JP2020188800A

JP2020188800A - バクテリオシンの細胞壁ターゲティングドメインを用いた細菌感染部位への免疫学的機能のターゲティング方法

Info

Publication number: JP2020188800A
Application number: JP2020129953A
Authority: JP
Inventors: モハムドジャバドアマン; Javad AMAN Mohammad; ラジャンプラサドアディカリ; Prasad Adhikari Rajan
Original assignee: Integrated BioTherapeutics Inc
Current assignee: Integrated BioTherapeutics Inc
Priority date: 2014-01-14
Filing date: 2020-07-31
Publication date: 2020-11-26
Anticipated expiration: 2035-01-14
Also published as: EP3094348A1; US10487140B2; US20160333077A1; EP3094348A4; JP7142371B2; US20200216521A1; WO2015109012A1; US11028153B2; JP2017504325A

Abstract

【課題】感染部位へと様々な免疫機能を特異的にターゲティングさせるための包括的なアプローチを提供する。【解決手段】バクテリオシン細胞壁ターゲティングドメイン(CWT)および免疫機能媒介成分(IFMC)からなる、様々な融合タンパク質を提供する。該CWTは、細菌表面へと該融合タンパク質をターゲティングさせて、該感染部位における蓄積をもたらす。該IFMCは、様々な免疫機能、例えば、毒素の中和、または細菌を排除できる免疫細胞の動員を媒介する。【選択図】図１

Description

相互参照
本特許協力条約出願は、2014年1月14日に出願された米国仮特許出願第61/927,120号に係る優先権を主張する。米国仮特許出願第61/927,120号は、その全体が本明細書に組み入れられる。

背景
ファージによってコードされるリシンと、バクテリオシンとを含む溶菌素は、4つの主な細胞壁ペプチドグリカン結合の1つを標的とし、細菌の細胞壁を溶解する酵素である。リシンはファージ生活環の間に感染細菌の細胞質に蓄積する。遺伝的にハードコード(hard-code)されている時、ホリンと名付けられた別のファージタンパク質が細胞膜の中に挿入されて、膜が破壊される[1]。これによりリシンはペプチドグリカンに接近できるようになり、それによって、細胞が溶解され、子孫ファージが放出される[2]。興味深いことに、外因的に適用された組換えリシンは、感受性のある細菌の内在性ペプチドグリカン結合を切断することができる[3]。特定の細菌種によってコードされ、競合株を溶解するという目的にかなうかまたは細胞分裂中の細菌細胞の隔膜領域における自己分解に役に立つ非ファージ溶菌素も述べられている。リゾスタフィンは、スタフィロコッカス・シミュランス(Staphylococcus simulans)次亜種スタフィロリティカス(staphylolyticus)によって分泌され、競合する黄色ブドウ球菌(S.aureus)の細胞壁に対して向けられるバクテリオシンである[4]。黄色ブドウ球菌自己溶解素(Atl)は2つの主なペプチドグリカン加水分解酵素に処理され、来たるべき細胞分裂部位の隔膜領域における細胞壁上に局在し、細胞分離において重要な役割を果たす138kDaタンパク質である[5]。非常に多くのインビトロ研究およびインビボ研究[4, 7〜10]において、潜在的な治療剤として種特異的ファージ[6]およびリゾスタフィンが試験されている。

ファージリシン、リゾスタフィン、および自己溶解素は全て、細胞壁ターゲティング(CWT)ドメイン(または細胞壁結合ドメイン; CBDとも知られる)と1つまたは複数の触媒ドメインからなる[4,10-13]。CWTは特定の表面部分を認識し、それによって、ペプチドグリカンを酵素的切断するために細菌表面に触媒ドメインが配置される。触媒ドメインは比較的保存されているのに対して、CWTは種間で保存されておらず、種特異性を付与し、異なる株に対して多種多様な結合親和性をもつことができる。いくつかの研究から、緑色蛍光タンパク質(GFP)などの異種状況(context)とつぎ合わされた場合に、個々のドメイン機能を示す切断型[8]またはキメラバージョンのファージリシン[7]が構築されたことが報告された。リゾスタフィンCWT(GFP-CWT)は黄色ブドウ球菌ならびにP.サキュリ(P.sacculi)に結合することが示された[9]。同様に、自己溶解素CWTのGFP融合は15nMの解離定数で黄色ブドウ球菌に結合する[14]。結晶構造研究から、単離されたCWTは緻密な構造を有し、独立して折り畳みできることが示されている。従って、単離されたCWTドメインを用いて、感染部位における細菌の表面へと異種タンパク質をターゲティングさせることができる。

抗体は体液性免疫応答の中心的存在である。細菌毒素に対してターゲティングした抗体は毒素を捕獲および中和し、従って、それぞれの細菌種のビルレンスを減少させることができる。しかしながら、抗毒素抗体は細菌細胞壁を認識する能力を欠いているので、細菌感染部位へと特異的にターゲティングしない。抗原結合Fabドメインを介して、細菌表面抗原、例えば、莢膜多糖および他の表面部分を認識する抗体は細菌をオプソニン化し、それによって、自然免疫応答が細菌に結合し、細菌を貪食することが可能になる。この機能は、好中球またはマクロファージなどの食細胞の表面上の受容体との特異的相互作用を受ける抗体Fc部分に依存する。適応免疫系では、保護抗体が産生されるためには侵入細菌に事前に遭遇していることか、またはそれぞれの細菌を模倣するワクチンが必要である。これは、完全に機能する保護応答を展開できる前に数日〜数週間かかるプロセスである。従って、急性感染が始まった後に、能動的にワクチン接種することが有用である。

簡単な概要
本開示は、免疫機能媒介成分(IFMC)と融合したバクテリオシン/ファージ/バクテリオシン様阻害物質(BLIS)の細胞壁ターゲティングドメインを含み、細菌標的へとIFMCをターゲティングさせることができる、治療用ポリペプチドを提供する。

ある特定の局面において、BLISは、ファージリシン、リゾスタフィン、自己溶解素、バクテリオシンAS-48、バクテリオシンColE9、ファージφKZ gp144、ファージO9882、ファージ(YC)、BLIS(ビブリオ・ハーベイ(Vibrio harveyi)VIB 571株)、BLIS(FM1025)、リゾスタフィン、φNM3リシン、φ11、リジン、φ68、P17、φB30、リシン、φK、LysK、φMR11、MV-L、ピリンタンパク質の接着結合ドメイン(adherence binding domain)、E-コリシン、自己溶解素、φSs2、ストレプトコッカス・スイス(Streptococcus suis)ファージ由来のPlySs2バクテリオファージリシン(PlySs2)、エンドリシンOBPgp279(シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)ファージOBP由来)、PVP-SE1gp146(サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)血液型亜型エンテリティディス(Enteritidis)ファージPVP-SE1)、E201φ2-1gp229(シュードモナス・クロロラフィス(Pseudomonas chlororaphis)ファージ201φ2-1)、T4リゾチームのN末端と融合したペスチシン(pesticin)のFyuA結合ドメインの間のハイブリッド、ファージエンドリシン、PlyLおよびPlyG、ラムダSa2(λSa2)(cpl-7)、溶原性バクテリオファージSM1(バクテリオファージリシンのフィブリノゲン結合ドメイン)、エンドリシンCD27L、マイコバクテリオファージMs6、それらの任意の細胞壁ターゲティング断片、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。

ある特定の局面において、IFMCは、抗体もしくはその断片、ヒト宿主もしくは動物宿主に先在している抗体に対する抗原、Fc受容体ターゲティングドメイン、オプソニン化物質、アジュバント、TLRアゴニスト、サイトカイン、またはそれらの組み合わせを含む。例えば、抗体またはその断片は、細菌抗原、例えば、毒素、例えば、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)毒素、例えば、スーパー抗原、ブドウ球菌エンテロトキシン、毒素ショック症候群毒素1; TSST-1、αヘモリシン、γヘモリシン、ロイコシジン、それらの任意の断片、またはそれらの任意の組み合わせ、クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)毒素A(TcdA)および毒素B(TcdB)、ウェルシュ菌 (Clostridium perfringens)毒素、炭疽菌(Bacillus anthracis)毒素、クロストリジウム・ジフテリア(Clostridium diphtheria)毒素、大腸菌(E.coli)毒素、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)毒素、コレラ菌(Vibrio cholerae)毒素、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)毒素、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)毒素、例えば、ニューモリシン、ストレプトリシン、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)毒素、それらの断片、またはそれらの組み合わせに特異的でもよい。ある特定の局面において、抗体またはその断片は抗原特異的でなく、むしろエフェクター機能を提供する。ある特定の局面において、抗体断片は、Fab部分を欠いている抗体Fc部分を含む。ある特定の局面において、Fc部分は、ヒトIgG抗体、例えば、IgG1抗体またはIgG3抗体に由来する。

ある特定の局面において、IFMCは、抗原、例えば、細菌毒素の非病原性変種、例えば、ブドウ球菌エンテロトキシンB(SEB)、破傷風トキソイド、百日咳トキソイドの変異体、それらの任意の断片、またはそれらの任意の組み合わせを含む。ある特定の局面において、IFMCは、ウイルスタンパク質、例えば、インフルエンザ血球凝集素、それらの任意の断片、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

本明細書において提供される治療用ポリペプチドのある特定の局面において、BLISはリンカーを介してIFMCと融合されている。ある特定の局面において、本明細書において提供される治療用ポリペプチドは、異種アミノ酸配列、例えば、Hisタグ、ユビキチンタグ、NusAタグ、キチン結合ドメイン、Bタグ、HSBタグ、緑色蛍光タンパク質(GFP)、カルモジュリン結合タンパク質(CBP)、ガラクトース結合タンパク質、マルトース結合タンパク質(MBP)、セルロース結合ドメイン(CBD)、アビジン/ストレプトアビジン/Strep-tag、trpE、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、lacZ(β-ガラクトシダーゼ)、FLAG(商標)ペプチド、Sタグ、T7タグ、任意のこのような異種ペプチドの断片、または2種もしくはそれ以上の異種ペプチドの組み合わせをさらに含んでもよい。ある特定の局面において、異種アミノ酸配列は、免疫原、T細胞エピトープ、B細胞エピトープ、該異種ペプチドのうちのいずれかの断片、および該異種ペプチドのうちの2つまたはそれ以上の組み合わせをコードする。

本開示はさらに、上記の治療用ポリペプチドをコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。ある特定の局面において、前記ポリヌクレオチドは、治療用ポリペプチドをコードする核酸と機能的に結合したプロモーターなどの異種核酸をさらに含んでもよい。

本開示はさらに、提供されたポリヌクレオチドを含むベクター、例えば、プラスミドベクター、および提供されたベクターを含む宿主細胞、例えば、大腸菌(Escherichia coli)などの細菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞、または植物細胞を提供する。

