JP2020195397A - 微生物トランスグルタミナーゼ、その基質、およびその使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
[0001]本出願は、2014年12月19日に出願され、「トランスグルタミナーゼ基質の同定およびその使用」と題する米国仮特許出願第62/094,495号、および2015年11月25日に出願され、「トランスグルタミナーゼ種の同定および特徴づけのための系および方法」と題する米国仮特許出願第62/260,162号に基づき、その利益を主張し、それらは参照により本明細書に組み込まれる。
[0002]適用なし。
[0009]別の態様において、基質タグは検出可能な標識をさらに含む。
[0011]別の態様において、アシル供与タグは、ペプチド配列APRYRQRAA(配列番号24)を有する。
[0014]別の態様において、第1の基質と第2の基質を架橋するステップが、アシル供与タグのγ−カルボキサミド基とアミノ供与タグのε−アミノ基の間にイソペプチド結合を形成する。
[0016]別の態様において、検出可能な標識は、ビオチン部分、蛍光色素、ルテニウム標識、放射標識、および化学発光標識から選択される。
[0018]別の態様において、第1の基質の第2の基質への架橋は、少なくとも約70%の収率で達成される。
[0020]本開示の別の態様によれば、微生物トランスグルタミナーゼの存在下でイソペプチド結合を形成するためのキットは、カツネリア・アルビダ微生物トランスグルタミナーゼ(配列番号6)と少なくとも80%配列同一性を有する、精製された微生物トランスグルタミナーゼを含む。
基質のうちの1つをさらに含む。
[0023]別の態様において、検出可能な標識は、ビオチン部分、蛍光色素、ルテニウム標識、放射標識、および化学発光標識から選択される。
[0025]別の態様において、キットは、第1の基質および第2の基質のうちの他方の1つをさらに含む。
[0028]別の態様において、アンモニウムは、少なくとも約10μMの濃度で存在する。
[0031]本開示の別の態様によれば、トランスグルタミナーゼについてのアミン供与基質は、式Xaa1−Xaa2−Xaa3−Xaa4−Xaa5を有するアミノ酸配列を含み、Xaaが任意のアミノ酸であり、前記アミノ酸配列が少なくとも1個のリジンを含み、Xaa1およびXaa2のうちの1個がチロシンおよびアルギニンから選択され、アルギニン、セリン、チロシン、およびリジンから選択される、前記アミノ酸配列におけるアミノ酸の総数が少なくとも3個である。
[0033]別の態様において、アミノ酸配列は2個以下のアミノ酸リジンを含む。
[0034]本発明の前述を始めとする態様および利点は、以下の説明から明らかだろう。その説明において、本明細書の一部を形成する添付の図面が参照され、かつ例示として本発明の好ましい実施形態が示されている。しかしながら、そのような実施形態は、必ずしも本発明の完全な範囲を表すわけではなく、したがって、本発明の範囲を解釈するために特許請求の範囲および本明細書が参照される。
Co.,Inc.の研究者により初めて記載されたタンパク質−グルタミンγ−グルタミルトランスフェラーゼ(EC 2.3.2.13)であり、多くの食品および生物工学的な適用においてタンパク質およびペプチドの架橋のために最も広く用いられている酵素群の一つである。MTGは、最初、生物体ストレプトマイセス・モバラエンシス(Streptomyces mobaraensis)において発見され、後で、それから抽出された。MTGは、アシル基(例えば、グルタミン側鎖;アシル供与体)とアルキル−アミン(例えば、リジン側鎖;アミン供与体)の間の安定なイソペプチド結合の形成を触媒する。反応性アミン基の非存在下において、水との酵素的反応は、グルタミン側鎖の脱アミノをもたらす。細菌酵素は、Ca2+またはGTPなどの補因子の添加なしで、かつ幅広い範囲のpH、バッファー、および温度条件で働く。
