JP2020201088A - 測定装置 - Google Patents
測定装置 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2020201088A JP2020201088A JP2019107182A JP2019107182A JP2020201088A JP 2020201088 A JP2020201088 A JP 2020201088A JP 2019107182 A JP2019107182 A JP 2019107182A JP 2019107182 A JP2019107182 A JP 2019107182A JP 2020201088 A JP2020201088 A JP 2020201088A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- chamber
- lipid bilayer
- current
- wells
- membrane
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000005259 measurement Methods 0.000 title abstract description 18
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 66
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 claims description 80
- 238000005192 partition Methods 0.000 claims description 18
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 abstract description 11
- 230000006378 damage Effects 0.000 abstract description 5
- 239000011148 porous material Substances 0.000 abstract description 4
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 21
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 description 9
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 9
- 102000034573 Channels Human genes 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 8
- 101710092462 Alpha-hemolysin Proteins 0.000 description 6
- DIOQZVSQGTUSAI-UHFFFAOYSA-N decane Chemical compound CCCCCCCCCC DIOQZVSQGTUSAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 4
- 239000003990 capacitor Substances 0.000 description 4
- WABPQHHGFIMREM-UHFFFAOYSA-N lead(0) Chemical compound [Pb] WABPQHHGFIMREM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101150060387 pfp gene Proteins 0.000 description 4
- 101150107865 prf1 gene Proteins 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N acrylic acid group Chemical group C(C=C)(=O)O NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 2
- ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N cocaine Chemical compound O([C@H]1C[C@@H]2CC[C@@H](N2C)[C@H]1C(=O)OC)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 239000000592 Artificial Cell Substances 0.000 description 1
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 1
- 229910021607 Silver chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 229960003920 cocaine Drugs 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000004720 dielectrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000002360 explosive Substances 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M silver monochloride Chemical compound [Cl-].[Ag+] HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Electric Means (AREA)
Abstract
Description
(1) 内部に脂質二重膜を形成する複数のウェルであって、各ウェルが隔壁により隔てられる第1のチャンバーと第2のチャンバーを具備し、前記隔壁内に、前記脂質二重膜を形成する微小透孔が設けられている、複数のウェルと、
