JP2020073459A - ヒストンによる細胞傷害を抑制するための薬剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】 ヒストンによる細胞傷害を効果的に抑制することができる薬剤を提供する。【解決手段】 ヒストンによる細胞傷害を抑制するための薬剤であって、アンチトロンビンＩＩＩを有効成分とすることを特徴とする。アンチトロンビンＩＩＩは、β体のものが好ましい。【選択図】図３
Description
本発明は、ヒストンによる細胞傷害を抑制するための薬剤に関する。
ヒストン（Ｈｉｓｔｏｎｅ）は生体に必要な機能を有する蛋白質である。しかし、炎症によってヒストンが過剰に細胞外に放出されると、病態悪化を引き起こし、生体を死に至らしめることがあることが近年報告されており、ヒストンについて活発な基礎研究が行われている。
ヒストンは、長いＤＮＡ分子を折り畳んで核内に収納する役割を持つ蛋白質であり、ヌクレオソーム間のＤＮＡに結合するヒストンＨ１を代表とするリンカーヒストンと、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４の４種類に分類されるコアヒストンとに大別される。このうち、コアヒストンは、それぞれ２分子ずつ集まり、ヒストン八量体（ヒストンオクタマー）を形成する。１つのヒストン八量体は、約１４６ｂｐのＤＮＡを左巻きに約１．６５回巻き付け、ヌクレオソームを構築する。コアヒストン（特にＨ３とＨ４）は、進化的によく保存されているのに対し、リンカーヒストンの一次構造は、より多様性が大きいことが知られている。表１にヒストンの種類及びその分子量を示した。
このように、ヒストンは、ＤＮＡを効率よく核内に収納する役割を持つ蛋白質であるが、細胞外に放出されると別の作用を有することが明らかになってきている。具体的には、細胞外に放出されたヒストンは、断片化したＤＮＡとともにＮＥＴｓ（Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｒａｐｓ）の主要構成要素であり、その高い殺細胞効果と凝固活性化作用によって生体防御に貢献していることが明らかになってきている。
しかし一方で、細胞外に放出されて血中に遊離したヒストンは、その細胞傷害性により、様々な疾患の増悪因子ともなり得る。例えば、非特許文献１には、コアヒストンのうち、特にヒストンＨ３とＨ４に内皮細胞に対する高い傷害性が見られることが開示されている。
ヒストンによる細胞傷害を抑制するための方法として、非特許文献１には、ヒストンＨ４抗体の投与、又は活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）の投与が提案されている。しかしながら、これらの薬剤によるヒストンの細胞傷害抑制効果は、あまり高くなく、実用的ではなかった。従って、ヒストンによる細胞傷害を効果的に抑制することができる薬剤の開発が求められていた。
Ｊｕｎ Ｘｕ．ＮａｔＭｅｄ．２００９ Ｎｏｖｅｎｂｅｒ；１５（１１）：１３１８−１３２１
本発明は、かかる従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、その目的は、ヒストンによる細胞傷害を効果的に抑制することができる薬剤を提供することにある。
本発明者らは、かかる目的を達成するために、ヒストンによる細胞傷害を抑制することができる薬剤について鋭意検討した結果、糖蛋白質の一種であるアンチトロンビンＩＩＩが、ヒストンによる細胞傷害を効果的に抑制することができることを見出した。また、アンチトロンビンＩＩＩには、α体とβ体の二種類のアイソフォームが存在するが、α体よりもβ体の方が上記の抑制効果が強いことを見出した。本発明者らは、かかる知見に基づき、本発明を完成させた。
即ち、本発明によれば、以下の（１）〜（６）の構成が提供される。
（１）ヒストンによる細胞傷害を抑制するための薬剤であって、アンチトロンビンＩＩＩを有効成分とすることを特徴とする薬剤。
（２）ヒストンがコアヒストンであることを特徴とする（１）に記載の薬剤。
（３）ヒストンがヒストンＨ３又はヒストンＨ４であることを特徴とする（２）に記載の薬剤。
（４）アンチトロンビンＩＩＩがα体又はβ体であることを特徴とする（１）〜（３）のいずれか一つに記載の薬剤。
（５）アンチトロンビンＩＩＩがβ体であることを特徴とする（４）に記載の薬剤。
（６）アンチトロンビンＩＩＩが血漿由来であることを特徴とする（１）〜（５）のいずれか一つに記載の薬剤。
（１）ヒストンによる細胞傷害を抑制するための薬剤であって、アンチトロンビンＩＩＩを有効成分とすることを特徴とする薬剤。
（２）ヒストンがコアヒストンであることを特徴とする（１）に記載の薬剤。
（３）ヒストンがヒストンＨ３又はヒストンＨ４であることを特徴とする（２）に記載の薬剤。
（４）アンチトロンビンＩＩＩがα体又はβ体であることを特徴とする（１）〜（３）のいずれか一つに記載の薬剤。
（５）アンチトロンビンＩＩＩがβ体であることを特徴とする（４）に記載の薬剤。
（６）アンチトロンビンＩＩＩが血漿由来であることを特徴とする（１）〜（５）のいずれか一つに記載の薬剤。
本発明の薬剤によれば、ヒストンによる細胞傷害を効果的に抑制することができ、結果としてかかる細胞傷害に起因した疾患を治療及び／又は予防することができる。
本発明の薬剤は、ヒストンによる細胞傷害を抑制するためのものである。ヒストンは、上述のように、ＤＮＡを効率よく核内に収納する役割を持つ蛋白質であるが、細胞外に放出されると、細胞を傷害する作用を有し、様々な疾患の増悪因子ともなり得る。本発明の薬剤は、ヒストンによる細胞傷害を効果的に抑制するものであり、結果として細胞傷害に起因した様々な疾患を治療及び／又は予防するものである。
本発明において、「ヒストンによる細胞傷害」とは、ヒストンが細胞膜を傷つけて不安定にし、それによって細胞の代謝能を低下させて、細胞を弱らせ、最悪の場合、細胞を死に至らしめる現象を意味する。また、本発明において、「ヒストンによる細胞傷害」を「抑制する」とは、上記現象を緩和すること、上記現象の進行を阻害すること、及び／又は上記現象の発生を防止することを意味する。
本発明の薬剤では、リンカーヒストンによる細胞傷害、及びコアヒストンによる細胞傷害のいずれも抑制対象とすることができるが、特にコアヒストンによる細胞傷害を抑制対象とすることができ、さらには、コアヒストンの中でも、内皮細胞に対して高い傷害性を示すことが知られているヒストンＨ３又はヒストンＨ４による細胞傷害を効果的に抑制することができる。