れたAlbertらによる米国仮特許出願第62/094,495号)、これを始めとするホモログ酵素の基質特異性のみが知られており、それにより、いかなるバイオ直交性コンジュゲーションアプローチ(例えば、2つ以上の異なる標識基質および2つ以上のトランスグルタミナーゼ種を用いる生体分子の同時標識)も妨げられている。したがって、新しいトランスグルタミナーゼ種の同定および特徴づけのためのハイスループットのアプローチの必要性が存在する。さらに、より高い活性、特異性、またはそれらの組み合わせを有する向上したトランスグルタミナーゼの必要性が存在する。さらに、目的のトランスグルタミナーゼについての特異的かつ固有の基質である、アシル供与タグ(例えば、グルタミンまたはQタグ)およびアミン供与タグ(例えば、リジンまたはKタグ)の必要性が存在する。
のホモログについての検索を含み得る。一つの例示的な実施形態において、トランスグルタミナーゼは、微生物トランスグルタミナーゼ(例えば、ストレプトベルティシリウム種(Streptoverticillium sp.)トランスグルタミナーゼ、カツネリア種トランスグルタミナーゼ、ストレプトマイセス種など)または哺乳類トランスグルタミナーゼであり得る。酵素が哺乳類トランスグルタミナーゼである実施形態において、哺乳類トランスグルタミナーゼは、例えば、ヒト第XIII因子Aトランスグルタミナーゼ、ヒト第XIII因子Bトランスグルタミナーゼ、第XIII因子トランスグルタミナーゼ、ケラチノサイトトランスグルタミナーゼ、組織型トランスグルタミナーゼ、上皮トランスグルタミナーゼ、前立腺トランスグルタミナーゼ、神経細胞トランスグルタミナーゼ、ヒトトランスグルタミナーゼ5、およびヒトトランスグルタミナーゼ7からなる群から選択され得る。
を迅速にスクリーニングすることを含み得る。スクリーニングのための一つの適切な方法には、断片交換システムを用いる、宿主生物体における可溶性細胞質またはペリプラズム発現のために設計された1つまたは複数の発現ベクターへの候補トランスグルタミナーゼの遺伝子挿入断片の挿入が挙げられる(Geertsmaら、2011 Biochemistry 50(15):3272〜3278)。スクリーニングするための他の方法もまた用いられ得る。
分子)の形であり得る。
[実施例]
[0081]抗体−薬物コンジュゲートのような部位特異的コンジュゲーションアプローチのための実行可能かつロバストな、酵素による工業規模の方法を確立することにより、結合酵素への高い需要が生じる。いくつかある因子の中でも、そのようなアプローチが高い反応速度、コンジュゲーション効率、および基質特異性を有することが有用であり得る。さらに、そのようなアプローチが製造において経済的であり、分子量が小さい酵素、補因子に依存しない酵素など、およびそれらの組み合わせを含むことが有用であり得る。新しい微生物トランスグルタミナーゼの発見のために、言及された判定基準を全て満たし得る、この酵素のホモログの検索を、クエリとしてS.モバラエンシスのタンパク質−グルタミンγ−グルタミルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を用いて実施した。これは、細菌K.アルビダDSM 43870由来の仮定上の遺伝子産物KALB_7456をもたらし、その細菌は、2014年に配列決定された芽胞形成性グラム陽性細菌である(Rebetsら、2014 BMC genomics 15:885)。
43870由来の仮定上の遺伝子産物KALB_7456(GenBankアクセッション番号AHI00814.1;UniProtアクセッション番号W5WHY8)がもたらされた。遺伝子産物KALB_7456のアミノ酸配列は以下の通りである:
[0085]仮定上のK.アルビダ トランスグルタミナーゼ(KalbTG)について発現条件を迅速にスクリーニングするために、本発明者らは、断片交換システム(Geertsmaら、2011 Biochemistry 50(15):3272〜3278)を用いて、大腸菌における可溶性細胞質またはペリプラズム発現のために設計された複数の発現ベクターに合成遺伝子挿入断片を挿入した。