前記各ウェルの前記第1のチャンバーに設けられた電極と、前記各第1のチャンバーと前記各第2のチャンバー間に直流電圧を印加する直流電源と、
前記各電極と接続された単一の電流測定手段であって、前記各脂質二重膜に形成される透孔を流れる電流を測定する電流測定手段と、
前記各電極と前記電流測定手段との間にそれぞれ直列に挿入された電気抵抗器、
を具備する測定装置。
(2) 前記電気抵抗器は、前記脂質二重膜の透孔を前記電流が流れる際の電気抵抗値の0.2倍〜5倍の電気抵抗値を有する、(1)記載の測定装置。
(3) 前記電気抵抗器の電気抵抗値が、前記脂質二重膜の透孔を前記電流が流れる際の電気抵抗値の0.5倍〜2倍である、(2)記載の測定装置。
(4) 前記各ウェルを構成する前記第1のチャンバー及び第2のチャンバーが、鉛直方向に重なり、前記脂質二重膜が、前記第1のチャンバー及び第2のチャンバーとの間に水平方向に形成される、(1)〜(3)のいずれか1項に記載の測定装置。
(5) 前記各ウェルの前記各第1のチャンバーを設けた円板状の固定プレートと、該固定プレートに積層され、前記各ウェルの前記各第2のチャンバーを設けた円板状の上部プレートと、前記各第1のチャンバーと前記各第2のチャンバーの間に設けられた隔壁であって、前記脂質二重膜を形成する微小透孔を有する隔壁とを具備し、前記上部プレートは、前記固定プレートに対して回動可能である、(4)記載の測定装置。
図1〜図4に示す装置を作製した。すなわち、液滴を保持するための直径2 mmの第1のチャンバーを16個配列した固定プレートと、同様に配列した直径2 mmの透孔(第2のチャンバー)を持つ上部プレートをアクリル板からNC精密加工機を用いて作製した。これらの2つのプレートの間には、直径400μmの微小透孔を持つアクリルフィルムを上部プレートの底面に接着剤で固定した。この際、第2のチャンバーの真下に、微小透孔が来るようにアクリルフィルムを固定した。また、固定プレートの第1のチャンバー底面に銀/塩化銀電極を取り付け、それぞれの配線上に1GΩの抵抗を直列に接続した。これらを並列に束ねて計測器(商品名:FLEX-16 Bilayer テセラ社)に接続した(図4参照)。
以下の手順により、脂質二重膜を形成した。
1) 固定プレートのすべての第1のチャンバーを緩衝液(1M KCl含有PBS)でそれぞれ満たした。
2) リン脂質が分散している有機溶媒(DPhPC/n-デカン)を第1のチャンバーが配列された一面に流し込んだ。
3) 上部プレートを、固定プレートの上から上下のウェルが重なり合わないように、固定プレート上に積層した。
4) 本実施例における標的物質であるα-ヘモリシン(αHL)を含む緩衝液(1M KCl含有PBS)を上部プレートに滴下し満たした。
5) 上部プレートを手で回して、第1のチャンバーと第2のチャンバーが重なり合うようにした。これで脂質二重膜が形成される。
標的物質であるαHLは、脂質二重膜に対して再構成しナノメートルサイズの透孔(ポア)を形成する。このナノポア形成が脂質二重膜の抵抗値の低下を引き起こすため、脂質二重膜間に電圧を印加し、ナノポアを透過するイオン電流を測定することで標的物質αHLの検出を行った。まず、脂質二重膜の形成について、膜が形成されると膜のイオン電導性は非常に低いため、イオン電流はほぼ流れず、電流値は0付近を示す。膜形成後、αHLは自発的に膜に再構成される。ナノポアは1 M KCl水溶液において1 nSのコンダクタンスに相当する電流を透過する。すなわち、印加電圧が100 mVのとき、ナノポアが1つ再構成されるごとに100 pA程度のステップ状の電流値上昇が見られる。
印加電圧:100 mV
緩衝液:100 mM リン酸緩衝液(pH7.9)、1M KCl
DPhPC/n-デカン:5mg/ml
αHL:10 nM、 1 nM、 0.1 nM
サンプリング周波数:5 kHz
ローパスフィルタ:1 kHz
(1) シグナル(標的物質の検出)と膜破裂の判別
電流の測定結果を図5に示す。図5中、(a)が電流の測定結果(横軸に電流、縦軸にデータポイント数をとったグラフ)、(b)が横軸に時間、縦軸に電流をとった、電流値の経時変化を示す。(c)は、(a)及び(b)における(i)〜(v)の状態における、推測される各ウェルの膜の状態を示す図である。
図7(a)は、横軸に再構成したαHLの数、縦軸に電流値の増加分を取ったヒストグラムである。図7(b)は、横軸に時間、縦軸に電流値をとったグラフである。図7(c)は、横軸に測定された電流値、縦軸にデータポイントの数をとったグラフである。
図8は、図5と同様な図であり、図5とは別の測定結果を示す図である。また、上記した図7の(b)(c)にも同様な図が記載されている。
(i) 電流値の上昇が急峻か緩やかかで、膜破裂とαHL検出を判別できる。
(ii) 膜破裂の場合、100 pAから電流上昇値を引くことで、何個のαHLが再構成されている膜が破裂したかを求めることができる。
(iii) αHL検出の場合、電流上昇値から、何個目のαHLが再構成されたのかを求めることできる。
αHLの検出時間を、脂質二重膜が形成されてから初めてαHLが再構成されるまでの時間と定義する。図9に示す通り、標的物質であるαHL濃度が低くなるにつれて検出時間の平均値は長時間化し、検出時間の分散も大きくなる。しかしながら、本実施例の装置を用いた脂質二重膜の並列化を行うことにより、並列化されたセンサ素子数の増加とともに検出時間の平均値と標準偏差が小さくなることが確認できた。なお、図9中、各グラフにおける左端の列が単一ウェル(比較例)、中央の列が、4個のウェルで測定した場合、右端の列が16個のウェルで測定した場合の結果を示しており、ウェル数が増えるほど、検出までの時間が短くなる。
12 導線
14 電気抵抗器
18 固定プレート
20 第1のチャンバー
22 上部プレート
24 第2のチャンバー
26 隔壁
28 微小透孔
30 電極
32 周壁
33 第2の電極
34 周壁
36 脂質二重膜
28 直流電源
40 電流測定手段
Claims (5)
- 内部に脂質二重膜を形成する複数のウェルであって、各ウェルが隔壁により隔てられる第1のチャンバーと第2のチャンバーを具備し、前記隔壁内に、前記脂質二重膜を形成する微小透孔が設けられている、複数のウェルと、