本発明の薬剤は、アンチトロンビンＩＩＩを有効成分として含有することを特徴とする。アンチトロンビンＩＩＩ（以下、ＡＴ−ＩＩＩとも言う）は、血中における重要な血液凝固阻害系因子（セリンプロテアーゼ阻害剤）として知られており、ヒト血漿中に約１５０ｍｇ／Ｌの濃度で存在する。ＡＴ−ＩＩＩは４３２個のアミノ酸残基よりなる分子量約５９０００〜６５０００の糖蛋白質であり、分子内に３個のジスルフィド結合（Ｃｙｓ８−Ｃｙｓ１２８、Ｃｙｓ２１−Ｃｙｓ９５およびＣｙｓ２４７−Ｃｙｓ４３０）を有している。ＡＴ−ＩＩＩのＮ末端から９６番目、１３５番目、１５５番目および１９２番目の４箇所のアスパラギン残基（それぞれＡｓｎ９６、Ａｓｎ１３５、Ａｓｎ１５５およびＡｓｎ１９２と表す）にＮ−グリコシド結合により糖鎖が付加する。
ヒト血漿中に存在するＡＴ−ＩＩＩには、４本のＮ−グリコシド結合糖鎖を有するα体およびＡｓｎ１３５へのＮ−グリコシド結合糖鎖の付加がなく３本の糖鎖しか有さないβ体の二種類のアイソフォームが存在する。ヒト血漿中のＡＴ−ＩＩＩは、９０〜９５％がα体、残りの５〜１０％がβ体で構成される。
本発明の薬剤では、ＡＴ−ＩＩＩの二種類のアイソフォームであるα体とβ体のいずれも有効成分として使用することができるが、効果の強さの点でβ体を使用することが特に好ましい。以下の実施例に示すように、β体の方がα体より、ヒストンによる細胞傷害を抑制する効果に優れることが見出されている。
ＡＴ−ＩＩＩは、従来公知の製造方法で入手することができるが、例えば血漿を原料として、クロマトグラフィなどを使用して常法に従って精製することによって得られたものを使用することができる。また、このような血漿由来のもの以外に、ＡＴ−ＩＩＩ生産遺伝子組み換えＣＨＯ細胞やトランスジェニック動物によって生産された組み換えＡＴ−ＩＩＩも同様に使用することができる。
本発明の薬剤の投与方法は、従来公知の方法を適宜採用することができ、特に限定されないが、静脈注射や腹腔内投与などの非経口投与方法が、薬剤の効果を十分に発揮させるために好ましい。具体的な投与形態としては、本発明の薬剤の有効成分であるＡＴ−ＩＩＩの製剤を、所望により安定化剤などの通常使用される添加剤と共に、水や生理食塩水などの好適な溶媒に溶解し、静脈や腹腔に投与することができる。製剤としては、水溶液、懸濁液、凍結乾燥剤等が挙げられる。本発明の薬剤中の有効成分であるＡＴ−ＩＩＩの濃度は、投与形態や病状に応じて適宜設定すればよいが、一般的に２００〜３０００国際単位（ＩＵ）である。
以下に本発明の薬剤の優れた効果（ヒストンによる細胞傷害を抑制する効果）を具体的に示す。なお、実施例の記載は、純粋に発明の理解のためのみに挙げるものであり、本発明は、これらの実施例によって何ら限定されるものではない。
実施例では、まず、ＡＴ−ＩＩＩのα体及びβ体を血漿から精製し、その特性を確認した。また、ヒストンとしては、市販品を使用し、その特性を確認した。次に、これらのＡＴ−ＩＩＩのα体及びβ体並びにヒストンを使用して、ＬＤＨ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ及びＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８を利用して、ＡＴ−ＩＩＩのα体及びβ体による、ヒストンによる細胞傷害の抑制効果を検証した。なお、ＬＤＨ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔは、細胞から放出された乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を高感度に測定することにより細胞傷害を測定するキットであり、細胞膜の安定化効果を検出することができる。また、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８は、水溶性テトラゾリウム塩ＷＳＴ−８を発色試薬として用いた生細胞数測定キットであり、細胞呼吸活性を介し、発色が起こるため、細胞の代謝能を評価することができる。具体的な手順は、以下の通りである。
（１）ＡＴ−ＩＩＩのα体及びβ体の精製
コーン低温エタノール分画の上清Ｉ約１７．５リットルをＤＥＡＥ陰イオン交換体で処理した後、未吸着画分をプールとして集めた。
コーン低温エタノール分画の上清Ｉ約１７．５リットルをＤＥＡＥ陰イオン交換体で処理した後、未吸着画分をプールとして集めた。
０．０２Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）で予め平衡化したヘパリン−セファロース６ＦＦゲル（ＧＥヘルスケア社製）約３７０ｍｌを充填したカラムに前述のプール画分を５℃で負荷した。引き続き、５〜１０℃でそれぞれ０．０２Ｍのリン酸緩衝液、０．３Ｍ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７．３）３．０リットルで洗浄した後、それぞれ０．０２Ｍリン酸緩衝液、２．０Ｍ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７．３）３．０リットルでＡＴ−ＩＩＩを溶出した。
次いで、ヘパリン−セファロースゲルから溶出したＡＴ−ＩＩＩ画分を限外濾過装置（ポール社製 ポアサイズ１０Ｋ）を用い、５〜１０℃で０．１Ｍ以下の塩濃度になるよう脱塩し、約２００ｍｌになるまで濃縮した。
前記画分を０．０１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で約１．０リットルに希釈した。予め０．０１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＱ−セファロースＦＦゲル（ＧＥヘルスケア社製、トリメチルアミノメチル／架橋アガロース）約３４０ｍｌに前述の希釈液を５〜１０℃で負荷した。次いで、同温度条件下で０．０１Ｍリン酸緩衝液、０．１２Ｍ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７．０）を６．０リットル送液して洗浄した後、０．０１Ｍのリン酸緩衝液、０．１７Ｍ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７．０）を３．０リットル送液し、ＡＴ−ＩＩＩを溶出した。