本開示はさらに、提供された宿主細胞を培養する工程、および治療用ポリペプチドを回収する工程を含む、治療用ポリペプチドを産生する方法を提供する。

本開示はさらに、本明細書において提供される治療用ポリペプチドと、担体とを含む組成物、例えば、薬学的組成物を提供する。

本開示はさらに、治療を必要とする対象に、本明細書において提供される治療用ポリペプチドの有効量、または本明細書において提供される組成物を投与する工程を含む、細菌感染症、細菌性疾患、または細菌性障害を治療するための方法を提供する。ある特定の局面において、細菌感染症、細菌性疾患、または細菌性障害は、皮膚、軟部組織、血液、または臓器の限局性感染症もしくは全身性感染症である。ある特定の局面において、疾患は呼吸器疾患、例えば、肺炎である。ある特定の局面において、疾患は敗血症である。ある特定の局面において、対象は、哺乳動物、例えば、ヒト、ウシ、またはイヌである。ある特定の局面において、治療用ポリペプチドまたは組成物は、筋肉内注射、皮内注射、腹腔内注射、皮下注射、静脈内注射、経口投与、粘膜投与、鼻腔内投与、または肺投与を介して投与されてもよい。
[本発明1001]
免疫機能媒介成分(IFMC)と融合したバクテリオシン/ファージ/バクテリオシン様阻害物質(BLIS)の細胞壁ターゲティングドメインを含み、細菌標的へと該IFMCをターゲティングさせることができる、治療用ポリペプチド。
[本発明1002]
前記BLISが、ファージリシン、リゾスタフィン、自己溶解素、バクテリオシンAS-48、バクテリオシンColE9、ファージφKZ gp144、ファージO9882、ファージ(YC)、BLIS(ビブリオ・ハーベイ(Vibrio harveyi)VIB 571株)、BLIS(FM1025)、リゾスタフィン、φNM3リシン、φ11、リジン、φ68、P17、φB30、リシン、φK、LysK、φMR11、MV-L、ピリンタンパク質の接着結合ドメイン、E-コリシン、自己溶解素、φSs2、ストレプトコッカス・スイス(Streptococcus suis)ファージ由来のPlySs2バクテリオファージリシン(PlySs2)、エンドリシンOBPgp279(シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)ファージOBP由来)、PVP-SE1gp146(サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)血液型亜型エンテリティディス(Enteritidis)ファージPVP-SE1)、E201φ2-1gp229(シュードモナス・クロロラフィス(Pseudomonas chlororaphis)ファージ201φ2-1)、T4リゾチームのN末端と融合したペスチシンのFyuA結合ドメインの間のハイブリッド、ファージエンドリシン、PlyLおよびPlyG、ラムダSa2(λSa2)(cpl-7)、溶原性バクテリオファージSM1(バクテリオファージリシンのフィブリノゲン結合ドメイン)、エンドリシンCD27L、マイコバクテリオファージMs6、それらの任意の細胞壁ターゲティング断片、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、本発明1001の治療用ポリペプチド。
[本発明1003]
前記IFMCが、抗体もしくはその断片、ヒト宿主もしくは動物宿主に先在している抗体に対する抗原、Fc受容体ターゲティングドメイン、オプソニン化物質、アジュバント、TLRアゴニスト、サイトカイン、免疫刺激分子、例えば、フラジェリン、toll様受容体(TLR)に対する様々なリガンド、コレラ毒素サブユニット、親油性免疫刺激複合体(ISCOMS)、サポニン、共刺激分子、例えば、CD28、真菌免疫調節性タンパク質(FIP)、免疫刺激多糖、短い抗菌性ペプチド、例えば、αデフェンシン、βデフェンシン、およびθデフェンシン、それらの断片、またはそれらの組み合わせを含む、本発明1001の治療用ポリペプチド。
[本発明1004]
前記抗体またはその断片が細菌抗原に特異的である、本発明1003の治療用ポリペプチド。
[本発明1005]
前記細菌抗原が毒素である、本発明1004の治療用ポリペプチド。
[本発明1006]
前記毒素が、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)毒素、クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)毒素A(TcdA)および毒素B(TcdB)、ウェルシュ菌(Clostridium perfringens)毒素、炭疽菌(Bacillus anthracis)毒素、クロストリジウム・ジフテリア(Clostridium diphtheria)毒素、シュードモナスエキソプロテン(pseudomonas exoproten)A(EPA)、トキソイド抗原、例えば、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、ジフテリアトキソイド、もしくはウイルス抗原、例えば、インフルエンザウイルス血球凝集素、肝炎ウイルスBコア抗原、エプスタイン-バーウイルス由来、麻疹由来、ムンプス由来、風疹由来、ポリオーマウイルス由来、もしくはサイトメガロウイルス(CMV)由来の抗原、それらの断片、またはそれらの組み合わせを含む、本発明1005の治療用ポリペプチド。
[本発明1007]
前記黄色ブドウ球菌毒素が、スーパー抗原、ブドウ球菌エンテロトキシン、毒素ショック症候群毒素1;TSST-1、αヘモリシン、γヘモリシン、ロイコシジン、それらの任意の断片、またはそれらの任意の組み合わせを含む、本発明1006の治療用ポリペプチド。
[本発明1008]
前記抗原が、細菌毒素の非病原性変種、ウイルスタンパク質、それらの任意の断片、またはそれらの任意の組み合わせである、本発明1003の治療用ポリペプチド。
[本発明1009]
前記細菌毒素の非病原性変種が、ブドウ球菌エンテロトキシンB(SEB)、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、シュードモナスエキソプロテンA(EPA)の変異体、それらの任意の断片、またはそれらの任意の組み合わせを含む、本発明1008の治療用ポリペプチド。
[本発明1010]
前記ウイルスタンパク質が、インフルエンザ血球凝集素、肝炎ウイルスBコア抗原、エプスタイン-バーウイルス由来、麻疹由来、ムンプス由来、風疹由来、ポリオーマウイルス由来、またはサイトメガロウイルス(CMV)由来の抗原を含む、本発明1008の治療用ポリペプチド。
[本発明1011]
前記抗体またはその断片が、Fab部分を欠いている抗体Fc部分を含む、本発明1003の治療用ポリペプチド。
[本発明1012]
ヒトIgG抗体のFc部分を含む、本発明1011の治療用ポリペプチド。
[本発明1013]
前記ヒトIgGがIgG1またはIgG3である、本発明1012の治療用ポリペプチド。
[本発明1014]
前記BLISがリンカーを介して前記IFMCと融合されている、本発明1001の治療用ポリペプチド。
[本発明1015]
異種アミノ酸配列をさらに含む、本発明1001の治療用ポリペプチド。
[本発明1016]
前記異種アミノ酸配列が、Hisタグ、ユビキチンタグ、NusAタグ、キチン結合ドメイン、Bタグ、HSBタグ、緑色蛍光タンパク質(GFP)、カルモジュリン結合タンパク質(CBP)、ガラクトース結合タンパク質、マルトース結合タンパク質(MBP)、セルロース結合ドメイン(CBD)、アビジン/ストレプトアビジン/Strep-tag、trpE、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、lacZ(β-ガラクトシダーゼ)、FLAG(商標)ペプチド、Sタグ、T7タグ、該異種ペプチドのうちのいずれかの断片、および該異種ペプチドのうちの2つまたはそれ以上の組み合わせからなる群より選択されるペプチドをコードする、本発明1015の治療用ポリペプチド。
[本発明1017]
前記異種アミノ酸配列が、免疫原、T細胞エピトープ、B細胞エピトープ、該異種ペプチドのうちのいずれかの断片、および該異種ペプチドのうちの2つまたはそれ以上の組み合わせをコードする、本発明1016の治療用ポリペプチド。
[本発明1018]
本発明1001の治療用ポリペプチドをコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチド。
[本発明1019]
異種核酸をさらに含む、本発明1018のポリヌクレオチド。
[本発明1020]
前記異種核酸が、前記治療用ポリペプチドをコードする核酸と機能的に結合したプロモーターを含む、本発明1019のポリヌクレオチド。
[本発明1021]
本発明1018のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
[本発明1022]
プラスミドである、本発明1021のベクター。
[本発明1023]
前記プラスミドがpET24プラスミドである、本発明1022のベクター。
[本発明1024]
本発明1021のベクターを含む、宿主細胞。
[本発明1025]
細菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞、または植物細胞である、本発明1024の宿主細胞。
[本発明1026]
前記細菌が大腸菌(Escherichia coli)である、本発明1025の宿主細胞。
[本発明1027]
本発明1024の宿主細胞を培養する工程、および治療用ポリペプチドを回収する工程を含む、該治療用ポリペプチドを産生する方法。
[本発明1028]
本発明1001の治療用ポリペプチドおよび担体を含む、組成物。
[本発明1029]
アジュバントをさらに含む、本発明1028の組成物。
[本発明1030]
前記アジュバントがアラムまたは水酸化アルミニウムである、本発明1029の組成物。
[本発明1031]
治療を必要とする対象に、本発明1001の治療用ポリペプチドの有効量を投与する工程を含む、細菌感染症、細菌性疾患、または細菌性障害を治療するための方法。
[本発明1032]
前記細菌感染症、前記細菌性疾患、または前記細菌性障害が、皮膚、軟部組織、血液、または臓器の限局性感染症または全身性感染症である、本発明1031の方法。
[本発明1033]
前記疾患が呼吸器疾患である、本発明1031の方法。
[本発明1034]
前記呼吸器疾患が肺炎である、本発明1033の方法。
[本発明1035]
前記疾患が敗血症である、本発明1031の方法。
[本発明1036]
前記対象が哺乳動物である、本発明1031の方法。
[本発明1037]
前記哺乳動物がヒトである、本発明1036の方法。
[本発明1038]
前記哺乳動物がウシまたはイヌである、本発明1036の方法。
[本発明1039]
前記治療用ポリペプチドまたは前記組成物が、筋肉内注射、皮内注射、腹腔内注射、皮下注射、静脈内注射、経口投与、粘膜投与、鼻腔内投与、または肺投与を介して投与される、本発明1031の方法。

図1Aおよび1Bは、感染部位ターゲティング抗毒素抗体(ISTAb)技術である。A)ISTAb分子の図。可動性リンカー配列を介して抗毒素モノクローナル抗体(mAb)が溶菌素の細胞壁ターゲティングドメインと遺伝子融合されている。B)ISTAb分子は細菌細胞壁に結合することによって感染部位に蓄積し、放出された毒素を捕獲し、細菌-毒素複合体は多形核細胞(好中球; PMN)または他の食細胞によって排除される。感染部位ターゲティングユニバーサル抗原(ISTUA)である。ISTUAは、特定のCWTを、ほとんどのヒト宿主に先在している抗体に対する抗原、例えば、解毒化ブドウ球菌エンテロトキシンB(SEB)と融合することによって作製される。感染時にはISTUAが患者に投与される。ISTUAはCWTドメインを介して細菌に結合することによって感染部位に蓄積する。先在している抗体がSEBに結合し、食細胞を動員して、貪食により細菌が排除される。感染部位ターゲティングFc分子(ISTAF)である。細胞壁ターゲティングドメインを抗体Fc部分に直接連結することによって作製されたISTAFは、細菌感染部位へと食細胞をターゲティングさせて、細菌の排除をもたらす。 cCan6 ISTAb L1およびcCan6 ISTAb L2を示した模式図である。cCan6は、配列決定されたCan6 mAbの可変領域をヒト軽鎖および重鎖の定常領域と融合することによって得られたキメラ抗体である。次いで、cCan6をL1(SEQ ID NO:1)またはL2(SEQ ID NO:2)のいずれか一方によってリゾスタフィンCWT(結合ドメイン)と連結して、cCan6_ISTAb_L1およびcCan6_ISTAb_ L2を作製した。図5A〜5Cは、構築物のインビトロ機能TNAを示す。A)HEK293細胞株において増殖させた異なる構築物に由来する培養上清をα毒素(0.15ug/ml)中和アッセイ法(TNA)で使用した。B)上清を、NE286(プロテインAヌルJE2(USA300)株)の一晩培養物から作製した細胞懸濁液とインキュベートした。次いで、懸濁液を遠心分離し、上清中でTNAを行った。C)ペレットを用いてα毒素TNAを行った。 cCan6 ISTAB L1とcCan6のHPLC分析を示す。