現への負の影響が観察された。しかしながら、対イオンとしての硫酸イオンの使用は、精製ステップに関して負の効果をほとんど、あるいは全く生じ得ない。したがって、所定のトランスグルタミナーゼの発現および精製への対イオンの効果をまず、決定することは有用であり得る。さらに、所定のトランスグルタミナーゼの発現中または精製中のいずれかに存在するアンモニウムイオンの濃度は、様々であり得る。一実施形態において、アンモニウムは、少なくとも約10μMの濃度で存在し得る。別の実施形態において、アンモニウムは、少なくとも約100μMの濃度で存在し得る。さらに別の実施形態において、アンモニウムは、少なくとも約1mMの濃度で存在し得る。なお別の実施形態において、アンモニウムは、少なくとも約10mMの濃度で存在し得る。
[0097]K.アルビダ トランスグルタミナーゼの有望なアシル供与基質およびアミン供与基質を同定するために、5merペプチドアレイにおけるハイスループットスクリーニングを実施した(図4Aおよび4B)。SlyD融合型および成熟型のKalbTG酵素のどちらについても少なくとも1.65U/mgの活性が、市販のアッセイにより確認された(Zedira MTG−ANiTA−KIT;そのキットと共に供給されたMTGによる4.3U mg−1およびBSAでの0.07U/mgブランク値と比較して)。アッセイは、架橋基質としてβ−カゼインを用い、NADPHのグルタミン酸デヒドロゲナーゼ依存性酸化により脱アミドを検出した。特異的認識モチーフを、マスクレスアレイ合成により調製されたペプチドアレイでKalbTGをアッセイすることにより、同定した(2014年12月19日に出願されたAlbertらによる米国特許公開第2015/0185216号)。140万個の固有の5merペプチドとビオチン化アミン供与体との間のアミド基転移反応を、2つのアレイ上で並行して定量化し、最も高いターンオーバーを有するペプチドの配列を決定した(図4A)。9個の最良のペプチドを再合成し、スタンドアロン型GLDH共役アッセイにおいてKalbTG活性について試験した。対応するアレイデータと並べた、GLDH共役アッセイの結果は、表1に示されている。配列MLAQG(配列番号13)についてのアレイシグナルは、この配列がアレイに含まれていなかったため、適用せず(n.a.)と示されていることに留意されたい。同様に、バックグラウンドシグナルの測定は、アレイ上で実施された実験に対してだけ適用された。
ッセイにおける最高ターンオーバー(4.47±0.16pmol NADH s−1)は、配列RYESK(配列番号2)に関して観察された。これは小さいが、カダベリン(3.51±0.12pmol s−1)またはARSKL(配列番号30)(ペプチドアレイにおいて好ましいMTGリジン供与体モチーフとして以前に確立されたペプチド)(3.87±0.31pmol s−1)に対して有意な増加である。S.モバラエンシスMTG基質ペプチドARSKL(配列番号30)に関する追加の詳細は、2014年12月19日に出願されたAlbertらによる米国仮特許出願第62/094,495号に見出すことができる。
peptide array synthesis)を用いることにより同じアレイにおいて二連で合成した。3:1の比を有するグリシンとセリンの混合物を用いることにより合成された3アミノ酸長リンカーに、各5merペプチドを、N末端およびC末端の両方において、隣接させた。
[0105]ペプチドアレイは、全ての実行可能な5merペプチドについての読み取りを一度に与えることができるため、単一のデータセットそれぞれは、酵素が基質特異性においてどのように異なるかを評価するのに十分である。上位のKalbTGグルタミン基質(図4A)は、MTGで実施されたアレイにおけるシグナル分布(図5A)の中央の場に見出された。比較により、上位の性能を示すS.モバラエンシスMTGグルタミン含有基質(図5B)は、KalbTGアレイにおいて相対的により低いシグナルを示した(図5C)。その2つのトランスグルタミナーゼ酵素が直交性グルタミン含有基質優先を有することを確認するため、および交差反応性の量を定量するために、両方の酵素の動態を、様々な濃度の基質ペプチドZ−GGGYRYRQGGGGおよびZ−GGGDYALQGGGGの存在下で決定した(図5D)。