この溶出画分をさらに精製するため、再度ヘパリン−セファロースゲル処理を行った。すなわち０．０２Ｍのリン酸緩衝液、ｐＨ７．３で予め平衡化したヘパリン−セファロースゲル約３７０ｍｌを充填したカラムに、前述のＱ−セファロースＦＦゲルの溶出液を５〜１０℃で負荷した。引き続き、同温度条件下でそれぞれ０．０２Ｍのリン酸緩衝液、０．３Ｍ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７．３）３．０リットルで洗浄した後、それぞれ０．０２Ｍリン酸緩衝液、２．０Ｍ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７．３）３．０リットルでＡＴ−ＩＩＩを溶出した。
この溶出画分からα体とβ体を分離精製するため、再度ヘパリン−セファロースゲル処理を行った。すなわち０．０２Ｍのリン酸緩衝液、ｐＨ７．３で予め平衡化したヘパリン−セファロースゲル約３７０ｍｌを充填したカラムに、前述のヘパリン−セファロースゲルの溶出液を５〜１０℃で負荷した。引き続き、同温度条件下でそれぞれ０．０２Ｍのリン酸緩衝液、０．３Ｍ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７．３）３．０リットルで洗浄した後、それぞれ０．０２Ｍリン酸緩衝液、１．３Ｍ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７．３）３．０リットルでα体を、０．０２Ｍリン酸緩衝液、３．０Ｍ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７．３）３．０リットルでβ体を溶出した。
次いで、ヘパリン−セファロースゲルから溶出した各ＡＴ−ＩＩＩ画分を限外濾過装置（ポール社製 ポアサイズ１０Ｋ）を用い、５〜１０℃で０．０２Ｍのリン酸緩衝液、０．１５Ｍ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７．３）にて脱塩し、波長２８０ｎｍにおける吸光度が約１０になるように濃縮した液を、０．２μｍメンブランフィルターを用いてろ過し、ＡＴ−ＩＩＩα体製剤及びＡＴ−ＩＩＩβ体製剤とした。
（２）ＡＴ−ＩＩＩのα体及びβ体の特性の確認
（ｉ）肉眼観察
（１）で得たＡＴ−ＩＩＩα体製剤及びＡＴ−ＩＩＩβ体製剤について、日本薬局方の注射剤の不溶性異物検査法に準じて肉眼観察した。その結果、ＡＴ−ＩＩＩα体製剤及びＡＴ−ＩＩＩβ体製剤の外観は、いずれも無色〜淡黄色の透明な液であり、不溶性異物を認めなかった。
（ｉ）肉眼観察
（１）で得たＡＴ−ＩＩＩα体製剤及びＡＴ−ＩＩＩβ体製剤について、日本薬局方の注射剤の不溶性異物検査法に準じて肉眼観察した。その結果、ＡＴ−ＩＩＩα体製剤及びＡＴ−ＩＩＩβ体製剤の外観は、いずれも無色〜淡黄色の透明な液であり、不溶性異物を認めなかった。
（ｉｉ）比活性
実施例１で得たＡＴ−ＩＩＩα体製剤及びＡＴ−ＩＩＩβ体製剤について、それぞれＡＴ−ＩＩＩα体及びβ体の比活性を試験した。
実施例１で得たＡＴ−ＩＩＩα体製剤及びＡＴ−ＩＩＩβ体製剤について、それぞれＡＴ−ＩＩＩα体及びβ体の比活性を試験した。
ＡＴ−ＩＩＩの活性の測定
Ｓ−２２３８を用いる合成其質法により行った。ＡＴ−ＩＩＩ標準原液、トロンビン溶液、検体希釈液、其質液及び反応停止液を下記のとおり調製した。
Ｓ−２２３８を用いる合成其質法により行った。ＡＴ−ＩＩＩ標準原液、トロンビン溶液、検体希釈液、其質液及び反応停止液を下記のとおり調製した。
＜試験材料＞
ＡＴ−ＩＩＩ標準原液：正常血漿剤「第一」（積水メディカル社製）に蒸留水１ｍＬを添加し完全に溶解した（１ＩＵ／ｍＬ）。
トロンビン溶液：ＨＳＡ（人血漿アルブミン ＳＩＧＭＡ社 Ａ−１６５３）２０ｍｇ及び塩化ナトリウム ０．９ｇを１００ｍＬの蒸留水に溶解し、この液をトロンビン希釈液とした。ヒトトロンビン（ＳＩＧＭＡ社製 Ｔ−６８８４ １ＫＵ／ｖｉａｌ）に生理食塩液を加えてトロンビン活性が１０００Ｕ／ｍＬとなるように溶解した。さらに、トロンビン希釈液を加えてトロンビン活性が３Ｕ／ｍＬになるように希釈し、トロンビン溶液を調製した。
検体希釈液：２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール１．７４ｇ、ＥＤＴＡ・２Ｎａ ０．８０ｇ、ＨＳＡ（人血漿アルブミン ＳＩＧＭＡ社 Ａ−１６５３）０．３６ｇ、塩化ナトリウム５．８９ｇ、ヘパリンナトリウム（Ｓｉｇｍａ社製、Ｈ−９３９９）２７単位（Ｕ）を量り、蒸留水で溶解し、２００ｍＬとした。ｐＨを８．４±０．１となる様に５Ｎ塩酸で調整した。
基質液（２．１４ｍｇ／ｍＬ）：合成基質Ｓ−２２３８（積水メディカル社製、２５ｍｇ/ｖｉａｌ）１ｖｉａｌに蒸留水１１．６６ｍＬを加え溶解した。
反応停止液：くえん酸一水和物３．１５ｇを５００ｍＬの蒸留水で溶解した。
ＡＴ−ＩＩＩ標準原液：正常血漿剤「第一」（積水メディカル社製）に蒸留水１ｍＬを添加し完全に溶解した（１ＩＵ／ｍＬ）。
トロンビン溶液：ＨＳＡ（人血漿アルブミン ＳＩＧＭＡ社 Ａ−１６５３）２０ｍｇ及び塩化ナトリウム ０．９ｇを１００ｍＬの蒸留水に溶解し、この液をトロンビン希釈液とした。ヒトトロンビン（ＳＩＧＭＡ社製 Ｔ−６８８４ １ＫＵ／ｖｉａｌ）に生理食塩液を加えてトロンビン活性が１０００Ｕ／ｍＬとなるように溶解した。さらに、トロンビン希釈液を加えてトロンビン活性が３Ｕ／ｍＬになるように希釈し、トロンビン溶液を調製した。
検体希釈液：２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール１．７４ｇ、ＥＤＴＡ・２Ｎａ ０．８０ｇ、ＨＳＡ（人血漿アルブミン ＳＩＧＭＡ社 Ａ−１６５３）０．３６ｇ、塩化ナトリウム５．８９ｇ、ヘパリンナトリウム（Ｓｉｇｍａ社製、Ｈ−９３９９）２７単位（Ｕ）を量り、蒸留水で溶解し、２００ｍＬとした。ｐＨを８．４±０．１となる様に５Ｎ塩酸で調整した。
基質液（２．１４ｍｇ／ｍＬ）：合成基質Ｓ−２２３８（積水メディカル社製、２５ｍｇ/ｖｉａｌ）１ｖｉａｌに蒸留水１１．６６ｍＬを加え溶解した。
反応停止液：くえん酸一水和物３．１５ｇを５００ｍＬの蒸留水で溶解した。
＜試験方法＞
ＡＴ−ＩＩＩ標準原液を検体希釈液で４０倍、８０倍希釈し、ＡＴ−ＩＩＩ標準液とした。また、検体を検体希釈液で測定値が検量線範囲内となるように希釈し、試料液とした。試験管にＡＴ−ＩＩＩ標準液、試料液及び検体希釈液を５０μＬずつ分注した。各試験管にトロンビン溶液２００μＬずつを添加し、混和した後、３７℃で正確に５分間加温後、基質液２００μＬずつを各試験管に添加し、混和した後、さらに３７℃で正確に５分間加温した後、反応停止液２ｍＬを添加し、反応を停止した。各ＡＴ−ＩＩＩ標準液、試料液及び検体希釈液から得られた反応液について、分光光度計で波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。ＡＴ−ＩＩＩ標準液の吸光度から検量線を作成し、試料液中のＡＴ−ＩＩＩの活性を算出した。