詳細な説明
定義
本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は、文脈によってはっきりと示されていない限り複数の指示物を含む。従って、「1つの(a)」(または「1つの(an)」)という用語ならびに「1つまたは複数の」および「少なくとも1つの」という用語は本明細書において同義に使用することができる。

さらに、「および/または」は、本明細書において用いられる場合、2つの指定された特徴または成分をそれぞれ、他方と共に、または他方を伴わずに明確に開示すると解釈される。従って、「および/または」という用語は、本明細書において「Aおよび/またはB」などの句において用いられる場合、「AおよびB」、「AまたはB」、「A」(のみ)、および「B」(のみ)を含むことが意図される。同様に、「および/または」という用語は、「A、B、および/またはC」などの句において用いられる場合、以下の局面のそれぞれを包含することが意図される:A、B、およびC;A、B、またはC;AまたはC;AまたはB;BまたはC;AおよびC;AおよびB;BおよびC;A(のみ);B(のみ);ならびにC(のみ)。

局面が「〜を含む」という言葉を用いて説明されている場合は必ず、「〜からなる」および/または「〜から本質的になる」で説明される類似の局面も提供される。

特に定義のない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語は全て、本開示が関連する当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press;およびthe Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Pressは、本開示で使用する用語の多くの総合的な辞書を当業者に提供する。

単位、接頭辞、および記号は国際単位系(SI)に認められている形式で表される。数の範囲は、その範囲を規定している数字を含む。特に定めのない限り、アミノ酸配列は左から右にアミノからカルボキシ方向に書かれる。本明細書において提供される標題は、本明細書全体を参照することによって持つことができる本開示の様々な局面の限定ではない。従って、すぐ下で定義される用語は、本明細書全体を参照することによってさらに完全に定義される。

「核酸」または「核酸断片」という用語は、ポリヌクレオチドまたは構築物に存在する、いずれか1つまたは複数の核酸セグメント、例えば、DNA断片またはRNA断片を指す。本発明の2つまたはそれ以上の核酸が単一のポリヌクレオチド構築物、例えば、単一のプラスミドに存在してもよく、別々の(非同一の)ポリヌクレオチド構築物、例えば、別々のプラスミドに存在してもよい。さらに、任意の核酸または核酸断片が単一のポリペプチド、例えば、単一の抗原、サイトカイン、または調節ポリペプチドをコードしてもよく、複数種のポリペプチドをコードしてもよい。例えば、核酸が2種類またはそれ以上のポリペプチドをコードしてもよい。さらに、核酸が調節エレメント、例えば、プロモーターまたは転写ターミネーターをコードしてもよく、ポリペプチドまたはタンパク質の特殊なエレメントまたはモチーフ、例えば、分泌シグナルペプチドまたは機能ドメインをコードしてもよい。

「ポリヌクレオチド」という用語は、単数の核酸または核酸断片ならびに複数の核酸または核酸断片を包含することが意図され、ポリヌクレオチドを含む、単離された分子または構築物、例えば、ウイルスゲノム(例えば、非感染性ウイルスゲノム)、メッセンジャーRNA(mRNA)、プラスミドDNA(pDNA)、またはpDNA誘導体(例えば、(Darquet, A-M et al., Gene Therapy 4: 1341-1349, 1997)に記載のミニサークル)を指す。ポリヌクレオチドは、直鎖型(例えば、mRNA)、環状型(例えば、プラスミド)、または分岐型、ならびに二本鎖型または一本鎖型で提供されてもよい。ポリヌクレオチドは従来型のホスホジエステル結合を含んでもよく、非従来型の結合(例えば、アミド結合、例えば、ペプチド核酸(PNA)に見られるアミド結合)を含んでもよい。

本明細書で使用する「ポリペプチド」という用語は、単数の「ポリペプチド」ならびに複数の「ポリペプチド」を包含することが意図され、2つまたはそれ以上のアミノ酸からなる任意の鎖を含む。従って、本明細書で使用する「ペプチド」、「オリゴペプチド」、「ジペプチド」、「トリペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、「アミノ酸配列」、または2つまたはそれ以上のアミノ酸からなる鎖を言うために用いられる他の任意の用語は、(これらの用語がそれぞれ、さらに具体的な意味を有する場合があっても)「ポリペプチド」の定義に含まれる。「ポリペプチド」という用語は、これらの任意の用語の代わりに、またはこれらの任意の用語と同義に使用することができる。この用語は、翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基/ブロック基による誘導体化、タンパク質切断、または非天然アミノ酸による修飾を受けたポリペプチドをさらに含む。

「断片」、「類似体」、「誘導体」、または「変種」という用語は、本明細書において提供されるポリペプチドについて言及している場合、親タンパク質の結合活性、免疫原性、または抗原性の少なくとも一部を保持している任意のポリペプチドを含む。本明細書において提供されるポリペプチドの断片には、例えば、タンパク質分解断片または欠失断片が含まれ得る。ある特定の局面において、断片は、対象に送達された場合に低い病原性を示す。

本明細書で使用する「変種」という用語は、アミノ酸の置換、欠失、挿入、および/または改変により、列挙されたポリペプチドと異なるポリペプチドを指す。非天然変種は、当技術分野において公知の変異誘発法を用いて産生することができる。一部の態様において、変種ポリペプチドは、同定された配列と3個のアミノ酸またはそれより少ないアミノ酸の置換、欠失、または付加だけ異なる。このような変種は、一般的に、ポリペプチド配列を改変し、例えば、改変されたポリペプチドの結合特性を評価することによって同定することができる。

変種はまた他の改変も含有してもよいか、または変種は代替的に他の改変を含有してもよい。例えば、この改変によって、ポリペプチドを接合または結合することができる、例えば、異種アミノ酸配列、例えば、翻訳と同時に、または翻訳後にタンパク質移行を誘導する、タンパク質のN末端におけるシグナル(またはリーダー)配列と融合することができる。ポリペプチドを、ポリペプチドの合成、精製、もしくは同定を容易にするために(例えば、6-His)、またはポリペプチドと固体支持体との結合を強化するためにリンカーもしくは他の配列に接合することもできるか、またはリンカーもしくは他の配列と結合した状態で産生することができる。

本明細書で使用する、「抗体」(またはその断片、変種、もしくは誘導体)という用語は、少なくとも、抗原に結合することができる抗体の最小部分、例えば、B細胞によって産生される典型的な抗体の状況では、少なくとも、重鎖(VH)の可変ドメインと軽鎖(VL)の可変ドメインを指す。脊椎動物系における抗体の基本構造はかなりよく理解されている。例えば、Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)を参照されたい。

軽鎖および重鎖は両方とも構造および機能に相同性のある領域に分けられる。機能上、「定常」および「可変」という用語が用いられる。これに関して、軽鎖部分の可変ドメイン(VL)および重鎖部分の可変ドメイン(VH)が抗原認識および特異性を決定することが理解されるだろう。逆に、軽鎖の定常ドメイン(CL)および重鎖の定常ドメイン(CH1、CH2、またはCH3)は、分泌、経胎盤移動性、Fc受容体結合、補体結合などの重要な生物学的特性を付与する。

上記に示すように、可変領域によって、結合分子は抗原におけるエピトープを選択的に認識して、該エピトープに特異的に結合することが可能になる。すなわち、抗体のVLドメインおよびVHドメインまたは相補性決定領域(CDR)のサブセットが一緒になって、三次元抗原結合部位を規定する可変領域を形成する。この結合分子の四次構造は、Yの各アームの末端に存在する抗原結合部位を形成する。さらに具体的には、抗原結合部位は、VH鎖およびVL鎖のそれぞれにおける3つのCDRによって規定される。

天然抗体において、それぞれの抗原結合ドメインに存在する6つの「相補性決定領域」すなわち「CDR」は、抗体が水環境内で三次元立体構造をとる場合に抗原結合ドメインを形成するように特異的に配置される短く隣接しないアミノ酸配列である。抗原結合ドメイン中の残りのアミノ酸は「フレームワーク」領域と呼ばれ、分子内の変化がより少ない。フレームワーク領域は主にβシートコンホメーションをとり、CDRは、βシート構造をつなぐループを形成し、場合によってはβシート構造の一部を形成する。従って、フレームワーク領域は、非共有結合性の鎖間相互作用によってCDRを正しい方向に配置する足場を形成するように働く。配置されたCDRによって形成される抗原結合ドメインは、免疫反応性抗原上のエピトープに相補的な表面を規定する。この相補的な表面は、抗体とそのコグネイトエピトープとの非共有結合を促進する。CDRを構成するアミノ酸およびフレームワーク領域を構成するアミノ酸はそれぞれ正確に定められているので(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、「Sequences of Proteins of Immunological Interest」, Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983);およびChothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)を参照されたい)、当業者であれば、所定の重鎖可変領域または軽鎖可変領域についてCDRを構成するアミノ酸およびフレームワーク領域を構成するアミノ酸を容易に同定することができる。

当技術分野において用いられかつ/または受け入れられている用語の2つまたはそれ以上の定義がある場合、本明細書で使用する用語の定義は、はっきりと反対のことが述べられている場合を除いて、このような意味の全てを含むことが意図される。具体例は、「相補性決定領域」(「CDR」)という用語が、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの可変領域の中に見られる隣接しない抗原結合部位について述べるために用いられることである。この特定の領域は、参照により本明細書に組み入れられるKabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, 「Sequences of Proteins of Immunological Interest」(1983)およびChothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917(1987)によって説明されており、ここでは、これらの定義は、互いに比較した場合にアミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。それにもかかわらず、抗体またはその変種のCDRを言うために一方の定義を適用しても、本明細書において定義および使用される用語の範囲内にあると意図される。

抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、もしくはキメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合断片、例えば、Fab、Fab'、およびF(ab')2、Fd、Fv、単鎖Fv(scFv)、単鎖抗体、ジスルフィド連結Fv(sdFv)、VLドメインもしくはVHドメインのいずれかを含む断片、Fab発現ライブラリーによって作製された断片、または二重特異性抗体もしくは多重特異性抗体が含まれるが、これに限定されない。ScFv分子は当技術分野において公知であり、例えば、米国特許第5,892,019号に記載されている。本開示に包含される免疫グロブリンまたは抗体分子は、任意のタイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、およびIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2)、またはサブクラスの免疫グロブリン分子でよい。

