JP2020171216A - Technology to promote symbiosis between plants and arbuscular mycorrhizal fungi - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、植物と微生物の共生を促進する技術に関する。詳細には、本発明は、植物におけるアーバスキュラー菌根菌の感染および共生を促進するための剤および方法、ならびにアーバスキュラー菌根菌の胞子生産量を増加させるための剤および方法に関する。 The present invention relates to a technique for promoting symbiosis between plants and microorganisms. In particular, the present invention relates to agents and methods for promoting infection and symbiosis of arbuscular mycorrhizal fungi in plants, and agents and methods for increasing spore production of arbuscular mycorrhizal fungi.
陸上植物の約９割は根において真菌と共生しており、共生により土壌中の必須元素を効率的に利用可能となる。このような植物との共生体は「菌根」、共生菌は「菌根菌」、共生現象は「菌根共生」と呼ばれる。ほとんどの作物が共生するアーバスキュラー菌根（ＡＭ）菌（ＶＡ菌根菌とも呼ばれる）との共生により、植物に土壌中のリンが効率的に供給される。リンは生物にとって必須の元素であるが、菌根共生により、リンが少ない土壌でも植物は生育可能となる。世界的なリン鉱石の枯渇の問題、ならびに日本の土壌はリンの吸着性が強く、植物が吸収できないといった問題から、菌根菌の農業利用が期待されている。しかしながら、アーバスキュラー菌根菌を使用した菌根菌資材（ＶＡ菌根菌資材）は既に市販されているが、価格が高く、品質の安定性や使い勝手の面で必ずしも満足のいくものとはいえないため、地力増進法で定められた唯一の微生物資源であるにもかかわらず、普及があまり進んでいないのが現状である。 About 90% of land plants coexist with fungi in the roots, and the symbiosis makes it possible to efficiently use essential elements in the soil. Symbiosis with such plants is called "mycorrhiza", symbiotic bacteria are called "mycorrhizal fungi", and symbiotic phenomenon is called "mycorrhiza symbiosis". Symbiosis with arbuscular mycorrhizal (AM) fungi (also called VA mycorrhizal fungi), which most crops coexist with, efficiently supplies plants with phosphorus in the soil. Phosphorus is an essential element for living organisms, but mycorrhizal symbiosis allows plants to grow even in soils low in phosphorus. Agricultural use of mycorrhizal fungi is expected due to the problem of global phosphorus ore depletion and the problem that Japanese soil has strong phosphorus adsorption and cannot be absorbed by plants. However, although mycorrhizal fungus materials using arbuscular mycorrhizal fungi (VA mycorrhizal fungus materials) are already on the market, they are expensive, and although they are not always satisfactory in terms of quality stability and usability. Therefore, although it is the only microbial resource stipulated by the Soil Strengthening Law, it is not widely used at present.
これまでに、植物と菌根菌との共生を促進するための方法がいくつか提案されている（例えば特許文献１等参照）が、より効果の大きい方法が望まれている。また、植物との共生の際に、アーバスキュラー菌根菌であるGigaspora margaritaやRhizophagus irregularisからキチンオリゴ糖などの物質が分泌されていることが報告されている（非特許文献１）が、これらの物質は共生成立前の菌由来のシグナル分子（Presymbiotic fungal signal）として考えられており、これらの処理によって共生が促進されることは報告されていない。 So far, several methods for promoting the symbiosis between plants and mycorrhizal fungi have been proposed (see, for example, Patent Document 1 and the like), but more effective methods are desired. In addition, it has been reported that substances such as chitin oligosaccharides are secreted from the arbuscular mycorrhizal fungi Gigaspora margarita and Rhizophagus irregularis during symbiosis with plants (Non-Patent Document 1). The substance is considered as a signal molecule (Presymbiotic fungal signal) derived from the fungus before symbiosis, and it has not been reported that symbiosis is promoted by these treatments.
植物におけるアーバスキュラー菌根菌の感染および共生を促進すること、ならびにアーバスキュラー菌根菌の胞子生産量を増加させることが、本発明が解決しようとする課題であった。さらに、価格が安く、品質が安定した菌根菌資材を提供することも、本発明が解決しようとする課題であった。 Promoting the infection and symbiosis of arbuscular mycorrhizal fungi in plants and increasing the spore production of arbuscular mycorrhizal fungi have been the problems to be solved by the present invention. Further, it is also a problem to be solved by the present invention to provide a mycorrhizal fungus material having a low price and stable quality.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ね、キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを土壌に施用することで、様々な植物におけるアーバスキュラー菌根菌の感染が劇的に改善され、かつ共生による植物の成長促進も更に亢進可能であることを見出した。また、培地へのキチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーの添加により、インビトロ培養系において得られるアーバスキュラー菌根菌の胞子量を飛躍的に増やすことが可能であることを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づいて、本発明を完成させるに至った。 The present inventors have conducted extensive research to solve the above problems, and by applying chitin oligosaccharides and / or chitin nanofibers to soil, the infection of arbuscular mycorrhizal fungi in various plants is dramatically improved. It was found that it can be improved and the promotion of plant growth by symbiosis can be further promoted. It was also found that the addition of chitin oligosaccharides and / or chitin nanofibers to the medium can dramatically increase the amount of spores of arbuscular mycorrhizal fungi obtained in an in vitro culture system. Based on these findings, the present inventors have completed the present invention.
従って、本発明は以下のものを提供する。
（１）キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを含む、植物におけるアーバスキュラー菌根菌の感染を促進するための剤。
（２）キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを含む、植物とアーバスキュラー菌根菌との共生を促進するための剤。
（３）キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを含む、植物の成長を促進するための剤。
（４）キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを植物の根に適用することを含む、植物におけるアーバスキュラー菌根菌の感染を促進するための方法。
（５）キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを植物の根に適用することを含む、植物とアーバスキュラー菌根菌との共生を促進するための方法。
（６）キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを植物の根に適用することを含む、植物の成長を促進するための方法。
（７）キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを含む、アーバスキュラー菌根菌のインビトロ培養用の培地。
（８）アーバスキュラー菌根菌の増殖を促進するための、（７）記載の培地。
（９）アーバスキュラー菌根菌の胞子生産量を増加させるための、（７）記載の培地。
（１０）キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを含む、アーバスキュラー菌根菌のインビトロ培養用の培地添加剤。
（１１）アーバスキュラー菌根菌の増殖を促進するための、（１０）記載の培地添加剤。
（１２）アーバスキュラー菌根菌の胞子生産量を増加させるための、（１０）記載の培地添加剤。
（１３）キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーをアーバスキュラー菌根菌のインビトロ培養系に添加することを含む、アーバスキュラー菌根菌の増殖を促進するための方法。
（１４）キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーをアーバスキュラー菌根菌のインビトロ培養系に添加することを含む、アーバスキュラー菌根菌の胞子生産量を増加させるための方法。
（１５）キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを含む、肥料補助剤または肥料添加剤。
Therefore, the present invention provides the following.
(1) An agent for promoting infection with arbuscular mycorrhizal fungi in plants, which comprises chitin oligosaccharides and / or chitin nanofibers.
(2) An agent for promoting symbiosis between plants and arbuscular mycorrhizal fungi, which comprises chitin oligosaccharides and / or chitin nanofibers.
(3) An agent for promoting plant growth, which comprises chitin oligosaccharides and / or chitin nanofibers.
(4) A method for promoting arbuscular mycorrhizal infection in a plant, which comprises applying chitin oligosaccharides and / or chitin nanofibers to plant roots.
(5) A method for promoting symbiosis between plants and arbuscular mycorrhizal fungi, which comprises applying chitin oligosaccharides and / or chitin nanofibers to plant roots.
(6) A method for promoting plant growth, which comprises applying chitin oligosaccharides and / or chitin nanofibers to plant roots.
(7) A medium for in vitro culture of arbuscular mycorrhizal fungi containing chitin oligosaccharides and / or chitin nanofibers.
(8) The medium according to (7) for promoting the growth of arbuscular mycorrhizal fungi.
(9) The medium according to (7) for increasing the spore production of arbuscular mycorrhizal fungi.
(10) A medium additive for in vitro culture of arbuscular mycorrhizal fungi, which comprises chitin oligosaccharides and / or chitin nanofibers.
