JP2020068678A - Methods for detecting streptococcus mutans - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、唾液や歯垢のような口腔内試料の分析により、ストレプトコッカス ミュータンス（Streptococcus mutans）、特に、ｃｎｍ−陽性ストレプトコッカス ミュータンスやＰＡ（Protein antigen）−陽性ストレプトコッカス ミュータンスの保有の有無を検出する方法に関する。 The present invention analyzes presence or absence of Streptococcus mutans, particularly, cnm-positive Streptococcus mutans and PA (Protein antigen) -positive Streptococcus mutans, by analyzing oral samples such as saliva and dental plaque. Regarding the method of detecting.
ストレプトコッカス ミュータンスは、齲蝕の代表的な原因菌であるのみならず、全身疾患とも関連することが知られている。 Streptococcus mutans is known to be not only a representative causative bacterium of caries but also associated with systemic diseases.
例えば、非特許文献１は、２７９人の被験者について、Ｉ型コラーゲンに結合する表層ｃｎｍタンパク質を有するストレプトコッカス ミュータンス（ｃｎｍ−陽性ストレプトコッカス ミュータンス）を唾液中に保有するか否か、脳微小出血を有するか否か、及び認知機能を調べた結果、脳微小出血を有する被検者群は、脳微小出血を有しない被検者群に比べてｃｎｍ−陽性ストレプトコッカス ミュータンスを保有する頻度が高かったこと、ｃｎｍ−陽性ストレプトコッカス ミュータンス検出群では非検出群に比べて脳微小出血のリスクが有意に高かったこと（オッズ比＝１４．３）、及びｃｎｍ−陽性ストレプトコッカス ミュータンス保有群は認知機能が低かったことを開示している。
非特許文献２も、同様に、５１人の被験者について唾液中のｃｎｍ−陽性ストレプトコッカス ミュータンスの有無、及び脳微小出血の有無を調べた結果、ｃｎｍ−陽性ストレプトコッカス ミュータンスを有する群では脳微小出血の発生が多かったことを開示している。
For example, Non-Patent Document 1 determines whether or not 279 subjects have streptococcus mutans having a surface cnm protein that binds to type I collagen (cnm-positive Streptococcus mutans) in saliva and cerebral microhemorrhage. As a result of investigating whether or not it had, and the cognitive function, the group of subjects with cerebral microhemorrhage had a higher frequency of having the cnm-positive Streptococcus mutans than the group of subjects without cerebral microhemorrhage. In the cnm-positive Streptococcus mutans detection group, the risk of cerebral microhemorrhage was significantly higher than in the non-detection group (odds ratio = 14.3), and the cnm-positive Streptococcus mutans possessing group had a cognitive function. It discloses that it was low.
In Non-patent Document 2, similarly, as a result of investigating presence / absence of cnm-positive Streptococcus mutans in saliva and presence / absence of cerebral microhemorrhage in 51 subjects, cerebral microhemorrhage in a group having cnm-positive Streptococcus mutans. It is disclosed that there were many occurrences of.
また、非特許文献３は、ｃｎｍ−陽性ストレプトコッカス ミュータンスが血中に侵入することで、炎症性腸炎が増悪することを開示している。 In addition, Non-Patent Document 3 discloses that inflammatory bowel disease is exacerbated by invasion of cmn-positive Streptococcus mutans into blood.
また、非特許文献３、４は、ストレプトコッカス ミュータンスのうち、表層にｃｎｍタンパク質及びＰＡタンパク質を有する菌株を、高脂肪食を投与したマウスに静脈内投与したところ非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ：Non-alcoholic steatohepatitis）症状を呈したことを開示している。
近年、アルコール非摂取者でも栄養過剰摂取などにより肝障害が見られるようになり、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ：Non-alcoholic fatty liver disease）と称されている。ＮＡＦＬＤのうち、肝臓の脂肪化と共に炎症性変化や線維化が進行する非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）は、肝硬変やさらに肝臓癌に進行することから、問題視されており、早期発見が必要である。
In Non-Patent Documents 3 and 4, non-alcoholic steatohepatitis (NASH: NSH :) was obtained by intravenously administering a strain having a cnm protein and a PA protein in the surface layer among Streptococcus mutans to a mouse fed with a high fat diet. Non-alcoholic steatohepatitis) symptoms are disclosed.