「特異的に結合する」とは、一般的に、抗体またはその断片、変種、もしくは誘導体がその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合し、かつその結合が、抗原結合ドメインとエピトープとの間でいくらかの相補性を必要とすることを意味する。この定義によれば、抗体は、その抗原結合ドメインを介して、ランダムな無関係のエピトープに結合するより容易にエピトープに結合した場合にエピトープに「特異的に結合する」と言われる。

抗体またはその断片、変種、もしくは誘導体は、参照抗体または抗原結合断片とある特定のエピトープとの結合をある程度までブロックするくらいに、そのエピトープに優先的に結合するのであれば、参照抗体または抗原結合断片とそのエピトープとの結合を競合阻害すると言われる。競合阻害は、当技術分野において公知の任意の方法、例えば、競合ELISAアッセイ法によって確かめることができる。結合分子は、参照抗体または抗原結合断片とある特定のエピトープとの結合を少なくとも90％、少なくとも80％、少なくとも70％、少なくとも60％、または少なくとも50％競合阻害すると言うことができる。

本明細書において開示された抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体は、抗原、例えば、本明細書において開示された抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体が認識するか、または特異的に結合する標的ポリペプチドのエピトープまたは部分によって説明または特定することができる。

本明細書で使用する(例えば、「細菌感染症、細菌性疾患、または細菌性障害を有する患者を治療する」という句における)「治療する」、「治療」、または「〜の治療」という用語は、治療を受けている対象において、病原性細菌の病態もしくは疾患の症状の可能性を減らすこと、細菌感染症の程度を小さくすること、または病原性細菌の感染を排除することを指す。例えば、治療するとは、療法が対象に実施された場合に、細菌感染症が発生しないようにする、細菌感染症が広がらないようにする、例えば、感染部位から広がらないようにする、および/または細菌性疾患の症状、徴候、もしくは原因を治癒もしくは軽減する能力を指すことがある。治療するとはまた、少なくとも1つの臨床症状を鎮静させるかもしくは減少させること、および/または状態の進行を阻害するかもしくは遅らせること、および/または疾患もしくは病気の発症を予防するかもしくは遅らせることも指す。従って、「治療する」、「治療すること」、もしくは「〜の治療」という用語(または文法的に等価な用語)は予防的処置体制および治療的処置体制の両方を指す。

本開示は、細菌感染症、細菌性疾患、または細菌性障害の治療において治療利益をもたらす方法およびシステムを提供する。治療利益は必ずしも特定の感染、疾患、障害の治癒とは限らず、むしろ、細菌感染症、細菌性疾患、もしくは細菌性障害の緩和、または生存率の上昇、細菌感染症、細菌性疾患、もしくは細菌性障害の排除、細菌感染症、細菌性疾患、もしくは細菌性障害に関連する症状の軽減、一次的な細菌感染症、細菌性疾患、もしくは細菌性障害の発生に起因する二次的な疾患、障害、もしくは状態の予防もしくは緩和、および/または細菌感染症、細菌性疾患、もしくは細菌性障害の予防を包含する。

本明細書で使用する「対象」または「患者」という用語は、細菌感染症、細菌性疾患、または細菌性障害の診断、予後、または療法が望まれる、任意の対象、特に、哺乳動物の対象を指す。本明細書で使用する「対象」または「患者」という用語は任意のヒトまたは非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」という用語は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、クマ、ニワトリ、両生類、ハ虫類などを含む。本明細書で使用する「細菌感染症、細菌性疾患、または細菌性障害を有する患者」などの句は、細菌感染症、細菌性疾患、または細菌性障害の療法および/または予防的処置の投与から利益を得るであろう対象、例えば、哺乳動物対象を含む。

本明細書で使用する「療法」という用語は、例えば、治療用物質、計器の使用、補助的措置、および外科的処置またはリハビリテーション処置を含む、細菌感染症、細菌性疾患、または細菌性障害を治癒するか、鎮静するか、または予防するための任意の手段を含む。この点において、療法という用語は、細菌感染症、細菌性疾患、または細菌性障害の予防、管理、治療、および/または寛解において使用することができる、任意のプロトコール、方法、および/または治療法もしくは診断法を包含する。一部の局面において、「療法」という用語は、治療用物質によりある特定の細菌種の細胞壁をターゲティングさせることができる治療用物質の治療的有効量を投与することを指す。

本明細書で使用する「治療用物質」という用語は、望ましい、通常は有益な効果を生じるように、細菌感染症、細菌性疾患、または細菌性障害を有する対象に投与される、治療活性のある任意の物質を指す。本明細書において提供される治療用物質は、治療部分、例えば、抗体もしくはその断片、トキソイドもしくはスーパー抗原、またはそれらの断片、あるいは、ペプチド、タンパク質薬物、タンパク質結合体薬物、酵素、サイトカイン、リガンドなどを含むがこれに限定されない他の作用物質と融合した下記および表1に記載のようなバクテリオシン/ファージ/バクテリオシン様阻害物質(BLIS)に由来する細菌細胞壁ターゲティングドメインを含む。

本明細書で使用する「治療的有効」量とは、細菌感染症、細菌性疾患、または細菌性障害を有する対象に、いくらかの改善または利益をもたらす治療用物質の量である。従って、「治療的有効」量とは、細菌感染症、細菌性疾患、または細菌性障害の少なくとも1つの臨床症状のいくらかの緩和、鎮静、および/または減少をもたらす量である。当業者は、いくらかの利益が対象に提供される限り、治療効果が完全である必要はなく、治癒的である必要はないことを理解するだろう。一部の局面において、「治療的有効」という用語は、それを必要とする患者において細菌感染症、細菌性疾患、または細菌性障害を排除、軽減、または隔離することができる治療用物質の量を指す。

本明細書で使用する、細菌感染症、細菌性疾患、または細菌性障害を有する患者において特定の結果を実現するのに「十分な量」または「〜に十分な量」とは、望ましい効果を生じるのに、任意で、治療効果を(すなわち、治療的有効量の投与によって)生じるのに有効な治療用物質(例えば、本明細書に記載のCWT融合タンパク質)の量を指す。

治療用ポリペプチド
本開示は、溶菌素細胞壁ターゲティングドメイン(CWT)および免疫機能媒介成分(IFMC)を含む様々な治療用融合タンパク質によって感染部位へと、様々な免疫機能、例えば、体液性免疫機能、細胞性免疫機能、またはサイトカインを介した免疫機能を特異的にターゲティングさせるための包括的なアプローチを提供する。

ある特定の局面において、CWTは、リンカーを介して、例えば、ペプチドリンカーを介してIFMCと融合されている。適切なペプチドリンカー配列は、可動性の拡大したコンホメーション、すなわち、つなぎ合わされたポリペプチドと相互作用することができる二次構造をとる能力に基づいて、または融合ポリペプチドの全溶解度を高める能力に基づいて、またはつなぎ合わされたペプチド領域に影響を及ぼす静電効果もしくは水相互作用効果が無いことに基づいて選択することができる。

ある特定の局面において、本明細書において提供される治療用ポリペプチドは異種ポリペプチドに取り付けることができる。安定化、分泌、または簡素化された精製を付与するN末端ペプチドまたはC末端ペプチド、例えば、ヘキサヒスチジンタグ、ユビキチンタグ、NusAタグ、キチン結合ドメイン、ompT、ompA、pelB、DsbA、DsbC、c-myc、KSI、ポリアスパラギン酸、(Ala-Trp-Trp-Pro)n、ポリフェニルアラニン、ポリシステイン、ポリアルギニン、Bタグ、HSBタグ、緑色蛍光タンパク質(GFP)、インフルエンザウイルス血球凝集素(HAI)、カルモジュリン結合タンパク質(CBP)、ガラクトース結合タンパク質、マルトース結合タンパク質(MBP)、セルロース結合ドメイン(CBD)、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)、連鎖球菌プロテインG、ブドウ球菌プロテインA、T7遺伝子10、アビジン/ストレプトアビジン/Strep-tag複合体、trpE、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、lacZ(β-ガラクトシダーゼ)、His-パッチチオレドキシン、チオレドキシン、FLAG(商標)ペプチド(Sigma-Aldrich)、Sタグ、またはT7タグを含むが、これに限定されない様々な異種ポリペプチドを使用することができる。例えば、Stevens, R.C., Structure, 8:R177-R185(2000)を参照されたい。異種ポリペプチドはまた、宿主細胞からの本明細書において提供される治療用ポリペプチドの輸送、移動、処理、および/または精製を容易にする任意のプレ配列および/またはプロ配列、あるいは微生物病原体のT細胞エピトープまたは他の免疫原性タンパク質および/もしくは免疫原性エピトープをコードする配列を含むが、これに限定されない任意の有用な免疫原性配列を含んでもよい。

CWTは、細菌表面へと融合タンパク質をターゲティングさせて、感染部位における蓄積をもたらす。IFMCは、様々な免疫機能、例えば、毒素の中和、または細菌を排除できる免疫細胞の動員を媒介する。表1は、感染部位へと免疫機能をターゲティングさせるために操作されることができる、ファージリシン由来および他の溶菌素由来の多数の潜在的なCWTを列挙している。

（表１）CWT(CBD)ドメインを介して感染部位へと免疫機能をターゲティングさせるために使用することができるファージリシンの例

ある特定の局面において、IFMCは、抗体もしくはその断片、例えば、抗原結合断片または非抗原結合断片、例えば、Fc領域、抗原、例えば、細菌抗原、例えば、病原性が弱められた毒素変異体、対象が既存の免疫応答を有すると予想される抗原、例えば、スーパー抗原(例えば、ブドウ球菌エキソトキシンB)、シュードモナスエキソプロテイン(Pseudomonas exoprotein)A(EPA)、小児科ワクチンにおいて用いられるトキソイド抗原、例えば、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、ジフテリアトキソイド、または遍在性ウイルスに由来するウイルス抗原、例えば、インフルエンザウイルス血球凝集素、肝炎ウイルスBコア抗原、エプスタイン-バーウイルス由来、麻疹由来、ムンプス由来、風疹由来、ポリオーマウイルス由来、またはサイトメガロウイルス(CMV)由来の抗原を含んでもよい。

他の局面において、IFMCは、免疫刺激分子またはアジュバント、例えば、フラジェリン、toll様受容体(TLR)に対する様々なリガンド、コレラ毒素サブユニット、親油性免疫刺激複合体(ISCOMS)、サポニン、サイトカイン、共刺激分子、例えば、CD28、真菌免疫調節性タンパク質(FIP)、免疫刺激多糖、短い抗菌性ペプチド、例えば、αデフェンシン、βデフェンシン、およびθデフェンシンを含んでもよい。

CWTを含む融合タンパク質の例には、感染部位ターゲティング抗毒素抗体(ISTAb)、抗菌性免疫再指向ワクチン(Anti-bacterial immune-redirecting vaccine)、および抗菌性自発ワクチン(Anti-bacterial spontaneous vaccine)が含まれるが、これに限定されない。