とりわけ、Zコンジュゲート型基質は、ペプチド配列GGGYRYRQGGGG(配列番号75)およびGGGDYALQGGGG(配列番号76)を含んだ。S.モバラエンシスMTGは、両方の基質に対して0.6〜0.9mM範囲内の類似したKM値を示したが、ターンオーバーkcatは、好ましいDYALQ(配列番号22)配列を含むZ−GGGDYALQGGGG基質に関して有意により高く(YRYRQ(配列番号1)に関しての0.93s−1に対して1.39s−1)、それぞれ、1.64×103[M−1 s−1]および1.44×103[M−1 s−1]の触媒効率(kcat KM −1)を生じた(表3)。操作されたS.モバラエンシスMTG酵素と比較すると、KalbTGは、基質結合効率(2mMのKM)がより低いが、ターンオーバー(1.92s−1のkcat)がより高いように見え、0.89×103[M−1 s−1]のkcat KM −1となる。KalbTGは、S.モバラエンシスMTG基質Z−GGGDYALQGGGGに対して完全に非反応であるように見え、したがって、動態学的パラメータは、表3における「n.d.」により示されているように、決定することができなかった。
らびにKalbTGおよびS.モバラエンシスMTGの様々な基質との交差反応性を定量するために、S.モバラエンシスMTG活性についての連続的グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(GLDH)共役アッセイ(Oteng−Pabiら、2013、Analytical biochemistry 441(2):169〜173参照)を適用した。
ターンオーバー速度=|吸光度速度|*1.111 (方程式1)
[0112]標識化アッセイについて、サーマス・サーモフィラス由来のシャペロンSlyD(Universal Protein Resource(UniProt)番号Q5
SLE7)を、KalbTGについての標識化スキャフォールドとして用いた。SlyD配列は以下である:
KalbTG Kタグ−Cy3:
Z−RYESKG−O2Oc−EUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEU−C(sCy3−MH)−OH(5863.9g/mol)、および
MTG Kタグ−Cy5:
Z−RSKLG−O2Oc−EUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEU−C(Cy5−MH)−OH(5723.9g/mol)
式中、Eはグルタメートであり、Uはβ−アラニンであり、C(sCy3−MH)およびC(Cy5−MH)は、それぞれ、スルホ−Cy3マレイミドまたはCy5マレイミドにより、合成後に修飾されたC末端システインを表す。
RP18−HPLC)により精製した。色素標識化を、ペプチドのスルホ−Cy3マレイミド(Lumiprobe)およびCy5マレイミド(GE Healthcare)、それぞれとの反応により達成した。色素標識ペプチドの精製を、水/TFA アセトニトリル勾配を用いるRP18−HPLCにより達成した。ペプチドのアイデンティティを、Kinetex C18 2.6μm、50×3mmカラム(Phenomenex)を適用する液体クロマトグラフィ−質量分析(LC−MS)(Thermo Scientific RSLC−MSQplusシステム)により確認した。
[0118]図7A〜7Cに示されているように、K.アルビダ由来のMTGの完全な構造のS.モバラエンシス由来のMTGとのアラインメントは、KalbTGの性質を知る上での手掛かりを与えた。一態様において、最初の19個のN末端アミノ酸およびC末端の人工的なGGGSG−8×Hisタグが乱され、それゆえに、構造において解明されなかった。KalbTGの全体的な構造は、以前に記載されているような(Kashiwagiら、2002、J Bio Chem 277(46):44252〜44260)S.モバラエンシスMTG構造と似ており、α+βフォールディングクラスのディスク様形状を形成し、2つの複数ループ突出部が、活性部位溝を形成する。