ＡＴ−ＩＩＩ標準原液を検体希釈液で４０倍、８０倍希釈し、ＡＴ−ＩＩＩ標準液とした。また、検体を検体希釈液で測定値が検量線範囲内となるように希釈し、試料液とした。試験管にＡＴ−ＩＩＩ標準液、試料液及び検体希釈液を５０μＬずつ分注した。各試験管にトロンビン溶液２００μＬずつを添加し、混和した後、３７℃で正確に５分間加温後、基質液２００μＬずつを各試験管に添加し、混和した後、さらに３７℃で正確に５分間加温した後、反応停止液２ｍＬを添加し、反応を停止した。各ＡＴ−ＩＩＩ標準液、試料液及び検体希釈液から得られた反応液について、分光光度計で波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。ＡＴ−ＩＩＩ標準液の吸光度から検量線を作成し、試料液中のＡＴ−ＩＩＩの活性を算出した。
蛋白質量の定量
Ｃｙｎｔｈｉａ Ｂ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎら（Ｃｙｎｔｈｉａ Ｂ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｍｉｃｈａｅｌ Ｎ．Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ．（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０，Ｎｏ．１，Ｐ６１０−６１５）の方法により、波長２８０ｎｍにおける吸光度からＡＴ−ＩＩＩα体及びＡＴ−ＩＩＩβ体のそれぞれの濃度を算出した。１ｍｇ／ｍＬのＡＴ−ＩＩＩα体に相当する吸光度（波長２８０ｎｍ）は０．６５とし、１ｍｇ／ｍＬのＡＴ−ＩＩＩβ体に相当する吸光度（波長２８０ｎｍ）は０．６２とした。
Ｃｙｎｔｈｉａ Ｂ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎら（Ｃｙｎｔｈｉａ Ｂ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｍｉｃｈａｅｌ Ｎ．Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ．（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０，Ｎｏ．１，Ｐ６１０−６１５）の方法により、波長２８０ｎｍにおける吸光度からＡＴ−ＩＩＩα体及びＡＴ−ＩＩＩβ体のそれぞれの濃度を算出した。１ｍｇ／ｍＬのＡＴ−ＩＩＩα体に相当する吸光度（波長２８０ｎｍ）は０．６５とし、１ｍｇ／ｍＬのＡＴ−ＩＩＩβ体に相当する吸光度（波長２８０ｎｍ）は０．６２とした。
試験結果
ＡＴ−ＩＩＩα体製剤及びＡＴ−ＩＩＩβ体製剤について、ＡＴ−ＩＩＩの活性、波長２８０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ２８０）、蛋白質量、およびこれらの値より算出した比活性を表２に示す。表２からわかるように、比活性について、ＡＴ−ＩＩＩα体製剤は１１．２９ＩＵ／ＯＤを示したのに対し、β体は１５．８４ＩＵ／ＯＤと高い値を示した。
ＡＴ−ＩＩＩα体製剤及びＡＴ−ＩＩＩβ体製剤について、ＡＴ−ＩＩＩの活性、波長２８０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ２８０）、蛋白質量、およびこれらの値より算出した比活性を表２に示す。表２からわかるように、比活性について、ＡＴ−ＩＩＩα体製剤は１１．２９ＩＵ／ＯＤを示したのに対し、β体は１５．８４ＩＵ／ＯＤと高い値を示した。
（ｉｉｉ）電気泳動
（１）で得たＡＴ−ＩＩＩα体製剤及びＡＴ−ＩＩＩβ体製剤について、それぞれＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析を行った。
（１）で得たＡＴ−ＩＩＩα体製剤及びＡＴ−ＩＩＩβ体製剤について、それぞれＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析を行った。
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析
＜試験材料＞
・ ゲル：e−ＰＡＧＥＬ Ｅ−Ｔ７．５Ｌ（アトー社製、ゲル濃度７．５％）
・ トリス・グリシン・ＳＤＳ緩衝液（バイオラッド社製）
・ Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（バイオラッド社製）
・ 染色液：Ｂｉｏ−Ｓａｆｅクマシーステイン（バイオラッド社製）
・ 脱色液：クマシーブリリアントブルーＲ−２５０脱色液（バイオラッド社製）
・ 分子量用マーカー：デュアルカラースタンダード（バイオラッド社製、１６１−０３７４）
＜試験材料＞
・ ゲル：e−ＰＡＧＥＬ Ｅ−Ｔ７．５Ｌ（アトー社製、ゲル濃度７．５％）
・ トリス・グリシン・ＳＤＳ緩衝液（バイオラッド社製）
・ Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（バイオラッド社製）
・ 染色液：Ｂｉｏ−Ｓａｆｅクマシーステイン（バイオラッド社製）
・ 脱色液：クマシーブリリアントブルーＲ−２５０脱色液（バイオラッド社製）
・ 分子量用マーカー：デュアルカラースタンダード（バイオラッド社製、１６１−０３７４）
＜試験方法＞
Ｌａｅｍｍｌｉの方法［Ｎａｔｕｒｅ，２２７巻，６８０（１９７０）］に従って行った。検体を波長２８０ｎｍにおける吸光度が０．１となるようにリン酸緩衝液で希釈した後、等量のＬａｅｍｍｌｉサンプルバッファーを加えて混和し、試料液とした。本試料液１０μＬにつき、トリス・グリシン・ＳＤＳ緩衝液を電極用緩衝液とし、２０ｍＡの低電流で９０分間泳動した。分子量マーカーは、分子量用マーカー１バイアルを精製水１００μＬに溶解し、試料液と同様に処理した。泳動後、ゲルをガラス板対より取り出し、染色液に２時間浸した後、脱色液で液を交換しながら、染色バンドが明確になるまで洗い、写真撮影した。操作は全て室温で行った。
Ｌａｅｍｍｌｉの方法［Ｎａｔｕｒｅ，２２７巻，６８０（１９７０）］に従って行った。検体を波長２８０ｎｍにおける吸光度が０．１となるようにリン酸緩衝液で希釈した後、等量のＬａｅｍｍｌｉサンプルバッファーを加えて混和し、試料液とした。本試料液１０μＬにつき、トリス・グリシン・ＳＤＳ緩衝液を電極用緩衝液とし、２０ｍＡの低電流で９０分間泳動した。分子量マーカーは、分子量用マーカー１バイアルを精製水１００μＬに溶解し、試料液と同様に処理した。泳動後、ゲルをガラス板対より取り出し、染色液に２時間浸した後、脱色液で液を交換しながら、染色バンドが明確になるまで洗い、写真撮影した。操作は全て室温で行った。