(1)感染部位ターゲティング抗毒素抗体(ISTAb):
この技術は、感染部位へと治療用抗毒素抗体をターゲティングさせるために溶菌素CWTの高親和性および種特異性を利用する。抗毒素モノクローナル抗体が特定の溶菌素のCWTと遺伝子融合されている(図1A)。感染部位ターゲティング抗毒素抗体(ISTAb)を産生するために宿主細胞内で融合タンパク質が発現される。ISTABは感染宿主に投与された場合に、侵入細菌の細胞壁に結合することで感染部位に蓄積し、毒素を捕獲し、細菌全体-ISTAb-毒素複合体が宿主の食細胞によって排除される(図1B)。ISTAbは、(i)感染因子への特異的かつ高親和性の結合[15]、(ii)ISTAb 1つにつき2つのCWTドメインがあるので、アビディティ効果により結合がさらに強化されること、(iii)抗毒素が必要とされる感染部位における蓄積、(iv)毒血症を阻止する、感染部位における毒素の隔離、および/または(v)食細胞が細菌を貪食するので細菌と毒素が同時に排除されることであり、ISTAbの潜在的なオプソニン活性によってさらに強化される可能性があるプロセスを含むが、これに限定されない多数の好ましい特徴を示すことができる。

ISTAbは、病気の発生において毒素が重要な役割を果たす様々な細菌感染症を治療するための治療用物質として使用することができる。このような用途の非限定的な例には以下が含まれる。
-黄色ブドウ球菌:黄色ブドウ球菌毒素、例えば、スーパー抗原(ブドウ球菌エンテロトキシンおよび毒素ショック症候群毒素1; TSST-1)、αヘモリシン、γヘモリシン、またはロイコシジンに対する中和モノクローナル抗体が、様々な黄色ブドウ球菌感染、例えば、敗血症、肺炎、骨髄炎、および心内膜炎を治療するために感染部位へと中和活性をターゲティングさせるための、黄色ブドウ球菌特異的ファージリシン、リゾスタフィン、または自己溶解素のCWTと融合されている。
-クロストリジウム・ディフィシル:C.ディフィシル毒素A(TcdA)および毒素B(TcdB)に対する中和モノクローナル抗体が、C.ディフィシル関連下痢(CAD)を治療するために感染部位へと抗毒素活性をターゲティングさせるための、C.ディフィシル特異的ファージリシン、例えば、CD27LのCWTと融合されている。
-ウェルシュ菌、炭疽菌、およびC.ジフテリアを含むが、これに限定されない様々な他の細菌種に対して同様のアプローチを考案することができる。

(2)抗菌性免疫再指向ワクチン:
前記技術の第2の非限定的な応用例は、既存の無関係の免疫応答を新たな細菌感染の部位に向け直して、細菌を排除することを目的とする。関心対象の細菌に特異的なCWT(表1を参照されたい)が、ほとんどのヒト宿主または動物宿主に先在している抗体に対する抗原と融合されている。図2は、ブドウ球菌エンテロトキシンB(SEB)の解毒化組換え変異体を用いた、このような融合タンパク質の一例を図示する。感染部位ターゲティングユニバーサル抗原(ISTUA)を作製しするために、可動性リンカーを介して、組換えトキソイドが、関心対象の細菌に特異的なCWTと遺伝子融合されている。ISTUAは、感染した患者または動物を治療するのに使用することができ、この分子は、感染した患者または動物の感染部位に蓄積する。ユニバーサル抗原(本実施例ではSEB)に対する既存の抗体は抗原を認識し、抗原に特異的に結合した結果として細菌をオプソニン化することができる。これにより、食細胞のFc受容体を介して結合抗体のFc部分に結合する食細胞の動員と、細菌の貪食が誘発され、感染が排除される。ISTUAを作製するために使用することができる、このようなユニバーサル抗原の他の例には、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、およびインフルエンザ血球凝集素が含まれるが、これに限定されない。

このアプローチは、感染病原体が同定されると、肺炎または心内膜炎などの命にかかわる感染症を素早く治療するのに使用することができる。感染リスクが高い待機手術などの、ある特定の状況では、応答を強化するために外科手術前に、抗原を用いて患者を追加免疫することができる。外科手術後に、同定された病原体に特異的な適切なCWTと融合した抗原を含有するISTUAを用いて、感染患者を治療することができる。

(3)抗菌性自発ワクチン
前記技術の第3の非限定的な応用例は、前述したISTUAの改良版である。このアプローチでは、CWTは、Fab部分を欠いている、ヒトIgGサブタイプ、例えば、IgG1またはIgG3のFc部分と融合されている。この融合タンパク質は同じように感染部位に蓄積し、抗体を介した間接的な相互作用を必要とすることなく、Fc受容体を介して食細胞と直接連結する。図3は感染部位ターゲティングFc分子(ISTAF)の一例を図示する。

ポリヌクレオチド
本発明はさらに、本明細書において提供される治療用ポリペプチドをコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドに関する。ある特定の態様において、本明細書において提供される単離されたポリヌクレオチドは、本明細書の他の場所において説明される、プロモーター、オペレーター、または転写ターミネーターなどの非コード領域をさらに含んでもよい。一部の態様において、上記のポリヌクレオチドは異種核酸をさらに含んでもよい。異種核酸は、一部の態様では、本明細書において提供される治療用ポリペプチドと融合された異種ポリペプチドをコードしてもよい。例えば、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、さらなるコード領域、例えば、上記の治療用ポリペプチドと融合された異種ポリペプチドをコードする、さらなるコード領域、または選択マーカー、免疫エンハンサーなどがあるが、これに限定されない、上記の治療用ポリペプチドとは別の異種ポリペプチドをコードするコード領域を含んでもよい。

本明細書において提供されるポリヌクレオチドを含む、発現構築物、ベクター、および/または宿主細胞も提供される。単離されたポリヌクレオチドの一例は、ベクター内に含まれる組換えポリヌクレオチドである。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞内に維持されている組換えポリヌクレオチド、または溶解状態にある(部分的もしくは実質的に)精製されたポリヌクレオチドが含まれる。ある特定の態様において、ポリヌクレオチドは「組換え」である。本明細書において提供される単離されたポリヌクレオチドまたは核酸は合成により作製することができる。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの純度の相対的な程度は周知の方法によって容易に決定される。

ベクターおよび発現システム
本開示はさらに、本明細書において提供されるポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。本明細書で使用する「ベクター」という用語は、例えば、異なる遺伝子環境間で輸送するために、または宿主細胞内で発現させるために、望ましい配列を挿入することができる、例えば、望ましい配列を制限処理および連結によって挿入することができる多数の任意の核酸を指す。核酸ベクターはDNAでもよくRNAでもよい。ベクターには、プラスミド、ファージ、ファージミド、細菌ゲノム、およびウイルスゲノムが含まれるが、これに限定されない。クローニングベクターは、宿主細胞内で複製することができ、かつ、1つまたは複数のエンドヌクレアーゼ制限部位をさらに特徴とし、該エンドヌクレアーゼ制限部位において、ベクターが決定可能なやり方で切断されることができ、かつ新たな組換えベクターが宿主細胞内で複製能力を保持するように望ましいDNA配列が連結されることができる、ベクターである。プラスミドの場合、望ましい配列の複製は、プラスミドのコピー数が宿主細菌内で増える場合に何回でも行われてもよく、宿主が有糸分裂により複製する前に1つの宿主あたり1回だけ行われてもよい。ファージの場合、複製は溶菌期(lytic phase)の間に能動的に行われてもよく、溶原期(lysogenic phase)の間に受動的に行われてもよい。ある特定のベクターは、ある特定のベクターが導入された宿主細胞内で自己複製することができる。他のベクターは宿主細胞に導入されたら宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって、宿主ゲノムと共に複製される。

適切な宿主と使用することができる多種多様な任意の適切なクローニングベクターが当技術分野において公知であり、市販されている。本明細書で使用する「プラスミド」という用語は、遺伝物質が染色体外にあり、場合によっては自己複製する、遺伝物質(すなわち、核酸)で作られた環状二本鎖構築物を指す。本発明のポリヌクレオチドは環状プラスミド内にあってもよく、直線化プラスミド内にあってもよく、他の任意の種類のベクター内にあってもよい。ヌクレオチド配列をベクター、例えば、発現ベクターに挿入し、形質転換またはトランスフェクションによって適切な宿主細胞に導入し、発現に適した条件下で培養するための手順は一般的に当技術分野において公知である。

ある特定の局面において、本開示は、本明細書に記載の治療用ポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターを提供する。ある特定の態様において、ベクターは、適切な宿主細胞内で治療用ポリペプチドを発現することができる発現ベクターである。「発現ベクター」という用語は、ポリペプチドを発現することができるベクターを指す。すなわち、ベクター配列は、プロモーター、オペレーター、転写終結部位、リボソーム結合部位などを含むが、これに限定されない、ポリペプチドの転写および翻訳に必要とされる制御配列を含有する。「発現」という用語は、コード配列によってコードされる産物の生物学的生産を指す。ほとんどの場合、コード配列を含むDNA配列は転写されてメッセンジャーRNA(mRNA)を形成する。次いで、メッセンジャーRNAは翻訳されて、関連した生物学的活性を有するポリペプチド産物を形成する。また、発現プロセスは、RNA転写産物へのさらなる処理工程、例えば、イントロンを除去するスプライシング、および/またはポリペプチド産物の翻訳後処理を伴ってもよい。

ベクター-宿主システムには、インビボ、例えば、動物における、またはインビトロ、例えば、細菌もしくは細胞培養におけるシステム、例えば、細菌システム、哺乳動物システム、酵母システム、昆虫システム、または植物細胞システムが含まれるが、これに限定されない。適切な宿主の選択は、本明細書における開示から当業者の範囲内であると考えられる。ある特定の態様において、宿主細胞は細菌、例えば、大腸菌である。

宿主細胞には、本発明のベクターを用いて遺伝子操作(感染、形質導入、形質転換、またはトランスフェクション)が行われる。従って、一局面において、本開示は、本発明のポリヌクレオチドを含有するベクターを含む宿主細胞を提供する。操作された宿主細胞を、プロモーターの活性化、形質転換体の選択、またはポリヌクレオチドの増幅のために適宜改変された従来の栄養培地中で培養することができる。温度、pHなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞と共に以前に用いられた培養条件であり、当業者に明らかであろう。本明細書で使用する「トランスフェクトする」という用語は、真核細胞がそのゲノムに、プラスミドの形をしたDNAを含むが、これに限定されない単離されたDNAを受け入れ、組み込むように誘導される任意の手順を指す。本明細書で使用する「形質転換する」という用語は、細菌細胞がそのゲノムに、プラスミドの形をしたDNAを含むが、これに限定されない単離されたDNAを受け入れ、組み込むように誘導される任意の手順を指す。

細菌宿主-発現ベクターシステムには、組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNA、またはコスミドDNAで形質転換された原核生物(例えば、大腸菌)が含まれるが、これに限定されない。一部の態様において、大腸菌と共に用いられるプラスミドは、IPTG誘導を介してLacIタンパク質によって調節されるT7プロモーター駆動システムを使用する。多数の適切なベクターが当業者に公知であり、市販されている。例として以下の細菌ベクター:pET(Novagen)、pET28、pBAD、pTrcHIS、pBR322、pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、phagescript、psiX174、pBluescript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pBR322、pPS10、RSF1010、pRIT5(Pharmacia);pCR(Invitrogen);pLex(Invitrogen)、およびpUCプラスミド誘導体が提供される。