(11) The medium additive according to (10) for promoting the growth of arbuscular mycorrhizal fungi.
(12) The medium additive according to (10) for increasing the spore production of arbuscular mycorrhizal fungi.
(13) A method for promoting the growth of arbuscular mycorrhizal fungi, which comprises adding chitin oligosaccharides and / or chitin nanofibers to an in vitro culture system of arbuscular mycorrhizal fungi.
(14) A method for increasing spore production of arbuscular mycorrhizal fungi, which comprises adding chitin oligosaccharides and / or chitin nanofibers to an in vitro culture system of arbuscular mycorrhizal fungi.
(15) A fertilizer aid or fertilizer additive comprising chitin oligosaccharides and / or chitin nanofibers.
本発明によれば、様々な植物においてアーバスキュラー菌根菌の感染および共生が大幅に促進されるため、植物の成長も促進される。したがって、農作物の大幅な収量増加が可能となる。これに伴ってリン酸肥料の使用量を減らすこともできる。さらに、本発明によれば、インビトロ培養系において大量のアーバスキュラー菌根菌の菌体および胞子を得ることができるため、安定した品質の菌根菌資材を製造することができる。そのため、菌根菌資材の普及も進むと考えられる。さらに、キチンオリゴ糖やキチンナノファイバーは、大量に廃棄されているカニやエビの甲羅から調製できるため、本発明を低コストで実施することができる。 According to the present invention, infection and symbiosis of arbuscular mycorrhizal fungi are greatly promoted in various plants, so that plant growth is also promoted. Therefore, it is possible to significantly increase the yield of agricultural products. Along with this, the amount of phosphate fertilizer used can be reduced. Further, according to the present invention, since a large amount of arbuscular mycorrhizal cells and spores can be obtained in an in vitro culture system, a stable quality mycorrhizal fungus material can be produced. Therefore, it is considered that the spread of mycorrhizal fungus materials will be promoted. Furthermore, since chitin oligosaccharides and chitin nanofibers can be prepared from the shells of crabs and shrimp that are discarded in large quantities, the present invention can be carried out at low cost.
本発明は、１の態様において、キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを含む、植物におけるアーバスキュラー菌根菌の感染を促進するための剤を提供する。 The present invention provides, in one embodiment, an agent comprising chitin oligosaccharides and / or chitin nanofibers for promoting infection with arbuscular mycorrhizal fungi in plants.
本明細書において「キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバー」という場合、キチンオリゴ糖、キチンナノファイバーのいずれか一方を意味してもよく、これら両方を意味してもよい。 In the present specification, the term "chitin oligosaccharide and / or chitin nanofiber" may mean either one of chitin oligosaccharide and chitin nanofiber, or both of them.
キチンオリゴ糖は公知物質であり、Ｎ−アセチルグルコサミンが２個〜数個程度、例えば２個〜８個つながったオリゴ糖である。キチンオリゴ糖の製法も公知である。キチンオリゴ糖は、例えばカニやエビなどの甲羅から得たキチンを濃塩酸で加水分解し、次いで、加水分解、中和、濾過等の工程行うことによって得てもよい。市販のキチンオリゴ糖を本発明に用いてもよい。 Chitin oligosaccharide is a known substance, and is an oligosaccharide in which about 2 to several N-acetylglucosamines, for example, 2 to 8 are linked. A method for producing chitin oligosaccharide is also known. The chitin oligosaccharide may be obtained by hydrolyzing chitin obtained from the shell of, for example, crab or shrimp with concentrated hydrochloric acid, and then performing steps such as hydrolysis, neutralization, and filtration. Commercially available chitin oligosaccharides may be used in the present invention.
キチンナノファイバーは天然界から、例えばキチン含有生物由来の材料から得ることができる。キチン含有生物としては、エビ、カニなどの甲殻類、昆虫類またはオキアミなどが例示されるが、これらに限定されない。好ましくは、キチン含量の多い生物、例えばエビ、カニなどの甲殻類の殻および外皮からキチンナノファイバーを得てもよい。ただし、生体中のキチンナノファイバーは、その周囲および間隙に存在する蛋白および炭酸カルシウムを含むマトリクスを有しているので、脱マトリクス処理を行わなければ得ることができない。脱マトリクス処理後に解繊処理を行う。上で説明した工程によりナノファイバー化されるキチンは、カニ殻やエビ殻由来のキチンなどのα型の結晶構造を有するキチンであってもよく、イカの甲由来のキチンなどのβ型の結晶構造を有するキチンであってもよい。 Chitin nanofibers can be obtained from nature, for example from materials derived from chitin-containing organisms. Examples of chitin-containing organisms include, but are not limited to, crustaceans such as shrimp and crab, insects and krill. Preferably, chitin nanofibers may be obtained from the shell and exodermis of crustaceans such as shrimp and crab, which are high in chitin content. However, since chitin nanofibers in a living body have a matrix containing proteins and calcium carbonate existing around and in the gaps thereof, they cannot be obtained without dematrix treatment. After the dematrix treatment, the defibration treatment is performed. The chitin to be nanofibered by the process described above may be chitin having an α-type crystal structure such as chitin derived from crab shell or shrimp shell, or β-type crystal such as chitin derived from squid cuttlebone. It may be chitin having a structure.
本発明において使用されるキチンナノファイバーはいずれの方法・手段にて製造されたものであってもよい。本発明において使用されるキチンナノファイバーの好ましい製造方法としては、例えば国際公開ＷＯ２０１０／０７３７５８の明細書（参照により本明細書にその内容を一体化させる）に記載された方法、あるいは高圧湿式粉砕機、湿式超高圧微粒化装置、ブレンダー、コロイドミル、ビーズミル、ボールミルなどを用いる方法などがある。 The chitin nanofibers used in the present invention may be produced by any method or means. Preferred methods for producing the chitin nanofibers used in the present invention include, for example, the method described in the specification of WO2010 / 073758 (integrating the contents into the present specification by reference), or a high-pressure wet crusher. , Wet ultra-high pressure pulverizer, blender, colloid mill, bead mill, ball mill and the like.
本発明において使用されるキチンナノファイバーは修飾または誘導体化されていてもよい。例えば、糖の３位の水酸基、６位の水酸基、または糖鎖の末端の水酸基の水素が、アルキル基などの他の基に置換されていてもよい。あるいはキチンの糖の２位のアセチル基中のメチル基が、エチル基などの他の基に置換されていてもよい。これらの修飾体、誘導体および塩はあくまでも例示であり、限定的なものではない。本明細書では、これらの修飾体、誘導体および塩もキチンナノファイバーに包含されるものとする。このような誘導体および修飾体は当業者に知られており、それらの製造方法も公知である。 The chitin nanofibers used in the present invention may be modified or derivatized. For example, the hydrogen of the hydroxyl group at the 3-position, the hydroxyl group at the 6-position, or the hydroxyl group at the end of the sugar chain of the sugar may be substituted with another group such as an alkyl group. Alternatively, the methyl group in the acetyl group at the 2-position of the sugar of chitin may be replaced with another group such as an ethyl group. These modifications, derivatives and salts are merely exemplary and not limiting. As used herein, these modifications, derivatives and salts are also included in chitin nanofibers. Such derivatives and modified products are known to those skilled in the art, and methods for producing them are also known.
本発明において使用されるキチンナノファイバーは、幅（または径）が約２ｎｍ〜約２００ｎｍ、好ましくは約２ｎｍ〜約１００ｎｍ、より好ましくは約２ｎｍ〜約５０ｎｍ、例えば、約５ｎｍ〜約２０ｎｍ、約２ｎｍ〜約２０ｎｍ等である。例えば、「キチンナノファイバーの幅（または径）が約２ｎｍ〜約２０ｎｍ」とは、幅（または径）が約２ｎｍ〜約２０ｎｍであるキチンナノファイバーが全体の約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上を占める状態をいう。 The chitin nanofibers used in the present invention have a width (or diameter) of about 2 nm to about 200 nm, preferably about 2 nm to about 100 nm, more preferably about 2 nm to about 50 nm, for example, about 5 nm to about 20 nm, about 2 nm. ~ About 20 nm and the like. For example, "width (or diameter) of chitin nanofibers is about 2 nm to about 20 nm" means that chitin nanofibers having a width (or diameter) of about 2 nm to about 20 nm account for about 50% or more, preferably about 60. Percentage or more, more preferably about 70% or more.
