JP2020127406A - T細胞受容体 - Google Patents

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Abstract

【課題】MAGE−A10タンパク質由来のHLA−A*02制限ペプチドGLYDGMEHLを結合するT細胞受容体(TCR)の提供。【解決手段】可溶型のT細胞受容体(TCR)を使用してHLA−A*02と複合体形成したGLYDGMEHLに結合する特性を有するTCRであって、前記TCRが、TCRアルファ鎖可変ドメインおよびTCRベータ鎖可変ドメインを含むTCR。TCRをコードする核酸、TCRを提示するように改変された細胞、TCRをコードする発現ベクターを宿している細胞、および本発明のTCR、核酸または細胞を含む医薬組成物も提供される。【選択図】なし

Description

本発明は、MAGE−A10タンパク質由来のHLA−A02制限ペプチドGLYD
GMEHL(配列番号1)を結合するT細胞受容体(TCR)に関する。本発明のTCR
は、このMAGEエピトープに対する優れた特異性プロファイルを示す。
GLYDGMEHL(配列番号1)ペプチドは、多くの腫瘍型において発現される既知
のMAGE−A10タンパク質のアミノ酸残基番号254〜262に該当する。MAGE
−A10は、多数の配列関連MAGEがん−精巣抗原タンパク質の最も免疫原性のメンバ
ーのうちの1つである。それは、1/3から1/2の間の一範囲の一般的な固形腫瘍型(
例えば、肺、肝臓および胃の転移巣)によって発現される。加えて、それは、より一般的
でない数種類の腫瘍型(例えば、種々の扁平上皮癌)によって発現される。
正常な成人のMAGE−A10組織発現は、胎盤および精子細胞/精巣の免疫特権部位
に限定される。
MAGE−A10 T細胞抗原ペプチドGLYDGMEHLは、HLA−A2陽性腫瘍
細胞株によって提示されると質量分析を介して確認されている。
いくつかのMAGE遺伝子ファミリータンパク質は、生殖細胞およびがんにおいてのみ
発現される(MAGE−AからMAGE−Cファミリー)。他は、正常組織において広範
に発現される(MAGE−DからMAGE−H)。これらすべてのMAGEタンパク質フ
ァミリーは、MAGE−A10 GLYDGMEHLペプチドの配列と近似した相同領域
を有する。したがって、MAGE−A10ペプチド/HLA−A2抗原に特異性が高い、
または少なくとも、相補的な正常組織および腫瘍内の分布を有する他のMAGEファミリ
ー抗原に結合する、TCR臨床候補を選択することは重要である。
第1の態様では、本発明は、可溶型のT細胞受容体(TCR)を使用して25℃、pH
7.1から7.5の間で表面プラズモン共鳴で測定されるときに約0.05μMから約1
0.0μMまでの解離定数で、HLA−A02と複合体形成したGLYDGMEHL(
配列番号1)に結合する特性を有するTCRであって、TCRは、TCRアルファ鎖可変
ドメインおよびTCRベータ鎖可変ドメインを含み、TCR可変ドメインは、GLYDG
MEHL(配列番号1)の少なくとも残基Y3およびE7との接触を形成する、TCRを
提供する。
一部の実施形態では、TCRのアルファ鎖可変ドメインは、配列番号4のアミノ酸残基
1〜111の配列に対して少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ
/またはベータ鎖可変ドメインは、配列番号5のアミノ酸残基1〜111の配列に対して
少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
さらなる態様では、本発明は、HLA−A02と複合体形成したGLYDGMEHL
(配列番号1)に結合する特性を有し、TCRアルファ鎖可変ドメインおよびTCRベー
タ鎖可変ドメインを含む、T細胞受容体(TCR)であって、
アルファ鎖可変ドメインは、配列番号4のアミノ酸残基1〜111の配列に対して少な
くとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ/または
ベータ鎖可変ドメインは、配列番号5のアミノ酸残基1〜111の配列に対して少なく
とも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、TCRを提供する。
GLYDGMEHL HLA−A2複合体は、本発明のTCRが標的としうるがんマー
カーを提供する。本発明は、がん細胞に細胞傷害剤または免疫エフェクター剤を送達する
目的に有用な、かつ/または養子療法における使用に有用な、こうしたTCRを提供する
TCRは、国際免疫遺伝学(IMGT)TCR命名法、およびTCR配列のIMGT公
的データベースへのリンクを使用して記載されている。天然のアルファ−ベータヘテロ二
量体TCRは、アルファ鎖およびベータ鎖を有する。概して、それぞれの鎖は、可変領域
、連結領域および定常領域を含み、ベータ鎖は、通常、可変領域と連結領域との間に短い
多様性領域も含むが、この多様性領域は、連結領域の部分とみなされることが多い。それ
ぞれの可変領域は、フレームワーク配列内に埋め込まれた3つのCDR(相補性決定領域
)を含み、1つは、CDR3と命名された超可変領域である。それらのフレームワーク、
CDR1およびCDR2配列によって、ならびに部分的に定義されたCDR3配列によっ
て、区別されるいくつかの型のアルファ鎖可変(Vα)領域およびいくつかの型のベータ
鎖可変(Vβ)領域がある。Vα型は、IMGT命名法において固有のTRAV番号によ
って称される。したがって、「TRAV21」は、TCRからTCRまでで保存されてい
るがTCRからTCRまでで異なるアミノ酸配列も含むアミノ酸配列によって部分的に定
義される固有のフレームワークおよびCDR1およびCDR2配列、ならびにCDR3配
列を有するTCR Vα領域を定義する。同様の方法で、「TRBV5−1」は、固有の
フレームワークおよびCDR1およびCDR2配列を有するTCR Vβ領域を定義する
が、部分的にのみ定義されたCDR3配列を有する。
TCRの連結領域は、固有のIMGT TRAJおよびTRBJ命名法によって、定常
領域は、IMGT TRACおよびTRBC命名法によって、同様に定義される。
ベータ鎖多様性領域は、IMGT命名法において略語TRBDによって称され、上記の
ように、連鎖状のTRBD/TRBJ領域は、連結領域と一緒とみなされることが多い。
αβTCRのα鎖およびβ鎖は、一般に、それぞれ2つの「ドメイン」、すなわち、可
変ドメインおよび定常ドメインを有するとみなされる。可変ドメインは、可変領域および
連結領域の連鎖からなる。本明細書および特許請求の範囲において、「TCRアルファ可
変ドメイン」という用語は、したがって、TRAVおよびTRAJ領域の連鎖を指し、T
CRアルファ定常ドメインという用語は、細胞外TRAC領域、またはC末端トランケー
ト型TRAC配列を指す。同様に、「TCRベータ可変ドメイン」という用語は、TRB
VおよびTRBD/TRBJ領域の連鎖を指し、TCRベータ定常ドメインという用語は
、細胞外TRBC領域、またはC末端トランケート型TRBC配列を指す。
IMGT命名法によって定義される固有の配列は、TCR分野における当業者に広く知
られており、利用可能である。例えば、それらは、IMGT公的データベースにおいて見
出されうる。“T cell Receptor Factsbook”,(2001)
LeFranc and LeFranc,Academic Press,ISBN
0−12−441352−8も、IMGT命名法によって定義される配列を開示している
が、その公開日および結果として生じる時間のずれのため、その中の情報は、時に、IM
GTデータベースの参照による確認を必要とする。
本発明による1つのTCRは、配列番号2に示されているようなアルファ鎖細胞外ドメ
インおよび配列番号3に示されているようなベータ鎖細胞外ドメインを含む。「親TCR
」、「親MAGE−A10 TCR」という用語は、本明細書において同義的に使用され
、配列番号2および3それぞれの細胞外アルファ鎖およびベータ鎖を含むこのTCRを指
す。ペプチド−HLA複合体に対して親TCRよりも高い親和性および/または遅い解離
速度を有する、親TCRに対して相対的に変異または修飾されたTCRを提供することは
望ましい。
こうした変異または修飾されたTCRの結合プロファイルが比較されうるものに対する
参照TCRを提供する目的で、図2a(配列番号4)に示されている親MAGE−A10
TCRアルファ鎖の細胞外配列および図2b(配列番号5)に示されている親MAGE
−A10 TCRベータ鎖の細胞外配列を有する本発明による可溶性TCRを使用するこ
とは都合がいい。そのTCRは、本明細書において、「参照TCR」または「参照MAG
E−A10 TCR」と称される。配列番号4は、T162(すなわち、TRACのT4
8)からC162に置換されていることを除いて配列番号2の親アルファ鎖細胞外配列で
あることに留意されたい。同様に、配列番号5は、S169(すなわち、TRBC2のS
57)からC169に置換され、C187からA187に置換され、N201からD20
1に置換されていることを除いて配列番号3の親ベータ鎖細胞外配列である。親アルファ
鎖および親ベータ鎖細胞外配列に対して相対的なこれらのシステイン置換は、リフォール
ディングされた可溶性TCR、すなわち、細胞外アルファ鎖およびベータ鎖をリフォール
ディングすることによって形成されたTCRを安定化する鎖間ジスルフィド結合の形成を
可能にする。安定なジスルフィドで連結された可溶性TCRを参照TCRとして使用する
ことにより、結合親和性および結合半減期のさらに好都合な評価が可能となる。本発明の
TCRは、上記の変異を含んでいてもよい。
本発明のTCRは、天然に存在しないものであってもよく、かつ/または精製および/
もしくは改変されていてもよい。本発明のTCRは、親TCRに対して相対的なアルファ
鎖可変ドメインおよび/またはベータ鎖可変ドメインに存在する2つ以上の変異を有して
いてもよい。「改変TCR」および「変異体TCR」は、本明細書において同義的に使用
され、親TCRに対して相対的に、特に、そのアルファ鎖可変ドメインおよび/またはベ
ータ鎖可変ドメイン内に、導入された1つまたは複数の変異を有するTCRを一般に意味
する。これらの変異は、HLA−A02と複合体形成したGLYDGMEHL(配列番
号1)に対する結合親和性を改良しうる。ある特定の実施形態では、アルファ鎖可変ドメ
イン内に1、2、3、4、5、6、7つまたは8つの変異、例えば、4つまたは8つの変
異があり、かつ/またはベータ鎖可変ドメイン内に1、2、3、4つまたは5つの変異、
例えば、5つの変異がある。一部の実施形態では、本発明のTCRのα鎖可変ドメインは
、配列番号4のアミノ酸残基1〜111の配列に対して少なくとも90%、少なくとも9
1%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少
なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%の同一性
を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。一部の実施形態では、本発明のTCRのβ鎖
可変ドメインは、配列番号5のアミノ酸残基1〜111の配列に対して少なくとも90%
、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なく
とも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも
99%の同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。
本発明のTCRのアルファ鎖可変ドメインは、配列番号4に示されている番号付けを参
照して
の変異を有していてもよく、かつ/または
ベータ鎖可変ドメインは、配列番号5に示されている番号付けを参照して
の変異のうちの少なくとも1つを有していてもよい。
本発明のTCRのアルファ鎖可変ドメインは、配列番号6もしくは12のアミノ酸残基
1〜111のアミノ酸配列
またはそのアミノ酸残基1〜26、33〜49、55〜89および94〜111がそれ
ぞれ配列番号6もしくは12のアミノ酸残基1〜26、33〜49、55〜89および9
4〜111の配列に対して少なくとも90%もしくは95%の同一性を有し、アミノ酸残
基27〜32、50〜54および90〜93がそれぞれ配列番号6もしくは12のアミノ
酸残基27〜32、50〜54および90〜93の配列に対して少なくとも90%もしく
は95%の同一性を有するアミノ酸配列
を含んでいてもよい。
代替的に、アルファ鎖可変ドメインは、配列番号7もしくは13のアミノ酸残基1〜1
11のアミノ酸配列
またはそのアミノ酸残基1〜26、33〜49、55〜89および94〜111がそれ
ぞれ配列番号7もしくは13のアミノ酸残基1〜26、33〜49、55〜89および9
4〜111の配列に対して少なくとも90%もしくは95%の同一性を有し、アミノ酸残
基27〜32、50〜54および90〜93がそれぞれ配列番号7もしくは13のアミノ
酸残基27〜32、50〜54および90〜93の配列に対して少なくとも90%もしく
は95%の同一性を有するアミノ酸配列
を含んでいてもよい。
アルファ鎖可変ドメインにおいて
(i)そのアミノ酸残基1〜26の配列は、(a)配列番号4のアミノ酸残基1〜26
の配列に対して少なくとも90%の同一性を有していてもよく、または(b)(a)の配
列に対して相対的に挿入もしくは欠失された1つ、2つまたは3つのアミノ酸残基を有し
ていてもよく、
(ii)アミノ酸残基27〜32の配列は、DRGSQS、DRGSASまたはDRG
SSSであってもよく、
(iii)そのアミノ酸残基33〜49の配列は、(a)配列番号4のアミノ酸残基3
3〜49の配列に対して少なくとも90%の同一性を有していてもよく、または(b)(
a)の配列に対して相対的に挿入もしくは欠失された1つ、2つまたは3つのアミノ酸残
基を有していてもよく、
(iv)アミノ酸残基50〜54の配列は、IYSNGであってもよく、
(v)そのアミノ酸残基55〜89の配列は、配列番号4のアミノ酸残基55〜89の
配列に対して少なくとも90%の同一性を有していてもよく、またはそれに対して相対的
に1つ、2つまたは3つの挿入、欠失もしくは置換を有していてもよく、
(vi)アミノ酸90〜93の配列は、AVRGであってもよく、
(vii)そのアミノ酸残基94〜111の配列は、配列番号4のアミノ酸残基94〜
111の配列に対して少なくとも90%の同一性を有する、またはそれに対して相対的に
1つ、2つまたは3つの挿入、欠失もしくは置換を有していてもよい。
本発明のTCRのベータ鎖可変ドメインは、配列番号8もしくは14のアミノ酸配列
またはそのアミノ酸残基1〜26、32〜48、54〜90および96〜111がそれ
ぞれ配列番号8もしくは14のアミノ酸残基1〜26、32〜48、54〜90および9
6〜111の配列に対して少なくとも90%もしくは95%の同一性を有し、アミノ酸残
基27〜31、49〜53および91〜95がそれぞれ配列番号8もしくは14のアミノ
酸残基27〜31、49〜53および91〜95の配列に対して少なくとも90%もしく
は95%の同一性を有するアミノ酸配列
を含んでいてもよい。
代替的に、本発明のTCRのベータ鎖可変ドメインは、配列番号9もしくは15のアミ
ノ酸配列
またはそのアミノ酸残基1〜26、32〜48、54〜90および96〜111がそれ
ぞれ配列番号9もしくは15のアミノ酸残基1〜26、32〜48、54〜90および9
6〜111の配列に対して少なくとも90%もしくは95%の同一性を有し、アミノ酸残
基27〜31、49〜53および91〜95がそれぞれ配列番号9もしくは15のアミノ
酸残基27〜31、49〜53および91〜95の配列に対して少なくとも90%もしく
は95%の同一性を有するアミノ酸配列
を含んでいてもよい。
代替的に、本発明のTCRのベータ鎖可変ドメインは、配列番号10もしくは16のア
ミノ酸配列
またはそのアミノ酸残基1〜26、32〜48、54〜90および96〜111がそれ
ぞれ配列番号10もしくは16のアミノ酸残基1〜26、32〜48、54〜90および
96〜111の配列に対して少なくとも90%もしくは95%の同一性を有し、アミノ酸
残基27〜31、49〜53および91〜95がそれぞれ配列番号10もしくは16のア
ミノ酸残基27〜31、49〜53および91〜95の配列に対して少なくとも90%も
しくは95%の同一性を有するアミノ酸配列
を含んでいてもよい。
代替的に、本発明のTCRのベータ鎖可変ドメインは、配列番号11もしくは17のア
ミノ酸配列
またはそのアミノ酸残基1〜26、32〜48、54〜90および96〜111がそれ
ぞれ配列番号11もしくは17のアミノ酸残基1〜26、32〜48、54〜90および
96〜111の配列に対して少なくとも90%もしくは95%の同一性を有し、アミノ酸
残基27〜31、49〜53および91〜95がそれぞれ配列番号11もしくは17のア
ミノ酸残基27〜31、49〜53および91〜95の配列に対して少なくとも90%も
しくは95%の同一性を有するアミノ酸配列
を含んでいてもよい。
ベータ鎖可変ドメインにおいて
(i)そのアミノ酸残基1〜26の配列は、(a)配列番号5の残基1〜26のアミノ
酸配列に対して少なくとも90%の同一性を有していてもよく、または(b)(a)の配
列に対して相対的に挿入もしくは欠失された1つ、2つまたは3つのアミノ酸残基を有し
ていてもよく、
(ii)アミノ酸残基27〜31の配列は、MNHEYまたはMNHDYであってもよ
く、
(iii)そのアミノ酸残基32〜48の配列は、(a)配列番号5のアミノ酸残基3
2〜48の配列に対して少なくとも90%の同一性を有していてもよく、または(b)(
a)の配列に対して相対的に挿入もしくは欠失された1つ、2つまたは3つのアミノ酸残
基を有していてもよく、
(iv)アミノ酸残基49〜53の配列は、SVGEG、SVSEG、SVAEGまた
はSVFEGであってもよく、
(v)そのアミノ酸残基54〜90の配列は、(a)配列番号5のアミノ酸残基54〜
90の配列に対して少なくとも90%の同一性を有していてもよく、または(b)(a)
の配列に対して相対的に挿入もしくは欠失された1つ、2つまたは3つのアミノ酸残基を
有していてもよく、
(vi)アミノ酸91〜95の配列は、CASSFであってもよく、
(vii)そのアミノ酸残基96〜111の配列は、配列番号5のアミノ酸残基96〜
111の配列に対して少なくとも90%の同一性を有していてもよい、またはそれに対し
て相対的に1つ、2つまたは3つの挿入、欠失もしくは置換を有していてもよい。
本発明のTCRは、以下のアルファ鎖およびベータ鎖可変ドメインの組合せのうちの1
つを有していてもよい:
本明細書中に開示されている本発明のいずれのTCRの表現型的にサイレントなバリア
ントも本発明の範囲内である。本明細書中で使用される場合、「表現型的にサイレントな
バリアント」という用語は、上記のものに加えて1つまたは複数のさらなるアミノ酸変更
を組み込むTCRであって前記変更を含まない対応するTCRと類似した表現型を有する
TCRを指すことが理解される。本出願の目的で、TCR表現型には、抗原結合特異性(
および/または結合半減期)および抗原特異性が含まれる。表現型的にサイレントな
バリアントは、同一条件下で(例えば、25℃、同じSPRチップ上で)測定されたとき
に、前記変更を含まない対応するTCRの測定されたKおよび/または結合半減期の1
0%以内の、GLYDGMEHL(配列番号1) HLA−A02複合体に対するK
および/または結合半減期を有していてもよい。好適な条件は、実施例3においてさらに
定義されている。抗原特異性は、以下でさらに定義されている。当業者に知られているよ
うに、GLYDGMEHL(配列番号1) HLA−A02複合体との相互作用のため
の親和性を変えることなく、上記に詳述されているものと比較して、その定常ドメインお
よび/または可変ドメイン内に変更を組み込むTCRを作製することが可能でありうる。
特に、こうしたサイレントな変異は、抗原結合に直接に関与しないことが知られている配
列の部分内(例えば、CDRの外側)に組み込まれうる。こうした些細なバリアントは、
本発明の範囲内に含まれる。1つまたは複数の保存的置換がなされているTCRも、本発
明の部分を構成する。
変異は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に基づいたもの、制限酵素に基づいたクロー
ニング、またはライゲーション非依存性クローニング(LIC)手順を含むが、これらに
限定されない、任意の適切な方法を使用して行われうる。これらの方法は、多くの標準的
な分子生物学教科書の中で詳述されている。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)および制限
酵素に基づいたクローニングに関するさらなる詳細については、Sambrook&Ru
ssell,(2001)Molecular Cloning − A Labora
tory Manual(3rd Ed.)CSHL Pressを参照されたい。ライ
ゲーション非依存性クローニング(LIC)手順についてのさらなる情報は、Rasht
chian,(1995)Curr Opin Biotechnol 6(1):30
−6において見出されうる。
本発明のTCRは、MAGE−A10ペプチド、GLYDGMEHL(配列番号1)
HLA−A2複合体を結合する特性を有する。本発明のTCRは、他の、関連性のないエ
ピトープに対して相対的に、そのMAGEエピトープに対する特異性が高いことが見出さ
れており、したがって、そのエピトープを提示している細胞および組織に治療剤または検
出可能な標識を送達するためのターゲティングベクターとして特に好適である。本発明の
TCRの文脈における特異性は、ペプチドGLYDGMEHLについて陰性であるHLA
−A02標的細胞を認識するきわめて低い能力を有するのに対して、該ペプチドについ
て陽性であるHLA−A02標的細胞を認識する本発明のTCRの能力に関する。特異
性を試験するために、TCRは、可溶型であってもよく、かつ/またはT細胞の表面上で
発現されてもよい。認識は、TCRおよび標的細胞の存在下におけるT細胞活性化のレベ
ルを測定することによって決定されうる。この場合には、ペプチド陰性標的細胞の最低限
の認識は、同じ条件下で測定されたときに、ペプチド陽性標的細胞の存在下で産生される
レベルの10%未満、好ましくは、5%未満、より好ましくは、1%未満のT細胞活性化
のレベルとして定義される。本発明の可溶性TCRについて、特異性は、治療的に関連す
るTCR濃度で決定されうる。治療的に関連する濃度は、10−9M以下のTCR濃度と
して、かつ/または対応するEC50値よりも最高100倍、好ましくは、最高1000
倍高い濃度として定義されうる。ペプチド陽性細胞は、ペプチドをパルスすることによっ
て得られてもよく、または、より好ましくは、それらは天然に存在する前記ペプチドであ