試験結果
試験結果を図１に示す。図１からわかるように、ＡＴ−ＩＩＩα体製剤及びＡＴ−ＩＩＩβ体製剤は、それぞれほぼ単一のバンドを示した。また、β体において、α体より高い易動度が確認された。これは糖鎖の欠損による分子量低下を反映していると考えられた。
試験結果を図１に示す。図１からわかるように、ＡＴ−ＩＩＩα体製剤及びＡＴ−ＩＩＩβ体製剤は、それぞれほぼ単一のバンドを示した。また、β体において、α体より高い易動度が確認された。これは糖鎖の欠損による分子量低下を反映していると考えられた。
（３）ヒストンの特性の確認
（ｉ）電気泳動
ヒストンとしては、ヒストンＨ３（ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社（ＮＥＢ社）製、Ｍ２５０３Ｓ）、ヒストンＨ４（ＮＥＢ社製、Ｍ２５０４Ｓ）及び胸腺由来ヒストン（Ｓｉｇｍａ社製、Ｈ９２５０）を使用した。これらのヒストンについて、それぞれＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析を行った。
（ｉ）電気泳動
ヒストンとしては、ヒストンＨ３（ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社（ＮＥＢ社）製、Ｍ２５０３Ｓ）、ヒストンＨ４（ＮＥＢ社製、Ｍ２５０４Ｓ）及び胸腺由来ヒストン（Ｓｉｇｍａ社製、Ｈ９２５０）を使用した。これらのヒストンについて、それぞれＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析を行った。
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析
＜試験材料＞
・ ゲル：e−ＰＡＧＥＬ Ｅ−Ｔ５２０Ｌ（アトー社製、ゲル濃度５〜２０％）
・ トリス・グリシン・ＳＤＳ緩衝液（バイオラッド社製）
・ Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（バイオラッド社製）
・ 染色液：Ｂｉｏ−Ｓａｆｅクマシーステイン（バイオラッド社製）
・ 脱色液：クマシーブリリアントブルーＲ−２５０脱色液（バイオラッド社製）
・ 分子量用マーカー：デュアルカラースタンダード（バイオラッド社製、１６１−０３７４）
＜試験材料＞
・ ゲル：e−ＰＡＧＥＬ Ｅ−Ｔ５２０Ｌ（アトー社製、ゲル濃度５〜２０％）
・ トリス・グリシン・ＳＤＳ緩衝液（バイオラッド社製）
・ Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（バイオラッド社製）
・ 染色液：Ｂｉｏ−Ｓａｆｅクマシーステイン（バイオラッド社製）
・ 脱色液：クマシーブリリアントブルーＲ−２５０脱色液（バイオラッド社製）
・ 分子量用マーカー：デュアルカラースタンダード（バイオラッド社製、１６１−０３７４）
＜試験方法＞
Ｌａｅｍｍｌｉの方法［Ｎａｔｕｒｅ，２２７巻，６８０（１９７０）］に従って行った。検体を波長２８０ｎｍにおける吸光度が０．１となるようにリン酸緩衝液で希釈した後、等量のＬａｅｍｍｌｉサンプルバッファーを加えて混和し、試料液とした。本試料液１０μＬにつき、トリス・グリシン・ＳＤＳ緩衝液を電極用緩衝液とし、２０ｍＡの低電流で９０分間泳動した。分子量マーカーは、分子量用マーカー１バイアルを精製水１００μＬに溶解し、試料液と同様に処理した。泳動後、ゲルをガラス板対より取り出し、染色液に２時間浸した後、脱色液で液を交換しながら、染色バンドが明確になるまで洗い、写真撮影した。操作は全て室温で行った。
Ｌａｅｍｍｌｉの方法［Ｎａｔｕｒｅ，２２７巻，６８０（１９７０）］に従って行った。検体を波長２８０ｎｍにおける吸光度が０．１となるようにリン酸緩衝液で希釈した後、等量のＬａｅｍｍｌｉサンプルバッファーを加えて混和し、試料液とした。本試料液１０μＬにつき、トリス・グリシン・ＳＤＳ緩衝液を電極用緩衝液とし、２０ｍＡの低電流で９０分間泳動した。分子量マーカーは、分子量用マーカー１バイアルを精製水１００μＬに溶解し、試料液と同様に処理した。泳動後、ゲルをガラス板対より取り出し、染色液に２時間浸した後、脱色液で液を交換しながら、染色バンドが明確になるまで洗い、写真撮影した。操作は全て室温で行った。
試験結果
試験結果を図２に示す。図２からわかるように、ヒストンＨ３は分子量１．５万付近に、ヒストンＨ４は分子量１．１万付近にバンドが認められた。胸腺由来ヒストンは、ヒストン２Ａ、ヒストン２Ｂ、ヒストンＨ３、ヒストンＨ４などの様々なヒストンの混合物であるため、分子量１．１万付近及び１．３万から１．５万付近にバンドが認められた。
試験結果を図２に示す。図２からわかるように、ヒストンＨ３は分子量１．５万付近に、ヒストンＨ４は分子量１．１万付近にバンドが認められた。胸腺由来ヒストンは、ヒストン２Ａ、ヒストン２Ｂ、ヒストンＨ３、ヒストンＨ４などの様々なヒストンの混合物であるため、分子量１．１万付近及び１．３万から１．５万付近にバンドが認められた。
実施例１
胸腺由来ヒストンで刺激した際の細胞傷害に対するアンチトロンビンＩＩＩの効果のＬＤＨ Ａｓｓａｙによる検証
１）ＬＤＨ Ａｓｓａｙ方法
ラット大動脈由来血管内皮細胞（Ｒａｔ ＡＯＲＴＩＣ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ（ＲＡＯＥＣ），Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．製）を９６ウェルプレートに播種し、ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ状態になるまで培養後、（１）で調製したアンチトロンビンＩＩＩα体製剤を用い、アンチトロンビンＩＩＩα体を３００μｇ／ｍＬ含むように無血清培地に交換し、２時間培養を行った。２時間後に胸腺由来ヒストン（Ｈｉｓｔｏｎｅ ｆｒｏｍ ｃａｌｆ ｔｈｙｍｕｓ、Ｓｉｇｍａ社製）を最終濃度１５０μｇ／ｍＬになるように添加して５時間培養した後、１００μＬの培養上清を回収し、ＬＤＨ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いて培養上清のＬＤＨ量の評価を行なった。別に、（１）で調製したアンチトロンビンＩＩＩα体製剤の代わりに、（１）で調製したアンチトロンビンＩＩＩβ体製剤を用い、上記と同様に操作し、培養上清のＬＤＨ量の評価を行なった。
