIEVVDVNCFNSFNRCIYKYTKDEAFPM
ベクターは、以下の遺伝子要素を含有するように構築した:(a)プロモータ、好ましくはヒトユビキチンプロモータ;(b)レポーター遺伝子(例えば緑色蛍光タンパク質)、あるいは1つ以上の抗原が単一の導入遺伝子中に融合され、および;(c)IRESとそれに続くアジュバント遺伝子(すなわち、LMP1−IPS1COまたはその機能的変異体)。任意にベクターは、(d)IRESとそれに続く可溶性および分泌型免疫チェックポイント阻害剤遺伝子または可溶性免疫モジュレータ遺伝子(図8Cを参照)。好ましくは、配列は上記の順序であるが、遺伝子は他の適切な順序でベクター中に位置させることができる。上記の領域の全部ではないがいくつかを有する対照ベクターも構築された。
レンチウイルスベクターは、Nasriら(2014)に記載されているように、HEK 293T細胞株の一過性リン酸カルシウムトランスフェクションによって産生された。HEK 293T細胞を250mLの完全培地中の2チャンバーCell Stack(Corning)に1.6×108細胞で播種し、37℃で5%CO2の加湿雰囲気のインキュベーター内で24時間維持して接着させた。産生された各ベクターについて、1つの細胞スタックを以下のようにトランスフェクトさせた。レンチウイルス骨格プラスミド(235μg)、エンベロープコードプラスミド(47μg)、およびパッケージングプラスミド(235μg)を8.6mLの滅菌蒸留水および3.0mLのCaCl2と混合した。次いで、DNA混合物を、37℃の予め温めたHBS 2X(pH=7.1)12.1mLに一滴ずつ添加し、そして得られた24.2mLの沈殿物を、室温で30分間インキュベートした後に細胞の培地に添加した。トランスフェクトした細胞を37℃、5%CO2でインキュベートした。トランスフェクションの24時間後に培地を血清およびフェノールレッドを含まない210mLの回収培地と交換し、さらに24時間後にウイルス上清を回収し、2500rpmで5分間の遠心分離により清澄化した。回収した清澄化バルク(210mL)をMgCl2の存在下でDNase Iで30分間処理してあらゆる残留DNAを開裂し、22000rpm、4℃で1時間の遠心分離により濃縮した。ベクターペレットを70μlのトリス−トレハロース(50mM)に再懸濁し、1.5mLのマイクロチューブにプールし、50μLのアリコートに分け、凍結し、≦−70℃で保存した。確かにより長いDNAカセットの存在のために、生産収率はGFPベクターと比較してアジュバント添加ベクターでは少し効果的ではなかった。しかしながら、全てのアジュバント化構築物について、力価は少なくとも109TU/mLの範囲内であり、そして異なる生産キャンペーンを通して一貫して得られた。それ故、これらのアジュバント構造の将来の工業的バイオ生産に関する問題は予想される筈はない。
新鮮なヒト樹状細胞およびマクロファージをヒト健康ドナー(白血球錐体)から密度勾配にわたって得た。CD14+単球を、磁気単離キット(ポジティブセレクション)を用いてPBMCから精製し、そして完全RPMI中で6ウェルプレートにプレーティングした。公表された方法を使用して、単球をGM−CSFおよびIL−4を用いて樹状細胞に分化させた。サイトカインを補充するために3日後に10%の培地交換を行い、そして細胞を非酵素的細胞解離溶液を用いて合計6日の培養後に回収した。次いでDCを完全RPMI+4μg/mlのポリブレン+レンチウイルス構築物(MOI 15にて)+ GM−CSFおよびIL−4中に再プレーティングした。2時間後、700μlの完全RPMI+GM−CSF/IL−4を添加し、細胞を合計96時間培養した。活性化マーカー発現の陽性対照として作用するために、追加の対照ウェルをIFN−ガンマおよびLPSで96時間刺激した。
構築物1:GFP−IRES−LMP1(dIC)hIPS1
構築物2:GFP−IRES−LMP1(dIC)hIPS1(dTM)
構築物3:GFP−IRES−LMP1(dIC)hIPS1(dTMdPro)
構築物4:GFP−IRES−LMP1(dIC)hIPS1(dTMRev)
対照構築物1:GFP
対照構築物2:GFP+LMP1(dIC)
対照構築物3:細胞をGFPとLMP1(dIC)hIPS1で二重形質導入(それぞれMOI 15にて、分離ベクターにおいて)
対照構築物の説明については図8A、アジュバント化構築物については図8B参照。
膜貫通ドメインの除去に加えてプロリン富裕領域(PRO)が除去された場合、アジュバント効果はわずかに増加しただけであった。PRO領域機能は十分に記載されていないが、それはIPS1タンパク質の立体配座において役割を果たす可能性がある。
IPS1 CARDおよびPROドメインの方向を逆転させながら、IPS1膜貫通ドメインを除去すると、免疫刺激効果の減少を示した。この除去は、当該タンパク質の誤った立体配座および活性の損失を導き得る。