適切な発現ベクターは、本明細書において提供される治療用ポリペプチドをコードする挿入ヌクレオチド配列に機能的につなげることができる制御配列を含有する。本明細書で使用する「制御配列」という用語は、宿主細胞による、治療用ポリペプチドをコードする挿入配列の転写に必要な、もしくは転写の助けとなるヌクレオチド配列、および/または結果として生じた転写物から望ましい治療用ポリペプチドへの宿主細胞による翻訳に必要な、もしくは翻訳の助けとなるヌクレオチド配列を意味する。制御配列には、5'配列、例えば、オペレーター、プロモーターおよびリボソーム結合配列、ならびに3'配列、例えば、ポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターが含まれるが、これに限定されない。制御配列はエンハンサー配列または上流アクチベーター配列も含んでよい。

一般的に、細菌ベクターは、宿主細胞の形質転換を可能にする、複製起点および選択マーカー、例えば、大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、および下流構造配列の転写を誘導する高発現遺伝子由来プロモーターを含む。適切なプロモーターには、T7プロモーター、ラムダ(λ)プロモーター、T5プロモーター、およびlacプロモーター、または解糖酵素、例えば、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)、酸性ホスファターゼ、もしくは熱ショックタンパク質をコードするオペロンに由来するプロモーター、またはカドミウム(pcad)およびβラクタマーゼ(pbla)のような誘導性プロモーターが含まれるが、これに限定されない。

発現ベクターが選択されると、本明細書において提供されるポリヌクレオチドをプロモーターの下流に、例えば、ポリリンカー領域にクローニングすることができる。ベクターで適切な細菌株を形質転換し、DNAを標準的な技法を用いて調製する。ポリヌクレオチドならびにベクターに含まれる他の全てのエレメントの方向およびDNA配列を、制限酵素マッピング、DNA配列分析、および/またはPCR分析を用いて確認する。正しいプラスミドを有する細菌細胞を細胞バンクとして保管することができる。

薬学的組成物
本開示はさらに、本明細書において提供される治療用ポリペプチドの有効量、または治療用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する、組成物、例えば、免疫原性組成物または薬学的組成物を提供する。組成物は、さらなる成分、例えば、担体、賦形剤、またはアジュバントをさらに含んでもよい。

組成物は公知の方法に従って製剤化することができる。適切な調製方法は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA(1995)に記載されている。組成物は、水溶液、エマルジョン、ゲル、懸濁液、凍結乾燥型、または当技術分野において公知の他の任意の形を含むが、これに限定されない様々な形をとってもよい。さらに、組成物は、例えば、希釈剤、結合剤、安定剤、および防腐剤を含む、薬学的に許容される添加物を含有してもよい。本発明の組成物は製剤化されると、対象に直接投与することができる。治療される対象は動物であることができ;特に、ヒト対象が治療されることができる。

本明細書において提供される組成物と共に使用することができる担体は当技術分野において周知であり、例えば、チログロブリン、アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン、破傷風トキソイド、およびポリアミノ酸、例えば、ポリL-リジン、ポリL-グルタミン酸、インフルエンザ、B型肝炎ウイルスコアタンパク質などを含むが、それに限定されるわけではない。様々な水性担体、例えば、水、緩衝水、0.8％食塩水、0.3％グリシン、ヒアルロン酸などを使用することができる。組成物は従来の周知の滅菌法によって滅菌されてもよく、滅菌濾過されてもよい。結果として生じた組成物は、使用のためにそのままで包装されてもよく、凍結乾燥されて包装されてもよく、凍結乾燥された調製物は投与の前に滅菌溶液と混合される。組成物は、生理条件に近づけるのに必要とされる薬学的に許容される補助物質、例えば、pH調節剤および緩衝剤、張性調節剤、湿潤剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミンなどを含有してもよい。

本明細書において提供されるある特定の組成物は、例えば、免疫原に対する免疫応答を増強するために、保持するために、局在させるために、または調節するために組成物に添加される物質である1種類または複数種のアジュバントをさらに含む。「アジュバント」という用語は、(1)ある特定の抗原に対する免疫応答を変えるかもしくは高める能力、または(2)薬理学的作用物質の効果を高めるかもしくは助ける能力を有する任意の材料を指す。ポリペプチドの発現、抗原性、または免疫原性を高めることができる全ての化合物が潜在的アジュバントである。

多種多様な材料が様々な機構を介してアジュバント活性を有すると示されてきた。例えば、体液性免疫の増大は、典型的に、抗原に対して産生された抗体の力価の大幅な増加によって明らかにされ、T細胞活性の増加は、典型的に、細胞増殖または細胞傷害性またはサイトカイン分泌の増大となって現れる。アジュバントはまた、例えば、主として体液性応答すなわちTh₂応答を主として細胞性応答すなわちTh₁応答に変えることによって免疫応答を変えるか、または調節することができる。ある特定の抗原に対する免疫応答は、当業者に周知の、および/または本明細書の他の場所に記載の様々なイムノアッセイ法によって試験することができる。

多数のアジュバントが当業者によく知られており、非常に多くの参照文献に記載されている。本発明による組成物において使用することができるアジュバントには、不活性担体、例えば、アラム、ベントナイト、ラテックス、およびアクリル粒子;不完全フロイントアジュバント、完全フロイントアジュバント;アルミニウム塩、例えば、水酸化アルミニウム;カルシウム塩;シリカ;または任意のTLR生物学的リガンドが含まれるが、これに限定されない。一態様において、アジュバントは水酸化アルミニウム(例えば、ALHDROGEL(商標)ウェットゲル懸濁物)である。アジュバントの量、製剤化方法、および投与方法、当業者の十分に範囲内の全てのパラメータ。

一部の態様において、本発明の組成物は、例えば、製剤を安定化するのに、リンパ系組織などの特定の組織へと製剤をターゲティングさせるのに、またはポリペプチド組成物の半減期を延ばすのに役立ち得る、リポソームまたは他の粒子担体をさらに含む。このような粒子担体には、エマルジョン、発泡体、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散液、ラメラ層、iscomなどが含まれる。これらの調製物において、本明細書において提供される治療用ポリペプチドはリポソームまたは他の粒子の一部として組み込まれてもよく、リポソームと共に送達されてもよい。本発明に従う使用のためのリポソームは、一般的に、中性リン脂質および負に荷電しているリン脂質ならびにコレステロールなどのステロールを含む標準的な小胞形成脂質から形成することができる。リポソームまたは他の粒子懸濁液ならびに本明細書において提供される治療用ポリペプチドを含む組成物は、特に、投与のやり方、送達されているポリペプチド、および治療されている疾患の段階に応じて変化する用量で、静脈内、局所、局部などに投与することができる。

エアロゾル投与または粘膜投与の場合、本明細書において提供される治療用ポリペプチドは、超微粒子の形で、任意で、界面活性剤ならびに噴霧剤および/または粘膜付着剤、例えば、キトサンと共に供給することができる。界面活性剤は、もちろん、薬学的に許容される界面活性剤でなければならず、一部の態様では、噴霧剤に溶けなければならない。このような剤を代表するものは、6〜22個の炭素原子を含有する脂肪酸、例えば、カプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリン酸(olesteric acid)、およびオレイン酸と、脂肪族多価アルコールまたはその環式無水物とのエステルまたは部分エステルである。混合エステル、例えば、混合グリセリドまたは天然グリセリドを使用することができる。界面活性剤は、組成物の0.1重量％〜20重量％、一部の態様では0.25〜5重量％を構成してもよい。通常、組成物の残りは噴霧剤であるが、噴霧剤が必要でなく、それに応じて他のパーセントが調節されるアトマイザーを使用することができる。一部の態様において、本明細書において提供される治療用ポリペプチドを空気力学的に軽い粒子、例えば、米国特許第6,942,868号または米国特許出願公開第2005/0008633号に記載の粒子の中に組み込むことができる。担体、例えば、鼻腔内送達の場合はレシチンも含めることができる。

治療/予防の方法、およびレジメン
それを必要とする対象に、本明細書において提供される治療用ポリペプチドを含む本明細書に記載の組成物、あるいは該治療用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞を投与する工程を含む、対象において細菌感染症、細菌性疾患、または細菌性障害を治療または予防する方法も提供される。ある特定の態様において、対象は、脊椎動物、例えば、哺乳動物、例えば、ネコ、例えば、イヌ、例えば、ウシ、例えば、霊長類、例えば、ヒトである。

一部の態様において、予防的に、例えば、細菌病原体に潜在的もしくは実際に曝露される前に、例えば、外科手術または歯科作業の前に、健常な動物において、従って、疾患を予防するか、症状を緩和するか、症状を軽減するか、または疾患症状の重篤度を下げる予防的処置として、対象には、本明細書において提供される治療用ポリペプチドを含む本明細書に記載の組成物、あるいは該治療用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞が投与される。一態様において、疾患は呼吸器疾患、例えば、肺炎である。別の態様において、疾患は敗血症である。治療または予防される他の疾患または状態には、皮膚感染、創傷感染、心内膜炎、骨感染および関節感染、骨髄炎、ならびに/または髄膜炎が含まれるが、これに限定されない。本明細書において提供される1つまたは複数の組成物、治療用ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞はまた、動物の免疫系をさらに刺激し、従って、その曝露に関連した症状を軽減または排除するように、細菌病原体に既に曝露されている対象、または細菌感染症、細菌性疾患、もしくは細菌性障害に既に罹患している対象を治療するのに使用することもできる。本明細書において定義される「動物の治療」とは、動物における細菌感染症、細菌性疾患、もしくは細菌性障害による症状を予防するか、治癒するか、遅らせるか、または細菌感染症、細菌性疾患、もしくは細菌性障害の重篤度を下げるための、および/あるいは特定の期間にわたって症状を悪化させないための本明細書において提供される1つまたは複数の組成物、治療用ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞の使用を指す。本明細書において提供される任意の組成物、治療用ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞は細菌感染症、細菌性疾患、もしくは細菌性障害からの完全な防御を付与すること、または全ての関連症状を完全に治癒するか、もしくは排除することが必要とされない。

治療的用途において、本明細書において提供される組成物、治療用ポリペプチド、またはポリヌクレオチドは、効果的な抗菌反応を誘発して、症状および/もしくは合併症を治癒するか、または症状および/もしくは合併症を少なくとも部分的に抑えるのに十分な量で対象に投与される。

ある特定の態様において、本発明の組成物は本明細書に記載の方法によって対象に送達され、それによって、効果的な治療効果が実現する。開示された方法によれば、組成物は、粘膜送達、経皮送達、皮下注射、静脈内注射、経口投与、肺投与、筋肉内(i.m.)投与によって、または腹腔内注射を介して投与することができる。他の適切な投与経路には、気管内投与、経皮投与、眼内投与、鼻腔内投与、吸入投与、腔内投与、管内(例えば、膵臓内)投与、および実質内(すなわち、任意の組織内)投与が含まれるが、これに限定されない。経皮送達には、皮内投与(例えば、真皮もしくは表皮への投与)、経皮投与(例えば、経皮的投与)、および経粘膜投与(すなわち、皮膚もしくは粘膜組織の中への投与または皮膚もしくは粘膜組織を通過する投与)が含まれるが、これに限定されない。腔内投与には、口腔、膣腔、直腸腔、鼻腔、腹腔、または腸腔(intestinal cavity)への投与、ならびに、くも膜下腔内(すなわち、脊柱管内)投与、室内(すなわち、脳室内または心室内)投与、動脈内(すなわち、心房内)投与、およびくも膜下(すなわち、脳のくも膜下腔内)投与が含まれるが、これに限定されない。