胸腺由来ヒストンで刺激した際の細胞傷害に対するアンチトロンビンＩＩＩの効果のＬＤＨ Ａｓｓａｙによる検証
１）ＬＤＨ Ａｓｓａｙ方法
ラット大動脈由来血管内皮細胞（Ｒａｔ ＡＯＲＴＩＣ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ（ＲＡＯＥＣ），Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．製）を９６ウェルプレートに播種し、ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ状態になるまで培養後、（１）で調製したアンチトロンビンＩＩＩα体製剤を用い、アンチトロンビンＩＩＩα体を３００μｇ／ｍＬ含むように無血清培地に交換し、２時間培養を行った。２時間後に胸腺由来ヒストン（Ｈｉｓｔｏｎｅ ｆｒｏｍ ｃａｌｆ ｔｈｙｍｕｓ、Ｓｉｇｍａ社製）を最終濃度１５０μｇ／ｍＬになるように添加して５時間培養した後、１００μＬの培養上清を回収し、ＬＤＨ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いて培養上清のＬＤＨ量の評価を行なった。別に、（１）で調製したアンチトロンビンＩＩＩα体製剤の代わりに、（１）で調製したアンチトロンビンＩＩＩβ体製剤を用い、上記と同様に操作し、培養上清のＬＤＨ量の評価を行なった。
２）試験結果
試験結果を図３に示す。図３からわかるように、胸腺由来ヒストンで刺激した際の細胞傷害に対してＡＴ−ＩＩＩα体及びＡＴ−ＩＩＩβ体では、無添加（Ｍｅｄｉｕｍ）に比べて顕著な細胞傷害抑制効果が認められた。また、ＡＴ−ＩＩＩα体よりもＡＴ−ＩＩＩβ体の方が、より顕著に細胞傷害抑制効果があることがわかった。
試験結果を図３に示す。図３からわかるように、胸腺由来ヒストンで刺激した際の細胞傷害に対してＡＴ−ＩＩＩα体及びＡＴ−ＩＩＩβ体では、無添加（Ｍｅｄｉｕｍ）に比べて顕著な細胞傷害抑制効果が認められた。また、ＡＴ−ＩＩＩα体よりもＡＴ−ＩＩＩβ体の方が、より顕著に細胞傷害抑制効果があることがわかった。
実施例２
胸腺由来ヒストンで刺激した際の細胞傷害に対するアンチトロンビンＩＩＩの効果のＣＣＫ-８ Ａｓｓａｙによる検証
１）ＣＣＫ−８ Ａｓｓａｙ方法
ラット大動脈由来血管内皮細胞（ＲＡＯＥＣ，Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．製）を９６ウェルプレートに播種し、ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ状態になるまで培養後、（１）で調製したアンチトロンビンＩＩＩα体製剤を用い、アンチトロンビンＩＩＩα体を３００μｇ／ｍＬ含むように無血清培地に交換し２時間培養を行った。２時間後に胸腺由来ヒストン（Ｈｉｓｔｏｎｅ ｆｒｏｍ ｃａｌｆ ｔｈｙｍｕｓ、Ｓｉｇｍａ社製、Ｎｏ．９２５０）を最終濃度３５μｇ／ｍＬになる様に添加して５時間培養した後、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（同仁化学研究所製）を用いて細胞生存率の評価を行なった。別に、（１）で調製したアンチトロンビンＩＩＩα体の代わりに（１）で調製したアンチトロンビンＩＩＩβ体を用い、上記と同様に操作し、細胞生存率の評価を行った。
胸腺由来ヒストンで刺激した際の細胞傷害に対するアンチトロンビンＩＩＩの効果のＣＣＫ-８ Ａｓｓａｙによる検証
１）ＣＣＫ−８ Ａｓｓａｙ方法
ラット大動脈由来血管内皮細胞（ＲＡＯＥＣ，Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．製）を９６ウェルプレートに播種し、ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ状態になるまで培養後、（１）で調製したアンチトロンビンＩＩＩα体製剤を用い、アンチトロンビンＩＩＩα体を３００μｇ／ｍＬ含むように無血清培地に交換し２時間培養を行った。２時間後に胸腺由来ヒストン（Ｈｉｓｔｏｎｅ ｆｒｏｍ ｃａｌｆ ｔｈｙｍｕｓ、Ｓｉｇｍａ社製、Ｎｏ．９２５０）を最終濃度３５μｇ／ｍＬになる様に添加して５時間培養した後、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（同仁化学研究所製）を用いて細胞生存率の評価を行なった。別に、（１）で調製したアンチトロンビンＩＩＩα体の代わりに（１）で調製したアンチトロンビンＩＩＩβ体を用い、上記と同様に操作し、細胞生存率の評価を行った。
２）試験結果
試験結果を図４に示す。図４からわかるように、胸腺由来ヒストン刺激による細胞死を評価したところ、３００μｇ／ｍＬの濃度のアンチトロンビンの添加により細胞の生存率に改善が認められた。
試験結果を図４に示す。図４からわかるように、胸腺由来ヒストン刺激による細胞死を評価したところ、３００μｇ／ｍＬの濃度のアンチトロンビンの添加により細胞の生存率に改善が認められた。
実施例３
ヒストンＨ４で刺激した際の細胞傷害に対する各アンチトロンビンＩＩＩ濃度の効果のＬＤＨ Ａｓｓａｙによる検証
１）ＬＤＨ Ａｓｓａｙ方法
ラット大動脈由来血管内皮細胞（ＲＡＯＥＣ，Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．製）を９６ウェルプレートに播種し、ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ状態になるまで培養後、（１）で調製したアンチトロンビンＩＩＩα体製剤を用い、アンチトロンビンＩＩＩα体を７５、１５０、３００及び６００μｇ／ｍＬを含む無血清培地に交換し２時間培養を行った。２時間後にヒストンＨ４（ＮＥＢ社製、Ｎｏ．Ｍ２５０４Ｓ）を最終濃度３５μｇ／ｍｌになる様に添加して５時間培養した後、１００μＬの培養上清を回収し、ＬＤＨ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いて培養上清のＬＤＨ量の評価を行なった。別に、（１）で調製したアンチトロンビンＩＩＩα体の代わりに（１）で調製したアンチトロンビンＩＩＩβ体を用い、上記と同様に操作し、ＬＤＨ量の評価を行なった。
ヒストンＨ４で刺激した際の細胞傷害に対する各アンチトロンビンＩＩＩ濃度の効果のＬＤＨ Ａｓｓａｙによる検証
１）ＬＤＨ Ａｓｓａｙ方法