(a)ヒトユビキチンプロモータ、(b)1つの腫瘍抗原、および(c)LMP1(ヒト発現にコドン最適化)およびヒトIPS1、またはそれらの機能的変異体の膜貫通ドメインの融合をコードする、発現カセットを含有する異なるウイルスベクターで健康なマウスが処置される。抗原およびアジュバント(すなわち、IMP1 IPS1融合)を2回の投与後(プライム+ブースト)に同じベクターから発現された場合に対して異なるベクターから発現させたときの免疫応答を比較するために実験を実施する。インビボの免疫原性の短期(3週間)および長期(3ヶ月)評価は、抗原特異的免疫細胞、例えばCD4+、CD8+、およびベクター中に存在する抗原を標的とするメモリーT細胞の検出および定量化を可能にするマウス血液バイオマーカー(IFN−γおよびさまざまなインターロイキン)のFACS分析によって行われる。抗原をコードするレンチウイルスベクターおよびLMP1−IPS1での処置は、LMP1−IPS1なしで同じレンチウイルスベクターと比較した場合、またはLMP1の膜ドメインのみを発現した場合に、特異的免疫原性を高めると予想される。さらに、異なるベクターからの発現と比較して、同じベクターから抗原とアジュバントの両方を発現させると、免疫原性のより大きな増加が予想される。
特定の腫瘍のマウスモデルが、(a)プロモータとしてのヒトユビキチン、(b)腫瘍特異的抗原、およびLMP1(ヒト発現のためにコドン最適化)およびヒトIPS1、またはそれらの機能的変異体の膜貫通ドメインの融合をコードする、発現カセットを含有するレンチウイルスベクターで処置された。マウスは、ベクタータイプおよび構築物、用量および注射回数によって異なる処置群に分割される。実験群は、以下をコードするベクターと共に投与される(プライム+ブースト注射):適応症特異的抗原のみ。LMPI−IPS1または適応症特異的抗原、およびLMP1−IPS1(または機能的IPS1を有する変異体)のみ。インビボでの有効性および免疫原性は、腫瘍増殖速度、生存、ならびにマウス血液バイオマーカー(IFN−γおよび種々のインターロイキン)のFACS分析によるCD4+、CD8+およびメモリーT細胞として特異的な抗原の検出によって評価される。適応症特異的抗原およびLMP1−IPS1融合タンパク質をコードするレンチウイルスベクターは、すべての実験群の中で最も強力で長期にわたる免疫応答を誘導すると予想され、したがって処置群のマウスにおいてより高い生存率および/またはより低い腫瘍増殖を誘導する。
特定の腫瘍のマウスモデルは、プロモータとしてヒトユビキチンをコードする発現カセットおよび以下の少なくとも1つを含有するレンチウイルスベクターで処置される:適応症特異的抗原、LMP1−IPS1、および1つ以上の抗チェックポイント分子の可溶性および分泌型形態。マウスは、ベクター構築物、用量、および注射回数によって異なる処置群に分けられる。実験群は、以下をコードするベクターと共に投与される(プライム+ブースト注射):適応症特異的抗原のみ。LMP1−IPS1のみ。1つ以上の可溶性の分泌型抗チェックポイント分子のみ。適応症特異的抗原およびLMP1(デルタIC)。適応症特異的抗原およびLMP1(デルタIC)、ならびに1以上の可溶性および分泌型抗チェックポイント分子。適応症特異的抗原およびLMP1−IPS1(または機能的IPS1を有する変異体)。または適応症特異的抗原および1以上の可溶性および分泌抗チェックポイント分子。または適応症特異的抗原、LMP1−IPS1または機能的IPS1を有する変異体)、および1以上の可溶性および分泌型抗チェックポイント分子。インビボでの有効性および免疫原性は、腫瘍増殖速度、生存、ならびにマウス血液バイオマーカー(IFN−γおよび種々のインターロイキン)のFACS分析によるCD4+、CD8+およびメモリーT細胞として特異的な抗原の検出によって評価される。適応症特異的抗原、LMP1−IPS1(または機能性IPS1持つ変異体)をコードするレンチウイルスベクターおよび抗チェックポイント分子は、全ての実験群について最も強力で長期持続の免疫応答を誘導することが予想される。
・Barry, M. et al. Role of endogenous endonucleases and tissue site in transfection and CpG-mediated immune activation after naked DNA injection(裸のDNA注射後のトランスフェクションおよびCpG媒介免疫活性化における内因性エンドヌクレアーゼおよび組織部位の役割)
・Hum Gene Ther, 10 (15) (1999), pp. 2461-2480
・McNamara, M. et al. RNA-Based Vaccines in Cancer Immunotherapy. J Immunol Res. 2015; 2015: 794528.