本発明において使用されるキチンナノファイバーのアスペクト比（繊維の長さ/繊維の幅）は約５０以上、好ましくは約１００以上である。例えば、「キチンナノファイバーのアスペクト比が約１００以上」とは、アスペクト比が約１００以上であるキチンナノファイバーが全体の約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上を占める状態をいう。 The aspect ratio (fiber length / fiber width) of the chitin nanofibers used in the present invention is about 50 or more, preferably about 100 or more. For example, "the aspect ratio of chitin nanofibers is about 100 or more" means that chitin nanofibers having an aspect ratio of about 100 or more account for about 50% or more, preferably about 60% or more, and more preferably about 70% or more. The state that occupies.
本発明において使用されるキチンナノファイバーの結晶状態はα型の伸びきり鎖微結晶であることが好ましい。「伸び切り鎖微結晶」とは無数のキチン分子が伸び切った状態で規則的に配列して結晶化した状態のことをいう。 The crystalline state of the chitin nanofibers used in the present invention is preferably α-type stretched chain crystallites. The "stretched chain microcrystal" refers to a state in which innumerable chitin molecules are regularly arranged and crystallized in a fully stretched state.
キチンナノファイバーは水に均一に分散可能で、取り扱いが容易である。したがって、キチンナノファイバーは土壌や培地に適用し易く、効果のムラが少ない。 Chitin nanofibers can be uniformly dispersed in water and are easy to handle. Therefore, chitin nanofibers are easy to apply to soil and medium, and the effect is less uneven.
アーバスキュラー菌根菌は、「ＡＭ菌」または「ＶＡ菌根菌」とも呼ばれる内生菌根菌であり、約８０％以上の陸上植物と共生している。アーバスキュラー菌根菌は、グロムス門（phylum Glomeromycota）に属するすべての綱（classes）、目（orders）、科（families）、属（genera）および種（species）を包含する。アーバスキュラー菌根菌は、植物と共生して、土壌中のリンや水などを植物に供給して植物の生育を促進する。 Arbuscular mycorrhizal fungi are endophytic mycorrhizal fungi, also called "AM fungi" or "VA mycorrhizal fungi", and coexist with about 80% or more of land plants. Arbuscular mycorrhizal fungi include all classes, orders, families, genera and species belonging to the phylum Glomeromycota. Arbuscular mycorrhizal fungi coexist with plants and supply phosphorus and water in the soil to the plants to promote their growth.
本発明の剤は、いずれの形態であってもよい。本発明の剤は、例えば粉末、顆粒、ペレット、フレーク、ジェル、ペースト、溶液、懸濁液、濃縮液などであってもよい。本発明の剤がキチンナノファイバーを含む場合は、溶液、懸濁液、濃縮液、ジェル、ペーストなどの含水剤形が好ましい。本発明の剤は、アーバスキュラー菌根菌の菌糸および／または胞子を含んでいてもよい。本発明の剤は、肥料成分を含んでいてもよい。本発明の剤は、土壌を含んでいてもよい。本発明の剤は、バーミキュライトなどの公知の担体を用いて製剤化されていてもよい。 The agent of the present invention may be in any form. The agent of the present invention may be, for example, powder, granules, pellets, flakes, gels, pastes, solutions, suspensions, concentrates and the like. When the agent of the present invention contains chitin nanofibers, water-containing dosage forms such as solutions, suspensions, concentrates, gels and pastes are preferred. The agents of the present invention may contain hyphae and / or spores of arbuscular mycorrhizal fungi. The agent of the present invention may contain a fertilizer component. The agent of the present invention may contain soil. The agent of the present invention may be formulated using a known carrier such as vermiculite.
本発明の剤の適用方法は、キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーが植物の根に到達できればいずれの適用方法であってもよく、市販の資材と同様の適用方法であってもよい。本発明の剤を、公知の手段・方法を用いて土壌と混合してもよく、土壌に噴霧してもよい。本発明の剤を播種時に使用する場合は、本発明の剤を土壌と混合したところに播種してもよい。本発明の剤を苗の仮植え時あるいはポット苗の定植時に使用する場合は、苗の底部に「根部処理」してもよく、「植穴処理」してもよい。 The application method of the agent of the present invention may be any application method as long as the chitin oligosaccharide and / or chitin nanofiber can reach the roots of the plant, and may be the same application method as the commercially available material. The agent of the present invention may be mixed with soil or sprayed on soil by using known means and methods. When the agent of the present invention is used at the time of sowing, the agent of the present invention may be sown in a place mixed with soil. When the agent of the present invention is used at the time of temporary planting of seedlings or at the time of planting pot seedlings, the bottom of the seedlings may be "root treated" or "planted hole treated".
本発明の剤の適用量は使用者が適宜定めうる。一般的には、土壌１リットルあたり約０．０００１ｇ〜約０．０２ｇ、好ましくは約０．００１ｇ〜約０．０２ｇのキチンオリゴ糖またはキチンナノファイバーが適用されるように本発明の剤を適用するが、これらの量に限定されない。本発明の剤の適用量は、上記量に限定されず、植物の種類や栽培方法などに応じて適宜変更されうる。 The applicable amount of the agent of the present invention can be appropriately determined by the user. Generally, the agents of the invention are applied such that about 0.0001 g to about 0.02 g, preferably about 0.001 g to about 0.02 g of chitin oligosaccharides or chitin nanofibers per liter of soil are applied. However, it is not limited to these amounts. The applied amount of the agent of the present invention is not limited to the above amount, and may be appropriately changed depending on the type of plant, cultivation method and the like.
本発明の剤は、アーバスキュラー菌根菌が共生できるあらゆる植物に適用可能である。具体的には、本発明の剤は、アブラナ科、アカザ科およびカヤツリグサ科の植物以外の植物に適用可能である。本発明の剤が適用される植物は、双子葉植物、単子葉植物、裸子植物、シダ植物およびコケ植物であり得る。また本発明の剤が適用される植物は、草本植物および木本植物であり得る。本発明の剤は、野菜類、豆類、イモ類、果樹類、穀類、シソ科葉菜類、セリ科葉菜類、花卉、観葉植物、樹木、芝などの植物（これらに限定されない）に好適に用いられる。 The agent of the present invention can be applied to any plant in which arbuscular mycorrhizal fungi can coexist. Specifically, the agent of the present invention can be applied to plants other than cruciferous, Chenopodiaceae and Sedges. The plants to which the agents of the present invention are applied can be dicotyledonous plants, monocotyledonous plants, gymnosperms, fern plants and moss plants. The plants to which the agent of the present invention is applied may be herbaceous plants and woody plants. The agent of the present invention is suitably used for plants (not limited to these) such as vegetables, beans, potatoes, fruit trees, grains, Labiatae leafy vegetables, Umbelliferae leafy vegetables, flowers, foliage plants, trees, and turf.
本発明の剤は、植物におけるアーバスキュラー菌根菌の感染を促進するために使用される。アーバスキュラー菌根菌の感染を促進することによって、植物とアーバスキュラー菌根菌の共生が促進される。したがって、本発明は、さらなる態様において、キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを含む、植物とアーバスキュラー菌根菌との共生を促進するための剤を提供する。上記の剤の適用方法、適用量、適用植物、剤形などについては上で説明したとおりである。 The agents of the present invention are used to promote infection with arbuscular mycorrhizal fungi in plants. By promoting infection with arbuscular mycorrhizal fungi, symbiosis between plants and arbuscular mycorrhizal fungi is promoted. Therefore, the present invention provides, in a further aspect, an agent containing chitin oligosaccharides and / or chitin nanofibers for promoting symbiosis between plants and arbuscular mycorrhizal fungi. The application method, application amount, application plant, dosage form, etc. of the above agent are as described above.
植物とアーバスキュラー菌根菌の共生が促進されると、植物へのリンや水分の供給が円滑となり、植物の成長が促進される。したがって、本発明は、さらなる態様において、キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを含む、植物の成長を促進するための剤を提供する。上記の剤の適用方法、適用量、適用植物、剤形などについては上で説明したとおりである。 When the symbiosis between plants and arbuscular mycorrhizal fungi is promoted, the supply of phosphorus and water to the plants becomes smooth, and the growth of plants is promoted. Therefore, in a further aspect, the present invention provides an agent for promoting plant growth, which comprises chitin oligosaccharides and / or chitin nanofibers. The application method, application amount, application plant, dosage form, etc. of the above agent are as described above.