前記各ウェルの前記第1のチャンバーに設けられた電極と、前記各第1のチャンバーと前記各第2のチャンバー間に直流電圧を印加する直流電源と、
前記各電極と接続された単一の電流測定手段であって、前記各脂質二重膜に形成される透孔を流れる電流を測定する電流測定手段と、
前記各電極と前記電流測定手段との間にそれぞれ直列に挿入された電気抵抗器、
を具備する測定装置。 - 前記電気抵抗器は、前記脂質二重膜の透孔を前記電流が流れる際の電気抵抗値の0.2倍〜5倍の電気抵抗値を有する、請求項1記載の測定装置。
- 前記電気抵抗器の電気抵抗値が、前記脂質二重膜の透孔を前記電流が流れる際の電気抵抗値の0.5倍〜2倍である、請求項2記載の測定装置。
- 前記各ウェルを構成する前記第1のチャンバー及び第2のチャンバーが、鉛直方向に重なり、前記脂質二重膜が、前記第1のチャンバー及び第2のチャンバーとの間に水平方向に形成される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の測定装置。
- 前記各ウェルの前記各第1のチャンバーを設けた円板状の固定プレートと、該固定プレートに積層され、前記各ウェルの前記各第2のチャンバーを設けた円板状の上部プレートと、前記各第1のチャンバーと前記各第2のチャンバーの間に設けられた隔壁であって、前記脂質二重膜を形成する微小透孔を有する隔壁とを具備し、前記上部プレートは、前記固定プレートに対して回動可能である、請求項4記載の測定装置。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2019107182A JP7239923B2 (ja) | 2019-06-07 | 2019-06-07 | 測定装置 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2019107182A JP7239923B2 (ja) | 2019-06-07 | 2019-06-07 | 測定装置 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2020201088A true JP2020201088A (ja) | 2020-12-17 |
JP7239923B2 JP7239923B2 (ja) | 2023-03-15 |
Family
ID=73741989
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019107182A Active JP7239923B2 (ja) | 2019-06-07 | 2019-06-07 | 測定装置 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP7239923B2 (ja) |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011002385A (ja) * | 2009-06-19 | 2011-01-06 | Univ Of Tokyo | 人工脂質二重膜を用いた電流計測装置 |
JP2014190891A (ja) * | 2013-03-28 | 2014-10-06 | Hitachi High-Technologies Corp | ナノポア式分析装置の電圧印加システム |
WO2015079510A1 (ja) * | 2013-11-27 | 2015-06-04 | 株式会社日立製作所 | 電流計測装置、電流計測方法、及び電流計測キット |
WO2017187588A1 (ja) * | 2016-04-28 | 2017-11-02 | 株式会社日立製作所 | メンブレンデバイス、計測装置、メンブレンデバイス製造方法 |
WO2018096348A1 (en) * | 2016-11-24 | 2018-05-31 | Oxford Nanopore Technologies Limited | Apparatus and methods for controlling insertion of a membrane channel into a membrane |
WO2018105123A1 (ja) * | 2016-12-09 | 2018-06-14 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | ナノポア形成方法、ナノポア形成装置及び生体分子計測装置 |
JP2019022872A (ja) * | 2017-07-24 | 2019-02-14 | 地方独立行政法人神奈川県立産業技術総合研究所 | 脂質二重膜の形成方法及びそのための器具 |
-
2019
- 2019-06-07 JP JP2019107182A patent/JP7239923B2/ja active Active
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011002385A (ja) * | 2009-06-19 | 2011-01-06 | Univ Of Tokyo | 人工脂質二重膜を用いた電流計測装置 |
JP2014190891A (ja) * | 2013-03-28 | 2014-10-06 | Hitachi High-Technologies Corp | ナノポア式分析装置の電圧印加システム |
WO2015079510A1 (ja) * | 2013-11-27 | 2015-06-04 | 株式会社日立製作所 | 電流計測装置、電流計測方法、及び電流計測キット |
WO2017187588A1 (ja) * | 2016-04-28 | 2017-11-02 | 株式会社日立製作所 | メンブレンデバイス、計測装置、メンブレンデバイス製造方法 |
WO2018096348A1 (en) * | 2016-11-24 | 2018-05-31 | Oxford Nanopore Technologies Limited | Apparatus and methods for controlling insertion of a membrane channel into a membrane |