In recent years, even non-alcoholics have come to have liver damage due to overnutrition and the like, and it is called non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). Among NAFLDs, non-alcoholic steatohepatitis (NASH), in which inflammatory changes and fibrosis progress with liver fatification, is regarded as a problem because it progresses to cirrhosis and further liver cancer, and early detection is required. Is.
このように、ストレプトコッカス ミュータンス、中でも菌体表層にｃｎｍタンパク質やＰＡタンパク質を有するストレプトコッカス ミュータンスは、脳微小出血とそれによる脳卒中や認知症、炎症性腸炎、ＮＡＳＨといった重篤な全身疾患と関連している。従って、これらの菌の保有の有無を調べることにより、これらの疾患の発症を予測し、早期に予防することができる。 Thus, Streptococcus mutans, particularly Streptococcus mutans having cnm protein and PA protein on the cell surface, are associated with cerebral microhemorrhage and serious systemic diseases such as stroke, dementia, inflammatory bowel disease, and NASH. ing. Therefore, by examining the presence or absence of these bacteria, it is possible to predict the onset of these diseases and prevent them at an early stage.
口腔内のストレプトコッカス ミュータンスの検出方法は種々知られている。
一般的に行われているのは、非特許文献２が採用している方法である。この方法では、唾液又は歯垢をＭＳＢ（Mitis-Salivarius-Bacitracin）寒天培地に塗布し、２日間培養後、コロニーを採取し、液体培地に接種して１日間培養し、増殖した菌体を回収して、リゾチーム溶菌、ＲＮａｓｅ処理、及びエタノール沈殿によりＤＮＡを抽出し、ストレプトコッカス ミュータンス遺伝子に特異的なプライマーを用いたＰＣＲを行って、ストレプトコッカス ミュータンスの有無を判定する。この方法は、３〜４日間を要する。
Various methods of detecting Streptococcus mutans in the oral cavity are known.
The method generally used is the method adopted by Non-Patent Document 2. In this method, saliva or dental plaque is applied to MSB (Mitis-Salivarius-Bacitracin) agar medium, and after culturing for 2 days, colonies are collected, inoculated into a liquid medium and cultured for 1 day, and the grown bacterial cells are collected. Then, DNA is extracted by lysozyme lysis, RNase treatment, and ethanol precipitation, and PCR using a primer specific to the Streptococcus mutans gene is performed to determine the presence or absence of Streptococcus mutans. This method requires 3-4 days.
また、特許文献１は、歯垢に含まれる細菌を界面活性剤（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）処理及び煮沸処理により溶菌させ、溶菌液を、ストレプトコッカス ミュータンスのトランスグルコシダーゼ遺伝子を増幅できるプライマーを用いたＬＡＭＰ（Loop-mediated isothermal amplification）法に供し、ＤＮＡ増幅の副産物であるピロリン酸マグネシウムによる白濁を目視で確認することで、ストレプトコッカス ミュータンスの有無を判定する方法を開示している。この方法は、数日にわたる培養は要さないが、界面活性剤処理及び煮沸処理を行わなければならず、煩雑である。
また、歯垢は被検者自身が簡単に採取できるものではないため、特許文献１の方法は、多人数を対象とする集団検診に適していない。
Further, in Patent Document 1, bacteria contained in dental plaque are lysed by a surfactant (Triton X-100) treatment and a boiling treatment, and the lysate is LAMP using a primer that can amplify a transglucosidase gene of Streptococcus mutans ( Loop-mediated isothermal amplification) method, and visually observing white turbidity due to magnesium pyrophosphate, which is a by-product of DNA amplification, is disclosed to determine the presence or absence of Streptococcus mutans. Although this method does not require culturing for several days, it requires a surfactant treatment and a boiling treatment, which is complicated.
In addition, dental plaque cannot be easily collected by a subject himself / herself, and thus the method of Patent Document 1 is not suitable for mass screening for a large number of people.
また、特許文献２は、唾液をＭＳＢ寒天培地に塗布し、２日間培養し、コロニーを採取し、液体培地に接種して１８時間培養し、培養菌液を試薬と反応させて液色変化によりストレプトコッカス ミュータンスを検出する方法を開示している。この方法は、約３日間を要する。 Further, in Patent Document 2, saliva is applied to an MSB agar medium, cultured for 2 days, colonies are collected, inoculated into a liquid medium and cultured for 18 hours, and the cultured bacterial solution is reacted with a reagent to change the liquid color. A method for detecting Streptococcus mutans is disclosed. This method requires about 3 days.
このように、口腔内試料からストレプトコッカス ミュータンスを検出する従来の方法は、３〜４日を要するか、又は手間のかかる工程を含む方法である。
ストレプトコッカス ミュータンスの保有の有無を集団検診などで検査する場合、多数の被験試料を検査するため、簡単な操作で短時間に結果が得られることが求められる。また、ストレプトコッカス ミュータンスの検出検査と並行して、脳の画像検査や血液検査などを行うことも想定されるが、早期診断を行うためには、それらの検査よりストレプトコッカス ミュータンスの検出結果の判明が遅くなることは避けるべきである。また、煩雑な工程を含まないことは、検査精度を良くするためにも求められることである。
As described above, the conventional method for detecting Streptococcus mutans from the intraoral sample is a method that requires 3 to 4 days or includes a time-consuming step.
When testing for the presence or absence of Streptococcus mutans by mass screening or the like, a large number of test samples are tested, so it is necessary to obtain results in a short time with simple operation. It is also conceivable that an image test of the brain or a blood test will be carried out in parallel with the detection test for Streptococcus mutans, but in order to make an early diagnosis, the detection results of Streptococcus mutans can be found from these tests. Should not be delayed. In addition, not including complicated steps is also required for improving inspection accuracy.
本発明は、口腔内試料中のストレプトコッカス ミュータンスの有無を簡単な操作で短時間に検出できる方法を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a method capable of detecting the presence or absence of Streptococcus mutans in an intraoral sample in a short time with a simple operation.
本発明者は、上記課題を解決するために研究を重ね、以下の知見を得た。
即ち、唾液、歯垢といった口腔内試料を、ストレプトコッカス ミュータンスを選択的に増殖させることができる固体培地に塗布して培養し、この固体培地上に生育した菌体を使って、ストレプトコッカス ミュータンス染色体の部分配列を標的とした核酸増幅を行うことによりストレプトコッカス ミュータンスの有無を検出する方法において、この固体培地での培養を４０時間以内の短い時間とし、固体培地上に生育した菌を集菌用液で回収し、回収液を核酸増幅に供することで、煩雑な操作を要さず短時間に、ストレプトコッカス ミュータンスの有無を検出することができる。
The present inventor has conducted repeated studies to solve the above problems and obtained the following findings.
That is, oral samples such as saliva and dental plaque are applied to a solid medium capable of selectively growing Streptococcus mutans and cultured, and the cells grown on this solid medium are used to form Streptococcus mutans chromosomes. In the method for detecting the presence or absence of Streptococcus mutans by performing nucleic acid amplification targeting the partial sequence of, the culture in this solid medium is set to a short time within 40 hours, and the bacteria grown on the solid medium are collected. By recovering with a solution and subjecting the recovered solution to nucleic acid amplification, the presence or absence of Streptococcus mutans can be detected in a short time without requiring complicated operations.
本発明は、上記知見に基づき完成されたものであり、下記〔１〕〜〔９〕を提供する。
〔１〕 唾液、及び歯垢からなる群より選ばれる少なくとも１種の口腔内試料を、ストレプトコッカス ミュータンスを選択的に増殖させることができる固体培地に塗布して６〜４０時間培養する培養工程と、固体培地上に生育した菌を集菌用液中に回収する回収工程と、回収液を用いて、ストレプトコッカス ミュータンス染色体の標的配列部分を増幅する核酸増幅を行う核酸増幅工程と、標的配列部分の増幅の有無を判定する判定工程とを含む、ストレプトコッカス ミュータンスの検出方法。
〔２〕 固体培地での培養を、コロニーが目視で観察できる前まで行う、〔１〕に記載の方法。
〔３〕 回収工程の後、回収液中の菌から核酸を抽出する操作を行わずに核酸増幅工程を行う、〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕 核酸増幅をＬＡＭＰ法で行う、〔１〕〜〔３〕の何れかに記載の方法。
〔５〕 標的配列部分が、ｃｎｍタンパク質をコードする遺伝子又はＰＡタンパク質をコードする遺伝子の全長又は一部を含む配列部分である、〔１〕〜〔４〕の何れかに記載の方法。
〔６〕 口腔内試料が唾液である、〔１〕〜〔５〕の何れかに記載の方法。
〔７〕 配列番号４に示す塩基配列からなる、ストレプトコッカス ミュータンスのｃｎｍタンパク質遺伝子の部分。
〔８〕 配列番号１３の塩基配列からなるプライマー、配列番号１４の塩基配列からなるプライマー、配列番号１５の塩基配列からなるプライマー、配列番号１６の塩基配列からなるプライマー、配列番号１７の塩基配列からなるプライマー、及び配列番号１８の塩基配列からなるプライマーのセット。
〔９〕 〔１〕に記載のストレプトコッカス ミュータンスの検出方法に用いる固体培地であって、容器の１又は複数の凹部にストレプトコッカス ミュータンスを選択的に増殖させることができる固体培地が形成されており、その１の凹部に形成された固体培地の表面の面積が０．２〜８ｃｍ２である固体培地。
The present invention has been completed based on the above findings, and provides the following [1] to [9].
[1] A culturing step of applying at least one oral sample selected from the group consisting of saliva and dental plaque to a solid medium capable of selectively growing Streptococcus mutans, and culturing for 6 to 40 hours , A recovery step of recovering the bacteria growing on the solid medium in a collecting solution, a nucleic acid amplification step of amplifying a target sequence part of the Streptococcus mutans chromosome using the recovery solution, and a target sequence part A method for detecting Streptococcus mutans, which comprises a determination step of determining the presence or absence of amplification.
[2] The method according to [1], wherein the culture in the solid medium is performed until the colonies can be visually observed.
[3] The method according to [1] or [2], wherein after the recovery step, the nucleic acid amplification step is performed without performing the operation of extracting the nucleic acid from the bacterium in the recovery solution.
[4] The method according to any one of [1] to [3], wherein nucleic acid amplification is performed by the LAMP method.
[5] The method according to any one of [1] to [4], wherein the target sequence portion is a sequence portion containing a full length or a part of a gene encoding a cnm protein or a gene encoding a PA protein.
[6] The method according to any one of [1] to [5], wherein the oral sample is saliva.
[7] A part of the cnm protein gene of Streptococcus mutans consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4.
[8] From the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17 And a set of primers consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18.
[9] A solid medium used in the method for detecting Streptococcus mutans according to [1], wherein a solid medium capable of selectively growing Streptococcus mutans is formed in one or more recesses of a container. , The solid medium having a surface area of 0.2 to 8 cm 2 formed in the recess of the first solid medium.
口腔内試料中のストレプトコッカス ミュータンスを検出する従来の方法は、培養に３〜４日間を要して短時間に結果を得ることができないか、又は、培養後の菌体から核酸を抽出するなどの煩雑な操作が必要であり、何れにしても、簡便に行うことができなかった。
この点、本発明方法は、固体培地での培養時間を４０時間以内の（最大１日半の）、例えばコロニーが形成されない程度の短時間にすることができ、また、液体培地での培養を要さないため、全体として、非常に短時間でストレプトコッカス ミュータンスの有無を判定することができる。本発明方法は、被験試料を採取した日、或いは試験開始した日のうちに結果を出すこともできる。
また、本発明方法は、増殖させた菌体から核酸を抽出する操作を行わなくても、ストレプトコッカス ミュータンスが存在していれば、その染色体の標的配列部分を特異的に増幅することができ、非常に簡便である。
Conventional methods for detecting Streptococcus mutans in oral samples require 3 to 4 days for culturing and cannot obtain results in a short time, or extract nucleic acid from cells after culturing, etc. However, it was not possible to perform the operation easily.
In this respect, according to the method of the present invention, the culture time in the solid medium can be shortened to 40 hours or less (maximum of one and a half days), for example, a time such that colonies are not formed, and the culture in the liquid medium can be performed. Since it is not necessary, the presence or absence of Streptococcus mutans can be determined in a very short time as a whole. The method of the present invention can produce the results on the day when the test sample is collected or the day when the test is started.