上で説明した３つの態様に係る剤は、土壌改良剤や肥料などの他の剤に添加して用いてもよく、これらと併用してもよい。したがって、本発明は、さらなる態様において、キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを含む、肥料補助剤または肥料添加剤を提供する。本発明の肥料補助剤を肥料と併用することによって、あるいは本発明の肥料添加剤を肥料に添加することによって、植物の成長促進などの肥料の効果を高めることができる。 The agents according to the three aspects described above may be added to other agents such as soil conditioners and fertilizers, or may be used in combination with them. Therefore, in a further aspect, the present invention provides fertilizer aids or fertilizer additives, including chitin oligosaccharides and / or chitin nanofibers. By using the fertilizer auxiliary agent of the present invention in combination with the fertilizer, or by adding the fertilizer additive of the present invention to the fertilizer, the effect of the fertilizer such as promotion of plant growth can be enhanced.
本発明は、もう１つの態様において、キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを植物の根に適用することを含む、植物におけるアーバスキュラー菌根菌の感染を促進するための方法を提供する。 The present invention provides, in another embodiment, a method for promoting arbuscular mycorrhizal infection in a plant, which comprises applying chitin oligosaccharides and / or chitin nanofibers to plant roots.
キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを植物の根に適用する手段・方法は公知のものであってよく、特に限定されないが、好ましくは上記の剤として植物の根に適用する。キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを植物の根に適用した場合、根の表面および周囲にキチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーが存在することとなり、植物の根やその周囲に存在するアーバスキュラー菌根菌の感染が促進される。 Means and methods for applying chitin oligosaccharides and / or chitin nanofibers to plant roots may be known and are not particularly limited, but are preferably applied to plant roots as the above agents. When chitin oligosaccharides and / or chitin nanofibers are applied to plant roots, chitin oligosaccharides and / or chitin nanofibers are present on and around the roots, and the arborscular present in and around the roots of plants. Infection of mycorrhizal fungi is promoted.
アーバスキュラー菌根菌の根への感染が促進されることにより、植物とアーバスキュラー菌根菌との共生が促進されうる。したがって、本発明は、さらなる態様において、キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを植物の根に適用することを含む、植物とアーバスキュラー菌根菌との共生が促進するための方法を提供する。 By promoting infection of the roots of arbuscular mycorrhizal fungi, symbiosis between plants and arbuscular mycorrhizal fungi can be promoted. Therefore, the present invention provides, in a further aspect, a method for promoting symbiosis between a plant and an arbuscular mycorrhizal fungus, which comprises applying chitin oligosaccharides and / or chitin nanofibers to the roots of the plant.
植物とアーバスキュラー菌根菌の共生が促進されると、植物へのリンや水分の供給が円滑となり、植物の成長が促進される。したがって、本発明は、さらなる態様において、キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを植物の根に適用することを含む、植物の成長を促進するための方法を提供する。 When the symbiosis between plants and arbuscular mycorrhizal fungi is promoted, the supply of phosphorus and water to the plants becomes smooth, and the growth of plants is promoted. Therefore, the present invention provides, in a further aspect, a method for promoting plant growth, comprising applying chitin oligosaccharides and / or chitin nanofibers to plant roots.
本発明は、さらなる態様において、キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを含む、アーバスキュラー菌根菌のインビトロ培養用の培地を提供する。 In a further aspect, the present invention provides a medium for in vitro culture of arbuscular mycorrhizal fungi containing chitin oligosaccharides and / or chitin nanofibers.
菌根菌のインビトロ培養は、一般的には、滅菌された植物の根とともに培地中で行われる。使用培地は液体培地であってもよく、固体培地（寒天培地など）であってもよい。アーバスキュラー菌根菌のインビトロ培養に用いられる培地は公知であり、例えばＭ培地、ＭＷ培地、改変Ｍ培地やＭＳＲ培地などが挙げられるが、これらに限定されない。植物の根は、アーバスキュラー菌根菌が共生可能な植物の根であればよく、特に限定されない。例えばニンジンの毛状根だけでなく、アマやチコリーなどの毛状根を用いてもよい。 In vitro culture of mycorrhizal fungi is generally carried out in medium with sterile plant roots. The medium used may be a liquid medium or a solid medium (such as an agar medium). The medium used for in vitro culture of arbuscular mycorrhizal fungi is known, and examples thereof include, but are not limited to, M medium, MW medium, modified M medium, and MSR medium. The root of the plant is not particularly limited as long as it is the root of a plant in which arbuscular mycorrhizal fungi can coexist. For example, not only the hairy root of carrot but also the hairy root of flax or chicory may be used.
培地中のキチンオリゴ糖またはキチンナノファイバーの培地中の濃度は適宜決定しうる。一般的には、約０．０００１重量％〜約０．０１重量％、好ましくは約０．００１重量％〜約０．０１重量％であるが、これらの量に限定されない。 The concentration of chitin oligosaccharide or chitin nanofiber in the medium can be appropriately determined. Generally, it is about 0.0001% by weight to about 0.01% by weight, preferably about 0.001% by weight to about 0.01% by weight, but is not limited to these amounts.
本発明の培地はいずれの形態であってもよく、液体培地や固体培地（例えば寒天平板培地など）であってもよい。本発明の培地は、成分を濃縮した形態、例えば粉末、顆粒、ペレット、フレーク、ジェル、ペースト、溶液、懸濁液、濃縮液などであってもよいが、これらの形態に限定されない。かかる濃縮形態の培地は、所望の成分濃度となるように使用時に水等の媒体にて希釈される。 The medium of the present invention may be in any form, and may be a liquid medium or a solid medium (for example, an agar plate medium). The medium of the present invention may be in a concentrated form of the components, such as powder, granules, pellets, flakes, gels, pastes, solutions, suspensions, concentrates, etc., but is not limited to these forms. The medium in such a concentrated form is diluted with a medium such as water at the time of use so as to have a desired component concentration.
本発明の培地を用いることにより、アーバスキュラー菌根菌の増殖が促進され、菌糸が増える。その結果、胞子生産量も増加する。したがって、本発明の培地を、アーバスキュラー菌根菌の増殖が促進するために用いてもよい。また、本発明の培地を、アーバスキュラー菌根菌の胞子生産量を増加させるために用いてもよい。 By using the medium of the present invention, the growth of arbuscular mycorrhizal fungi is promoted and hyphae increase. As a result, spore production also increases. Therefore, the medium of the present invention may be used to promote the growth of arbuscular mycorrhizal fungi. In addition, the medium of the present invention may be used to increase the spore production of arbuscular mycorrhizal fungi.
本発明は、さらなる態様において、キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを含む、アーバスキュラー菌根菌のインビトロ培養用の培地添加剤を提供する。 In a further aspect, the invention provides a medium additive for in vitro culture of arbuscular mycorrhizal fungi, including chitin oligosaccharides and / or chitin nanofibers.
培地中において所望のキチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーの濃度となるよう、本発明の培地添加剤を培地に添加する。 The medium additive of the present invention is added to the medium so as to have the desired concentration of chitin oligosaccharides and / or chitin nanofibers in the medium.
本発明の培地添加剤の形態は、例えば粉末、顆粒、ペレット、フレーク、ジェル、ペースト、濃縮液などであってもよいが、これらの形態に限定されない。 The form of the medium additive of the present invention may be, for example, powder, granules, pellets, flakes, gels, pastes, concentrates, etc., but is not limited to these forms.
本発明の培地添加剤を用いることにより、アーバスキュラー菌根菌の増殖が促進され、菌糸が増える。その結果、胞子生産量も増加する。したがって、本発明の培地添加剤を、アーバスキュラー菌根菌の増殖が促進するために用いてもよい。また、本発明の培地添加剤を、アーバスキュラー菌根菌の胞子生産量を増加させるために用いてもよい。 By using the medium additive of the present invention, the growth of arbuscular mycorrhizal fungi is promoted and hyphae increase. As a result, spore production also increases. Therefore, the medium additive of the present invention may be used to promote the growth of arbuscular mycorrhizal fungi. In addition, the medium additive of the present invention may be used to increase the spore production of arbuscular mycorrhizal fungi.