しかしながら、構造は、KalbTG構造に存在しない2つのαヘリックス(Kashiwagiのナンバリングにおいてα4およびα5)、およびKalbTGにおいてより少ない疎水性残基を含む(それぞれ、AFの代わりにSF、およびLVの代わりにQV)2つの小さいβストランド(β2およびβ4)の点で異なり、KalbTGにおける全要素を9個のαヘリックスおよび6個のβストランドのみへと構築する。触媒性三つ組(Cys64、Asp255、His274)は、構造的に保存されている(KalbTGオープンリーディングフレームの始めからナンバリングすると、Cys82、Asp211、His224)。しかしながら、KalbTG Cys82のチオール側鎖は、活性溝において、それのS.モバラエンシスMTG対応物より2.6Å、深く埋もれている。S.モバラエンシスMTG酵素前駆体の結晶構造(Yangら、2011、J Bio Chem 286(9):7301〜7307)は、活性溝が、L形プロペプチドによってしっかりと塞がれていることを示す。KalbTGの結合ポケットは、S.モバラエンシスMTGのプロペプチドと立体障害なしにアライメントすることができ、類似した酵素前駆体機構がKalbTGにおいて存在し得ることを示す(図7B)。驚くことに、Cys82近くの活性溝を形成するループの1つが、アミノ酸配列YRYRAR(配列番号4)を提示し、その配列は、グルタミン側鎖を別にすれば、ペプチドアレイにおいて発見された好ましいKalbTG基質(すなわち、上位の2つの5merペプチドはYRYRQ(配列番号1)およびRYRQR(配列番号14)であった;図7C)と同一である。したがって、結晶構造の分析は、基質配列の同定に関して、ペプチドアレイの信頼性の独立した確認としての役割を果たした。
[0122]動的走査熱量(DSC)測定を、参照としてPBSを用い、VP−キャピラリDSC装置(MicroCal/GE Healthcare)および90℃ h−1の走査速度で、20℃から90℃の温度範囲において実施した。
[0123]表6および7に関して、本明細書で同定されたKalbTGペプチド基質の分析
により、それらの基質に共有される一連の特性が明らかにされた。
<態様>
態様1.ペプチド配列YRYRQ(配列番号1)と少なくとも80%配列同一性を有するアシル供与タグ、およびペプチド配列RYESK(配列番号2)と少なくとも80%配列同一性を有するアミン供与タグのうちの1つを含む、微生物トランスグルタミナーゼについての基質タグ。
態様2.微生物トランスグルタミナーゼが、カツネリア・アルビダ(Kutzneria albida)微生物トランスグルタミナーゼ(配列番号6)と少なくとも80%配列同一性を有する、態様1に記載の基質タグ。
態様3.検出可能な標識をさらに含む、態様1に記載の基質タグ。
態様4.検出可能な標識が、ビオチン部分、蛍光色素、ルテニウム標識、放射標識、および化学発光標識から選択される、態様3に記載の基質タグ。
態様5.アシル供与タグがペプチド配列APRYRQRAA(配列番号24)を有する、態様1に記載の基質タグ。
態様6.微生物トランスグルタミナーゼを第1の基質および第2の基質に曝露するステップであって、前記第1の基質が、ペプチド配列YRYRQ(配列番号1)と少なくとも80%配列同一性を有するアシル供与タグを含み、前記第2の基質が、ペプチド配列RYESK(配列番号2)と少なくとも80%配列同一性を有するアミン供与タグを含む、ステップ、ならびに
前記第1の基質と前記第2の基質を架橋するステップであって、それにより、アシル供与タグとアミノ供与タグの間にイソペプチド結合を形成する、ステップ
を含む、微生物トランスグルタミナーゼの存在下でイソペプチド結合を形成する方法。
態様7.微生物トランスグルタミナーゼがカツネリア・アルビダ微生物トランスグルタミナーゼ(配列番号6)と少なくとも80%配列同一性を有する、態様6に記載の方法。
態様8.第1の基質と第2の基質を架橋するステップが、アシル供与タグのγ−カルボキサミド基とアミノ供与タグのε−アミノ基の間にイソペプチド結合を形成する、態様6に記載の方法。
態様9.第1の基質および第2の基質のうちの少なくとも1つが検出可能な標識を含む、態様6に記載の方法。