ってもよい。好ましくは、ペプチド陽性細胞およびペプチド陰性細胞の両方がヒト細胞で
ある。
本発明のある特定のTCRは、養子療法における使用にきわめて好適であることが見出
されている。こうしたTCRは、200μM未満、例えば、約0.05μMから約100
μMまでの、複合体に対するKを有していてもよく、かつ/または約0.5秒から約1
2分までの範囲内の、複合体に対する結合半減期(T1/2)を有していてもよい。一部
の実施形態では、本発明のTCRは、約0.05μMから約10μM、約0.1μMから
約5μMまたは約0.1μMから約2μMまでの、複合体に対するKを有しうる。理論
に拘束されることを望むものではないが、養子細胞療法における治療的使用を伴うTCR
に対する親和性の最適枠があるようである。腫瘍抗原からエピトープを認識する天然に存
在するTCRは、一般に、親和性が低すぎ(20マイクロMから50マイクロM)、(ナ
ノモル範囲内またはそれより高い)きわめて高い親和性のTCRは、交差反応性の問題を
持つ(Robbins et al(2008)J.Immunol.180 6116
−6131;Zhao et al(2007)J.Immunol.179 5845
−5854;Scmid et al(2010)J.Immunol 184 493
6−4946)
本発明のTCRは、αβヘテロ二量体であってもよくまたは単鎖形式であってもよい。
単鎖形式には、Vα−L−Vβ、Vβ−L−Vα、Vα−Cα−L−VβまたはVα−L
−Vβ−Cβ型のαβTCRポリペプチドが含まれ、VαおよびVβはそれぞれTCRα
可変領域およびTCRβ可変領域であり、CαおよびCβはそれぞれTCRα定常領域お
よびTCRβ定常領域であり、Lはリンカー配列である。治療剤を抗原提示細胞に送達す
るためのターゲティング剤としての使用のために、TCRは、可溶型(すなわち、膜貫通
ドメインまたは細胞質ドメインを有していない)であってもよい。安定性のために、可溶
性αβヘテロ二量体TCRは、例えば、WO03/020763に、記載されているよう
に、それぞれの定常ドメインの残基間に導入されたジスルフィド結合を有することが好ま
しい。本発明のαβヘテロ二量体内に存在する定常ドメインのうちの1つまたは両方は、
例えば、多くとも15個、または多くとも10個もしくは多くとも8個の、またはそれよ
り少ないアミノ酸だけ、C末端でトランケートされていてもよい。養子療法における使用
のために、αβヘテロ二量体TCRは、例えば、細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインの
両方を有する完全長の鎖としてトランスフェクトされてもよい。養子療法における使用の
ためのTCRは、自然界においてそれぞれのアルファ定常ドメインとベータ定常ドメイン
との間に見出されるものと一致しているジスルフィド結合を含んでいてもよく、付加的に
または代替的に、天然でないジスルフィド結合が存在していてもよい。
当業者には明らかであろうように、TCRの結合特性に実質的に影響を及ぼすことなく
、所与の配列をそのC末端および/またはN末端で、1、2、3、4、5つまたはそれ以
上の残基だけ、トランケートすることも可能でありうる。すべてのこうした些細なバリア
ントは、本発明によって包含される。
本発明のアルファ−ベータヘテロ二量体TCRは、通常、アルファ鎖TRAC定常ドメ
イン配列およびベータ鎖TRBC1またはTRBC2定常ドメイン配列を含む。アルファ
鎖およびベータ鎖定常ドメイン配列は、TRACのエクソン2のCys4とTRBC1ま
たはTRBC2のエクソン2のCys2との間の天然のジスルフィド結合を欠失させるた
めのトランケーションまたは置換によって修飾されていてもよい。アルファ鎖およびベー
タ鎖定常ドメイン配列は、TRACのThr48およびTRBC1またはTRBC2のS
er57についてのシステイン残基の置換によっても修飾されていてもよく、前記システ
インは、TCRのアルファ定常ドメインとベータ定常ドメインとの間でジスルフィド結合
を形成する。
本発明のいくつかのTCRは、参照MAGE−A10 TCRのものよりも実質的に高
いGLYDGMEHL−HLA−A2複合体に対する結合親和性、および/または結合半
減期を有する。天然のTCRの結合親和性を高めると、そのペプチド−MHCリガンドに
対するTCRの特異性が低下されることが多く、これは、Zhao Yangbing
et al.,The Journal of Immunology,The Ame
rican Association of Immunologists,US,vo
l.179,No 9,1 November 2007,5845−5854において
実証されている。しかし、親TCRに由来する本発明のTCRは、親TCRよりも実質的
に高い結合親和性を有しているにもかかわらず、GLYDGMEHL−HLA−A2複合
体に対する特異的を維持している。
結合親和性(平衡定数Kに反比例する)および結合半減期(T1/2と表される)は
、本明細書中の実施例3の表面プラズモン共鳴(BIAcore)法を使用して決定され
うる。測定は、可溶型のTCRを使用して25℃、pH7.1から7.5の間で行われう
る。TCRの親和性が2倍になると、結果としてKは半分になることは理解されよう。
1/2は、解離速度(koff)によって除算されたln2として算出される。したが
って、T1/2が2倍になると、結果としてkoffは半分になる。TCRについてのK
およびkoff値は、通常、可溶型、すなわち、トランケートされて疎水性膜貫通ドメ
イン残基が除去された形態のTCRについて測定される。したがって、所与のTCRは、
そのTCRの可溶型がその必要条件を満たす場合には、それが、GLYDGMEHL−H
LA−A2複合体に対する結合親和性、および/または結合半減期を有するという必要条
件を満たすことが理解されるべきである。好ましくは、所与のTCRの結合親和性または
結合半減期は、同じアッセイプロトコールを使用して、数回、例えば、3回以上測定され
、結果の平均がとられる。参照MAGE−A10 TCRは、その方法によって測定され
るように、約2μMのKを有し、そのkoffは約0.73/秒である(すなわち、T
1/2は約0.95秒である)。
さらなる態様では、本発明は、本発明のTCRをコードする核酸を提供する。一部の実
施形態では、核酸は、cDNAである。一部の実施形態では、本発明は、本発明のTCR
のα鎖可変ドメインをコードする配列を含む核酸を提供する。一部の実施形態では、本発
明は、本発明のTCRのβ鎖可変ドメインをコードする配列を含む核酸を提供する。核酸
は、天然に存在しないものであってもよく、かつ/または精製および/もしくは改変され
ていてもよい。
別の態様では、本発明は、本発明の核酸を含むベクターを提供する。好ましくは、ベク
ターは、TCR発現ベクターである。
本発明は、本発明のベクター、好ましくは、TCR発現ベクターを宿している細胞も提
供する。ベクターは、単一のオープンリーディングフレーム、または2つの異なるオープ
ンリーディングフレームにおいて、アルファ鎖およびベータ鎖をそれぞれコードする本発
明の核酸を含んでいてもよい。別の態様は、本発明のTCRのアルファ鎖をコードする核
酸を含む第1の発現ベクター、および本発明のTCRのベータ鎖をコードする核酸を含む
第2の発現ベクターを宿している細胞を提供する。こうした細胞は、養子療法において特
に有用である。本発明の細胞は、単離されていてもよく、かつ/または組換え体および/
または天然に存在しないものであってもよく、かつ/または改変されていてもよい。
本発明のTCRは、養子療法における有用性を有するので、本発明には、本発明のTC
Rを提示している、天然に存在しないかつ/または精製および/もしくは改変された細胞
、特に、T細胞が含まれる。本発明は、本発明のTCRを提示しているT細胞の増殖した
集団も提供する。本発明のTCRをコードする核酸(DNA、cDNAまたはRNAなど
)でのT細胞のトランスフェクションに好適ないくつかの方法がある(例えば、Robb
ins et al.,(2008)J Immunol.180:6116−6131
を参照されたい)。本発明のTCRを発現しているT細胞は、養子療法に基づいたがんの
治療における使用に好適となる。当業者には知られているであろうように、養子療法が行
われうるいくつかの好適な方法がある(例えば、Rosenberg et al.,(
2008)Nat Rev Cancer 8(4):299−308を参照されたい)
本発明の可溶性TCRは、抗原提示細胞および抗原提示細胞を含む組織に対する検出可
能な標識または治療剤を送達するのに有用である。したがって、(GLYDGMEHL−
HLA−A2複合体を提示している細胞の存在を検出するためにTCRが使用される、診
断目的のための)検出可能な標識;治療剤;または(例えば、ペグ化による)PK修飾部
分と(共有結合または他の方法で)結合されていてもよい。
診断目的のための検出可能な標識としては、例えば、蛍光標識、放射標識、酵素、核酸
プローブおよびコントラスト試薬が含まれる。
本発明のTCRと結合されうる治療剤としては、免疫調節物質、放射性化合物、酵素(
例えばパーフォリン)または化学療法剤(例えばシスプラチン)が含まれる。毒性作用が
望ましい部位において果たされることを確実にするために、毒素は、化合物がゆっくりと
放出されるように、TCRに連結されたリポソームの中にあってもよい。これは、体内で
の輸送中の損傷作用を防止することになり、関連する抗原提示細胞に対するTCRの結合
後に毒素が最も高い効果を有することを確実にする。
他の好適な治療剤としては、
・ 小分子細胞傷害剤、すなわち、700ダルトン未満の分子量を有し、哺乳動物細胞
を死滅させる能力を有する化合物。こうした化合物としては、細胞傷害作用を有する能力
のある毒性金属も含まれうる。さらに、これらの小分子細胞傷害剤としては、プロドラッ
グ、すなわち、生理学的な条件下で壊変してまたは変換されて細胞傷害剤を放出する化合
物も含まれることが理解されるべきである。こうした作用剤の例には、シスプラチン、メ
イタンシン誘導体、ラシェルマイシン、カリケアマイシン、ドセタキセル、エトポシド、
ゲムシタビン、イホスファミド、イリノテカン、メルファラン、ミトキサントロン、ソル
フィマーソディウムフォトフリンII(sorfimer sodiumphotofr
in II)、テモゾロミド、トポテカン、トリメトレートグルクロネート(trime
treate glucuronate)、オーリスタチンE ビンクリスチンおよびド
キソルビシンが含まれる;
・ ペプチド細胞毒素、すなわち、哺乳動物細胞を死滅させる能力を有するタンパク質
またはその断片。例えば、リシン、ジフテリア毒素、シュードモナス細菌外毒素A、DN
アーゼおよびRNアーゼ;
・ 放射性核種、すなわち、α粒子もしくはβ粒子、またはγ線のうちの1つまたは複
数の同時発生的な放出を伴って壊変する元素の不安定同位体。例えば、ヨウ素131、レ
ニウム186、インジウム111、イットリウム90、ビスマス210および213、ア
クチニウム225ならびにアスタチン213;高親和性TCR、またはその多量体に対す
るこれらの放射性核種の結合を促進するためにキレート化剤が使用されてもよい;
・ 免疫刺激剤、すなわち、免疫応答を刺激する免疫エフェクター分子。例えば、IL
−2およびIFN−γなどのサイトカイン、
・ スーパー抗原およびその変異体;
・ TCR−HLA融合体;
・ ケモカイン、例えば、IL−8、血小板第4因子、黒色腫増殖刺激タンパク質など