本明細書に記載の細菌感染症、細菌性疾患、または細菌性障害を治療または予防するのに十分な量で望ましい治療用ポリペプチドを送達および/または発現する限り、任意の投与様式を使用することができる。投与は、例えば、針注射(needle injection)、または当技術分野において公知の他の送達もしくは装置によるものでよい。

「(cCan6)」と名付けた抗α毒素(H1a)キメラ抗体を用いて、感染部位ターゲティング抗体(ISTAb)を作製した。L1(SEQ ID NO:1)およびL2(SEQ ID NO:2)と示した2つの異なるリンカーを用いて、リゾスタフィンの細胞壁ターゲティングドメイン(CWT)(C末端の90アミノ酸)を抗H1a mAb(cCan6)のC末端と融合させた(図4)。

抗H1a-ISTAbの生物学的活性は、α毒素中和ウサギRBC溶解アッセイ法において抗H1a-ISTAbの活性を親cCan6と比較することによって証明された。図5Aに示したように、親抗体であるcCan6と、ISTAbであるcCan6 ISTAb-L1およびISTAb-L2は、上清希釈曲線の毒素中和力価を用いて同等の生理活性を示した。これらのデータから、CWTを抗毒素抗体につなげてもモノクローナル抗体の中和活性は妨げられないことがはっきりと示された。

ISTAbが細菌に結合する(cCan6が細菌に結合しない)ことを証明するために、トランスフェクト細胞由来の上清を黄色ブドウ球菌とインキュベートし、その後に遠心分離した。ISTAbの結合後曲線では活性の低下が示されたが、親cCan6では示されなかった(図5B)。これらのデータから、単離されたリゾスタフィン細胞壁ターゲティングドメインの細胞壁結合活性は融合ISTabにおいて保持されていることが示された。

さらに、「細胞結合型」ISTAbは細菌に結合すると依然として毒素中和能力を保持できることが証明された。簡単に述べると、cCan6上清またはcCan6-ISTAb上清を黄色ブドウ球菌とインキュベートした。次いで、ペレット状細菌の段階希釈液をウサギRBC溶解アッセイ法に添加した。図5Cに示したように、細菌に結合しているcCan6-ISTAb L1およびcCan6-ISTAb_L2は中和活性を保持していた。これらのデータから、ISTAbは細菌表面に結合した場合に依然として機能活性を保持していることが示された。

精製cCan6-ISTAb-L1に対してHPLC分析も行った。精製cCan6-ISTAb-L1は単量体の形で>95％の純度であることが示された(図6)。Biacore結合分析から、抗H1a親cCan6(11x10-9)および抗cCan6-ISTAb-L1(8.3x10-9)について同等の結合Kd値が示された。これらのデータから、抗毒素抗体とCWTが融合しても凝集が起こらないことが分かる。

本開示の実施では、特に定めのない限り、当技術分野の技術の範囲内である細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫学の従来法が用いられる。このような技法は文献内で十分に説明されている。例えば、Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., Sambrook et al., ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press: (1989); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., ed., Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1992), DNA Cloning, D. N. Glover ed., Volumes I and II (1985); Oligonucleotide Synthesis, M. J. Gait ed., (1984); Mullis et al. 米国特許第4,683,195号; Nucleic Acid Hybridization, B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1984); Transcription And Translation, B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1984); Culture Of Animal Cells, R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., (1987); Immobilized Cells And Enzymes, IRL Press, (1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology, Academic Press, Inc., N.Y.; Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, J. H. Miller and M. P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory (1987); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology, Mayer and Walker, eds., Academic Press, London (1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV, D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., (1986); Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986);およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)を参照されたい。

免疫学の一般原則を示した標準的な参照出版物には、Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Klein, J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, John Wiley & Sons, New York (1982); Roitt, I., Brostoff, J. and Male D., Immunology, 6^th ed. London: Mosby (2001); Abbas A., Abul, A. and Lichtman, A., Cellular and Molecular Immunology, Ed. 5, Elsevier Health Sciences Division (2005);およびHarlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)が含まれる。

特定の局面の前述の説明は本発明の一般的な内容を十分に明らかにしているので、他の人は、当技術分野の技術の範囲内の知識を適用することによって、本開示の一般的な概念から逸脱することなく、過度の実験なく、このような特定の局面を容易に変更することができる、および/または様々な用途に適合させることができる。従って、このような適合および変更は、本明細書において提示された開示およびガイダンスに基づいて、開示された局面の均等物の意味の範囲内および該均等物の範囲内にあることが意図される。開示およびガイダンスを考慮して本明細書の用語または語句が当業者により解釈されるように、本明細書における語句または用語は説明を目的とし、限定を目的としないと理解すべきである。

本開示の広さおよび範囲は、上記の例示的な局面のいずれによっても限定されてはならず、添付の特許請求の範囲およびその均等物によってのみ定義すべきである。

参照文献:

態様
態様1 免疫機能媒介成分(IFMC)と融合したバクテリオシン/ファージ/バクテリオシン様阻害物質(BLIS)の細胞壁ターゲティングドメインを含み、細菌標的へと該IFMCをターゲティングさせることができる、治療用ポリペプチド。
態様2 前記BLISが、ファージリシン、リゾスタフィン、自己溶解素、バクテリオシンAS-48、バクテリオシンColE9、ファージφKZ gp144、ファージO9882、ファージ(YC)、BLIS(ビブリオ・ハーベイ(Vibrio harveyi)VIB 571株)、BLIS(FM1025)、リゾスタフィン、φNM3リシン、φ11、リジン、φ68、P17、φB30、リシン、φK、LysK、φMR11、MV-L、ピリンタンパク質の接着結合ドメイン、E-コリシン、自己溶解素、φSs2、ストレプトコッカス・スイス(Streptococcus suis)ファージ由来のPlySs2バクテリオファージリシン(PlySs2)、エンドリシンOBPgp279(シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)ファージOBP由来)、PVP-SE1gp146(サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)血液型亜型エンテリティディス(Enteritidis)ファージPVP-SE1)、E201φ2-1gp229(シュードモナス・クロロラフィス(Pseudomonas chlororaphis)ファージ201φ2-1)、T4リゾチームのN末端と融合したペスチシンのFyuA結合ドメインの間のハイブリッド、ファージエンドリシン、PlyLおよびPlyG、ラムダSa2(λSa2)(cpl-7)、溶原性バクテリオファージSM1(バクテリオファージリシンのフィブリノゲン結合ドメイン)、エンドリシンCD27L、マイコバクテリオファージMs6、それらの任意の細胞壁ターゲティング断片、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、態様1に記載の治療用ポリペプチド。
態様3 前記IFMCが、抗体もしくはその断片、ヒト宿主もしくは動物宿主に先在している抗体に対する抗原、Fc受容体ターゲティングドメイン、オプソニン化物質、アジュバント、TLRアゴニスト、サイトカイン、免疫刺激分子、例えば、フラジェリン、toll様受容体(TLR)に対する様々なリガンド、コレラ毒素サブユニット、親油性免疫刺激複合体(ISCOMS)、サポニン、共刺激分子、例えば、CD28、真菌免疫調節性タンパク質(FIP)、免疫刺激多糖、短い抗菌性ペプチド、例えば、αデフェンシン、βデフェンシン、およびθデフェンシン、それらの断片、またはそれらの組み合わせを含む、態様1または態様2に記載の治療用ポリペプチド。
態様4 前記抗体またはその断片が細菌抗原に特異的である、態様3に記載の治療用ポリペプチド。
態様5 前記細菌抗原が毒素である、態様4に記載の治療用ポリペプチド。
態様6 前記毒素が、黄色ブドウ球菌毒素、クロストリジウム・ディフィシル毒素A(TcdA)および毒素B(TcdB)、ウェルシュ菌毒素、炭疽菌毒素、クロストリジウム・ジフテリア毒素、シュードモナスエキソプロテインA(EPA)、トキソイド抗原、例えば、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、ジフテリアトキソイド、もしくはウイルス抗原、例えば、インフルエンザウイルス血球凝集素、肝炎ウイルスBコア抗原、エプスタイン-バーウイルス由来、麻疹由来、ムンプス由来、風疹由来、ポリオーマウイルス由来、もしくはサイトメガロウイルス(CMV)由来の抗原、それらの断片、またはそれらの組み合わせを含む、態様5に記載の治療用ポリペプチド。
態様7 前記黄色ブドウ球菌毒素が、スーパー抗原、ブドウ球菌エンテロトキシン、毒素ショック症候群毒素1;TSST-1、αヘモリシン、γヘモリシン、ロイコシジン、それらの任意の断片、またはそれらの任意の組み合わせを含む、態様6に記載の治療用ポリペプチド。
態様8 前記抗原が、細菌毒素の非病原性変種、ウイルスタンパク質、それらの任意の断片、またはそれらの任意の組み合わせである、態様3に記載の治療用ポリペプチド。
態様9 前記細菌毒素の非病原性変種が、ブドウ球菌エンテロトキシンB(SEB)、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、シュードモナスエキソプロテインA(EPA)の変異体、それらの任意の断片、またはそれらの任意の組み合わせを含む、態様8に記載の治療用ポリペプチド。
態様10 前記ウイルスタンパク質が、インフルエンザ血球凝集素、肝炎ウイルスBコア抗原、エプスタイン-バーウイルス由来、麻疹由来、ムンプス由来、風疹由来、ポリオーマウイルス由来、またはサイトメガロウイルス(CMV)由来の抗原を含む、態様8に記載の治療用ポリペプチド。
態様11 前記抗体またはその断片が、Fab部分を欠いている抗体Fc部分を含む、態様3に記載の治療用ポリペプチド。
態様12 ヒトIgG抗体のFc部分を含む、態様11に記載の治療用ポリペプチド。
態様13 前記ヒトIgGがIgG1またはIgG3である、態様12に記載の治療用ポリペプチド。
態様14 前記BLISがリンカーを介して前記IFMCと融合されている、態様1〜13のいずれかに記載の治療用ポリペプチド。
態様15 異種アミノ酸配列をさらに含む、態様1〜14のいずれかに記載の治療用ポリペプチド。
態様16 前記異種アミノ酸配列が、Hisタグ、ユビキチンタグ、NusAタグ、キチン結合ドメイン、Bタグ、HSBタグ、緑色蛍光タンパク質(GFP)、カルモジュリン結合タンパク質(CBP)、ガラクトース結合タンパク質、マルトース結合タンパク質(MBP)、セルロース結合ドメイン(CBD)、アビジン/ストレプトアビジン/Strep-tag、trpE、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、lacZ(β-ガラクトシダーゼ)、FLAG(商標)ペプチド、Sタグ、T7タグ、該異種ペプチドのうちのいずれかの断片、および該異種ペプチドのうちの2つまたはそれ以上の組み合わせからなる群より選択されるペプチドをコードする、態様15に記載の治療用ポリペプチド。
態様17 前記異種アミノ酸配列が、免疫原、T細胞エピトープ、B細胞エピトープ、該異種ペプチドのうちのいずれかの断片、および該異種ペプチドのうちの2つまたはそれ以上の組み合わせをコードする、態様16に記載の治療用ポリペプチド。
態様18 態様1〜17のいずれかに記載の治療用ポリペプチドをコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチド。
態様19 異種核酸をさらに含む、態様18に記載のポリヌクレオチド。
態様20 前記異種核酸が、前記治療用ポリペプチドをコードする核酸と機能的に結合したプロモーターを含む、態様19に記載のポリヌクレオチド。
態様21 態様18〜20のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
態様22 プラスミドである、態様21に記載のベクター。
態様23 前記プラスミドがpET24プラスミドである、態様22に記載のベクター。
態様24 態様21〜23のいずれかに記載のベクターを含む、宿主細胞。
態様25 細菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞、または植物細胞である、態様24に記載の宿主細胞。
態様26 前記細菌が大腸菌(Escherichia coli)である、態様25に記載の宿主細胞。
態様27 態様24〜26のいずれかに記載の宿主細胞を培養する工程、および治療用ポリペプチドを回収する工程を含む、該治療用ポリペプチドを産生する方法。
態様28 態様1〜17のいずれかに記載の治療用ポリペプチドおよび担体を含む、組成物。
態様29 アジュバントをさらに含む、態様28に記載の組成物。
態様30 前記アジュバントがアラムまたは水酸化アルミニウムである、態様29に記載の組成物。
態様31 治療を必要とする対象に、態様1〜17のいずれかに記載の治療用ポリペプチドの有効量または態様28〜30のいずれかに記載の組成物を投与する工程を含む、細菌感染症、細菌性疾患、または細菌性障害を治療するための方法。
態様32 前記細菌感染症、前記細菌性疾患、または前記細菌性障害が、皮膚、軟部組織、血液、または臓器の限局性感染症または全身性感染症である、態様31に記載の方法。
態様33 前記疾患が呼吸器疾患である、態様31または態様32に記載の方法。
態様34 前記呼吸器疾患が肺炎である、態様33に記載の方法。
態様35 前記疾患が敗血症である、態様31または態様32に記載の方法。
態様36 前記対象が態様哺乳動物である、態様31〜35のいずれかに記載の方法。
態様37 前記哺乳動物がヒトである、態様36に記載の方法。
態様38 前記哺乳動物がウシまたはイヌである、態様36に記載の方法。
態様39 前記治療用ポリペプチドまたは前記組成物が、筋肉内注射、皮内注射、腹腔内注射、皮下注射、静脈内注射、経口投与、粘膜投与、鼻腔内投与、または肺投与を介して投与される、態様31〜38のいずれかに記載の方法。