ラット大動脈由来血管内皮細胞（ＲＡＯＥＣ，Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．製）を９６ウェルプレートに播種し、ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ状態になるまで培養後、（１）で調製したアンチトロンビンＩＩＩα体製剤を用い、アンチトロンビンＩＩＩα体を７５、１５０、３００及び６００μｇ／ｍＬを含む無血清培地に交換し２時間培養を行った。２時間後にヒストンＨ４（ＮＥＢ社製、Ｎｏ．Ｍ２５０４Ｓ）を最終濃度３５μｇ／ｍｌになる様に添加して５時間培養した後、１００μＬの培養上清を回収し、ＬＤＨ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いて培養上清のＬＤＨ量の評価を行なった。別に、（１）で調製したアンチトロンビンＩＩＩα体の代わりに（１）で調製したアンチトロンビンＩＩＩβ体を用い、上記と同様に操作し、ＬＤＨ量の評価を行なった。
２）試験結果
試験結果を図５〜図８に示す。図５〜図８からわかるように、ヒストンＨ４での刺激により遊離するＬＤＨ量を評価したところ、アンチトロンビンＩＩＩα体及びアンチトロンビンＩＩＩβ体の濃度依存的な遊離量の減少傾向が観察された。その傾向は、アンチトロンビンＩＩＩα体よりもアンチトロンビンＩＩＩβ体の方が、顕著に観察され、より顕著に細胞傷害抑制効果があることがわかった。
試験結果を図５〜図８に示す。図５〜図８からわかるように、ヒストンＨ４での刺激により遊離するＬＤＨ量を評価したところ、アンチトロンビンＩＩＩα体及びアンチトロンビンＩＩＩβ体の濃度依存的な遊離量の減少傾向が観察された。その傾向は、アンチトロンビンＩＩＩα体よりもアンチトロンビンＩＩＩβ体の方が、顕著に観察され、より顕著に細胞傷害抑制効果があることがわかった。
実施例４
ヒストンＨ４で刺激した際の細胞傷害に対する各アンチトロンビンＩＩＩ濃度の効果のＣＣＫ−８ Ａｓｓａｙによる検証
１）ＣＣＫ−８ Ａｓｓａｙ方法
ラット大動脈由来血管内皮細胞（ＲＡＯＥＣ，Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．製）を９６ウェルプレートに播種し、ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ状態になるまで培養後、（１）で調製したアンチトロンビンＩＩＩα体製剤を用い、アンチトロンビンＩＩＩα体を７５、１５０、３００及び６００μｇ／ｍＬを含む無血清培地に交換し２時間培養を行った。２時間後にヒストンＨ４（ＮＥＢ社製、Ｎｏ．Ｍ２５０４Ｓ）を最終濃度３５μｇ／ｍＬになる様に添加して５時間培養した後、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（同仁化学研究所製）を用いて細胞生存率の評価を行なった。別に、（１）で調製したアンチトロンビンＩＩＩα体の代わりに（１）で調製したアンチトロンビンＩＩＩβ体を用い、上記と同様に操作し、細胞生存率の評価を行なった。
ヒストンＨ４で刺激した際の細胞傷害に対する各アンチトロンビンＩＩＩ濃度の効果のＣＣＫ−８ Ａｓｓａｙによる検証
１）ＣＣＫ−８ Ａｓｓａｙ方法
ラット大動脈由来血管内皮細胞（ＲＡＯＥＣ，Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．製）を９６ウェルプレートに播種し、ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ状態になるまで培養後、（１）で調製したアンチトロンビンＩＩＩα体製剤を用い、アンチトロンビンＩＩＩα体を７５、１５０、３００及び６００μｇ／ｍＬを含む無血清培地に交換し２時間培養を行った。２時間後にヒストンＨ４（ＮＥＢ社製、Ｎｏ．Ｍ２５０４Ｓ）を最終濃度３５μｇ／ｍＬになる様に添加して５時間培養した後、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（同仁化学研究所製）を用いて細胞生存率の評価を行なった。別に、（１）で調製したアンチトロンビンＩＩＩα体の代わりに（１）で調製したアンチトロンビンＩＩＩβ体を用い、上記と同様に操作し、細胞生存率の評価を行なった。
２）試験結果
試験結果を図９〜図１２に示す。図９〜図１２からわかるように、ヒストンＨ４での刺激による細胞死を評価したところ、１５０μｇ／ｍＬ以上の濃度のアンチトロンビンの添加により細胞の生存率に改善が認められた。またその効果はα体と比べβ体の方が優れていた。
試験結果を図９〜図１２に示す。図９〜図１２からわかるように、ヒストンＨ４での刺激による細胞死を評価したところ、１５０μｇ／ｍＬ以上の濃度のアンチトロンビンの添加により細胞の生存率に改善が認められた。またその効果はα体と比べβ体の方が優れていた。
実施例５
ヒストンＨ３で刺激した際の細胞傷害に対するアンチトロンビンＩＩＩの効果のＣＣＫ−８ Ａｓｓａｙによる検証
１）ＣＣＫ−８ Ａｓｓａｙ方法
ラット大動脈由来血管内皮細胞（ＲＡＯＥＣ，Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．製）を９６ウェルプレートに播種し、ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ状態になるまで培養後、（１）で調製したアンチトロンビンＩＩＩα体製剤を用い、アンチトロンビンＩＩＩα体を３００μｇ／ｍＬを含む無血清培地に交換し２時間培養を行った。２時間後にヒストンＨ３（ＮＥＢ社製、Ｎｏ．Ｍ２５０３Ｓ）を最終濃度２５μｇ／ｍＬになる様に添加して１６時間培養した後、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（同仁化学研究所製）を用いて細胞生存率の評価を行なった。別に、（１）で調製したアンチトロンビンＩＩＩα体の代わりに（１）で調製したアンチトロンビンＩＩＩβ体を用い、上記と同様に操作し、細胞生存率の評価を行なった。
ヒストンＨ３で刺激した際の細胞傷害に対するアンチトロンビンＩＩＩの効果のＣＣＫ−８ Ａｓｓａｙによる検証
１）ＣＣＫ−８ Ａｓｓａｙ方法
ラット大動脈由来血管内皮細胞（ＲＡＯＥＣ，Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．製）を９６ウェルプレートに播種し、ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ状態になるまで培養後、（１）で調製したアンチトロンビンＩＩＩα体製剤を用い、アンチトロンビンＩＩＩα体を３００μｇ／ｍＬを含む無血清培地に交換し２時間培養を行った。２時間後にヒストンＨ３（ＮＥＢ社製、Ｎｏ．Ｍ２５０３Ｓ）を最終濃度２５μｇ／ｍＬになる様に添加して１６時間培養した後、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（同仁化学研究所製）を用いて細胞生存率の評価を行なった。別に、（１）で調製したアンチトロンビンＩＩＩα体の代わりに（１）で調製したアンチトロンビンＩＩＩβ体を用い、上記と同様に操作し、細胞生存率の評価を行なった。