本発明は、さらにもう１つの態様において、キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーをアーバスキュラー菌根菌のインビトロ培養系に添加することを含む、アーバスキュラー菌根菌の増殖を促進するための方法を提供する。 The present invention, in yet another embodiment, comprises adding chitin oligosaccharides and / or chitin nanofibers to an in vitro culture system of arbuscular mycorrhizal fungi, a method for promoting the growth of arbuscular mycorrhizal fungi. I will provide a.
上記方法を用いることにより、アーバスキュラー菌根菌の増殖が促進され、菌糸が増える。その結果、胞子生産量も増加する。したがって、上記方法は、アーバスキュラー菌根菌の胞子生産量を増加させるための方法であってもよい。 By using the above method, the growth of arbuscular mycorrhizal fungi is promoted and hyphae increase. As a result, spore production also increases. Therefore, the above method may be a method for increasing the spore production of arbuscular mycorrhizal fungi.
上で説明した本発明の剤、培地、培地添加剤、肥料補助剤、肥料添加剤、および方法において、キチンオリゴ糖、キチンナノファイバーに代えて、あるいはそれらに加えて、ナノファイバー化されていないキチン、ナノファイバー化されていないキトサン、キトサンオリゴ糖、キトサンナノファイバー、および／または表面キトサン化キチンナノファイバーを用いてもよい。これらの物質およびその製造方法は公知である。これらの物質は修飾または誘導体化されていてもよい。キトサンナノファイバーの好ましい製造方法としては、国際公開ＷＯ２０１０／０７３７７５８号の明細書に記載された方法が挙げられるが、この方法に限定されない。 In the agents, media, medium additives, fertilizer aids, fertilizer additives, and methods of the invention described above, in place of or in addition to chitin oligosaccharides, chitin nanofibers, they are not nanofibered. Chitin, non-nanofiberized chitosan, chitosan oligosaccharides, chitosan nanofibers, and / or surface chitosanized chitin nanofibers may be used. These substances and methods for producing them are known. These materials may be modified or derivatized. Preferred methods for producing chitosan nanofibers include, but are not limited to, the methods described in the specification of International Publication WO2010 / 0737758.
以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は説明のためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail and concretely with reference to Examples, but the Examples are for illustration purposes only and do not limit the scope of the present invention.
ミヤコグサの根に対するアーバスキュラー菌根菌（ＡＭ菌）の感染、菌糸侵入率およびアーバスキュール形成率に及ぼすキチンオリゴ糖およびキチンナノファイバーの影響について調べた。 The effects of chitin oligosaccharides and chitin nanofibers on the infection of Lotus japonicus roots with arbuscular mycorrhizal fungi (AM fungi), hyphal invasion rate and arbuscular formation rate were investigated.
１．実験方法
供試植物としてミヤコグサ (Lotus japonicus Gifu B-129系統)を用いた。
供試菌としてRhizophagus irregularis DAOM 197198の胞子液（Premier Tech Biotechnologies）を用いた。
1. 1. Experimental method Lotus japonicus (Lotus japonicus Gifu B-129 strain) was used as a test plant.
The spore solution (Premier Tech Biotechnologies) of Rhizophagus irregularis DAOM 197198 was used as the test bacterium.
ミヤコグサの培養を以下の手順で行った。
１．サンドペーパーで傷をつけた種子を１％次亜塩素酸ナトリウム水溶液で１５分間表面殺菌し、滅菌水で洗浄してから１晩吸水させた。
２．滅菌水で湿らせた濾紙上に播種し、２４℃に設定された培養器内で３日間の暗期と２日間の明期を経て発芽させた。
Lotus japonicus was cultivated according to the following procedure.
1. 1. The seeds damaged with sandpaper were surface sterilized with 1% aqueous sodium hypochlorite solution for 15 minutes, washed with sterile water, and then allowed to absorb water overnight.
2. The seeds were sown on filter paper moistened with sterile water and germinated in an incubator set at 24 ° C. after a dark period of 3 days and a light period of 2 days.
ミヤコグサの移植およびＡＭ菌の接種を以下の手順で行った。
１．プラントボックス（plant box）を３段に組み、上段は通気口が空いたフタ、中段は培養土（３００ｍＬの川砂：バーミキュライト＝１：１) 、下段は水の受け皿として用いた。なお、中段のボックス底には穴があり、そこによじったキムワイプを通すことで下段の水が培養土に浸み込むようになっている。
２．１．で組み立てたプラントボックスをオートクレーブ処理（１２１℃、２０分間） して滅菌した。
３．２５ｍＬのＫＨ２ＰＯ４を２０μＭにしたＢ＆Ｄ液に１％キチンオリゴ糖（焼津水産化学工業・ＮＡ−ＣＯＳ−Ｙ（残基数２−６））または１％キチンナノファイバー水分散液を１．５ｍＬ添加して得られた液を培養土に添加した。コントロールにはキチンオリゴ糖、キチンナノファイバーを添加しなかった。
４．ミヤコグサ実生を１ボックスにつき６個体ずつ移植し、根の周辺にR. irregularisの胞子を４００個接種した。
５．培養土が乾燥するのを防ぐため、下段のボックスに滅菌水を１００ｍＬほど加え、２４℃、１４時間明期に設定した培養室で６週間培養した。
なお、使用したキチンナノファイバーは以下のようにして調製した：
カニ殻由来のキチン粉末(キチンTC-L，甲陽ケミカル（株）)に水を添加して１％（ｗ／ｖ）に調整し，石臼式磨砕機（スーパーマスコロイダー，MKCA6-2，増幸産業（株））を用いて２回処理することで，キチンナノファイバーの水分散液を得た。
Lotus japonicus was transplanted and AM bacteria were inoculated according to the following procedure.
1. 1. The plant box was assembled in three stages, the upper stage was a lid with a vent, the middle stage was potting soil (300 mL river sand: vermiculite = 1: 1), and the lower stage was used as a water tray. In addition, there is a hole in the bottom of the box in the middle row, and the water in the lower row can seep into the potting soil by passing the Kimwipe twisted through it.
2.1. The plant box assembled in 1 was autoclaved (121 ° C., 20 minutes) and sterilized.
Add 1% chitin oligosaccharide (Yaitsu Fisheries Chemical Industry, NA-COS-Y (residue number 2-6)) or 1% chitin nanofiber aqueous dispersion to a B & D solution containing 3.25 mL of KH 2 PO 4 at 20 μM. The liquid obtained by adding 1.5 mL was added to the culture soil. No chitin oligosaccharides or chitin nanofibers were added to the control.
4. Six Lotus japonicus seedlings were transplanted per box, and 400 R. irregularis spores were inoculated around the roots.
5. In order to prevent the culture soil from drying, about 100 mL of sterilized water was added to the lower box, and the cells were cultured at 24 ° C. for 14 hours in a culture room set in the light period for 6 weeks.
The chitin nanofibers used were prepared as follows:
Water is added to chitin powder derived from crab shell (chitin TC-L, Koyo Chemical Co., Ltd.) to adjust to 1% (w / v), and a stone mill type grinder (Super Mascoroider, MKCA6-2, Masuko Sangyo) An aqueous dispersion of chitin nanofibers was obtained by treating twice with (Co., Ltd.).
ＡＭ菌の菌糸侵入率およびアーバスキュール形成率を以下の手順で測定した。
１．固定液で固定したミヤコグサの根を１ｃｍ断片にして１０％ ＫＯＨ水溶液に浸し、１０５℃、１５分間オートクレーブ処理した。
２．２％ ＨＣｌ水溶液で根を中和した後、０．０５％トリパンブルー（１％トリパンブルー水溶液を乳酸で２０倍希釈）を９０℃、１５分間処理した。
３．染色された根断片をスライドガラスの長辺に並行になるように１０本ずつ並べ、カバーガラスをかけた。
４．接眼レンズに接眼ミクロメーターを取り付けた光学顕微鏡で、根に対して垂直 （Ｙ軸方向）になるようステージを動かし、接眼ミクロメーターの交点と根が接した時に、根内にＡＭ菌の菌糸の有無を調べた。以下に菌糸侵入率の式を示す。
菌糸侵入率％ ＝ （菌糸が確認できた視野数 ／ 観察視野数）×１００
なお、アーバスキュール形成率は、分子を「アーバスキュールが確認できた視野数」に置き換えて算出した。
The hyphal invasion rate and arbuscular mycorrhizal rate of AM bacteria were measured by the following procedure.