態様10.検出可能な標識が、ビオチン部分、蛍光色素、ルテニウム標識、放射標識、および化学発光標識から選択される、態様9に記載の方法。
態様11.アシル供与タグがペプチド配列APRYRQRAA(配列番号24)を有する、態様6に記載の方法。
態様12.第1の基質の第2の基質への架橋が少なくとも約70%の収率で達成される、態様6に記載の方法。
態様13.前記収率が約30分以内に達成される、態様12に記載の方法。
態様14.カツネリア・アルビダ微生物トランスグルタミナーゼ(配列番号6)と少なくとも80%配列同一性を有する、精製された微生物トランスグルタミナーゼを含む、微生物トランスグルタミナーゼの存在下でイソペプチド結合を形成するためのキット。
態様15.ペプチド配列YRYRQ(配列番号1)と少なくとも80%配列同一性を有するアシル供与タグを含む第1の基質およびペプチド配列RYESK(配列番号2)と少なくとも80%配列同一性を有するアミン供与タグを含む第2の基質のうちの1つをさらに含む、態様14に記載のキット。
態様16.第1の基質および第2の基質の少なくとも1つが検出可能な標識を含む、態様15に記載のキット。
態様17.検出可能な標識が、ビオチン部分、蛍光色素、ルテニウム標識、放射標識、および化学発光標識から選択される、態様16に記載のキット。
態様18.アシル供与タグがペプチド配列APRYRQRAA(配列番号24)を有する、態様15に記載のキット。
態様19.第1の基質および第2の基質のうちの他方の1つをさらに含む、態様15に記載のキット。
態様20.カツネリア・アルビダ微生物トランスグルタミナーゼ(配列番号6)と少なくとも80%配列同一性を有する、単離された微生物トランスグルタミナーゼを含む、イソペプチド結合を形成するための酵素。
態様21.単離された微生物トランスグルタミナーゼがアンモニウムの存在下で発現し、単離される、態様20に記載の酵素。
態様22.アンモニウムが少なくとも約10μMの濃度で存在する、態様21に記載の酵素。
態様23.式Xaa1−Xaa2−Xaa3−Xaa4−Xaa5を有するアミノ酸配列を含む、トランスグルタミナーゼについてのアシル供与基質であって、Xaaが任意のアミノ酸であり、Xaa3、Xaa4、およびXaa5のうちの少なくとも1個がグルタミンであり、Xaa4およびXaa5のうちの1個がアルギニンであり、前記アミノ酸配列が、グルタミンと連続的に隣接した少なくとも1個のアルギニンを含み、アルギニン、グルタミン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンから選択される、前記アミノ酸配列におけるアミノ酸の総数が少なくとも4個である、アシル供与基質。
態様24.Xaa5と、Xaa1、Xaa2、およびXaa3の少なくとも1個とがアルギニンである、態様23に記載のアシル供与基質。
態様25.式Xaa1−Xaa2−Xaa3−Xaa4−Xaa5を有するアミノ酸配列を含む、トランスグルタミナーゼについてのアミン供与基質であって、Xaaが任意のアミノ酸であり、前記アミノ酸配列が少なくとも1個のリジンを含み、Xaa1およびXaa2のうちの1個がチロシンおよびアルギニンから選択され、アルギニン、セリン、チロシン、およびリジンから選択される、前記アミノ酸配列におけるアミノ酸の総数が少なくとも3個である、アミン供与基質。
態様26.Xaa4およびXaa5のうちの1個がリジンである、態様25に記載のアミン供与基質。
態様27.アミノ酸配列が2個以下のアミノ酸リジンを含む、態様25に記載のアミン供与基質。
Claims (22)
- 微生物トランスグルタミナーゼを第1の基質および第2の基質に曝露するステップであって、前記第1の基質が、ペプチド配列YRYRQ(配列番号1)と少なくとも80%配列同一性を有するアシル供与タグを含み、前記第2の基質が、ペプチド配列RYESK(配列番号2)と少なくとも80%配列同一性を有するアミン供与タグを含む、ステップ、ならびに
前記第1の基質と前記第2の基質を架橋するステップであって、それにより、アシル供与タグとアミノ供与タグの間にイソペプチド結合を形成する、ステップ