・ 抗T細胞または抗NK細胞決定因子抗体(例えば、抗CD3、抗CD28または抗
CD16)を含む、抗体またはその断片;
・ 抗体様結合特性を有する代替のタンパク質足場
・ 補体活性化因子;
・ 異種のタンパク質ドメイン、同種異系のタンパク質ドメイン、ウイルス/細菌のタ
ンパク質ドメイン、ウイルス/細菌のペプチド
が含まれる。
好ましい一実施形態は、抗CD3抗体、または前記抗CD3抗体の機能的な断片もしく
はバリアントと(通常、アルファ鎖またはベータ鎖のN末端またはC末端への融合によっ
て)結合された本発明のTCRによって提供される。本明細書に記載の組成物および方法
における使用に好適である抗体断片およびバリアント/アナログとしては、ミニボディ、
Fab断片、F(ab’)2断片、dsFvおよびscFv断片、Nanobodies
(商標)(Ablynx(Belgium)によって市販されている、これらのコンスト
ラクトは、ラクダ科動物(例えば、ラクダまたはラマ)抗体に由来する合成単一免疫グロ
ブリン可変重鎖ドメインを含む)ならびにドメイン抗体(Domantis(Belgi
um)、親和性が成熟した単一の免疫グロブリン可変重鎖ドメインまたは免疫グロブリン
可変軽鎖ドメインを含む)または抗体様結合特性を示す代替のタンパク質足場、ほんの少
し例を挙げれば、Affibodies(Affibody(Sweden)、改変され
たプロテインA足場を含む)またはAnticalins(Pieris(German
)、改変されたアンチカリンを含む)などが含まれる。
いくつかの目的のために、本発明のTCRは、数種類のTCRを含む複合体に凝集され
て多価TCR複合体を形成していてもよい。多価TCR複合体の生成において使用されう
る、多量体化ドメインを含むいくつかのヒトタンパク質がある。例えば、p53の四量体
化ドメイン、これは、単量体scFv断片と比較して、血清残留性の上昇および解離速度
の顕著な低下を示す、scFv抗体断片の四量体を生成するために利用されてきた(Wi
lluda et al.(2001)J.Biol.Chem.276(17)143
85−14392)。ヘモグロビンも、この種類の適用に潜在的に使用されうる四量体化
ドメインを有する。本発明の多価TCR複合体は、多量体でない野生型または本発明のT
細胞受容体ヘテロ二量体と比較して、GLYDGMEHL HLA−A2複合体に対する
増強された結合能力を有しうる。したがって、本発明のTCRの多価複合体も本発明の範
囲内に含まれる。本発明によるこうした多価TCR複合体は、in vitroまたはi
n vivoで特定の抗原を提示している細胞をトラッキングまたはターゲティングする
のに特に有用であり、こうした使用を有するさらなる多価TCR複合体の生成のための中
間体としても有用である。
当技術分野においてよく知られているように、TCRには、翻訳後修飾が行われうる。
グリコシル化は、1つのこうした修飾であり、これは、TCR鎖における定められたアミ
ノ酸に対するオリゴ糖部分の共有結合的付加を含む。例えば、アスパラギン残基、または
セリン/スレオニン残基は、よく知られているオリゴ糖付加のための部位である。特定の
タンパク質のグリコシル化状態は、タンパク質配列、タンパク質高次構造および特定の酵
素の有用性を含む、いくつかの要因に依存する。さらに、グリコシル化状態(すなわち、
オリゴ糖型、共有結合および付加の総数)は、タンパク質機能に影響しうる。したがって
、組換えタンパク質を製造するとき、グリコシル化を制御するのが望ましいことが多い。
制御されたグリコシル化は、抗体に基づいた療法を改良するために使用されてきた。(J
efferis R.,Nat Rev Drug Discov.2009 Mar;
8(3):226−34.)。本発明の可溶性TCRに対して、グリコシル化は、in
vivoで、例えば、特定の細胞株を使用することによって、またはin vitroで
、化学修飾によって、制御されてもよい。グリコシル化は、薬物動態を改良すること、免
疫原性を低下させること、および天然のヒトタンパク質をより近く模倣することができる
ので、こうした修飾は望ましい(Sinclair AM and Elliott S
.,Pharm Sci.2005 Aug;94(8):1626−35)。
患者への投与のために、(通常、検出可能な標識または治療剤と結合された)本発明の
TCR、核酸および/または細胞は、薬学的に許容される担体または添加剤と一緒に医薬
組成物中で提供されてもよい。本発明による治療用またはイメージング用TCRは、通常
、薬学的に許容される担体を通常は含むであろう無菌の医薬組成物の部分として供給され
ることになる。この医薬組成物は、(患者にそれを投与する望ましい方法に依存して)い
かなる好適な形態であってもよい。それは、単位剤形で提供されてもよく、一般には密封
された容器内で提供されることになり、キットの部分として提供されてもよい。こうした
キットには、通常は(必ずではないが)、使用のための説明書が含まれるはずである。そ
れは、複数の前記単位剤形を含んでいてもよい。
医薬組成物は、任意の適切な経路、好ましくは、非経口(皮下、筋肉内、または好まし
くは静脈内を含む)経路による投与用に構成されていてもよい。こうした組成物は、製薬
の分野において知られている任意の方法によって、例えば、無菌条件下で活性成分を担体
または添加剤と混合することによって調製されうる。
本発明の物質の用量は、治療される疾患または障害、治療される個体の年齢および状態
などによって広い範囲の間で変化しえ、医師が、使用される適切な用量を最終的に決定す
ることになる。
本発明のTCR、医薬組成物、ベクター、核酸および細胞は、実質的に純粋な形態で、
例えば、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、
少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくと
も96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%純粋
で、提供されてもよい。
本発明によってさらに提供されるのは、以下である:
・ 医学における使用のための、好ましくは、がん、例えば、固形腫瘍(例えば、肺、
肝臓および胃の転移巣)および/または扁平上皮癌などを治療する方法における使用のた
めの、本発明のTCR、核酸または細胞。
・ がんを治療するための医薬品の製造における本発明のTCR、核酸または細胞の使
用。
・ 患者に本発明のTCR、核酸または細胞を投与することを含む、患者においてがん
を治療する方法。
本発明のそれぞれの態様の好ましい特徴は、必要な変更を加えて他の態様のそれぞれに
ついてのものと同様である。本明細書において言及されている従来技術文献は、法律によ
って許可される最大限の範囲まで組み込まれている。
本発明は、以下の非限定的な実施例においてさらに記載される。以下の通りである添付
の図面が参照される。
親MAGE−10特異的TCRのアルファ鎖の細胞外部分のアミノ酸配列(配列番号2)を示す図である。 親MAGE−A10特異的TCRベータ鎖アミノ酸配列のベータ鎖の細胞外部分のアミノ酸配列(配列番号3)を示す図である。 (本明細書において「参照TCRと称される)可溶性TCRのアルファ鎖のアミノ酸配列(配列番号4)を示す図である。配列は、配列番号1のT162(すなわち、TRAC定常領域のT48)にシステイン(太字かつ下線付き)が置換されることを除いて図1のものと同じである。 (本明細書において「参照TCRと称される)可溶性TCRのベータ鎖のアミノ酸配列(配列番号5)を示す図である。配列は、S169(すなわち、TRBC2定常領域のS57)にシステイン(太字かつ下線付き)が置換され、C187にA187が置換され、N201にD201が置換されることを除いて図2のものと同じである。 本発明のTCR内に存在しうるアルファ鎖のそれぞれのアミノ酸配列(配列番号6および7)を示す図である。CDR領域を形成している部分配列、またはCDR領域の実質的な部分は、下線付きである。 本発明のTCR内に存在しうるベータ鎖のそれぞれのアミノ酸配列(配列番号8、9、10および11)を示す図である。CDR領域を形成している部分配列、またはCDR領域の実質的な部分は下線付きである。 本発明のTCR内に存在しうるアルファ鎖のそれぞれのアミノ酸配列(配列番号12および13)を示す図である。図3に示されている配列に対して相対的に、導入されたシステインは、太字かつ下線付きで示されている。 本発明のTCR内に存在しうるベータ鎖のそれぞれのアミノ酸配列(配列番号14および15)を示す図である。図4に示されている配列に対して相対的に、導入されたシステインは、太字かつ下線付きで示されている。さらに図4に対して相対的に、これらのベータ鎖を有するあらゆるアルファ−ベータTCR内の不対のシステインを除くために、C187がA187に変異されている。 親MAGE A10 TCR遺伝子(ブタのテッショウウイルス−1の2A配列を有するアルファ鎖−2A−ベータ鎖コンストラクト)についてのDNA配列を示す図(配列番号18)である。 図7のDNA配列から産生される、T細胞形質導入のための親MAGE A10 TCRのアミノ酸配列を示す図(配列番号19)である。ブタのテッショウウイルス−1の2A配列は、太字かつ下線付きである。 本発明によるT細胞の活性化の結果を示しているグラフである。
[実施例1]
pGMT7に基づく発現プラスミド内への参照MAGE−A10 TCRアルファ鎖およ
びベータ鎖可変領域配列のクローニング
それぞれ配列番号2および3の親MAGE−A10 TCR可変アルファドメインおよ
びTCR可変ベータドメインは、CαまたはCβのいずれかを含むpGMT7に基づく発
現プラスミド内に、(SambrookおよびRussellによるMolecular
Cloning a Laboratory Manual Third editi
on)に記載されている標準的な方法によってクローニングされた。プラスミドは、Ap
plied Biosystems 3730xl DNA Analyzerを使用し
てシークエンスされた。それぞれ配列番号4および5の参照MAGE−A10 TCR可
変アルファドメインおよびTCR可変ベータドメインは、同様の方法でクローニングされ
た。
TCRアルファ鎖可変領域をコードするDNA配列は、Nde1およびXho1で切断
された、pEX956内にライゲーションされた。TCRベータ鎖可変領域をコードする
DNA配列は、同じくNde1およびXho1で切断された、pEXb21内にライゲー
ションされた。
ライゲーションされたプラスミドは、コンピテントな大腸菌(E.coli)株XL1
−blue細胞内に形質転換され、100μg/mLのアンピシリンを含むLB/寒天プ
レート上に播種された。37℃で一晩インキュベーション後、単一コロニーが採取され、
100μg/mLのアンピシリンを含む5mLのLB中で37℃で振盪しながら一晩培養
された。クローニングされたプラスミドは、Miniprepキット(Qiagen)を
使用して精製され、プラスミドは、Applied Biosystems 3730x
l DNA Analyzerを使用してシークエンスされた。
[実施例2]
可溶性参照MAGE−A10 TCRの発現、リフォールディングおよび精製
実施例1において調製されるような、参照TCRα鎖およびβ鎖をそれぞれ含む発現プ
ラスミドが大腸菌株BL21pLysS内に別々に形質転換され、単一のアンピシリン耐
性コロニーがTYP(アンピシリン100μg/ml)培地中で37℃で約0.6〜0.
8のOD600まで培養された後に、0.5mMのIPTGでタンパク質発現が誘発され
た。細胞は、導入3時間後に、Beckman J−6B内で4000rpmで30分間
の遠心分離によって回収された。細胞ペレットは、MgClおよびDNアーゼIの存在
下で25mlのBug Buster(NovaGen)で溶解された。封入体ペレット
は、Beckman J2−21遠心分離機内で13000rpmで30分間の遠心分離
によって回収された。次いで、3回の界面活性剤での洗浄が行われて細胞デブリおよび膜
成分が除去された。封入体ペレットは、毎回、Tritonバッファー(50mM Tr
is−HCI pH8.0、0.5% Triton−X100、200mM NaCl
、10mM NaEDTA)中でホモジナイズされた後に、Beckman J2−21
内で13000rpmで15分間の遠心分離によってペレット化された。次いで、以下の
バッファー:50mM Tris−HCl pH8.0、1mM NaEDTA中での同
様の洗浄によって界面活性剤および塩が除去された。最終的に、封入体は、30mgの一
定分量に小分けされて−70℃で凍結された。封入体タンパク質の収量は、6Mのグアニ
ジン−HClで可溶化することによって定量化され、OD測定は、日立U−2001分光
光度計上で行われた。次いで、吸光係数を使用してタンパク質濃度が算出された。
約15mgのTCRα鎖および15mgのTCRβ鎖の可溶化封入体が凍結ストックか
ら解凍され、確実に完全に鎖変性するように、10mlのグアニジン溶液(6M 塩酸グ
アニジン、50mM Tris HCl pH8.1、100mM NaCl、10mM
EDTA、10mM DTT)中に希釈された。完全に還元および変性されたTCR鎖
を含むグアニジン溶液は、次いで、0.5リットルの以下のリフォールディングバッファ
ー:100mM Tris pH8.1、400mM L−アルギニン、2mM EDT
A、5M 尿素中に注入された。酸化還元対(システアミン塩酸塩およびシスタミン二塩
酸塩)がそれぞれ6.6mMおよび3.7mMの最終濃度まで添加され、約5分後に、変
性されたTCR鎖が添加された。溶液は、約30分間放置された。リフォールディングさ
れたTCRは、Spectrapor1メンブレン(Spectrum;製品番号132
670)において10LのHOに対して18〜20時間透析された。この時間の後に、
透析バッファーは、新しい10mM Tris pH8.1(10L)に2回交換され、
透析は、5℃±3℃でさらに約8時間継続された。
可溶性TCRは、透析されたリフォールディング物をPOROS 50HQ陰イオン交
換カラム上にロードすることによっておよび結合したタンパク質をAkta精製装置(G
E Healthcare)を使用して50カラム容量を超える10mMのTris p
H8.1中の0〜500mMのNaClの勾配で溶出することによって分解産物および夾
雑物から分離された。ピーク画分がプールされ、プロテアーゼ阻害剤のカクテル(Cal
biochem)が添加された。プールされた画分は、次いで、4℃で保存され、クマシ
ーで染色されたSDS−PAGEによって解析された後にプールおよび濃縮された。最終
的に、可溶性TCRは、PBSバッファー(Sigma)中で予め平衡化されたGE H
ealthcare Superdex 75HRゲル濾過カラムを使用して精製および
特性評価された。約50kDaの相対分子量で溶出していたピークがプールされ、BIA
core表面プラズモン共鳴解析による特性評価の前に濃縮された。
[実施例3]
結合特性評価
BIAcore解析
表面プラズモン共鳴バイオセンサー(BIAcore 3000(商標))は、可溶性
TCRの、そのペプチド−MHCリガンドに対する結合を解析するために使用されうる。
これは、ストレプトアビジンでコーティングされた結合表面(センサーチップ)に固定さ
れうる可溶性ビオチン化ペプチド−HLA(「pHLA」)複合体を作製することによっ
て容易になる。センサーチップは、異なる4種のpHLA複合体に対するT細胞受容体の
結合を同時に測定することを可能にする4つの個別のフローセルを含む。pHLA複合体
の手動注入により、固定されたクラスI分子の正確なレベルを容易に操作することが可能
となる。
ビオチン化されたクラスIのHLA−A02分子は、構成サブユニットタンパク質お
よび合成ペプチドを含む、細菌で発現された封入体からin vitroでリフォールデ
ィングされ、その後、精製されて、in vitroで酵素によりビオチン化された(O
’Callaghan et al.(1999)Anal.Biochem.266:
9−15)。HLA−A02重鎖は、適切なコンストラクトにおいてタンパク質の膜貫
通ドメインおよび細胞質ドメインを置き換えるC末端ビオチン化タグ付きで発現された。
1リットルの細菌培養液あたり約75mgの封入体発現レベルが得られた。MHC軽鎖ま
たはβ2−ミクログロブリンも、適切なコンストラクトから大腸菌における封入体として
、1リットルの細菌培養液あたり約500mgのレベルで発現された。
大腸菌細胞は溶解され、封入体は約80%の純度まで精製された。封入体からのタンパ
ク質は、6M グアニジン−HCl、50mM Tris pH8.1、100mM N
aCl、10mM DTT、10mM EDTA中で変性され、0.4M L−アルギニ
ン、100mM Tris pH8.1、3.7mM シスタミン二塩酸塩、6.6mM
システアミン塩酸塩、HLA−A01分子によるロードが必要とされる4mg/Lの
MAGE−3 EVDPIGHLYペプチド中に30mg/リットル 重鎖、30mg/
リットル β2mの濃度で、変性タンパク質の単一パルスを<5℃のリフォールディング
バッファー中に添加することによってリフォールディングされた。リフォールディングは
、4℃で少なくとも1時間で完了に到達することが可能にされた。
バッファーは、10容量の10mMのTris pH8.1中での透析によって交換さ
れた。バッファーの2回の交換は、溶液のイオン強度を十分に低下させるために必要とさ
れた。次いで、タンパク質溶液は、1.5μmのセルロースアセテートフィルターを通し
て濾過され、POROS 50HQ陰イオン交換カラム(8mlのベッド容量)上にロー
ドされた。タンパク質は、Akta精製装置(GE Healthcare)を使用して
10mMのTris pH8.1中の直線的な0〜500mMのNaCl勾配で溶出され
た。HLA−A02−ペプチド複合体は、約250mMのNaClで溶出され、ピーク
画分が収集されて、プロテアーゼ阻害剤のカクテル(Calbiochem)が添加され
、それらの画分が氷上で冷却された。
ビオチンタグ付きpHLA分子は、10mM Tris pH8.1、5mM NaC
l中で平衡化されたGE Healthcareの高速脱塩カラムを使用して、同バッフ
ァー中にバッファー交換された。溶出されるとすぐに、タンパク質含有分画は氷上で冷却
され、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Calbiochem)が添加された。次いで、ビ
オチン化試薬:1mM ビオチン、5mM ATP(pH8に緩衝された)、7.5mM
MgCl、および5μg/ml BirA酵素(O’Callaghan et a
l.(1999)Anal.Biochem.266:9−15に従って精製された)が
添加された。次いで、この混合物は、室温で一晩インキュベート可能にされた。
ビオチン化されたpHLA−A02分子は、ゲル濾過クロマトグラフィーを使用して
精製された。GE Healthcare Superdex 75HR 10/30カ
ラムは、濾過されたPBSで予め平衡化されて1mlのビオチン化反応混合物がロードさ
れ、そのカラムは、Akta精製装置(GE Healthcare)を使用してPBS
を用いて0.5ml/分で展開された。ビオチン化されたpHLA−A02分子は、約
15mlで単一のピークとして溶出された。タンパク質を含む画分は、プールされて、氷
上で冷却され、プロテアーゼ阻害剤カクテルが添加された。タンパク質濃度は、クマシー
結合アッセイ(PerBio)を使用して決定され、ビオチン化されたpHLA−A
1分子の一定分量は、−20℃で凍結保存された。
こうした固定された複合体は、T細胞受容体および補助受容体CD8ααの両方を結合
することができ、その両方が可溶相に注入されうる。可溶性TCRのpHLA結合特性は
、TCRが可溶相または固定相のいずれかにおいて使用される場合、質的にも量的にも類
似していることが認められる。これは、可溶種の部分活性についての重要な対照であり、
ビオチン化pHLA複合体が生物学的に非ビオチン化複合体と同じくらい活性であること
も示唆する。
BIAcore 3000(商標)表面プラズモン共鳴(SPR)バイオセンサーは、
小さなフローセル内のセンサー表面付近のレスポンスユニット(RU)で表される屈折率
における変化を測定し、受容体リガンド相互作用を検出するためおよびそれらの親和性お
よび動態パラメーターを解析するために使用されうる原理である。BIAcore実験は
、25℃の温度で、ランニングバッファーとしてPBSバッファー(Sigma、pH7
.1〜7.5)を使用し、タンパク質試料の希釈物を調製して行われた。ストレプトアビ
ジンは、標準的なアミンカップリング法によってフローセルに固定された。pHLA複合
体は、ビオチンタグを介して固定された。次いで、異なるフローセルの表面上を一定流速
で通過する可溶性TCRによってアッセイが行われ、その際のSPRレスポンスが測定さ
れた。
平衡結合定数
平衡結合定数を決定するために、上記のBIAcore解析法が使用された。ジスルフ
ィドで連結された可溶性ヘテロ二量体形態の参照MAGE−A10 TCRの段階希釈物
が調製され、1つめは約1000RUの特異的なGLYDGMEHL HLA−A02
複合体でコーティングされ、2つめは約1000RUの非特異的な複合体でコーティング
された、2つの異なるフローセル上に毎分5μlの一定流速で注入された。レスポンスは
、対照細胞からの測定値を使用して各濃度について標準化された。標準化されたデータレ
スポンスは、TCR試料の濃度に対してプロットされ、平衡結合定数Kを算出するため
に非線形曲線適合モデルに適合された。(Price&Dwek,Principles
and Problems in Physical Chemistry for
Biochemists(2nd Edition)1979,Clarendon P
ress,Oxford)。ジスルフィドで連結された可溶型の参照MAGE−10 T
CR(実施例2)は、約2.00μMのKを示した。同じBIAcoreデータより、
1/2は約0.95秒であった。
動態パラメーター
上記のBIAcore解析法は、平衡結合定数および解離速度を決定するためにも使用
された。
高親和性TCR(下記の実施例4を参照されたい)のために、Kは、解離速度定数、
off、および結合速度定数、konを実験的に測定することによって決定された。平
衡定数Kは、koff/konとして算出された。
1つめは約1000RUの特異的なGLYDGMEHL HLA−A02複合体でコ
ーティングされ、2つめは約1000RUの非特異的な複合体でコーティングされた2つ
の異なるセルにTCRが注入された。流速は、50μl/分に設定された。典型的には、
約1μMの濃度の250μlのTCRが注入された。次いで、レスポンスがベースライン
に戻るまでまたは>2時間が経過するまでバッファーが流された。動態パラメーターは、
BIAevaluationソフトウェアを使用して算出された。解離相は、半減期の算
出を可能にする単一指数関数的減衰方程式に適合された。
[実施例4]
本発明の高親和性TCRの調製
TCRα鎖およびβ鎖をそれぞれ含む発現プラスミドは、実施例1におけるように調製
された:
プラスミドが大腸菌株BL21pLysS内に別々に形質転換され、単一のアンピシリ
ン耐性コロニーがTYP(アンピシリン100μg/ml)培地中で37℃で約0.6〜
0.8のOD600まで培養された後に、0.5mMのIPTGでタンパク質発現が誘発
された。細胞は、導入3時間後に、Beckman J−6B内で4000rpmで30
分間の遠心分離によって回収された。細胞ペレットは、MgClおよびDNアーゼIの
存在下で25mlのBug Buster(Novagen)で溶解された。封入体ペレ
ットは、Beckman J2−21遠心分離機内で13000rpmで30分間の遠心
分離によって回収された。次いで、3回の界面活性剤での洗浄が行われて細胞デブリおよ
び膜成分が除去された。封入体ペレットは、毎回、Tritonバッファー(50mM
Tris−HCI pH8.0、0.5% Triton−X100、200mM Na
Cl、10mM NaEDTA)中でホモジナイズされた後に、Beckman J2−
21内で13000rpmで15分間の遠心分離によってペレット化された。次いで、以
下のバッファー:50mM Tris−HCl pH8.0、1mM NaEDTA中で
の同様の洗浄によって界面活性剤および塩が除去された。最終的に、封入体は、30mg
の一定分量に小分けされて−70℃で凍結された。封入体タンパク質の収量は、6Mのグ
アニジン−HClで可溶化することによって定量化され、OD測定は、日立U−2001
分光光度計上で行われた。次いで、吸光係数を使用してタンパク質濃度が算出された。
確実に完全に鎖変性するように、本発明の各TCRのための約10mgのTCRα鎖お
よび10mgのTCRβ鎖の可溶化封入体は、10mlのグアニジン溶液(6M 塩酸グ
アニジン、50mM Tris HCl pH8.1、100mM NaCl、10mM
EDTA、10mM DTT)中に希釈された。完全に還元および変性されたTCR鎖
を含むグアニジン溶液は、次いで、0.5リットルの以下のリフォールディングバッファ
ー:100mM Tris pH8.1、400mM L−アルギニン、2mM EDT
A、5M 尿素中に注入された。酸化還元対(システアミン塩酸塩およびシスタミン二塩
酸塩)がそれぞれ6.6mMおよび3.7mMの最終濃度まで添加され、約5分後に、変
性されたTCR鎖が添加された。溶液は、約30分間放置された。リフォールディングさ
れたTCRは、Spectrapor1メンブレン(Spectrum;製品番号132
670)において10LのHOに対して18〜20時間透析された。この時間の後に、
透析バッファーは、新しい10mM Tris pH8.1(10L)に2回交換され、
透析は、5℃±3℃でさらに約8時間継続された。
可溶性TCRは、透析されたリフォールディング物をPOROS 50HQ陰イオン交
換カラム上にロードすることによっておよび結合したタンパク質をAkta精製装置(G
E Healthcare)を使用して15カラム容量を超える10mMのTris p
H8.1中の0〜500mMのNaClの勾配で溶出することによって分解産物および夾
雑物から分離された。プールされた画分は、次いで、4℃で保存され、クマシーで染色さ
れたSDS−PAGEによって解析された後にプールおよび濃縮された。最終的に、可溶
性TCRは、PBSバッファー(Sigma)中で予め平衡化されたGE Health
care Superdex 75HRゲル濾過カラムを使用して精製および特性評価さ
れた。約50kDaの相対分子量で溶出していたピークがプールされ、BIAcore表
面プラズモン共鳴解析による特性評価の前に濃縮された。
MAGE−A10エピトープに対するこうして調製されたTCRの親和性プロファイル
は、実施例3の方法を使用して評価され、参照TCRと比較された。結果は、以下の表に
記載されている:
[実施例5]
親MAGE−A10 TCRおよびバリアントMAGE−A10 TCRでのT細胞のト
ランスフェクション
(a)Express−Inを介した293T細胞の一過的トランスフェクションによる
レンチウイルスベクター調製
望ましいTCRをコードする遺伝子を含むレンチウイルスベクターをパッケージングす
るために、第3世代レンチウイルスパッケージングシステムが使用された。Expres
s−Inを介したトランスフェクション(Open Biosystems)を使用して
、293T細胞は、4種のプラスミド(実施例5c(以下)に記載のTCRアルファ鎖−
P2A−TCRベータ鎖単一ORF遺伝子を含む1種のレンチウイルスベクター、および
感染性であるが複製不可能なレンチウイルス粒子を構築するために必要な他の構成要素を
含む3種のプラスミド)でトランスフェクトされた。
トランスフェクションのために、指数関数的な増殖期にある293T細胞の1つのT1
50フラスコが回収され、細胞は、プレート上に均一に分散され、わずかに50%を超え
るコンフルエントであった。Express−Inの一定分量は、室温にされた。3mL
の無血清培地(RPMI1640+10mM HEPES)が無菌の15mlのコニカル
チューブ内に入れられた。174μlのExpress−In試薬が無血清培地中に直接
に添加された(これは、3.6:1の試薬対DNAの重量比を実現する)。これは、3〜
4回チューブを逆さにすることによって完全に混合されて、室温で5〜20分間インキュ
ベートされた。
別の1.5mlのマイクロチューブ内で、予め混合されたパッケージング混合物一定分
量(18μgのpRSV.REV(Rev発現プラスミド)、18μgのpMDLg/p
.RRE(Gag/Pol発現プラスミド)、7μgのpVSV−G(VSV糖タンパク
質発現プラスミド)を含む、通常約22μl)に15μgのプラスミドDNAが添加され
、DNA混合物を確実に均一にさせるために上および下にピペッティングされた。このD
NA混合物に約1mLのExpress−In/無血清培地が滴下で添加され、次いで、
上および下に穏やかにピペッティングされた後に、残りのExpress−In/無血清
培地に移し戻された。チューブは、3〜4回逆さにされて、室温で15〜30分間インキ
ュベートされた。細胞のフラスコから古い培地が除去された。293T細胞の直立型フラ
スコの底にExpress−In/培地/DNA(3mL)複合体が直接に添加された。
ゆっくりと、フラスコは、細胞を覆うように平らに置かれ、確実に分散するようにきわめ
て穏やかに揺動された。1分後、22mlの新しい培地(R10+HEPES:RPMI
1640、熱失活された10%FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン/L−グル
タミン、10mM HEPES)が添加され、フラスコは、インキュベーターに注意深く
戻された。これは、37℃/5%COで一晩インキュベートされた。24時間後、パッ
ケージングされたレンチウイルスベクターを含む培地が回収された。
パッケージングされたレンチウイルスベクターを回収するために、細胞培養液上清は、
0.45ミクロンのナイロンシリンジフィルターを通して濾過され、培養液は、10,0
00gで18時間(または112,000gで2時間)遠心分離され、(ペレットを乱さ
ないように注意しながら)上清の大部分が除去され、残りの数mL(チューブあたり31
mlの開始容量から、通常、約2ml)の上清中にペレットが再懸濁された。これは、1
mlずつの一定分量でドライアイス上でスナップ凍結され、−80℃で保存された。
(b)目的の遺伝子を含むパッケージングされたレンチウイルスベクターでのT細胞の形
質導入
パッケージングされたレンチウイルスベクターでの形質導入前に、健常な志願者の血液
からヒトT細胞(CD8もしくはCD4または必要条件によっては両方)が単離された。
これらの細胞は、計数され、48ウェルプレート内で、50U/mLのIL−2を含むR
10中、1mlあたり1×10細胞(0.5mL/ウェル)で、1細胞あたり3個のビ
ーズの比率で、予め洗浄された抗CD3/CD28抗体コーティング付きマイクロビーズ
(Dynabeads(登録商標)T cell expander、Invitrog
en)と共に一晩インキュベートされた。
一晩の刺激後、0.5mlの無希釈のパッケージングされたレンチウイルスベクターが
、望ましい細胞に添加された。これは、37℃/5%COで3日間インキュベートされ
た。形質導入3日後、細胞は、計数され、0.5×10細胞/mlまで希釈された。I
L−2を含む新しい培地が必要に応じて添加された。ビーズは、形質導入5〜7日後に除
去された。2日間隔で、細胞が計数され、IL−2を含む新しい培地が交換または添加さ
れた。細胞は、0.5×10細胞/mLおよび1×10細胞/mLの間で維持された
。細胞は、3日目からフローサイトメトリーによって解析され、5日目から機能アッセイ
(例えば、IFNγ放出についてのELISpot、実施例6を参照されたい)に使用さ
れた。10日目から、または細胞が分裂を遅延させ、大きさが減少したときに、細胞は、
保存のために(90%FBS/10%DMSO中に1×10細胞/mlで)少なくとも
4×10細胞/バイアルの一定分量で凍結される。
(c)上記の方法(a)および(b)による、T細胞トランスフェクション用の親TCR
遺伝子
図7は、(最も高いヒト細胞発現のためにコドンが最適化された)親MAGE A10
TCRをコードするDNA配列(配列番号18)である。それは、完全長アルファ鎖−
ブタのテッショウウイルス−1の2A−完全長ベータ鎖の単一オープンリーディングフレ
ームコンストラクトである。2A配列は、下線付きであり、2A配列のタンパク質分解除
去を補助するためのフューリン切断部位をコードするヌクレオチドが前にある(以下に図
8(配列番号19)に関してさらに述べられている。mRNAのタンパク質翻訳中の2A
配列の3’末端におけるペプチド結合スキッピングにより、2種のタンパク質:1)アル
ファTCR鎖−2A融合体、2)ベータTCR鎖が産生される。
図8は、図7に対応しているアミノ酸配列(配列番号19)である。図8において:
・ M1〜Q22は、親アルファ鎖TCRの成熟において除去されるリーダー配列であ
る;
・ Q23〜S274は、親アルファ鎖配列に相当する;
・ Q23〜N247は、親アルファ鎖細胞外ドメインに相当する;
・ L248〜T268は、成熟TCRのアルファ鎖膜貫通領域である;
・ L269〜S274は、成熟TCRのアルファ鎖細胞内領域である;
・ R277〜R280は、ゴルジ装置における、P2A配列A285〜P303のタ
ンパク質分解除去を補助するためのフューリン切断部位である;
・ G275、S276、S281からG284は、フューリン切断およびP2A配列
の完全な機能を可能にするフレキシブルリンカーである;
・ R304〜V323は、親ベータ鎖TCRの成熟において除去されるリーダー配列
である;
・ N324〜G612は、親ベータ鎖配列に相当する;
・ N324〜E583は、親ベータ鎖細胞外ドメインに相当する;
・ I584〜V605は、成熟TCRのベータ鎖膜貫通領域である;
・ K606〜G612は、成熟TCRのベータ鎖細胞内領域である。
(d)親MAGE−A10 TCRおよび高親和性MAGE−A10 TCRでトランス
フェクトされたT細胞
上記の(a)および(b)に記載されている手順に従って、両方のDNAコンストラク
トに固有のNheIおよびSalI制限部位を使用して、親MAGE A10アルファ−
2A−ベータTCR遺伝子(配列番号18(図7))がpELNSxvレンチベクター内
に挿入され、トランスフェクトT細胞が作製された。
同様に、T細胞は、配列番号2、6または7のうちの1つを有するアルファ鎖可変ドメ
インをコードし、ベータ鎖可変ドメイン配列番号3、8、9、10または11をコードす
る配列と結合された配列を含む遺伝子でのトランスフェクションによって作製されてもよ
い。
[実施例6]
MAGE A10 TCR改変T細胞の活性化
腫瘍細胞株に応答した、TCR形質導入した細胞傷害性Tリンパ球(CTL)の活性化
を実証するために、以下のアッセイを行った。ELISPOTアッセイを使用して測定さ
れるような、IFN−γ産生を、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)活性化についての読み
出しとして使用した。
ELISPOT
試薬
アッセイ培地: 10%FCS(Gibco、カタログ番号2011−09)、88%R
PMI1640(Gibco、カタログ番号42401)、1%グルタミン(Gibco
カタログ番号25030)および1%ペニシリン/ストレプトマイシン(Gibcoカタ
ログ番号15070−063)。
洗浄バッファー:0.01M PBS/0.05%Tween 20
PBS(Gibcoカタログ番号10010)
関連したAEC基質セット(BD Bioscience、カタログ番号551951)
と共に、捕捉抗体および検出抗体ならびにヒトIFN−γ PVDF ELISPOT
96ウェルプレートを含むヒトIFNγ ELISPOTキット(BD Bioscie
nce;カタログ番号551849)
方法
標的細胞の調製
この方法において使用される標的細胞は、天然のエピトープ提示細胞:両方HLA−A
MAGE A10であるA375ヒト黒色腫細胞であった。HLA−A2
AGE A10である、HCT116ヒト結腸がんは、陰性対照として使用された。十
分な標的細胞(50,000細胞/ウェル)は、Megafuge(登録商標)1.0(
Heraeus)内で1200rpmで10分の遠心分離3回によって洗浄された。細胞
は、次いで、アッセイ培地中に10細胞/mlで再懸濁された。
エフェクター細胞調製
この方法において使用されるエフェクター細胞(T細胞)は、CD14およびCD25
マイクロビーズキット(それぞれMiltenyi Biotechカタログ番号130
−050−201および130−092−983)を使用して、健常な志願者の静脈血か
ら新たに単離された末梢血単核細胞(PBMC)から負の選択によって得られた、末梢血
リンパ球(PBL)であった。細胞は、抗CD3/CD28コーティング付きビーズ(D
ynabeads(登録商標)T cell expander、Invitrogen
)で刺激され、(実施例5に記載のコンストラクトに基づいた)目的の全αβTCRをコ
ードする遺伝子を運ぶレンチウイルスで形質導入され、50U/mLのIL−2を含むア
ッセイ培地中で形質導入10日後および13日後の間まで増殖した。これらの細胞は、次
いで、アッセイ培地中に入れられた後に、Megafuge(登録商標)1.0(Her
aeus)内で1200rpmで10分の遠心分離によって洗浄された。細胞は、次いで
、4×最終的に必要とされる濃度でアッセイ培地中に再懸濁された。
プレートは、以下のように調製された:100μLの抗IFN−γ捕捉抗体は、1プレ
ートあたり10mlの無菌PBS中に希釈された。次いで、各ウェル内に100μLの希
釈された捕捉抗体が分注された。プレートは、次いで、4℃で一晩インキュベートされた
。インキュベーション後、プレートは、洗浄(プログラム1、プレート型2、Ultra
wash Plus 96ウェルプレート洗浄機;Dynex)されて捕捉抗体が除去さ
れた。プレートは、次いで、各ウェルに200μLのアッセイ培地を添加することによっ
てブロッキングされ、室温で2時間インキュベートされた。アッセイ培地は、次いで、プ
レートから洗浄され(プログラム1、プレート型2、Ultrawash Plus 9
6ウェルプレート洗浄機、Dynex)、残りのすべての培地は、ELISPOTプレー
トをペーパータオル上で軽く振り払うことおよび軽く叩くことによって除去された。
次いで、以下の順序でアッセイの成分がELISPOTプレートに添加された:
50μLの標的細胞10細胞/ml(合計50,000個の標的細胞/ウェルにする

50μL 培地(アッセイ培地)
50μL エフェクター細胞(20,000個のTCR形質導入PBL細胞/ウェル)
プレートは、次いで、一晩インキュベートされた(37℃/5%CO)。翌日、プレ
ートは、洗浄バッファーで3回洗浄され(プログラム1、プレート型2、Ultrawa
sh Plus 96ウェルプレート洗浄機、Dynex)、ペーパータオル上で軽く叩
かれて乾燥されて余分な洗浄バッファーが除去された。100μlの一次検出抗体は、次
いで、各ウェルに添加された。一次検出抗体は、製造業者の説明書に明記された希釈を使
用して、10mLの希釈バッファー(単一のプレートに必要とされる容量)中に希釈され
た。プレートは、次いで、室温で少なくとも2時間インキュベートされた後に洗浄バッフ
ァーで3回洗浄された(プログラム1、プレート型2、Ultrawash Plus
96ウェルプレート洗浄機、Dynex);余分な洗浄バッファーは、プレートをペーパ
ータオル上で軽く叩くことによって除去された。
二次検出は、各ウェルに100μLの希釈されたストレプトアビジン−HRPを添加し
てプレートを室温で1時間インキュベートすることによって行われた。ストレプトアビジ
ン−HRPは、製造業者の説明書に明記された希釈を使用して、10mLの希釈バッファ
ー(単一のプレートに必要とされる容量)中に希釈された。プレートは、次いで、洗浄バ
ッファーで3回洗浄され(プログラム1、プレート型2、Ultrawash Plus
96ウェルプレート洗浄機、Dynex)、ペーパータオル上で軽く叩かれて余分な洗
浄バッファーが除去された。プレートは、次いで、PBSで各ウェルに200μLを添加
することによって2回洗浄され、バッファーが軽く振り出され、ペーパータオル上で軽く
叩かれて余分なバッファーが除去された。使用前15分以内に、1滴(20uL)のAE
C色素原が各1mlのAEC基質に添加されて混合された。各プレートについて10ml
のこの溶液が調製された;1ウェルあたり100μLが添加された。プレートは、次いで
、ホイルを使用して光から保護され、通常、5〜20分以内に生じる、スポット発色が定
期的にモニターされる。プレートは、発色反応を終了させるために水道水中で洗浄され、
それらが3つの成分に分解される前に振盪乾燥された。プレートは、次いで、室温で少な
くとも2時間乾燥可能にされた後に、Immunospot(登録商標)プレートリーダ
ー(CTL;Cellular Technology Limited)を使用してス
ポットが計数された。
結果
多様なAFP陽性および対照の腫瘍細胞株に応答した、活性化されたTCR形質導入T
細胞によるIFNγ放出は、(上記のように)ELISPOTアッセイによって試験され
た。各ウェル内で観察されるELISPOTスポットの数は、Graph Pad Pr
ism(登録商標)を使用してプロットされた。
TCR番号1〜8のうちの1種を発現しているCD4+、CD8+または混合されたC
D4+/CD8+のT細胞は、MAGE A10+ HLA:A2+腫瘍細胞株A375
と共にまたはMAGE A10+ HLA:A2+ HCT116腫瘍細胞株と共にイン
キュベートされた。T細胞を含んでいない試料および形質導入されていないT細胞の試料
は、対照として使用された。
図9は、上記の表に記載のTCRで形質導入されたT細胞が、MAGE A10陽性腫
瘍細胞に応答して活性化されることを示している。正常肝細胞(HCT116)は、MA
GE A10陰性であり、MAGE A10 TCRで形質導入されたT細胞の活性化を
誘導しない。したがって、本発明のMAGE A10 TCRは、MAGE A10提示
細胞を選択的に認識する。
[実施例7]
すべての代替アミノ酸での置換による結合モチーフの同定
それぞれの位置のアミノ酸残基が19種すべての代替の天然に存在するアミノ酸で順次
置き換えられた天然のMAGE−A10ペプチドのバリアントが得られ、それによって、
全部で171種のペプチドが調製された。天然のペプチドおよびアミノ酸置換されたペプ
チドが、抗原提示細胞上にパルスされ、ELISpotアッセイを使用して測定されるよ
うな、インターフェロンγ(IFNγ)産生が、TCR5で形質導入されたT細胞の活性
化についての読み出しとして使用された。不可欠な位置は、天然のペプチドに対して相対
的に50%を超えるT細胞活性における低下によって定義された。
ELISpotアッセイは、実施例6に記載のように行われた。
ペプチドの各位置における許容される残基は、以下に示される。下線付きのアミノ酸は
、ペプチド内の該当位置における天然の残基を表す。
したがって、抗原提示細胞の表面上でHLA−A02と複合体形成しているときに、
MAGE A10 TCR5が、GLYDGMEHLペプチド(配列番号1)の少なくと
もY3および7Eと接触することは明らかである。

Claims (21)

  1. 可溶型のT細胞受容体(TCR)を使用して25℃、pH7.1から7.5の間で表面
    プラズモン共鳴で測定されるときに約0.05μMから約10.0μMまでの解離定数で
    、HLA−A02と複合体形成したGLYDGMEHL(配列番号1)に結合する特性
    を有するTCRであって、前記TCRが、TCRアルファ鎖可変ドメインおよびTCRベ
    ータ鎖可変ドメインを含み、前記TCR可変ドメインが、GLYDGMEHL(配列番号
    1)の少なくとも残基Y3およびE7との接触を形成するTCR。
  2. アルファ鎖TRAC定常ドメイン配列およびベータ鎖TRBC1またはTRBC2定常