Claims

免疫機能媒介成分(IFMC)と融合したバクテリオシン/ファージ/バクテリオシン様阻害物質(BLIS)の細胞壁ターゲティングドメインを含み、細菌標的へと該IFMCをターゲティングさせることができる、治療用ポリペプチド。
前記BLISが、ファージリシン、リゾスタフィン、自己溶解素、バクテリオシンAS-48、バクテリオシンColE9、ファージφKZ gp144、ファージO9882、ファージ(YC)、BLIS(ビブリオ・ハーベイ(Vibrio harveyi)VIB 571株)、BLIS(FM1025)、リゾスタフィン、φNM3リシン、φ11、リジン、φ68、P17、φB30、リシン、φK、LysK、φMR11、MV-L、ピリンタンパク質の接着結合ドメイン、E-コリシン、自己溶解素、φSs2、ストレプトコッカス・スイス(Streptococcus suis)ファージ由来のPlySs2バクテリオファージリシン(PlySs2)、エンドリシンOBPgp279(シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)ファージOBP由来)、PVP-SE1gp146(サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)血液型亜型エンテリティディス(Enteritidis)ファージPVP-SE1)、E201φ2-1gp229(シュードモナス・クロロラフィス(Pseudomonas chlororaphis)ファージ201φ2-1)、T4リゾチームのN末端と融合したペスチシンのFyuA結合ドメインの間のハイブリッド、ファージエンドリシン、PlyLおよびPlyG、ラムダSa2(λSa2)(cpl-7)、溶原性バクテリオファージSM1(バクテリオファージリシンのフィブリノゲン結合ドメイン)、エンドリシンCD27L、マイコバクテリオファージMs6、それらの任意の細胞壁ターゲティング断片、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項1に記載の治療用ポリペプチド。
前記IFMCが、抗体もしくはその断片、ヒト宿主もしくは動物宿主に先在している抗体に対する抗原、Fc受容体ターゲティングドメイン、オプソニン化物質、アジュバント、TLRアゴニスト、サイトカイン、免疫刺激分子、例えば、フラジェリン、toll様受容体(TLR)に対する様々なリガンド、コレラ毒素サブユニット、親油性免疫刺激複合体(ISCOMS)、サポニン、共刺激分子、例えば、CD28、真菌免疫調節性タンパク質(FIP)、免疫刺激多糖、短い抗菌性ペプチド、例えば、αデフェンシン、βデフェンシン、およびθデフェンシン、それらの断片、またはそれらの組み合わせを含む、請求項1に記載の治療用ポリペプチド。
前記抗体またはその断片が細菌抗原に特異的である、請求項3に記載の治療用ポリペプチド。
前記細菌抗原が毒素である、請求項4に記載の治療用ポリペプチド。
前記毒素が、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)毒素、クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)毒素A(TcdA)および毒素B(TcdB)、ウェルシュ菌(Clostridium perfringens)毒素、炭疽菌(Bacillus anthracis)毒素、クロストリジウム・ジフテリア(Clostridium diphtheria)毒素、シュードモナスエキソプロテン(pseudomonas exoproten)A(EPA)、トキソイド抗原、例えば、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、ジフテリアトキソイド、もしくはウイルス抗原、例えば、インフルエンザウイルス血球凝集素、肝炎ウイルスBコア抗原、エプスタイン-バーウイルス由来、麻疹由来、ムンプス由来、風疹由来、ポリオーマウイルス由来、もしくはサイトメガロウイルス(CMV)由来の抗原、それらの断片、またはそれらの組み合わせを含む、請求項5に記載の治療用ポリペプチド。
前記黄色ブドウ球菌毒素が、スーパー抗原、ブドウ球菌エンテロトキシン、毒素ショック症候群毒素1;TSST-1、αヘモリシン、γヘモリシン、ロイコシジン、それらの任意の断片、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項6に記載の治療用ポリペプチド。
前記抗原が、細菌毒素の非病原性変種、ウイルスタンパク質、それらの任意の断片、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項3に記載の治療用ポリペプチド。
前記細菌毒素の非病原性変種が、ブドウ球菌エンテロトキシンB(SEB)、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、シュードモナスエキソプロテンA(EPA)の変異体、それらの任意の断片、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項8に記載の治療用ポリペプチド。
前記ウイルスタンパク質が、インフルエンザ血球凝集素、肝炎ウイルスBコア抗原、エプスタイン-バーウイルス由来、麻疹由来、ムンプス由来、風疹由来、ポリオーマウイルス由来、またはサイトメガロウイルス(CMV)由来の抗原を含む、請求項8に記載の治療用ポリペプチド。
前記抗体またはその断片が、Fab部分を欠いている抗体Fc部分を含む、請求項3に記載の治療用ポリペプチド。
ヒトIgG抗体のFc部分を含む、請求項11に記載の治療用ポリペプチド。
前記ヒトIgGがIgG1またはIgG3である、請求項12に記載の治療用ポリペプチド。
前記BLISがリンカーを介して前記IFMCと融合されている、請求項1に記載の治療用ポリペプチド。
異種アミノ酸配列をさらに含む、請求項1に記載の治療用ポリペプチド。
前記異種アミノ酸配列が、Hisタグ、ユビキチンタグ、NusAタグ、キチン結合ドメイン、Bタグ、HSBタグ、緑色蛍光タンパク質(GFP)、カルモジュリン結合タンパク質(CBP)、ガラクトース結合タンパク質、マルトース結合タンパク質(MBP)、セルロース結合ドメイン(CBD)、アビジン/ストレプトアビジン/Strep-tag、trpE、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、lacZ(β-ガラクトシダーゼ)、FLAG(商標)ペプチド、Sタグ、T7タグ、該異種ペプチドのうちのいずれかの断片、および該異種ペプチドのうちの2つまたはそれ以上の組み合わせからなる群より選択されるペプチドをコードする、請求項15に記載の治療用ポリペプチド。
前記異種アミノ酸配列が、免疫原、T細胞エピトープ、B細胞エピトープ、該異種ペプチドのうちのいずれかの断片、および該異種ペプチドのうちの2つまたはそれ以上の組み合わせをコードする、請求項16に記載の治療用ポリペプチド。
請求項1に記載の治療用ポリペプチドをコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチド。
異種核酸をさらに含む、請求項18に記載のポリヌクレオチド。
前記異種核酸が、前記治療用ポリペプチドをコードする核酸と機能的に結合したプロモーターを含む、請求項19に記載のポリヌクレオチド。
請求項18に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
プラスミドである、請求項21に記載のベクター。
前記プラスミドがpET24プラスミドである、請求項22に記載のベクター。
請求項21に記載のベクターを含む、宿主細胞。
細菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞、または植物細胞である、請求項24に記載の宿主細胞。
前記細菌が大腸菌(Escherichia coli)である、請求項25に記載の宿主細胞。
請求項24に記載の宿主細胞を培養する工程、および治療用ポリペプチドを回収する工程を含む、該治療用ポリペプチドを産生する方法。
請求項1に記載の治療用ポリペプチドおよび担体を含む、組成物。
アジュバントをさらに含む、請求項28に記載の組成物。
前記アジュバントがアラムまたは水酸化アルミニウムである、請求項29に記載の組成物。
治療を必要とする対象に、請求項1に記載の治療用ポリペプチドの有効量を投与する工程を含む、細菌感染症、細菌性疾患、または細菌性障害を治療するための方法。
前記細菌感染症、前記細菌性疾患、または前記細菌性障害が、皮膚、軟部組織、血液、または臓器の限局性感染症または全身性感染症である、請求項31に記載の方法。
前記疾患が呼吸器疾患である、請求項31に記載の方法。
前記呼吸器疾患が肺炎である、請求項33に記載の方法。
前記疾患が敗血症である、請求項31に記載の方法。
前記対象が哺乳動物である、請求項31に記載の方法。
前記哺乳動物がヒトである、請求項36に記載の方法。
前記哺乳動物がウシまたはイヌである、請求項36に記載の方法。
前記治療用ポリペプチドまたは前記組成物が、筋肉内注射、皮内注射、腹腔内注射、皮下注射、静脈内注射、経口投与、粘膜投与、鼻腔内投与、または肺投与を介して投与される、請求項31に記載の方法。