を含む、微生物トランスグルタミナーゼの存在下でイソペプチド結合を形成する方法。 - 微生物トランスグルタミナーゼがカツネリア・アルビダ微生物トランスグルタミナーゼ(配列番号6)と少なくとも80%配列同一性を有する、請求項1に記載の方法。
- 第1の基質と第2の基質を架橋するステップが、アシル供与タグのγ−カルボキサミド基とアミノ供与タグのε−アミノ基の間にイソペプチド結合を形成する、請求項1に記載の方法。
- 第1の基質および第2の基質のうちの少なくとも1つが検出可能な標識を含む、請求項1に記載の方法。
- 検出可能な標識が、ビオチン部分、蛍光色素、ルテニウム標識、放射標識、および化学発光標識から選択される、請求項4に記載の方法。
- アシル供与タグがペプチド配列APRYRQRAA(配列番号24)を有する、請求項1に記載の方法。
- 第1の基質の第2の基質への架橋が少なくとも約70%の収率で達成される、請求項1に記載の方法。
- 前記収率が約30分以内に達成される、請求項7に記載の方法。
- カツネリア・アルビダ微生物トランスグルタミナーゼ(配列番号6)と少なくとも80%配列同一性を有する、精製された微生物トランスグルタミナーゼを含む、微生物トランスグルタミナーゼの存在下でイソペプチド結合を形成するためのキット。
- ペプチド配列YRYRQ(配列番号1)と少なくとも80%配列同一性を有するアシル供与タグを含む第1の基質およびペプチド配列RYESK(配列番号2)と少なくとも80%配列同一性を有するアミン供与タグを含む第2の基質のうちの1つをさらに含む、請求項9に記載のキット。
- 第1の基質および第2の基質の少なくとも1つが検出可能な標識を含む、請求項10に記載のキット。
- 検出可能な標識が、ビオチン部分、蛍光色素、ルテニウム標識、放射標識、および化学発光標識から選択される、請求項11に記載のキット。
- アシル供与タグがペプチド配列APRYRQRAA(配列番号24)を有する、請求項10に記載のキット。
- 第1の基質および第2の基質のうちの他方の1つをさらに含む、請求項10に記載のキット。
- カツネリア・アルビダ微生物トランスグルタミナーゼ(配列番号6)と少なくとも80%配列同一性を有する、単離された微生物トランスグルタミナーゼを含む、イソペプチド結合を形成するための酵素。
- 単離された微生物トランスグルタミナーゼがアンモニウムの存在下で発現し、単離される、請求項15に記載の酵素。
- アンモニウムが少なくとも約10μMの濃度で存在する、請求項16に記載の酵素。
- 式Xaa1−Xaa2−Xaa3−Xaa4−Xaa5を有するアミノ酸配列を含む、トランスグルタミナーゼについてのアシル供与基質であって、Xaaが任意のアミノ酸であり、Xaa3、Xaa4、およびXaa5のうちの少なくとも1個がグルタミンであり、Xaa4およびXaa5のうちの1個がアルギニンであり、前記アミノ酸配列が、グルタミンと連続的に隣接した少なくとも1個のアルギニンを含み、アルギニン、グルタミン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンから選択される、前記アミノ酸配列におけるアミノ酸の総数が少なくとも4個である、アシル供与基質。
- Xaa5と、Xaa1、Xaa2、およびXaa3の少なくとも1個とがアルギニンである、請求項18に記載のアシル供与基質。
- 式Xaa1−Xaa2−Xaa3−Xaa4−Xaa5を有するアミノ酸配列を含む、トランスグルタミナーゼについてのアミン供与基質であって、Xaaが任意のアミノ酸であり、前記アミノ酸配列が少なくとも1個のリジンを含み、Xaa1およびXaa2のうちの1個がチロシンおよびアルギニンから選択され、アルギニン、セリン、チロシン、およびリジンから選択される、前記アミノ酸配列におけるアミノ酸の総数が少なくとも3個である、アミン供与基質。
- Xaa4およびXaa5のうちの1個がリジンである、請求項20に記載のアミン供与基質。
- アミノ酸配列が2個以下のアミノ酸リジンを含む、請求項20に記載のアミン供与基質。
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