WO2018105123A1 (ja) * | 2016-12-09 | 2018-06-14 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | ナノポア形成方法、ナノポア形成装置及び生体分子計測装置 |
JP2019022872A (ja) * | 2017-07-24 | 2019-02-14 | 地方独立行政法人神奈川県立産業技術総合研究所 | 脂質二重膜の形成方法及びそのための器具 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
大崎 寿久ほか: "確率論的バイオセンサの検出迅速化に関する研究", KISTEC研究報告2020, JPN7023000451, August 2020 (2020-08-01), pages 166 - 168, ISSN: 0004980070 * |
川野 竜司ほか: "液滴接触法を利用したチャネル型膜タンパク質のハイスループット機能解析システムの開発", BIO INDUSTRY 1月号, vol. 30, JPN7023000450, 2013, ISSN: 0004980069 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP7239923B2 (ja) | 2023-03-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11988659B2 (en) | Nanopore arrays | |
US11884024B2 (en) | Systems and methods for forming a nanopore in a lipid bilayer | |
US9470651B2 (en) | Electro-diffusion enhanced bio-molecule charge detection using electrostatic interaction | |
Han et al. | Label-free detection of single protein molecules and protein− protein interactions using synthetic nanopores | |
JP5424870B2 (ja) | イオンチャンネル記録並びに単分子検出及び解析のためのナノポア基盤 | |
US8324914B2 (en) | Systems and methods for characterizing a molecule | |
Nakane et al. | Evaluation of nanopores as candidates for electronic analyte detection | |
US20100025263A1 (en) | Nanopore particle analyzer, method of preparation and use thereof | |
del Rio Martinez et al. | Automated formation of lipid membrane microarrays for ionic single‐molecule sensing with protein nanopores | |
US20110287414A1 (en) | Systems and methods for identifying a portion of a molecule | |
US20110192723A1 (en) | Systems and methods for manipulating a molecule in a nanopore | |
US20120052188A1 (en) | Systems and methods for assembling a lipid bilayer on a substantially planar solid surface | |
WO2011097028A1 (en) | Systems and methods for manipulating a molecule in a nanopore | |
CN109154596B (zh) | 双分子层形成的电气增强 | |
CN109416353B (zh) | 使用对电气刺激的双分子层响应的测量进行非破坏性双分子层监测 | |
JP6695450B2 (ja) | 二重層形成のための浸透性不均衡法 | |
EP3256600A1 (en) | Adjustable bilayer capacitance structure for biomedical devices | |
JP7239923B2 (ja) | 測定装置 | |
Izawa et al. | Handheld nanopore-based biosensing device | |
KR20200125888A (ko) | 조절된 카운팅을 이용한 나노공극 포획률의 보정 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A80 | Written request to apply exceptions to lack of novelty of invention |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A80 Effective date: 20190704 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20220601 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20230131 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20230202 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20230222 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7239923 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |