JP2020111555A - Isovaleric acid odor inhibitor - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、イソ吉草酸臭抑制剤に関する。 The present invention relates to an isovaleric acid odor inhibitor.
ヒト等の哺乳動物においては、匂いは、鼻腔上部の嗅上皮に存在する嗅神経細胞上の嗅覚受容体に匂い分子が結合し、それに対する受容体の応答が中枢神経系へと伝達されることにより認識されている。ヒトの場合、嗅覚受容体は約４００個存在することが報告されており、これらをコードする遺伝子はヒトの全遺伝子の約２％にあたる。一般的に、嗅覚受容体と匂い分子は複数対複数の組み合わせで対応付けられている。すなわち、個々の嗅覚受容体は構造の類似した複数の匂い分子を異なる親和性で受容し、一方で、個々の匂い分子は複数の嗅覚受容体によって受容される。さらに、ある嗅覚受容体を活性化する匂い分子が、別の嗅覚受容体の活性化を阻害するアンタゴニストとして働くことも報告されている。これら複数の嗅覚受容体の応答の組み合わせが、個々の匂いの認識をもたらしている。 In mammals such as humans, the odor is that the odor molecule binds to the olfactory receptor on the olfactory nerve cells present in the olfactory epithelium in the upper nasal cavity, and the response of the receptor is transmitted to the central nervous system. Is recognized by. In humans, it has been reported that there are about 400 olfactory receptors, and the genes encoding these are about 2% of all human genes. In general, olfactory receptors and odor molecules are associated with each other in a plural-to-plural combination. That is, each olfactory receptor receives multiple odor molecules with similar structures with different affinities, while each odor molecule is received by multiple olfactory receptors. Furthermore, it has been reported that an odor molecule that activates one olfactory receptor acts as an antagonist that inhibits the activation of another olfactory receptor. The combination of these multiple olfactory receptor responses results in the recognition of individual odors.
したがって、同じ匂い分子が存在する場合でも、同時に他の匂い分子が存在すると、当該他の匂い分子によって受容体応答が阻害され、最終的に認識される匂いが全く異なることがある。このような仕組みを嗅覚受容体のアンタゴニズムと呼ぶ。この受容体アンタゴニズムによる匂いの抑制は、香水や芳香剤等の別の匂いを付加することによる消臭と異なり、特定の悪臭の認識を特異的に失くしてしまうことができ、また芳香剤の匂いによる不快感が生じることもないという利点を有している。 Therefore, even when the same odor molecule is present, if another odor molecule is present at the same time, the receptor response may be inhibited by the other odor molecule, and the finally recognized odor may be completely different. Such a mechanism is called olfactory receptor antagonism. Suppression of odor by this receptor antagonism is different from deodorization by adding another odor such as perfume and fragrance, and can specifically lose the recognition of a specific malodor. It has the advantage that no unpleasant sensation is caused by the odor.
イソ吉草酸は、汗や皮脂を原因とする体臭の原因物質の１つとして一般的に認識されている。嗅覚受容体アンタゴニズムの考え方に基づいたイソ吉草酸臭抑制剤がこれまでに開示されている。例えば、特許文献１、２には、フロルヒドラル等の香料物質が、イソ吉草酸に特異的に応答する嗅覚受容体の活性を抑制することでイソ吉草酸臭を抑制したことが開示されている。 Isovaleric acid is generally recognized as one of the causative substances of body odor caused by sweat and sebum. Isovaleric acid odor inhibitors based on the concept of olfactory receptor antagonism have been disclosed so far. For example, Patent Documents 1 and 2 disclose that a fragrance substance such as florhydral suppresses the odor of isovaleric acid by suppressing the activity of olfactory receptors that specifically respond to isovaleric acid.
一方で、体臭の原因物質は多様であり、それらの臭いを抑制するための様々な化合物又は組成物がこれまでに開示されている。特許文献３には、汗臭や腋臭などの酸臭に対して効果的にマスキング及び／又はハーモナージュすることができる体臭抑制香料組成物が開示されている。しかし当該組成物が標的とする体臭物質は特定構造のアルケニルカルボン酸である。 On the other hand, substances causing body odor are diverse, and various compounds or compositions for suppressing those odors have been disclosed so far. Patent Document 3 discloses a body odor suppressing perfume composition capable of effectively masking and/or harmonizing acid odors such as sweat odors and axillary odors. However, the odorant targeted by the composition is an alkenylcarboxylic acid having a specific structure.
特許文献４には、下記ａ）〜ｅ）：ａ）Ｒ1ＯＲ2（式中、Ｒ1及びＲ2はエーテル酸素原子を介してのみ連結され、エーテルが150〜200の分子量を有するような脂肪族又は芳香族の基である）の１種以上のエーテルを０．２〜２０重量％；ｂ）下記式(1)（式(1)中、Ｒ3はケトンの分子量が170〜300であるような芳香族基である）の１種以上の芳香族メチルケトンを５〜５０重量％；ｃ）Ｒ4ＯＨ（式中、Ｒ4は場合により１つ以下のオレフィン系二重結合を含有し、場合により芳香族置換基を有し、アルコールの分子量が130〜180の範囲にあるような脂肪族基である）の１種以上のアルコールを５〜５０重量％；ｄ）ＣＨ3ＣＯ2Ｒ5の酢酸エステル及びＣ2Ｈ5ＣＯ2Ｒ5のプロピオン酸エステル（式中、基Ｒ5は場合により１つ以下のオレフィン系二重結合を有し、場合により芳香族置換基を有し、エステルの分子量が180〜210の範囲にあるような脂肪族基である）の１種以上のエステルを２〜４０重量％；及び、ｅ）下記式(2)（式(2)中、Ｒ6は場合により１つ以下のオレフィン系二重結合を含有し、場合により芳香族置換基を有し、サリチル酸エステルの分子量が190〜230の範囲にあるような脂肪族基である）の１種以上のサリチル酸エステルを２〜６０重量％、のうちの少なくとも４つにより、その少なくとも５０重量％が構成されている香料組成物が、体臭を減少できることが開示されている。特許文献５には、下記ｆ）〜ｈ）：ｆ）下記式(1)（式(1)中、Ｒ3はケトンの分子量が170〜300であるような芳香族基である）の１種以上の芳香族メチルケトンを少なくとも７重量％；ｇ）Ｒ4ＯＨのアルコール、ＣＨ3ＣＯ2Ｒ5の酢酸エステル及びＣ2Ｈ5ＣＯ2Ｒ5のプロピオン酸エステル（式中、Ｒ4は、任意に１以下のオレフィン性二重結合を有し、任意に芳香族置換基を有し、アルコールの分子量が130〜180になるような脂肪族基であり、Ｒ5は、任意に１以下のオレフィン性二重結合を有し、任意に芳香族置換基を有し、酢酸エステル又はプロピオン酸エステルの分子量が180〜210の範囲であるような脂肪族基である）から選ばれる１つ以上の成分を少なくとも５重量％；ならびに、ｈ）下記式(2)（式(2)中、Ｒ6は場合により１つ以下のオレフィン系二重結合を含有し、場合により芳香族置換基を有し、サリチル酸エステルの分子量が190〜230の範囲にあるような脂肪族基である）の１種以上のサリチル酸エステルを少なくとも３重量％、により、その少なくとも３０重量％が構成されている香料組成物が、脇臭抑制に使用できることが開示されている。 Patent Document 4 discloses the following a) to e): a) R 1 OR 2 (wherein R 1 and R 2 are linked only through an ether oxygen atom, and ether has a molecular weight of 150 to 200). 0.2 to 20% by weight of one or more ethers (which are aliphatic or aromatic groups); b) the following formula (1) (wherein R 3 is a ketone having a molecular weight of 170 to 300). 5-50% by weight of one or more aromatic methyl ketones (which are such aromatic groups); c) R 4 OH, wherein R 4 optionally contains no more than one olefinic double bond. 5 to 50% by weight of one or more alcohols which are aliphatic groups, optionally with aromatic substituents and whose molecular weight is in the range of 130 to 180; d) CH 3 CO 2 R 5 propionic acid ester of acetic ester and C 2 H 5 CO 2 R 5 ( wherein, if the radicals R 5 by having no more than one olefinic double bond, have aromatic substituents by, 2 to 40% by weight of one or more esters of an aliphatic group such that the molecular weight of the ester is in the range of 180 to 210; and e) the following formula (2) (in the formula (2), R 6 Is optionally an aliphatic group containing at most one olefinic double bond, optionally having an aromatic substituent, and having a salicylic acid ester molecular weight in the range 190 to 230). It is disclosed that a fragrance composition composed of at least 50% by weight of at least 4 of the salicylic acid ester of 2 to 60% by weight can reduce body odor. Patent Document 5 describes the following f) to h): f) one of the following formulas (1) (in the formula (1), R 3 is an aromatic group in which the molecular weight of the ketone is 170 to 300). At least 7% by weight of the above aromatic methyl ketone; g) alcohol of R 4 OH, acetic acid ester of CH 3 CO 2 R 5 and propionic acid ester of C 2 H 5 CO 2 R 5 (wherein R 4 is optional) Is an aliphatic group having an olefinic double bond of 1 or less, optionally having an aromatic substituent, and having an alcohol molecular weight of 130 to 180, and R 5 is optionally an olefin of 1 or less. One or more components selected from the group consisting of aromatic double bonds, optionally aromatic substituents, and acetic acid esters or propionic acid esters having a molecular weight in the range of 180 to 210). At least 5% by weight; and h) the following formula (2) (in the formula (2), R 6 optionally contains at most one olefinic double bond and optionally has an aromatic substituent, A perfume composition comprising at least 30% by weight of at least 3% by weight of one or more salicylates of an aliphatic group such that the molecular weight of the salicylate is in the range of 190 to 230), It is disclosed that it can be used to suppress underarm odor.
特許文献６には、下記式（I）（式（I）中、Ｒ１は水素又はメチル基であり、Ｒ２は水素、ヒドロキシル基もしくは−ＯＣＨ３基）のアセトフェノン誘導体又はその美容的又は薬学的に受容できる塩が、体臭や、キッチン、トイレ、煙から発生した悪臭を阻害又は減少させるために使用できることが開示されている。特許文献７には、特定の構造を有するラクトンを、遊離脂肪酸やアルデヒドの臭気のマスキングに用いることが開示されている。 Patent Document 6 discloses an acetophenone derivative of the following formula (I) (in the formula (I), R 1 is hydrogen or a methyl group, and R 2 is hydrogen, a hydroxyl group or an —OCH 3 group), or a cosmetic or pharmaceutical agent thereof. It is disclosed that thermally acceptable salts can be used to inhibit or reduce body odor and malodors emanating from kitchen, toilet and smoke. Patent Document 7 discloses the use of a lactone having a specific structure for masking the odor of free fatty acids and aldehydes.
特許文献８には、複数の香料からなる糞便臭モデルの臭いをマスキングする糞便臭抑制用フレグランスが開示されている。該糞便臭モデルにはイソ吉草酸が含まれているが、インドール、酪酸、スルフィド類等の他の複数の悪臭成分も含まれているため、該糞便臭モデルの臭いは、それら複数の悪臭が混ざり合って生じる変調した臭いである。特許文献９には、２５℃で４Ｐａ以下の蒸気圧を有する香料化合物を含む動物排泄物からの不快な臭気の中和剤が開示されている。 Patent Document 8 discloses a scent-reducing fragrance for faecal odor that masks the odor of a fecal odor model composed of a plurality of fragrances. The stool model contains isovaleric acid, but it also contains a plurality of other malodorous components such as indole, butyric acid, and sulfides. It is a modulated odor that mixes. Patent Document 9 discloses a neutralizer for an unpleasant odor from animal excrement, which contains a fragrance compound having a vapor pressure of 4 Pa or less at 25°C.
本発明は、イソ吉草酸臭の抑制剤を提供することに関する。 The present invention relates to providing an inhibitor of isovaleric acid odor.
これまでに本発明者は、嗅覚受容体ＯＲ５１Ｉ２がイソ吉草酸臭に応答することを見出している（特許文献１）。さらに本発明者は、ＯＲ５１Ｉ２の応答を抑制し、嗅覚受容体アンタゴニズムによる匂い抑制によりイソ吉草酸臭を抑制することができる物質を見出した。 The present inventor has so far found that the olfactory receptor OR51I2 responds to isovaleric acid odor (Patent Document 1). Furthermore, the present inventor has found a substance capable of suppressing the response of OR51I2 and suppressing the isovaleric acid odor by suppressing the odor due to the olfactory receptor antagonism.
したがって、本発明は、アセチルセドレン、γ−メチルイオノン及びガラクソリドからなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする、イソ吉草酸臭抑制剤を提供する。 Therefore, the present invention provides an isovaleric acid odor inhibitor containing at least one selected from the group consisting of acetylcedrene, γ-methylionone and galaxolid as an active ingredient.
本発明により提供されるイソ吉草酸臭抑制剤は、嗅覚受容体アンタゴニズムによる匂い抑制によりイソ吉草酸臭を抑制することができる。したがって、当該抑制剤によれば、従来の消臭剤又は芳香剤を用いる消臭方法において生じていた芳香剤の強い匂いに基づく不快感等の問題を生じることがなく、イソ吉草酸臭を消臭することができる。 The isovaleric acid odor suppressor provided by the present invention can suppress the isovaleric acid odor by suppressing the odor due to the olfactory receptor antagonism. Therefore, the inhibitor suppresses the isovaleric acid odor without causing problems such as discomfort due to the strong odor of the fragrance, which has occurred in the deodorizing method using a conventional deodorant or fragrance. It can smell.
本明細書における「嗅覚受容体アンタゴニズムによる匂い抑制」とは、目的の匂い分子と他の匂い分子をともに適用することにより、当該他の匂い分子によって目的の匂い分子に対する受容体応答を阻害し、結果的に個体に認識される匂い（悪臭を含む）を抑制する手段である。嗅覚受容体アンタゴニズムによる匂い抑制は、同様に他の匂い分子を用いる手段であっても、芳香剤等の、目的の匂いを別の強い匂いによって打ち消す手段（いわゆる香りによるマスキング）とは区別される。嗅覚受容体アンタゴニズムによる匂い抑制の一例は、アンタゴニスト等の嗅覚受容体の応答を阻害する物質を使用するケースである。特定の匂いをもたらす匂い分子の受容体にその応答を阻害する物質を適用すれば、当該受容体の当該匂い分子に対する応答が抑制されるため、最終的に個体に知覚される匂いを抑制することができる。 In the present specification, "suppression of odor by olfactory receptor antagonism" means to apply a odor molecule of interest and another odor molecule together to inhibit a receptor response to the odor molecule of interest by the other odor molecule. As a result, it is a means of suppressing odors (including malodors) recognized by individuals. The suppression of odor by olfactory receptor antagonism is distinguished from the means of canceling a desired odor by another strong odor (so-called fragrance masking) such as fragrance, even if it is a means of using other odor molecules as well. It One example of odor suppression by olfactory receptor antagonism is the case of using a substance that inhibits the response of olfactory receptor such as an antagonist. By applying a substance that inhibits the response of an odor molecule that causes a specific odor to the receptor, the response of the receptor to the odor molecule is suppressed, so that the odor that is ultimately perceived by an individual is suppressed. You can
本明細書において「アンタゴニスト」とは、受容体に結合するが、受容体を活性化しないか、又はアゴニストに対する受容体の応答を抑制する（あるいは受容体活性を阻害する）物質をいう。 As used herein, the term "antagonist" refers to a substance that binds to a receptor but does not activate the receptor or suppresses the response of the receptor to an agonist (or inhibits receptor activity).
本明細書において、「嗅覚受容体ポリペプチド」とは、嗅覚受容体又はそれと同等の機能を有するポリペプチドをいい、嗅覚受容体と同等の機能を有するポリペプチドとは、嗅覚受容体と同様に、細胞膜上に発現することができ、匂い分子の結合によって活性化し、かつ活性化されると、細胞内のＧαｓと共役してアデニル酸シクラーゼを活性化することで細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる機能を有するポリペプチドをいう（Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２００４，５：２６３−２７８）。 In the present specification, "olfactory receptor polypeptide" refers to an olfactory receptor or a polypeptide having a function equivalent thereto, and a polypeptide having a function equivalent to an olfactory receptor is the same as an olfactory receptor. , Which can be expressed on the cell membrane, is activated by binding of odor molecules, and when activated, functions to increase intracellular cAMP level by activating adenylate cyclase by coupling with intracellular Gαs. (Nat. Neurosci., 2004, 5:263-278).
本明細書において、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の同一性は、リップマン−パーソン法（Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法；Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５−４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（Ｖｅｒ．５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。 In the present specification, the nucleotide sequence and amino acid sequence identities are calculated by the Lippmann-Person method (Lipman-Pearson method; Science, 1985, 227:1455-41). Specifically, using the homology analysis (Search homology) program of the genetic information processing software Genetyx-Win (Ver. 5.1.1; software development), the unit size to compare (ktup) is set to 2. Is calculated by
本明細書において、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列に関する「少なくとも８０％の同一性」とは、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性をいう。 In the present specification, “at least 80% identity” with respect to nucleotide sequences and amino acid sequences means 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more, even more preferably 98% or more, and more preferably 99% or more identity.
嗅覚受容体ＯＲ５１Ｉ２は、ヒト嗅細胞で発現している嗅覚受容体であり、ＧｅｎＢａｎｋにＧＩ：３９００６４として登録されている。ＯＲ５１Ｉ２は、配列番号１のヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。特許文献１、２に開示されているとおり、また図１に示すとおり、ＯＲ５１Ｉ２は、イソ吉草酸に対して濃度依存的に活性化するイソ吉草酸の受容体である。 The olfactory receptor OR51I2 is an olfactory receptor expressed in human olfactory cells, and is registered in GenBank as GI:390064. OR51I2 is a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO:2, which is encoded by the gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO:1. As disclosed in Patent Documents 1 and 2, and as shown in FIG. 1, OR51I2 is an isovaleric acid receptor that activates isovaleric acid in a concentration-dependent manner.
したがって、嗅覚受容体ＯＲ５１Ｉ２の応答を抑制するＯＲ５１Ｉ２アンタゴニストを、イソ吉草酸臭の抑制のために使用することができる。ＯＲ５１Ｉ２アンタゴニストは、嗅覚受容体アンタゴニズムによりイソ吉草酸によるＯＲ５１Ｉ２の活性化を抑制することで、個体のイソ吉草酸臭の認識に変化を生じさせ、結果として、イソ吉草酸臭を抑制することができる。 Therefore, an OR51I2 antagonist that suppresses the response of the olfactory receptor OR51I2 can be used for suppressing isovaleric acid odor. An OR51I2 antagonist suppresses the activation of OR51I2 by isovaleric acid by olfactory receptor antagonism, thereby causing a change in the recognition of isovaleric acid odor in individuals, and as a result, suppressing isovaleric acid odor. it can.
したがって、一態様において、本発明は、ＯＲ５１Ｉ２アンタゴニストを有効成分とする、イソ吉草酸臭抑制剤を提供する。本発明で使用されるＯＲ５１Ｉ２アンタゴニストとしては、下記の化合物が挙げられる：
アセチルセドレン（メチルセドリルケトン；［１−［（１Ｓ，２Ｒ，５Ｒ，７Ｓ）−２，６，６，８−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｔｒｉｃｙｃｌｏ［５．３．１．０1,5］ｕｎｄｅｃ−８−ｅｎ−９−ｙｌ］ｅｔｈａｎｏｎｅ）；
γ−メチルイオノン（α−ｉｓｏ−ｍｅｔｈｙｌｉｏｎｏｎｅ；３−ｍｅｔｈｙｌ−４−（２，６，６−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｃｙｃｌｏｈｅｘｅｎ−１−ｙｌ）−３−ｂｕｔｅｎ−２−ｏｎｅ）；及び、
ガラクソリド（１，３，４，６，７，８−Ｈｅｘａｈｙｄｒｏ−４，６，６，７，８，８−ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｃｙｃｌｏｐｅｎｔａ−ｇａｍｍａ−２−ｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ）。
Therefore, in one aspect, the present invention provides an isovaleric acid odor inhibitor, which comprises an OR51I2 antagonist as an active ingredient. OR51I2 antagonists used in the present invention include the following compounds:
Acetyl Cedrene (Methyl Cedryl Ketone; [1-[(1S,2R,5R,7S)-2,6,6,8-tetramethyltricyclyl[5.3.1.0 1,5 ]undec-8-en- 9-yl]ethaneone);
[gamma]-methylionone ([alpha]-iso-methylionone; 3-methyl-4-(2,6,6-trimethyl-2-cyclohexen-1-yl)-3-buten-2-one); and
Galaxolide (1,3,4,6,7,8-Hexahydro-4,6,6,7,8,8-hexamethylcyclopenta-gamma-2-benzopyran).
より詳細には、上記の化合物は、ＯＲ５１Ｉ２又はそれと同等な機能を有する嗅覚受容体ポリペプチドに対するアンタゴニストである。本明細書において「ＯＲ５１Ｉ２と同等な機能を有する嗅覚受容体ポリペプチド」の例としては、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソ吉草酸に対する応答性を有する嗅覚受容体ポリペプチドが挙げられる。ＯＲ５１Ｉ２と同等な機能を有する嗅覚受容体ポリペプチドのさらなる例としては、ＯＲ５１Ｉ２と相同な、他の動物由来の嗅覚受容体が挙げられ、その好ましい例としては、イソ吉草酸に応答性を有する、ＯＲ５１Ｉ２と相同なマウス又はラット由来の嗅覚受容体ポリペプチドが挙げられる。 More specifically, the above compounds are antagonists to olfactory receptor polypeptides having OR51I2 or equivalent functions. In the present specification, an example of the "olfactory receptor polypeptide having a function equivalent to that of OR51I2" is composed of an amino acid sequence having at least 80% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and is responsive to isovaleric acid. Olfactory receptor polypeptides having Further examples of the olfactory receptor polypeptide having a function equivalent to that of OR51I2 include olfactory receptors derived from other animals that are homologous to OR51I2, and preferable examples thereof include responsiveness to isovaleric acid, An olfactory receptor polypeptide derived from mouse or rat, which is homologous to OR51I2, can be mentioned.
上記に挙げたＯＲ５１Ｉ２アンタゴニストである化合物（以下、単にＯＲ５１Ｉ２アンタゴニストともいう）は、これまで香料素材として知られていたが、ＯＲ５１Ｉ２に対するアンタゴニスト作用を有することや、イソ吉草酸臭を選択的に抑制する機能があることは知られていなかった。なおこれらのＯＲ５１Ｉ２アンタゴニストは、イソ吉草酸臭を抑制する機能を有する一方で、香料素材として自身の香りを呈することができるので、イソ吉草酸臭の抑制剤として使用すると同時に香料としても使用することができる。 The above-mentioned compounds that are OR51I2 antagonists (hereinafter also simply referred to as OR51I2 antagonists) have been known as fragrance materials until now, but they have an antagonistic action against OR51I2 and selectively suppress isovaleric acid odor. It was not known to have a function. While these OR51I2 antagonists have the function of suppressing the isovaleric acid odor, they can exhibit their own scent as a perfume material, so they should be used as a perfume at the same time as the isovaleric acid odor suppressor. You can
当該ＯＲ５１Ｉ２アンタゴニストは、いずれも市販のものを購入することができる。例えば、該ＯＲ５１Ｉ２アンタゴニストは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｌａｖｏｒｓ＆Ｆｒａｇｒａｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．などから入手することが可能である。あるいは、化学合成によって、該市販品と同一物質又はそれを含む組成物を製造することが可能である。 As the OR51I2 antagonist, any commercially available product can be purchased. For example, the OR51I2 antagonist is described in International Flavors & Fragrances, Inc. It can be obtained from Alternatively, it is possible to produce the same substance as the commercially available product or a composition containing the same by chemical synthesis.
本発明のイソ吉草酸臭抑制剤は、上述のＯＲ５１Ｉ２アンタゴニストからなる群より選択される少なくとも１つの化合物を有効成分として含有する。例えば、本発明のイソ吉草酸臭抑制剤の有効成分は、該ＯＲ５１Ｉ２アンタゴニストからなる群より選択される少なくとも１つ、例えばいずれか単独又はいずれか２つ以上の組み合わせであり得る。 The isovaleric acid odor inhibitor of the present invention contains at least one compound selected from the group consisting of the above-mentioned OR51I2 antagonists as an active ingredient. For example, the active ingredient of the isovaleric acid odor inhibitor of the present invention may be at least one selected from the group consisting of the OR51I2 antagonists, for example, any one alone or a combination of any two or more.
一実施形態において、本発明のイソ吉草酸臭抑制剤は、該ＯＲ５１Ｉ２アンタゴニストからなる群より選択される少なくとも１つから本質的に構成され得る。別の一実施形態において、本発明のイソ吉草酸臭抑制剤は、該ＯＲ５１Ｉ２アンタゴニストを有効成分とし、さらにその他の成分を含む、イソ吉草酸臭を抑制するための組成物である。好ましくは、本発明において該ＯＲ５１Ｉ２アンタゴニストにより抑制される臭いは、インドール、酪酸、イソ吉草酸、及びスルフィド類を混合して得られる糞便臭モデルの臭いではない。 In one embodiment, the isovaleric acid odor suppressant of the present invention may consist essentially of at least one selected from the group consisting of said OR51I2 antagonists. In another embodiment, the isovaleric acid odor suppressor of the present invention is a composition for suppressing isovaleric acid odor, which comprises the OR51I2 antagonist as an active ingredient and further contains other components. Preferably, the odor suppressed by the OR51I2 antagonist in the present invention is not the odor of the fecal odor model obtained by mixing indole, butyric acid, isovaleric acid, and sulfides.
本発明の別の一態様において、当該ＯＲ５１Ｉ２アンタゴニストは、イソ吉草酸臭を抑制するための有効成分として使用され得る。一実施形態において、当該ＯＲ５１Ｉ２アンタゴニストは、イソ吉草酸臭を抑制するための化合物又は組成物に、イソ吉草酸臭を抑制するための有効成分として含有され得る。あるいは、該ＯＲ５１Ｉ２アンタゴニストは、イソ吉草酸臭抑制剤の製造のため、あるいはイソ吉草酸臭を抑制するための化合物又は組成物の製造のために使用することができる。 In another aspect of the present invention, the OR51I2 antagonist can be used as an active ingredient for suppressing isovaleric acid odor. In one embodiment, the OR51I2 antagonist can be contained in a compound or composition for suppressing isovaleric acid odor as an active ingredient for suppressing isovaleric acid odor. Alternatively, the OR51I2 antagonist can be used for producing an isovaleric acid odor inhibitor, or for producing a compound or composition for suppressing an isovaleric acid odor.
上述した本発明のイソ吉草酸臭抑制剤、及びイソ吉草酸臭を抑制するための組成物は、当該ＯＲ５１Ｉ２アンタゴニストに加えて、消臭効果を有する他の成分、又は消臭剤や防臭剤に使用される任意の成分を、その目的に応じて適宜含有していてもよい。該消臭効果を有する他の成分としては、公知の消臭剤が何れも使用できるが、例えば、植物の葉、葉柄、実、茎、根、樹皮等の各部位から抽出された消臭有効成分（例えば、緑茶抽出物）；乳酸、グルコン酸、コハク酸、グルタン酸、アジピン酸、リンゴ酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸、イタコン酸、クエン酸、安息香酸、サリチル酸等の有機酸、各種アミノ酸およびこれらの塩、グリオキサール、酸化剤、フラボノイド類、カテキン類、ポリフェノール類；活性炭、ゼオライトなどの多孔性物質；シクロデキストリン類などの包接剤；光触媒；各種マスキング剤、等が挙げられる。ただし、本発明のイソ吉草酸臭抑制剤、及びイソ吉草酸臭を抑制するための組成物は、好ましくは、特許文献４に開示されるような上記ａ）〜ｅ）のうちの少なくとも４つを少なくとも５０重量％含む香料組成物、特許文献５に開示されるような上記ｆ）〜ｈ）を少なくとも３０重量％含む香料組成物、又は特許文献６に開示されるような特定の構造のアセトフェノン誘導体又はその美容的もしくは薬学的に受容できる塩を含まず、より好ましくはこれらのいずれも含まない。 The above-mentioned isovaleric acid odor suppressor and composition for suppressing isovaleric acid odor according to the present invention include, in addition to the OR51I2 antagonist, other components having a deodorizing effect, or a deodorant or a deodorant. Any component used may be appropriately contained depending on the purpose. As the other component having the deodorant effect, any known deodorant can be used, but for example, the deodorant effect extracted from each site such as plant leaf, petiole, fruit, stem, root and bark Ingredients (for example, green tea extract); lactic acid, gluconic acid, succinic acid, glutanoic acid, adipic acid, malic acid, tartaric acid, maleic acid, fumaric acid, itaconic acid, citric acid, benzoic acid, salicylic acid and other organic acids, various Amino acids and salts thereof, glyoxal, oxidizing agents, flavonoids, catechins, polyphenols; porous materials such as activated carbon and zeolite; inclusion agents such as cyclodextrins; photocatalysts; various masking agents and the like. However, the isovaleric acid odor inhibitor and the composition for suppressing the isovaleric acid odor of the present invention are preferably at least four of the above a) to e) as disclosed in Patent Document 4. Perfume composition containing at least 50% by weight, a perfume composition containing at least 30% by weight of the above-mentioned f) to h) as disclosed in Patent Document 5, or acetophenone having a specific structure as disclosed in Patent Document 6. It does not contain derivatives or cosmetically or pharmaceutically acceptable salts thereof, more preferably neither.
当該消臭剤や防臭剤に使用される任意の成分の例としては、香料、粉末成分、液体油脂、固体油脂、ロウ、炭化水素、植物抽出物、漢方成分、高級アルコール類、低級アルコール類、エステル類、長鎖脂肪酸、界面活性剤（非イオン界面活性剤、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤等）、ステロール類、多価アルコール類、保湿剤、水溶性高分子化合物、増粘剤、皮膜剤、殺菌剤、防腐剤、紫外線吸収剤、保留剤、冷感剤、温感剤、刺激剤、金属イオン封鎖剤、糖分、アミノ酸類、有機アミン類、合成樹脂エマルジョン、ｐＨ調製剤、酸化防止剤、酸化防止助剤、油分、粉体、カプセル類、キレート剤、無機塩、有機塩色素、増粘剤、殺菌剤、防腐剤、防カビ剤、着色剤、消泡剤、増量剤、変調剤、有機酸、ポリマー、ポリマー分散剤、酵素、酵素安定剤、等が挙げられる。 Examples of optional components used in the deodorant and deodorant, perfumes, powder components, liquid fats and oils, solid fats and oils, waxes, hydrocarbons, plant extracts, Chinese herbs, higher alcohols, lower alcohols, Esters, long chain fatty acids, surfactants (nonionic surfactants, anionic surfactants, cationic surfactants, amphoteric surfactants, etc.), sterols, polyhydric alcohols, humectants, water-soluble polymer compounds , Thickeners, film agents, bactericides, antiseptics, ultraviolet absorbers, holding agents, cooling agents, warming agents, stimulants, sequestering agents, sugars, amino acids, organic amines, synthetic resin emulsions, pH adjusters, antioxidants, antioxidant aids, oils, powders, capsules, chelating agents, inorganic salts, organic salt dyes, thickeners, germicides, preservatives, fungicides, colorants, defoamers Examples include agents, extenders, modulators, organic acids, polymers, polymer dispersants, enzymes, enzyme stabilizers, and the like.
一実施形態において、当該ＯＲ５１Ｉ２アンタゴニストは、イソ吉草酸臭の抑制が所望されるあらゆる化合物又は組成物に対して、あるいはイソ吉草酸臭の抑制が所望されるあらゆる環境下において、又は該環境に含まれるあらゆる物品に対して、イソ吉草酸臭の抑制のための有効成分として使用され得る。あるいは、当該ＯＲ５１Ｉ２アンタゴニストは、イソ吉草酸臭の抑制のための有効成分として、イソ吉草酸臭の抑制が所望される化合物又は組成物の製造のために使用することができる。 In one embodiment, the OR51I2 antagonist is directed against any compound or composition in which suppression of isovaleric acid odor is desired, or in or in any environment in which suppression of isovaleric acid odor is desired. It can be used as an active ingredient for the control of isovaleric acid odor in any of the articles mentioned. Alternatively, the OR51I2 antagonist can be used as an active ingredient for suppressing isovaleric acid odor, for producing a compound or composition in which isovaleric acid odor is desired to be suppressed.
さらなる態様として、本発明は、イソ吉草酸臭と当該ＯＲ５１Ｉ２アンタゴニストとを共存させる工程を含む、イソ吉草酸臭の抑制方法を提供する。 As a further aspect, the present invention provides a method for suppressing an isovaleric acid odor, which comprises a step of allowing an isovaleric acid odor and the OR51I2 antagonist to coexist.
本発明の方法の一実施形態においては、イソ吉草酸臭の存在下で、対象に、当該ＯＲ５１Ｉ２アンタゴニストからなる群より選択される少なくとも１つを適用することにより、該イソ吉草酸臭と該アンタゴニストとを共存させる。それによって、該対象のＯＲ５１Ｉ２と該アンタゴニストが結合して、イソ吉草酸による該対象のＯＲ５１Ｉ２の活性化が抑制されるので、嗅覚受容体アンタゴニズムによる匂い抑制に基づいてイソ吉草酸臭が抑制される。 In one embodiment of the method of the present invention, the isovaleric acid odor and the antagonist are obtained by applying to the subject at least one selected from the group consisting of the OR51I2 antagonists in the presence of the isovaleric acid odor. And coexist. As a result, the target OR51I2 binds to the antagonist to suppress the activation of the target OR51I2 by isovaleric acid, and thus the isovaleric acid odor is suppressed based on the odor suppression by the olfactory receptor antagonism. It
本発明の方法において、当該対象の例としては、イソ吉草酸臭の抑制を必要とする対象、好ましくは嗅覚受容体アンタゴニズムによる匂い抑制に基づくイソ吉草酸臭の抑制を必要とする対象が挙げられる。該対象は、哺乳動物であれば特に限定されないが、好ましくはヒトである。 In the method of the present invention, examples of the subject include a subject in need of suppression of isovaleric acid odor, preferably a subject in need of suppression of isovaleric acid odor based on odor suppression by olfactory receptor antagonism. To be The subject is not particularly limited as long as it is a mammal, but is preferably a human.
本発明の方法の別の一実施形態において、当該ＯＲ５１Ｉ２アンタゴニストは、イソ吉草酸臭の発生する可能性のある環境下に予め適用される。それにより、該環境下でイソ吉草酸臭が発生した場合、該イソ吉草酸臭存在下で、該対象に該ＯＲ５１Ｉ２アンタゴニストが適用されるので、嗅覚受容体アンタゴニズムによる匂い抑制に基づいてイソ吉草酸臭は抑制される。 In another embodiment of the method of the present invention, the OR51I2 antagonist is pre-applied in an environment where isovaleric acid odor may occur. As a result, when an isovaleric acid odor is generated in the environment, the OR51I2 antagonist is applied to the subject in the presence of the isovaleric acid odor. Therefore, isovaleric acid is detected based on odor suppression by the olfactory receptor antagonism. Herb acid odor is suppressed.
本発明の方法の別の一実施形態において、当該ＯＲ５１Ｉ２アンタゴニストは、イソ吉草酸を含有するか、又はその可能性のある化合物又は組成物に適用される。これによって、該アンタゴニストは、該化合物又は組成物に含まれるイソ吉草酸によるＯＲ５１Ｉ２の活性化を抑制し、該対象におけるイソ吉草酸臭の認識を抑制し、結果としてイソ吉草酸臭を抑制する。本実施形態における該ＯＲ５１Ｉ２アンタゴニストの適用の例としては、該化合物又は組成物への該ＯＲ５１Ｉ２アンタゴニストの噴霧、及び該ＯＲ５１Ｉ２アンタゴニストを予め含有する該化合物又は組成物の提供、などが挙げられる。 In another embodiment of the methods of this invention said OR51I2 antagonist is applied to a compound or composition containing or potentially isovaleric acid. Thereby, the antagonist suppresses the activation of OR51I2 by isovaleric acid contained in the compound or composition, suppresses the recognition of isovaleric acid odor in the subject, and consequently suppresses isovaleric acid odor. Examples of the application of the OR51I2 antagonist in the present embodiment include spraying the compound or composition with the OR51I2 antagonist, and providing the compound or composition containing the OR51I2 antagonist in advance.
本発明の例示的実施形態として、さらに以下の組成物、製造方法、用途あるいは方法を本明細書に開示する。ただし、本発明はこれらの実施形態に限定されない。 The following compositions, manufacturing methods, uses or methods are further disclosed herein as exemplary embodiments of the present invention. However, the present invention is not limited to these embodiments.
〔１〕アセチルセドレン、γ−メチルイオノン及びガラクソリドからなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする、イソ吉草酸臭抑制剤。
〔２〕アセチルセドレン、γ−メチルイオノン及びガラクソリドからなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする、ＯＲ５１Ｉ２又はそれと同等な機能を有する嗅覚受容体ポリペプチドに対する受容体活性阻害剤。
〔３〕好ましくは、前記ＯＲ５１Ｉ２が、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、かつ
好ましくは、前記ＯＲ５１Ｉ２と同等な機能を有する嗅覚受容体ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソ吉草酸に対する応答性を有するポリペプチドである、
〔２〕記載の阻害剤。
[1] An isovaleric acid odor inhibitor containing, as an active ingredient, at least one selected from the group consisting of acetylcedrene, γ-methylionone and galaxolide.
[2] A receptor activity inhibitor for an olfactory receptor polypeptide having OR51I2 or a function equivalent thereto, which comprises at least one selected from the group consisting of acetylcedrene, γ-methylionone and galaxolide as an active ingredient.
[3] Preferably, the OR51I2 is a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO:2, and preferably, the olfactory receptor polypeptide having a function equivalent to that of the OR51I2 is at least the amino acid sequence of SEQ ID NO:2. A polypeptide consisting of an amino acid sequence having 80% identity and having responsiveness to isovaleric acid,
The inhibitor according to [2].
〔４〕イソ吉草酸臭抑制剤の製造のための、アセチルセドレン、γ−メチルイオノン及びガラクソリドからなる群より選択される少なくとも１種の使用。
〔５〕ＯＲ５１Ｉ２又はそれと同等な機能を有する嗅覚受容体ポリペプチドに対する受容体活性阻害剤の製造のための、アセチルセドレン、γ−メチルイオノン及びガラクソリドからなる群より選択される少なくとも１種の使用。
〔６〕好ましくは、前記ＯＲ５１Ｉ２が、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、かつ
好ましくは、前記ＯＲ５１Ｉ２と同等な機能を有する嗅覚受容体ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソ吉草酸に対する応答性を有するポリペプチドである、
〔５〕記載の使用。
[4] Use of at least one selected from the group consisting of acetylcedrene, γ-methylionone and galaxolide for producing an isovaleric acid odor inhibitor.
[5] Use of at least one selected from the group consisting of acetylcedrene, γ-methylionone and galaxolide for producing a receptor activity inhibitor against an olfactory receptor polypeptide having a function equivalent to OR51I2.
[6] Preferably, the OR51I2 is a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO:2, and preferably, the olfactory receptor polypeptide having a function equivalent to that of the OR51I2 is at least the amino acid sequence of SEQ ID NO:2. A polypeptide consisting of an amino acid sequence having 80% identity and having responsiveness to isovaleric acid,
[5] Use as described.
〔７〕イソ吉草酸臭の抑制のための、アセチルセドレン、γ−メチルイオノン及びガラクソリドからなる群より選択される少なくとも１種の使用。
〔８〕ＯＲ５１Ｉ２又はそれと同等な機能を有する嗅覚受容体ポリペプチドに対する受容体活性阻害のための、アセチルセドレン、γ−メチルイオノン及びガラクソリドからなる群より選択される少なくとも１種の使用。
〔９〕好ましくは、前記ＯＲ５１Ｉ２が、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、かつ
好ましくは、前記ＯＲ５１Ｉ２と同等な機能を有する嗅覚受容体ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソ吉草酸に対する応答性を有するポリペプチドである、
〔８〕記載の使用。
[7] Use of at least one selected from the group consisting of acetylcedrene, γ-methylionone and galaxolide for suppressing isovaleric acid odor.
[8] Use of at least one selected from the group consisting of acetylcedrene, γ-methylionone and galaxolide for inhibiting the receptor activity against OR51I2 or an olfactory receptor polypeptide having a function equivalent thereto.
[9] Preferably, the OR51I2 is a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO:2, and preferably, the olfactory receptor polypeptide having a function equivalent to that of OR51I2 is at least the amino acid sequence of SEQ ID NO:2. A polypeptide consisting of an amino acid sequence having 80% identity and having responsiveness to isovaleric acid,
[8] Use as described.
〔１０〕イソ吉草酸臭抑制方法であって、それを必要とする対象に、アセチルセドレン、γ−メチルイオノン及びガラクソリドからなる群より選択される少なくとも１種を適用することを含む、方法。
〔１１〕ＯＲ５１Ｉ２又はそれと同等な機能を有する嗅覚受容体ポリペプチドに対する受容体活性阻害方法であって、該ＯＲ５１Ｉ２又は該嗅覚受容体ポリペプチドに、アセチルセドレン、γ−メチルイオノン及びガラクソリドからなる群より選択される少なくとも１種を適用することを含む、方法。
〔１２〕好ましくは、前記ＯＲ５１Ｉ２が、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、かつ
好ましくは、前記ＯＲ５１Ｉ２と同等な機能を有する嗅覚受容体ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソ吉草酸に対する応答性を有するポリペプチドである、
〔１１〕記載の方法。
[10] A method for suppressing isovaleric acid odor, which comprises applying to a subject in need thereof at least one selected from the group consisting of acetylcedrene, γ-methylionone and galaxolide.
[11] A method for inhibiting a receptor activity against an olfactory receptor polypeptide having a function equivalent to OR51I2, wherein the OR51I2 or the olfactory receptor polypeptide is selected from the group consisting of acetylcedrene, γ-methylionone and galaxolide. A method comprising applying at least one selected.
[12] Preferably, the OR51I2 is a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO:2, and preferably, the olfactory receptor polypeptide having a function equivalent to that of the OR51I2 is at least the amino acid sequence of SEQ ID NO:2. A polypeptide consisting of an amino acid sequence having 80% identity and having responsiveness to isovaleric acid,
[11] The method described.
以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
試験物質
アセチルセドレン（メチルセドリルケトン；［１−［（１Ｓ，２Ｒ，５Ｒ，７Ｓ）−２，６，６，８−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｔｒｉｃｙｃｌｏ［５．３．１．０1,5］ｕｎｄｅｃ−８−ｅｎ−９−ｙｌ］ｅｔｈａｎｏｎｅ）；（ＣＡＳ登録番号：３２３８８−５５−９；商品名：Ｖｅｒｔｏｆｉｘ；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｌａｖｏｒｓ＆Ｆｒａｇｒａｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）
γ−メチルイオノン（α−ｉｓｏ−ｍｅｔｈｙｌｉｏｎｏｎｅ；３−ｍｅｔｈｙｌ−４−（２，６，６−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｃｙｃｌｏｈｅｘｅｎ−１−ｙｌ）−３−ｂｕｔｅｎ−２−ｏｎｅ）；（ＣＡＳ登録番号：１２７−５１−５）（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｌａｖｏｒｓ＆Ｆｒａｇｒａｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）
ガラクソリド（１，３，４，６，７，８−Ｈｅｘａｈｙｄｒｏ−４，６，６，７，８，８−ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｃｙｃｌｏｐｅｎｔａ−ｇａｍｍａ−２−ｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ）（ＣＡＳ登録番号：１２２２−０５−５；商品名：Ｇａｌａｘｏｌｉｄｅ ６５％ Ｉ．Ｐ．Ｍ．（ガラクソリド（６５％ミリスチン酸イソプロピル溶液））；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｌａｖｏｒｓ＆Ｆｒａｇｒａｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）
Test substance Acetyl Cedrene (Methyl Cedryl Ketone; [1-[(1S,2R,5R,7S)-2,6,6,8-tetramethyltricyclo[5.3.1.0 1,5 ]undec-8- en-9-yl]ethaneone); (CAS registration number: 32388-55-9; trade name: Vertofix; International Flavors & Fragrances, Inc.)
γ-Methylionone (α-iso-methylionone; 3-methyl-4-(2,6,6-trimethyl-2-cyclohexen-1-yl)-3-buten-2-one); (CAS Registry Number: 127- 51-5) (International Flavors & Fragrances, Inc.)
Galaxolide (1,3,4,6,7,8-Hexahydro-4,6,6,7,8,8-hexamethylcyclopenta-gamma-2-benzopyran) (CAS registration number: 1222-05-5; trade name: Galaxolide 65% IPM (Galaxolide (65% isopropyl myristate solution)); International Flavors & Fragrances, Inc.)
実施例１ イソ吉草酸受容体の同定
１）ＯＲ５１Ｉ２のクローニング
ＯＲ５１Ｉ２はＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報を基に、ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｆｅｍａｌｅ（Ｇ１５２１：Ｐｒｏｍｅｇａ）を鋳型としたＰＣＲによりクローニングした。ＰＣＲにより増幅した遺伝子（配列番号１）をｐＥＮＴＲベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にマニュアルに従って組込み、ｐＥＮＴＲベクター上に存在するＮｏｔ Ｉ、Ａｓｃ Ｉサイトを利用して、ｐＭＥ１８Ｓベクター上のＦｌａｇ−Ｒｈｏタグ配列の下流に作成したＮｏｔ Ｉ、Ａｓｃ Ｉサイトへと組換えた。
Example 1 Identification of Isovaleric Acid Receptor 1) Cloning of OR51I2 OR51I2 was cloned by PCR using human genomic DNA female (G1521:Promega) as a template based on the sequence information registered in GenBank. The gene (SEQ ID NO: 1) amplified by PCR was incorporated into the pENTR vector (Invitrogen) according to the manual, and the Not I and Asc I sites present on the pENTR vector were used to downstream the Flag-Rho tag sequence on the pME18S vector. It was recombined into the created Not I and Asc I sites.
２）ｐＭＥ１８Ｓ−ｈＲＴＰ１Ｓベクターの作製
ｈｕｍａｎ ＲＴＰ１遺伝子（ＭＨＳ１０１０−９２０５８６２：Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を鋳型としたＰＣＲにより、ｈＲＴＰ１Ｓ遺伝子（配列番号３）をクローニングした。ＰＣＲに用いるプライマーには、センス側にＥｃｏＲ Ｉ、アンチセンス側にＸｈｏ Ｉサイトを付加した。ＰＣＲ法により増幅したｈＲＴＰ１Ｓ遺伝子をｐＭＥ１８ＳベクターのＥｃｏＲ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉサイトへ組込んだ。
2) Preparation of pME18S-hRTP1S vector The hRTP1S gene (SEQ ID NO: 3) was cloned by PCR using the human RTP1 gene (MHS1010-9205862: Open Biosystems) as a template. For the primers used for PCR, EcoR I site was added to the sense side and Xho I site was added to the antisense side. The hRTP1S gene amplified by the PCR method was incorporated into the EcoRI and XhoI sites of the pME18S vector.
３）ＯＲ５１Ｉ２発現細胞の作製
ＯＲ５１Ｉ２を発現させたＨＥＫ２９３細胞を作製した。表１に示す組成の反応液を調製し、クリーンベンチ内で１５分間静置した。９６ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の各ウェルに反応液５０μＬを添加し、次いでＨＥＫ２９３細胞（３×１０５細胞／ｃｍ２）を１００μＬ播種した。３７℃、５％ＣＯ２を保持したインキュベータ内で細胞を２４時間培養した。
3) Preparation of cells expressing OR51I2 HEK293 cells expressing OR51I2 were prepared. A reaction solution having the composition shown in Table 1 was prepared and allowed to stand in a clean bench for 15 minutes. 50 μL of the reaction solution was added to each well of a 96-well plate (Becton, Dickinson), and 100 μL of HEK293 cells (3×10 5 cells/cm 2 ) were seeded. The cells were cultured for 24 hours in an incubator kept at 37° C. and 5% CO 2 .
４）ルシフェラーゼアッセイ
ＨＥＫ２９３細胞に発現させた嗅覚受容体は、細胞内在性のＧαｓと共役しアデニル酸シクラーゼを活性化することで、細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる。本実施例での悪臭物質に対する細胞の応答測定には、細胞内ｃＡＭＰ量の増加をホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｆｌｕｃ２Ｐ−ＣＲＥ−ｈｙｇｒｏ）由来の発光値としてモニターするルシフェラーゼレポータージーンアッセイを用いた。また、ＣＭＶプロモータ下流にウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を融合させたもの（ｈＲｌｕｃ−ＣＭＶ）を同時に細胞に遺伝子導入し、遺伝子導入効率や細胞数の誤差を補正する内部標準として用いた。３）の操作後、嗅覚受容体発現細胞の培養物から培地を取り除き、各ウェルにイソ吉草酸を含むＣＤ２９３培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を７５μＬずつ添加した（イソ吉草酸最終濃度０、３、１０、３０、１００、３００、及び１０００μＭ）。細胞をＣＯ２インキュベータ内で４時間培養し、ルシフェラーゼ遺伝子を細胞内で十分に発現させた。ルシフェラーゼの活性測定は、Ｄｕａｌ−ＧｌｏTMｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて製品の操作マニュアルに従って行い、ホタルルシフェラーゼ由来の発光値をウミシイタケルシフェラーゼ由来の発光値で除した値［ｆＬｕｃ／ｈＲｌｕｃ］を算出した。悪臭物質で刺激した細胞からの算出値を、悪臭物質刺激なしの細胞からの算出値で割った値をＦｏｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅとして求め、応答強度の指標とした。
4) Luciferase Assay The olfactory receptor expressed in HEK293 cells increases intracellular cAMP level by activating adenylate cyclase by coupling with intracellular Gαs. The luciferase reporter gene assay for monitoring the increase in intracellular cAMP amount as the luminescence value derived from the firefly luciferase gene (fluc2P-CRE-hygro) was used for measuring the response of cells to malodorous substances in this example. In addition, a fusion of the Renilla luciferase gene downstream of the CMV promoter (hRluc-CMV) was introduced into the cells at the same time and used as an internal standard for correcting the error in the gene introduction efficiency and the cell number. After the operation of 3), the medium was removed from the culture of the olfactory receptor-expressing cells, and 75 μL each of CD293 medium (Thermo Fisher Scientific) containing isovaleric acid was added to each well (final concentration of isovaleric acid 0, 3, 10). , 30, 100, 300, and 1000 μM). The cells were cultured in a CO 2 incubator for 4 hours to fully express the luciferase gene in the cells. The luciferase activity was measured according to the operation manual of the product using Dual-Glo ™ luciferase assay system (Promega), and the value [fLuc/hRluc] obtained by dividing the luminescence value derived from firefly luciferase by the luminescence value derived from Renilla luciferase. It was calculated. A value obtained by dividing the calculated value from the cells stimulated with the malodorous substance by the calculated value from the cells not stimulated with the malodorous substance was obtained as Fold increase and used as an index of the response intensity.