２）試験結果
試験結果を図１３に示す。図１３からわかるように、ヒストンＨ３刺激による細胞死を評価したところ、３００μｇ／ｍＬのアンチトロンビンＩＩＩの添加により細胞の生存率に改善が認められた。またその効果はα体と比べβ体の方が優れていた。
試験結果を図１３に示す。図１３からわかるように、ヒストンＨ３刺激による細胞死を評価したところ、３００μｇ／ｍＬのアンチトロンビンＩＩＩの添加により細胞の生存率に改善が認められた。またその効果はα体と比べβ体の方が優れていた。
実施例６
ヒストンＨ３で刺激した際の細胞傷害に対するアンチトロンビンＩＩＩの効果の顕微鏡観察
ラット大動脈由来血管内皮細胞（ＲＡＯＥＣ，Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．製）を９６ウェルプレートに播種し、ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ状態になるまで培養後、（１）で調製したアンチトロンビンＩＩＩβ体製剤を用い、アンチトロンビンＩＩＩβ体を３００μｇ／ｍＬを含む無血清培地に交換し２時間培養を行った。２時間後にヒストンＨ３（ＮＥＢ社製、Ｎｏ．Ｍ２５０３Ｓ）を最終濃度２５μｇ／ｍＬになる様に添加して１６時間培養した後、培養細胞の形態を顕微鏡で観察し、写真撮影した。その結果を図１４に示す。図１４からわかるように、ヒストン刺激ありでアンチトロンビンＩＩＩβ体無添加の場合、ヒストン刺激なしでアンチトロンビンＩＩＩβ体無添加の場合と比べて細胞が減少し、細胞間の隙間が大きくなっている。これに対して、ヒストン刺激ありでアンチトロンビンＩＩＩβ体添加の場合、ヒストン刺激ありでアンチトロンビンＩＩＩβ体無添加の場合と比べて細胞の減少が少なく、細胞間の隙間が小さくなっている。
ヒストンＨ３で刺激した際の細胞傷害に対するアンチトロンビンＩＩＩの効果の顕微鏡観察
ラット大動脈由来血管内皮細胞（ＲＡＯＥＣ，Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．製）を９６ウェルプレートに播種し、ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ状態になるまで培養後、（１）で調製したアンチトロンビンＩＩＩβ体製剤を用い、アンチトロンビンＩＩＩβ体を３００μｇ／ｍＬを含む無血清培地に交換し２時間培養を行った。２時間後にヒストンＨ３（ＮＥＢ社製、Ｎｏ．Ｍ２５０３Ｓ）を最終濃度２５μｇ／ｍＬになる様に添加して１６時間培養した後、培養細胞の形態を顕微鏡で観察し、写真撮影した。その結果を図１４に示す。図１４からわかるように、ヒストン刺激ありでアンチトロンビンＩＩＩβ体無添加の場合、ヒストン刺激なしでアンチトロンビンＩＩＩβ体無添加の場合と比べて細胞が減少し、細胞間の隙間が大きくなっている。これに対して、ヒストン刺激ありでアンチトロンビンＩＩＩβ体添加の場合、ヒストン刺激ありでアンチトロンビンＩＩＩβ体無添加の場合と比べて細胞の減少が少なく、細胞間の隙間が小さくなっている。
本発明の薬剤は、ヒストンによる細胞傷害を効果的に抑制することができる。特に、その抑制効果は、有効成分のアンチトロンビンＩＩＩがα体よりもβ体である場合に顕著である。従って、本発明の薬剤は、ヒストンによる細胞傷害に起因する様々な疾患を治療及び／又は予防するために極めて有用である。
Claims (6)
- ヒストンによる細胞傷害を抑制するための薬剤であって、アンチトロンビンＩＩＩを有効成分とすることを特徴とする薬剤。
- ヒストンがコアヒストンであることを特徴とする請求項１に記載の薬剤。
- ヒストンがヒストンＨ３又はヒストンＨ４であることを特徴とする請求項２に記載の薬剤。
- アンチトロンビンＩＩＩがα体又はβ体であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一つに記載の薬剤。
- アンチトロンビンＩＩＩがβ体であることを特徴とする請求項４に記載の薬剤。
- アンチトロンビンＩＩＩが血漿由来であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一つに記載の薬剤。
Priority Applications (2)
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|---|---|---|---|
| JP2017041981A JP2020073459A (ja) | 2017-03-06 | 2017-03-06 | ヒストンによる細胞傷害を抑制するための薬剤 |
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2017041981A JP2020073459A (ja) | 2017-03-06 | 2017-03-06 | ヒストンによる細胞傷害を抑制するための薬剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| JP2020073459A true JP2020073459A (ja) | 2020-05-14 |
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Family Applications (1)
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| JP2017041981A Pending JP2020073459A (ja) | 2017-03-06 | 2017-03-06 | ヒストンによる細胞傷害を抑制するための薬剤 |
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Also Published As
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| WO2018164027A1 (ja) | 2018-09-13 |
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