・Nasri et al., Production, Purification and Titration of a Lentivirus-Based Vector for Gene Delivery Purposes(遺伝子送達目的のためのレンチウイルスに基づくベクターの産生、精製および滴定), Cytotechnology 66,1031-8 (2014).
Claims (14)
- 抗原または抗原性エピトープをコードする第1の核酸配列、およびエプスタインバーウイルスの潜在膜タンパク質1(LMP1)の膜貫通部分を含む融合タンパク質をコードする第2の核酸配列を含むウイルスベクターであって、細胞質内ドメインがヒトIPS1またはその変異体で置換されており、ここで、前記ベクターを有する細胞の形質導入が前記細胞内のSTING経路を活性化する、前記ウイルスベクター。
- 前記ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項1に記載のウイルスベクター。
- 前記第1の核酸配列が、2以上の抗原または2以上の抗原性エピトープを含む融合タンパク質をコードする、請求項1に記載のウイルスベクター。
- LMP1の細胞質内ドメインが、その膜貫通ドメインを欠くヒトIPS1をコードする配列によって置換されている、請求項1に記載のウイルスベクター。
- 前記LMP1細胞質内ドメインが、その膜貫通ドメインを欠き、およびそのプロリン富裕ドメインを欠くヒトIPS1をコードする配列によって置換されている、請求項4に記載のウイルスベクター。
- 前記第2の核酸配列が、配列番号1、配列番号3、配列番号5、ならびに配列番号7からなる群から選択される配列を含む、請求項1に記載のウイルスベクター。
- 前記ベクターが、さらに、可溶性免疫チェックポイント阻害剤分子、または可溶性免疫モジュレータ分子をコードする第3の核酸配列を含む、請求項1に記載のウイルスベクター。
- 前記可溶性免疫チェックポイント阻害剤分子または前記可溶性免疫モジュレータ分子が、CTLA−4、PD−1、PDL−1、LAG−3、TIM 3、B7−H3、ICOS、IDO、4−1BB、CD47、B7−H4、OX−40、TIGIT、CD160、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項7に記載のウイルスベクター。
- 前記ベクターがさらに機能性レンチウイルス・インテグラーゼタンパク質を含み、前記ベクターが自己不活性化である、請求項1に記載のウイルスベクター。
- 前記抗原が、NY−ESO−1、メソテリン、PSA、MART−1、MART−2、Gp100、チロシナーゼ、p53、ras、MUC1、SAP−1、サバイビン、CEA、Ep−CAM,Her2、BRCA1/2、gag、逆トランスクリプターゼ、tat、スポロゾイト周囲のタンパク質、HCV非構造性タンパク質、ヘマグルチニンならびにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1に記載のウイルスベクター。
- 対象におけるがんまたは感染症を予防または処置するための免疫治療の処方物であって、前記処方物が請求項1に記載のウイルスベクターを含む。
- 対象においてがんまたは感染症に対する免疫応答を誘導または増強する方法であって、前記方法はそれを必要とする対象に請求項1に記載のウイルスベクターまたは請求項9に記載の免疫治療処方物を投与することを含み、 それによって、前記がんまたは感染症に対する免疫応答が対象において誘導または増強される前記方法。
- 免疫応答ががんに対して誘導または増強され、そして前記がんが黒色腫、神経膠腫、前立腺がん、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、腎臓がん、肺がん、リンパ腫、膵臓がんからなる群から選択される、請求項12に記載の方法。
- 免疫応答が感染症に対して誘導または増強され、前記感染症が、HIV/AIDS、C型肝炎、HPV、肺炎、インフルエンザ、マラリア、リーシュマニア症、結核、ハンセン病、狂犬病、デング熱、ジカ、エボラ、および住血吸虫症からなる群から選択される、請求項12に記載の方法。
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