５）結果
図１に示すように、ＯＲ５１Ｉ２発現細胞は、イソ吉草酸に対して濃度依存的に応答した。この結果から、ＯＲ５１Ｉ２がイソ吉草酸受容体であることが確認された。
5) Results As shown in FIG. 1, OR51I2-expressing cells responded to isovaleric acid in a concentration-dependent manner. From this result, it was confirmed that OR51I2 is an isovaleric acid receptor.
実施例２ アセチルセドレン、γ−メチルイオノン及びガラクソリドによるＯＲ５１Ｉ２のイソ吉草酸応答抑制
実施例１と同様の手順に従って、ＯＲ５１Ｉ２発現ＨＥＫ２９３細胞のルシフェラーゼアッセイを行い、アセチルセドレン、γ-メチルイオノン及びガラクソリドによる受容体応答の抑制効果を評価した。ルシフェラーゼアッセイにおいては、悪臭物質として１ｍＭイソ吉草酸を用い、かつイソ吉草酸とともにアセチルセドレン、γ−メチルイオノン又はガラクソリドを細胞に添加した。アセチルセドレンの最終濃度は、３、１０、３０、１００μＭに、γ-メチルイオノン及びガラクソリドの最終濃度は、３、１０、３０、１００、３００μＭに調整した。イソ吉草酸の単独刺激により誘導されたｆＬｕｃ／ｈＲｌｕｃ（Ｘ）、イソ吉草酸刺激なしの細胞でのｆＬｕｃ／ｈＲｌｕｃ（Ｙ）、及びイソ吉草酸とアセチルセドレン、γ-メチルイオノン又はガラクソリドとの混合物での刺激で誘導されたｆＬｕｃ／ｈＲｌｕｃ（Ｚ）を算出した。下記式により、アセチルセドレン、γ-メチルイオノン又はガラクソリド存在下での受容体のイソ吉草酸応答の変化を、イソ吉草酸応答強度（％）として評価した。独立した実験を二連で複数回行い、各回の実験の平均値を得た。
イソ吉草酸応答強度（％）＝｛（Ｚ−Ｙ）／（Ｘ−Ｙ）｝×１００
Example 2 Suppression of isovaleric acid response of OR51I2 by acetylcedrene, γ-methylionone and galaxolid According to the same procedure as in Example 1, luciferase assay of HEK293 cells expressing OR51I2 was performed, and acceptance by acetylcedrene, γ-methylionone and galaxolide. The effect of suppressing body response was evaluated. In the luciferase assay, 1 mM isovaleric acid was used as the malodorous substance, and acetylcedrene, γ-methylionone or galaxolide was added to the cells together with isovaleric acid. The final concentrations of acetylcedrene were adjusted to 3, 10, 30, 100 μM, and the final concentrations of γ-methylionone and galaxolide were adjusted to 3, 10, 30, 100, 300 μM. FLuc/hRluc(X) induced by isovaleric acid monostimulation, fLuc/hRluc(Y) in cells without isovaleric acid stimulation, and mixtures of isovaleric acid with acetylcedrene, γ-methylionone or galaxolide. The fLuc/hRluc(Z) induced by stimulation with 1. was calculated. The change in the isovaleric acid response of the receptor in the presence of acetylcedrene, γ-methylionone or galaxolide was evaluated as the isovaleric acid response strength (%) by the following formula. Independent experiments were performed multiple times in duplicate, and the average value of each experiment was obtained.
Isovaleric acid response strength (%)={(Z−Y)/(X−Y)}×100
結果を図２に示す。アセチルセドレン、γ−メチルイオノン及びガラクソリドのいずれも、濃度依存的にイソ吉草酸に対するＯＲ５１Ｉ２の応答を抑制した。以上の結果から、これら３つの化合物がＯＲ５１Ｉ２アンタゴニストであることが確認された。 The results are shown in Figure 2. All of acetyl cedrene, γ-methylionone and galaxolid suppressed the response of OR51I2 to isovaleric acid in a concentration-dependent manner. From the above results, it was confirmed that these three compounds are OR51I2 antagonists.
実施例３ ＯＲ５１Ｉ２アンタゴニストのイソ吉草酸臭抑制能
実施例２で同定したＯＲ５１Ｉ２アンタゴニストであるアセチルセドレン、γ−メチルイオノン及びガラクソリドについて、イソ吉草酸臭抑制能を官能試験により評価した。
Example 3 Isovaleric Acid Odor Control Ability of OR51I2 Antagonist With respect to the OR51I2 antagonists acetylcedrene, γ-methylionone and galaxolide identified in Example 2, the isovaleric acid odor control ability was evaluated by a sensory test.
イソ吉草酸、アセチルセドレン、γ−メチルイオノン及びガラクソリドは、それぞれプロピレングリコールで１００倍に希釈した。ガラス瓶（柏洋硝子Ｎｏ．１１、容量１１０ｍＬ）に入れた綿球に、希釈したイソ吉草酸溶液のみを２０μＬ滴下して基準サンプルを調製した。同様のガラス瓶中の綿球に、イソ吉草酸溶液と、アセチルセドレン、γ−メチルイオノン又はガラクソリド溶液とをそれぞれ２０μＬ滴下して試験サンプルを調製した。基準サンプル及び試験サンプルは一晩室温で静置して匂い分子をガラス瓶中で充分揮発させた。官能試験はパネラー４名で行い、基準サンプルのイソ吉草酸臭の強さを５としたときの試験サンプルのイソ吉草酸臭の強さを０から１０（０．５刻み）の２０段階で評価した。 Isovaleric acid, acetyl cedrene, γ-methylionone and galaxolide were each diluted 100 times with propylene glycol. 20 μL of the diluted isovaleric acid solution alone was dropped into a cotton ball placed in a glass bottle (Kashiwa Glass No. 11, volume: 110 mL) to prepare a reference sample. To a cotton ball in the same glass bottle, 20 μL each of the isovaleric acid solution and the acetylcedrene, γ-methylionone or galaxolide solution was dropped to prepare a test sample. The standard sample and the test sample were allowed to stand overnight at room temperature to sufficiently volatilize the odor molecules in the glass bottle. The sensory test was conducted by four panelists, and the strength of the isovaleric acid odor of the test sample was evaluated on a scale of 20 from 0 to 10 (in increments of 0.5) when the strength of the isovaleric acid smell of the reference sample was set to 5. did.
官能試験の結果を図３に示す。アセチルセドレン、γ−メチルイオノン及びガラクソリドは、いずれもイソ吉草酸臭を顕著に抑制した。 The results of the sensory test are shown in FIG. Acetyl cedrene, γ-methylionone and galaxolide all significantly suppressed the isovaleric acid odor.
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