1. 1. The roots of Lotus japonicus fixed with a fixative were made into 1 cm fragments, immersed in a 10% KOH aqueous solution, and autoclaved at 105 ° C. for 15 minutes.
After neutralizing the roots with a 2.2% HCl aqueous solution, 0.05% trypan blue (a 1% trypan blue aqueous solution diluted 20-fold with lactic acid) was treated at 90 ° C. for 15 minutes.
3. 3. Ten pieces of the dyed root fragments were arranged parallel to the long side of the slide glass, and covered with a cover glass.
4. With an optical microscope with an eyepiece micrometer attached to the eyepiece, move the stage so that it is perpendicular to the root (Y-axis direction), and when the intersection of the eyepiece micrometer and the root come into contact, the hyphae of AM bacteria enter the root. The presence or absence was examined. The formula for the hyphal invasion rate is shown below.
Mycelial penetration rate% = (number of visual fields where hyphae could be confirmed / number of observation visual fields) x 100
The arbuscule formation rate was calculated by replacing the numerator with "the number of visual fields in which arbuscules could be confirmed".
２．実験結果
ミヤコグサの根へのＡＭ菌の感染を示す写真を図１上段に示す。キチンオリゴ糖およびキチンナノファイバーの添加によって、感染が促進されたことがわかる。
2. Experimental Results A photograph showing the infection of Lotus japonicus roots with AM bacteria is shown in the upper part of FIG. It can be seen that the addition of chitin oligosaccharides and chitin nanofibers promoted infection.
アーバスキュール形成率を調べた結果を図１下段左図に示す。キチンオリゴ糖およびキチンナノファイバーの添加によって、アーバスキュール形成率が飛躍的に向上した。コントロールのアーバスキュール形成率が約５％であったのに対して、キチンオリゴ糖、キチンナノファイバーを添加した場合はいずれも９０％を超えていた。 The results of examining the arborscule formation rate are shown in the lower left figure of FIG. The addition of chitin oligosaccharides and chitin nanofibers dramatically improved the arborscule formation rate. The control arvacure formation rate was about 5%, whereas it was over 90% when chitin oligosaccharide and chitin nanofiber were added.
菌糸侵入率を調べた結果を図１下段右図に示す。キチンオリゴ糖およびキチンナノファイバーの添加によって、菌糸侵入率が飛躍的に向上した。コントロールの菌糸侵入率が約５％であったのに対して、キチンオリゴ糖を添加した場合は約９０％、キチンナノファイバーを添加した場合は約８５％となった。 The results of examining the hyphal invasion rate are shown in the lower right figure of FIG. The addition of chitin oligosaccharides and chitin nanofibers dramatically improved the hyphal penetration rate. The hyphal penetration rate of the control was about 5%, whereas it was about 90% when chitin oligosaccharide was added and about 85% when chitin nanofiber was added.
これらの結果から、キチンオリゴ糖およびキチンナノファイバーは、ＡＭ菌の植物への感染を促進し、アーバスキュラー形成率および菌糸侵入率を著しく増加させることがわかった。 From these results, it was found that chitin oligosaccharides and chitin nanofibers promote the infection of AM bacteria to plants and significantly increase the arbuscular formation rate and hyphal invasion rate.
ミヤコグサの成長に及ぼすキチンオリゴ糖およびキチンナノファイバーの影響について調べた。 The effects of chitin oligosaccharides and chitin nanofibers on the growth of Lotus japonicus were investigated.
１．実験方法
供試植物および供試菌は実施例１と同じであった。実験手順も実施例１と同様であった。
１．６週間ＡＭ菌と共培養したミヤコグサ実生をサンプリングし、すぐに新鮮重量を電子天秤で測定した。
２．定規を用いて地上部と根の長さを測定した。
1. 1. Experimental method The test plant and the test bacterium were the same as in Example 1. The experimental procedure was the same as in Example 1.
Lotus japonicus seedlings co-cultured with AM bacteria for 1.6 weeks were sampled and immediately weighed fresh on an electronic balance.
2. Above-ground and root lengths were measured using a ruler.
２．実験結果
図２からわかるように、キチンオリゴ糖およびキチンナノファイバーの添加によって、地上部長さ、根の長さ、新鮮重量が増加した。
2. Experimental Results As can be seen from FIG. 2, the addition of chitin oligosaccharides and chitin nanofibers increased the above-ground length, root length, and fresh weight.
これらの結果から、キチンオリゴ糖およびキチンナノファイバーは、ＡＭ菌と植物との共生を促進し、植物の成長を促進することがわかった。 From these results, it was found that chitin oligosaccharides and chitin nanofibers promote the symbiosis between AM bacteria and plants and promote the growth of plants.
キチンオリゴ糖およびキチンナノファイバーがＡＭ菌と植物の共生を促進することを遺伝子レベルで確認した。 It was confirmed at the genetic level that chitin oligosaccharides and chitin nanofibers promote symbiosis between AM bacteria and plants.
１．実験方法
実験手順を以下に示す。
１．供試植物および供試ＡＭ菌は実施例１と同じであった。水耕液としてリン酸含有量を２０μＭにした１／２ホーグランド（Hoagland）水耕液を用い、キチンオリゴ糖およびキチンナノファイバーの量を２倍とした以外は、実施例１と同様にして植物を培養した。
２． Total RNA Extraction Kit Mini（Plant）(RBC Bioscience)を用い、６週間生育させたミヤコグサの根からＲＮＡを抽出した。
３．ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover(TOYOBO)を用い、１００ｎｇのＲＮＡの逆転写を行うことでｃＤＮＡを合成した。
４．合成したｃＤＮＡを鋳型とし、THUNDERBIRD SYBR qPCR Mixを用いて定量ＰＣＲを行った。定量ＰＣＲはCFX Connect Real-Time System（BIO-RAD）により行った。表１に示す配列のプライマーを用いて各遺伝子の定量ＰＣＲを行った。
1. 1. The test plant and the test AM bacterium were the same as in Example 1. As the hydroponic solution, 1/2 Hoagland hydroponic solution having a phosphoric acid content of 20 μM was used, and the same procedure as in Example 1 except that the amounts of chitin oligosaccharides and chitin nanofibers were doubled. The plant was cultivated.
2. RNA was extracted from the roots of Lotus japonicus grown for 6 weeks using Total RNA Extraction Kit Mini (Plant) (RBC Bioscience).
3. 3. CDNA was synthesized by reverse transcription of 100 ng of RNA using ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover (TOYOBO).
4. Using the synthesized cDNA as a template, quantitative PCR was performed using THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix. Quantitative PCR was performed by CFX Connect Real-Time System (BIO-RAD). Quantitative PCR of each gene was performed using the primers of the sequences shown in Table 1.
２．実験結果
図３からわかるように、アーバスキュラー菌根共生のマーカー遺伝子であるＰＴ４、ＲＡＭ１およびＳｂｔＭ１の発現量は、キチンオリゴ糖、キチンナノファイバーの添加によって増加した。同様にマーカー遺伝子であるＧＰＡＴおよびＶｐｙ１の発現は、キチンナノファイバーの添加によって増加した。キチンナノファイバー処理によるこれらマーカー遺伝子の発現増加効果はキチンオリゴ糖を上回っていた。
2. Experimental Results As can be seen from FIG. 3, the expression levels of PT4, RAM1 and SbtM1, which are marker genes for arbuscular mycorrhizal symbiosis, were increased by the addition of chitin oligosaccharides and chitin nanofibers. Similarly, the expression of the marker genes GPAT and Vpy1 was increased by the addition of chitin nanofibers. The effect of increasing the expression of these marker genes by treatment with chitin nanofibers was higher than that of chitin oligosaccharides.
これらの結果から、キチンオリゴ糖およびキチンナノファイバーがＡＭ菌と植物の共生を促進することを、遺伝子発現の側面からも確認することができた。 From these results, it was confirmed from the aspect of gene expression that chitin oligosaccharides and chitin nanofibers promote the symbiosis between AM bacteria and plants.
イネの根に対するＡＭ菌の感染率に及ぼすキチンオリゴ糖およびキチンナノファイバーの影響について調べた。 The effects of chitin oligosaccharides and chitin nanofibers on the infection rate of AM bacteria on rice roots were investigated.