    ドメイン配列を有する、アルファ−ベータヘテロ二量体である、請求項1に記載のTCR
  3. 前記アルファ鎖およびベータ鎖定常ドメイン配列が、TRACのエクソン2のCys4
    とTRBC1またはTRBC2のエクソン2のCys2との間の天然のジスルフィド結合
    を欠失させるためのトランケーションまたは置換によって修飾される、請求項2に記載の
    TCR。
  4. 前記アルファ鎖およびベータ鎖定常ドメイン配列が、TRACのThr48およびTR
    BC1またはTRBC2のSer57についてのシステイン残基の置換によって修飾され
    、前記システインが、前記TCRの前記アルファ定常ドメインと前記ベータ定常ドメイン
    との間のジスルフィド結合を形成する、請求項2または請求項3に記載のTCR。
  5. VαおよびVβがそれぞれTCRα可変領域およびTCRβ可変領域であり、Cαおよ
    びCβがそれぞれTCRα定常領域およびTCRβ定常領域であり、Lがリンカー配列で
    ある、型Vα−L−Vβ、Vβ−L−Vα、Vα−Cα−L−Vβ、またはVα−L−V
    β−Cβの単鎖形式である、請求項1に記載のTCR。
  6. 検出可能な標識、治療剤またはPK修飾部分と結合された、請求項1から5のいずれか
    1項に記載のTCR。
  7. 前記アルファ鎖可変ドメインが、配列番号4のアミノ酸残基1〜111の配列に対して
    少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号4に示されている番号
    付けを参照して
    の変異を有し、かつ/または前記ベータ鎖可変ドメインが、配列番号5のアミノ酸残基1
    〜111の配列に対して少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番
    号5に示されている番号付けを参照して
    の変異のうちの少なくとも1つを有する、請求項1から6のいずれか1項に記載のTCR
  8. 前記アルファ鎖可変ドメインが、配列番号6もしくは12のアミノ酸残基1〜111の
    アミノ酸配列または
    そのアミノ酸残基1〜26、33〜49、55〜89および94〜111がそれぞれ配
    列番号6もしくは12のアミノ酸残基1〜26、33〜49、55〜89および94〜1
    11の配列に対して少なくとも90%もしくは95%の同一性を有し、アミノ酸残基27
    〜32、50〜54および90〜93がそれぞれ配列番号6もしくは12のアミノ酸残基
    27〜32、50〜54および90〜93の配列に対して少なくとも90%もしくは95
    %の同一性を有するアミノ酸配列
    を含む、請求項1から7のいずれか1項に記載のTCR。
  9. 前記アルファ鎖可変ドメインが、配列番号7もしくは13のアミノ酸残基1〜111の
    アミノ酸配列または
    そのアミノ酸残基1〜26、33〜49、55〜89および94〜111がそれぞれ配
    列番号7もしくは13のアミノ酸残基1〜26、33〜49、55〜89および94〜1
    11の配列に対して少なくとも90%もしくは95%の同一性を有し、アミノ酸残基27
    〜32、50〜54および90〜93がそれぞれ配列番号7もしくは13のアミノ酸残基
    27〜32、50〜54および90〜93の配列に対して少なくとも90%もしくは95
    %の同一性を有するアミノ酸配列
    を含む、請求項1から7のいずれか1項に記載のTCR。
  10. 前記アルファ鎖可変ドメインにおいて
    (i)そのアミノ酸残基1〜26の配列が、(a)配列番号4のアミノ酸残基1〜26
    の配列に対して少なくとも90%の同一性を有し、または(b)(a)の配列に対して相
    対的に挿入もしくは欠失された1つ、2つまたは3つのアミノ酸残基を有し、
    (ii)アミノ酸残基27〜32の配列が、DRGSQS、DRGSASまたはDRG
    SSSであり、
    (iii)そのアミノ酸残基33〜49の配列が、(a)配列番号4のアミノ酸残基3
    3〜49の配列に対して少なくとも90%の同一性を有し、または(b)(a)の配列に
    対して相対的に挿入もしくは欠失された1つ、2つまたは3つのアミノ酸残基を有し、
    (iv)アミノ酸残基50〜54の配列が、IYSNGであり、
    (v)そのアミノ酸残基55〜89の配列が、配列番号4のアミノ酸残基55〜89の
    配列に対して少なくとも90%の同一性を有し、またはそれに対して相対的に1つ、2つ
    または3つの挿入、欠失もしくは置換を有し、
    (vi)アミノ酸90〜93の配列が、AVRGであり、
    (vii)そのアミノ酸残基94〜111の配列が、配列番号4のアミノ酸残基94〜
    111の配列に対して少なくとも90%の同一性を有する、またはそれに対して相対的に
    1つ、2つまたは3つの挿入、欠失もしくは置換を有する、請求項1から9のいずれか1
    項に記載のTCR。
  11. 前記ベータ鎖可変ドメインが、配列番号8もしくは14のアミノ酸配列または
    そのアミノ酸残基1〜26、32〜48、54〜90および96〜111がそれぞれ配
    列番号8もしくは14のアミノ酸残基1〜26、32〜48、54〜90および96〜1
    11の配列に対して少なくとも90%もしくは95%の同一性を有し、アミノ酸残基27
    〜31、49〜53および91〜95がそれぞれ配列番号8もしくは14のアミノ酸残基
    27〜31、49〜53および91〜95の配列に対して少なくとも90%もしくは95
    %の同一性を有するアミノ酸配列
    を含む、請求項1から10のいずれか1項に記載のTCR。
  12. 前記ベータ鎖可変ドメインが、配列番号9もしくは15のアミノ酸配列または
    そのアミノ酸残基1〜26、32〜48、54〜90および96〜111がそれぞれ配
    列番号9もしくは15のアミノ酸残基1〜26、32〜48、54〜90および96〜1
    11の配列に対して少なくとも90%もしくは95%の同一性を有し、アミノ酸残基27
    〜31、49〜53および91〜95がそれぞれ配列番号9もしくは15のアミノ酸残基
    27〜31、49〜53および91〜95の配列に対して少なくとも90%もしくは95
    %の同一性を有するアミノ酸配列
    を含む、請求項1から10のいずれか1項に記載のTCR。
  13. 前記ベータ鎖可変ドメインが、配列番号10もしくは16のアミノ酸配列
    またはそのアミノ酸残基1〜26、32〜48、54〜90および96〜111がそれ
    ぞれ配列番号10もしくは16のアミノ酸残基1〜26、32〜48、54〜90および
    96〜111の配列に対して少なくとも90%もしくは95%の同一性を有し、アミノ酸
    残基27〜31、49〜53および91〜95がそれぞれ配列番号10もしくは16のア
    ミノ酸残基27〜31、49〜53および91〜95の配列に対して少なくとも90%も
    しくは95%の同一性を有するアミノ酸配列
    を含む、請求項1から10のいずれか1項に記載のTCR。
  14. 前記ベータ鎖可変ドメインが、配列番号11もしくは17のアミノ酸配列または
    そのアミノ酸残基1〜26、32〜48、54〜90および96〜111がそれぞれ配
    列番号11もしくは17のアミノ酸残基1〜26、32〜48、54〜90および96〜
    111の配列に対して少なくとも90%もしくは95%の同一性を有し、アミノ酸残基2
    7〜31、49〜53および91〜95がそれぞれ配列番号11もしくは17のアミノ酸
    残基27〜31、49〜53および91〜95の配列に対して少なくとも90%もしくは
    95%の同一性を有するアミノ酸配列
    を含む、請求項1から10のいずれか1項に記載のTCR。
  15. 前記ベータ鎖可変ドメインにおいて
    (i)そのアミノ酸残基1〜26の配列が、(a)配列番号5の残基1〜26のアミノ
    酸配列に対して少なくとも90%の同一性を有し、または(b)(a)の配列に対して相
    対的に挿入もしくは欠失された1つ、2つまたは3つのアミノ酸残基を有し、
    (ii)アミノ酸残基27〜31の配列が、MNHEYまたはMNHDYであり、
    (iii)そのアミノ酸残基32〜48の配列が、(a)配列番号5のアミノ酸残基3
    2〜48の配列に対して少なくとも90%の同一性を有し、または(b)(a)の配列に
    対して相対的に挿入もしくは欠失された1つ、2つまたは3つのアミノ酸残基を有し、
    (iv)アミノ酸残基49〜53の配列が、SVGEG、SVSEG、SVAEGまた
    はSVFEGであり、
    (v)そのアミノ酸残基54〜90の配列が、(a)配列番号5のアミノ酸残基54〜
    90の配列に対して少なくとも90%の同一性を有し、または(b)(a)の配列に対し
    て相対的に挿入もしくは欠失された1つ、2つまたは3つのアミノ酸残基を有し、
    (vi)アミノ酸91〜95の配列が、CASSFであり、
    (vii)そのアミノ酸残基96〜111の配列が、配列番号5のアミノ酸残基96〜
    111の配列に対して少なくとも90%の同一性を有する、またはそれに対して相対的に
    1つ、2つまたは3つの挿入、欠失もしくは置換を有する、請求項1から14のいずれか
    1項に記載のTCR。
  16. 請求項1から15のいずれか1項に記載のTCRをコードする核酸。
  17. 請求項1から15のいずれか1項に記載のTCRを提示している、単離されたまたは天
    然に存在しない細胞、特に、T細胞。
  18. (a)単一のオープンリーディングフレーム内に、もしくは前記アルファ鎖および前記
    ベータ鎖をそれぞれコードする2つの異なるオープンリーディングフレーム内に、請求項
    16に記載の核酸を含むTCR発現ベクター、または
    (b)請求項1から15のいずれか1項に記載のTCRのアルファ鎖をコードする核酸
    を含む第1の発現ベクター、および請求項1から15のいずれか1項に記載のTCRのベ
    ータ鎖をコードする核酸を含む第2の発現ベクター
    を宿している細胞。
  19. 1種または複数の薬学的に許容される担体または添加剤と一緒に、請求項1から15の
    いずれか1項に記載のTCR、請求項16の核酸、または請求項17もしくは請求項18
    に記載の細胞を含む医薬組成物。
  20. 薬における使用のための、請求項1から15のいずれか1項に記載のTCR、請求項1
    6の核酸または請求項17もしくは請求項18の細胞。
  21. がんを治療する方法における使用のための、請求項20に記載の使用のためのTCR、
    核酸または細胞。
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