１．実験方法
供試植物としてイネ (Oryza sativa cv. Nipponbare)を用いた。
供試菌としてR. irregularis DAOM 197198を用いた。
1. 1. Experimental method Rice (Oryza sativa cv. Nipponbare) was used as a test plant.
R. irregularis DAOM 197 198 was used as the test bacterium.
イネの培養を以下の手順で行った。
１．１％次亜塩素酸ナトリウム水溶液で１５分間表面殺菌した種子を２８℃、暗所で３日間培養して発芽させた。
２．発芽させた種子を実施例１と同様に移植、ＡＭ菌の接種をした。処理液も実施例１の実験と同じものを使用した。
３．高照度（４００００ｌｕｘ）、２８℃に設定されたグロースチャンバー内で６週間培養した。
Rice was cultured according to the following procedure.
Seeds surface-sterilized with 1.1% sodium hypochlorite aqueous solution for 15 minutes were cultured at 28 ° C. in the dark for 3 days to germinate.
2. The germinated seeds were transplanted and inoculated with AM bacteria in the same manner as in Example 1. The same treatment liquid as in the experiment of Example 1 was used.
3. 3. The cells were cultured in a growth chamber set at high illuminance (40,000 lux) and 28 ° C. for 6 weeks.
ＡＭ菌の感染率を以下の手順で測定した。
１．実施例１と同様に、サンプリングした根をトリパンブルー染色した。
２．５ ｍｍのマス目をひいたシャーレに染色した根断片を均一に広げた。
３．シャーレ上の線と根が交わった箇所を観察し、根内に侵入した菌糸の有無を調べた。以下に感染率の計算式を示す。
感染率％ ＝ （菌糸が確認できた交点 ／ 総交点数）×１００
The infection rate of AM bacteria was measured by the following procedure.
1. 1. The sampled roots were stained with trypan blue in the same manner as in Example 1.
Root fragments stained in a 2.5 mm squared petri dish were spread evenly.
3. 3. The intersection of the line on the petri dish and the root was observed, and the presence or absence of hyphae invading the root was examined. The formula for calculating the infection rate is shown below.
Infection rate% = (intersections where hyphae were confirmed / total number of intersections) x 100
２．実験結果
図４に示すように、キチンオリゴ糖およびキチンナノファイバーの添加によって、イネの根に対してもＡＭ菌の感染が促進された。感染率は、コントロールが約７％であったのに対し、キチンオリゴ糖を添加すると約２５％に、キチンナノファイバーを添加すると約２０％に増加した。
2. Experimental Results As shown in FIG. 4, the addition of chitin oligosaccharides and chitin nanofibers also promoted the infection of AM bacteria on rice roots. The infection rate increased from about 7% under control to about 25% with the addition of chitin oligosaccharides and to about 20% with the addition of chitin nanofibers.
これらの結果から、キチンオリゴ糖およびキチンナノファイバーは、ミヤコグサ以外の植物へのＡＭ菌の感染を促進することがわかった。 From these results, it was found that chitin oligosaccharides and chitin nanofibers promote the infection of plants other than Lotus japonicus with AM bacteria.
チャイブの根に対する菌根菌資材中のＡＭ菌の感染率に及ぼすキチンオリゴ糖およびキチンナノファイバーの影響について調べた。 The effects of chitin oligosaccharides and chitin nanofibers on the infection rate of AM bacteria in the mycorrhizal fungus material on chives roots were investigated.
１．実験方法
供試植物としてチャイブ（Allium schoenoprasum）（サカタのタネ）を用いた。
供試ＡＭ菌として菌根菌資材Ｄｒキンコン（出光興産）を用いた。
液肥としてピータース２５−５−２０（粉２ｇ／Ｌ）（ハイポネックスジャパン）を用いた。
1. 1. Experimental method Chives (Allium schoenoprasum) (Sakata seed) was used as a test plant.
The mycorrhizal fungus material Dr King Kong (Idemitsu Kosan) was used as the test AM bacterium.
Peters 25-5-20 (powder 2 g / L) (Hyponex Japan) was used as the liquid fertilizer.
実験手順を以下に示す。
１．無菌播種した種子を、２４℃ 暗黒下で５日間、続いて照明下（明期１４時間／暗期１０時間）で２日間培養した。
２．滅菌済みの土（ベストミックス３号）と、培養土と同量の以下の処理液、および５０ｇ／土１Ｌ量の菌根菌資材をよく混合し、底に穴を開けた５０ｍＬチューブに入れた。表２に示す組成の液を培養に用いた。
３．無菌播種して育てた植物を１チューブ当たり１個体植え替えたあと、２４℃、明期１４時間、暗期１０時間で６週間培養した。この間、適宜水やりと、週に１度２００μＬ／植物分のピータース施肥を行った。
４．６週間生育させたチャイブの根を、処理区ごとに５０ｍＬチューブに入れたＦＡＡ固定液に２４時間以上浸漬した。（５０ｍＬチューブは培養に用いたものとは別のチューブ）
５．固定したチャイブの根にトリパンブルー染色を行い、根内の菌根菌を可視化した。
６．実施例４と同様にして感染率を求めた。
The experimental procedure is shown below.
1. 1. Aseptically sown seeds were cultured in the dark at 24 ° C. for 5 days, followed by lighting (14 hours in the light period / 10 hours in the dark period) for 2 days.
2. Sterilized soil (Best Mix No. 3), the same amount of the following treatment solution as the potting soil, and 50 g / 1 L of soil mycorrhizal material were mixed well and placed in a 50 mL tube with a hole in the bottom. .. The solution having the composition shown in Table 2 was used for culturing.
3. 3. After replanting one plant per tube that had been sown and raised aseptically, the plants were cultured at 24 ° C. for 14 hours in the light period and 10 hours in the dark period for 6 weeks. During this period, watering was carried out as appropriate, and 200 μL / Peters fertilizer for plants was applied once a week.
Chives roots grown for 4.6 weeks were immersed in FAA fixative in 50 mL tubes for each treatment plot for at least 24 hours. (50 mL tube is different from the one used for culture)
5. The roots of the fixed chives were stained with trypan blue to visualize the mycorrhizal fungi in the roots.
6. The infection rate was determined in the same manner as in Example 4.
２．実験結果
図５からわかるように、キチンオリゴ糖およびキチンナノファイバーはいずれもチャイブの根へのＡＭ菌の感染率を増加させた。コントロールの感染率が約７％であったのに対し、キチンオリゴ糖添加系では約１７％、キチンナノファイバー添加系では約１３％となっていた。
2. Experimental Results As can be seen from FIG. 5, both chitin oligosaccharides and chitin nanofibers increased the infection rate of AM bacteria on the roots of chives. The infection rate of the control was about 7%, while that of the chitin oligosaccharide-added system was about 17% and that of the chitin nanofiber-added system was about 13%.
キチンオリゴ糖およびキチンナノファイバーは、ミヤコグサおよびイネの場合と同様に、チャイブへの感染率を増加させることがわかった。これらの結果から、キチンオリゴ糖およびキチンナノファイバーは、幅広い植物種へのＡＭ菌の感染を促進することがわかった。また、キチンオリゴ糖およびキチンナノファイバーは、既存の菌根菌資材を用いた場合にもＡＭ菌の感染率を増加させることがわかった。 Chitin oligosaccharides and chitin nanofibers have been found to increase the rate of infection with chives, as in the case of Lotus japonicus and rice. From these results, it was found that chitin oligosaccharides and chitin nanofibers promote the infection of AM bacteria to a wide range of plant species. It was also found that chitin oligosaccharides and chitin nanofibers increase the infection rate of AM bacteria even when existing mycorrhizal fungus materials are used.
ＡＭ菌のインビトロ培養における胞子形成に及ぼすキチンオリゴ糖およびキチンナノファイバーの影響について調べた。 The effects of chitin oligosaccharides and chitin nanofibers on sporulation in in vitro culture of AM bacteria were investigated.
１．実験方法
供試植物としてニンジン毛状根 (Daucus carota)を用いた。
供試菌としてR. irregularis DAOM 197198を用いた。
1. 1. Experimental method A carrot hairy root (Daucus carota) was used as a test plant.
R. irregularis DAOM 197 198 was used as the test bacterium.
毛状根へのＡＭ菌の接種を以下の手順で行った。
１．Ｍ培地で２８℃、暗所で２週間培養した毛状根の傍に、R. irregularisの胞子を５０個接種した。
２．さらに１ヶ月同じ条件で培養した後、培地上に菌糸が十分に蔓延したものから、ＡＭ菌が感染した毛状根を選んだ。
３．一方にキチンオリゴ糖、キチンナノファイバーをそれぞれ０．０１％添加したＭ培地（２５ｍＬ）、もう一方にキチンやショ糖を含まないＭ培地（８ｍＬ）を加えた２分割シャーレを用意した。なお、Ｍ培地（−ショ糖）でシャーレ中央の仕切り板を覆った。
４．２．で選んだ毛状根を培地ごとメスで切り取り、Ｍ培地（＋ショ糖、キチンオリゴ糖／キチンナノファイバー）に置いた。
５．２８℃、暗所で、Ｍ培地（−ショ糖）が下になるよう２分割シャーレを立て、約６〜８週間、菌糸がＭ培地（−ショ糖）で蔓延するまで培養した。
The hairy roots were inoculated with AM bacteria according to the following procedure.
1. 1. 50 R. irregularis spores were inoculated beside the hairy roots cultured in M medium at 28 ° C. for 2 weeks in the dark.
2. After further culturing under the same conditions for one month, hairy roots infected with AM bacteria were selected from those in which hyphae were sufficiently spread on the medium.
3. 3. A two-part petri dish was prepared by adding M medium (25 mL) containing 0.01% each of chitin oligosaccharide and chitin nanofiber to one side and M medium (8 mL) containing no chitin or sucrose to the other side. The partition plate in the center of the petri dish was covered with M medium (-sucrose).
4.2. The hairy roots selected in step 1 were cut out together with the medium with a scalpel and placed on M medium (+ sucrose, chitin oligosaccharide / chitin nanofiber).
In a dark place at 5.28 ° C., a two-part petri dish was erected so that the M medium (-sucrose) was on the bottom, and the cells were cultured for about 6 to 8 weeks until the hyphae spread in the M medium (-sucrose).
胞子数の測定を以下の手順で行った。
１．Ｍ培地（−ショ糖）側の適当な位置に、１ｃｍ２の正方形を描き、実体顕微鏡下でその範囲内の胞子数をカウントした。
２．１．で得られた値に、Ｍ培地（−ショ糖）の面積を乗じることで、１枚のシャーレで形成された胞子の数を算出した。
The number of spores was measured by the following procedure.
1. 1. A 1 cm 2 square was drawn at an appropriate position on the M medium (-sucrose) side, and the number of spores within that range was counted under a stereomicroscope.
2.1. The number of spores formed in one petri dish was calculated by multiplying the value obtained in 1) by the area of M medium (-sucrose).
２．実験結果
図６に示すように、コントロール（キチンオリゴ糖／キチンナノファイバー不含）での胞子数がプレートあたり約２０００個であったのに対し、キチンオリゴ糖添加系ではプレートあたり約６０００個、キチンナノファイバー添加系ではプレートあたり約１００００個であった。キチンオリゴ糖またはキチンナノファイバーの添加により、菌体の増殖が促進され、その結果、胞子数も増加したものと考えられた。
2. Experimental results As shown in Fig. 6, the number of spores in the control (without chitin oligosaccharide / chitin nanofiber) was about 2000 per plate, whereas in the chitin oligosaccharide addition system, it was about 6000 per plate. In the chitin nanofiber addition system, the number was about 10,000 per plate. It was considered that the addition of chitin oligosaccharide or chitin nanofiber promoted the growth of bacterial cells, and as a result, the number of spores also increased.
これらの結果から、キチンオリゴ糖またはキチンナノファイバーを添加した培地を用いてＡＭ菌を培養することにより、胞子数が大幅に増加することが示された。 From these results, it was shown that the number of spores was significantly increased by culturing AM bacteria in a medium supplemented with chitin oligosaccharide or chitin nanofiber.
本発明は、農業、林業、緑化事業、農薬、農業資材、生物学の分野などにおいて利用可能である。 The present invention can be used in the fields of agriculture, forestry, greening business, pesticides, agricultural materials, biology and the like.
配列番号：１は、ＲＴ−ｑＰＣＲ法によるＵＢＱ１０遺伝子の発現解析に用いたForward primerの塩基配列を示す。
配列番号：２は、ＲＴ−ｑＰＣＲ法によるＵＢＱ１０遺伝子の発現解析に用いたReverse primerの塩基配列を示す。
配列番号：３は、ＲＴ−ｑＰＣＲ法によるＰＴ４遺伝子の発現解析に用いたForward primerの塩基配列を示す。
配列番号：４は、ＲＴ−ｑＰＣＲ法によるＰＴ４遺伝子の発現解析に用いたReverse primerの塩基配列を示す。
配列番号：５は、ＲＴ−ｑＰＣＲ法によるＲＡＭ１遺伝子の発現解析に用いたForward primerの塩基配列を示す。
配列番号：６は、ＲＴ−ｑＰＣＲ法によるＲＡＭ１遺伝子の発現解析に用いたReverse primerの塩基配列を示す。
配列番号：７は、ＲＴ−ｑＰＣＲ法によるＳｂｔＭ１遺伝子の発現解析に用いたForward primerの塩基配列を示す。
配列番号：８は、ＲＴ−ｑＰＣＲ法によるＳｂｔＭ１遺伝子の発現解析に用いたReverse primerの塩基配列を示す。
配列番号：９は、ＲＴ−ｑＰＣＲ法によるＧＰＡＴ遺伝子の発現解析に用いたForward primerの塩基配列を示す。
配列番号：１０は、ＲＴ−ｑＰＣＲ法によるＧＰＡＴ遺伝子の発現解析に用いたReverse primerの塩基配列を示す。
配列番号：１１は、ＲＴ−ｑＰＣＲ法によるＶｐｙ１遺伝子の発現解析に用いたForward primerの塩基配列を示す。
配列番号：１２は、ＲＴ−ｑＰＣＲ法によるＶｐｙ１遺伝子の発現解析に用いたReverse primerの塩基配列を示す。
SEQ ID NO: 1 indicates the nucleotide sequence of the Forward primer used for the expression analysis of the UBQ10 gene by the RT-qPCR method.
SEQ ID NO: 2 shows the nucleotide sequence of the Reverse primer used for the expression analysis of the UBQ10 gene by the RT-qPCR method.
SEQ ID NO: 3 indicates the nucleotide sequence of the Forward primer used for the expression analysis of the PT4 gene by the RT-qPCR method.
SEQ ID NO: 4 indicates the nucleotide sequence of the Reverse primer used for the expression analysis of the PT4 gene by the RT-qPCR method.
SEQ ID NO: 5 shows the base sequence of the Forward primer used for the expression analysis of the RAM1 gene by the RT-qPCR method.
SEQ ID NO: 6 shows the nucleotide sequence of the Reverse primer used for the expression analysis of the RAM1 gene by the RT-qPCR method.
SEQ ID NO: 7 shows the nucleotide sequence of the Forward primer used for the expression analysis of the SbtM1 gene by the RT-qPCR method.
SEQ ID NO: 8 shows the nucleotide sequence of the Reverse primer used for the expression analysis of the SbtM1 gene by the RT-qPCR method.
SEQ ID NO: 9 shows the nucleotide sequence of the Forward primer used for the expression analysis of the GPAT gene by the RT-qPCR method.
SEQ ID NO: 10 shows the nucleotide sequence of the Reverse primer used for the expression analysis of the GPAT gene by the RT-qPCR method.
SEQ ID NO: 11 shows the nucleotide sequence of the Forward primer used for the expression analysis of the Vpy1 gene by the RT-qPCR method.
SEQ ID NO: 12 shows the nucleotide sequence of the Reverse primer used for the expression analysis of the Vpy1 gene by the RT-qPCR method.
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112514710A (en) * | 2020-11-30 | 2021-03-19 | 山西农业大学 | Arbuscular mycorrhizal fungi continuous type propagation incubator |
| CN113493249A (en) * | 2021-06-07 | 2021-10-12 | 江苏金陵环境股份有限公司 | Method for treating escherichia coli in tail water of sewage plant |
| WO2023167242A1 (en) * | 2022-03-04 | 2023-09-07 | 国立大学法人鳥取大学 | Composition and method for enhancing infectiousness of arbuscular mycorrhizal fungi |
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