Further, the method of the present invention, even without performing the operation of extracting the nucleic acid from the grown bacterial cells, if Streptococcus mutans is present, it is possible to specifically amplify the target sequence portion of the chromosome, It's very simple.
また、本発明方法は、口腔内試料を固体培地に塗布して培養する時間が非常に短いにも拘らず、例えば直径１ｃｍ程度のチューブ内に作製したような培養可能面積が小さい固体培地を用いても、ストレプトコッカス ミュータンスが存在していれば、その後の核酸増幅によりストレプトコッカス ミュータンスを検出することができる。本発明方法では、このように小スケールで培養できるため、集団検診などで多数の被験試料を検査するのに適している。
また、本発明方法は、口腔内試料を固体培地に塗布して培養する時間が非常に短いにも拘らず、歯垢と異なり菌密度が少ない唾液を被験試料として用いても、ストレプトコッカス ミュータンスが存在していれば、その後の核酸増幅によりストレプトコッカス ミュータンスを検出することができる。唾液は、歯垢と異なり、被検者自身が簡単に採取できるため、本発明方法は、多人数を対象とする集団検診に適している。
In addition, the method of the present invention uses a solid medium having a small cultivable area, such as that prepared in a tube having a diameter of about 1 cm, although the time for culturing by applying the oral sample to the solid medium is very short. However, if Streptococcus mutans is present, Streptococcus mutans can be detected by subsequent nucleic acid amplification. Since the method of the present invention can be cultivated on a small scale in this manner, it is suitable for testing a large number of test samples in mass screening and the like.
Further, the method of the present invention, despite the very short time for culturing by applying the oral sample to the solid medium, even when saliva having a low bacterial density unlike plaque is used as a test sample, Streptococcus mutans has a If present, Streptococcus mutans can be detected by subsequent nucleic acid amplification. Different from dental plaque, saliva can be easily collected by the subject himself / herself. Therefore, the method of the present invention is suitable for mass screening for a large number of people.
このように、本発明方法は、多数の被験試料を簡便に短時間で処理できるため、病院検査や集団検診などに組み込み易い。それにより、多数の被験者について、脳微小出血とそれによる脳卒中や認知症、炎症性腸炎、ＮＡＳＨとそれによる肝硬変や肝臓癌の発症などを予測し、早期に予防できるようになり、医療費の削減につながる。 As described above, the method of the present invention can easily process a large number of test samples in a short time, and thus can be easily incorporated into a hospital test or a mass examination. As a result, for a large number of subjects, it becomes possible to predict cerebral microhemorrhage and the resulting stroke and dementia, inflammatory bowel disease, NASH and the onset of cirrhosis and liver cancer due to it, and prevent it at an early stage, reducing medical costs. Lead to
また、ストレプトコッカス ミュータンスが検出されれば、薬剤による口腔内洗浄、ストレプトコッカス ミュータンスの増殖を抑制するラクトバチルス ロイテリ（Lactobacillus reuteri）Ｌ８０２０株の摂取などにより、ストレプトコッカス ミュータンスを静菌することができる。それにより、う蝕を始めとして、脳微小出血とそれによる脳卒中や認知症、炎症性腸炎、ＮＡＳＨとそれによる肝硬変や肝臓癌の発症などを抑制することができる。 When Streptococcus mutans is detected, it is possible to bacteriostatically treat Streptococcus mutans by washing the oral cavity with a drug, ingesting Lactobacillus reuteri L8020 strain that suppresses the growth of Streptococcus mutans, and the like. As a result, it is possible to suppress caries, cerebral microhemorrhage and resulting strokes and dementia, inflammatory bowel disease, NASH and cirrhosis and liver cancer due to it.
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のストレプトコッカス ミュータンスの検出方法は、唾液、及び歯垢からなる群より選ばれる少なくとも１種の口腔内試料を、ストレプトコッカス ミュータンスを選択的に増殖させることができる固体培地に塗布して６〜４０時間培養する培養工程と、固体培地上に生育した菌を集菌用液中に回収する回収工程と、回収液を用いて、ストレプトコッカス ミュータンス染色体の標的配列部分を増幅する核酸増幅を行う核酸増幅工程と、標的配列部分の増幅の有無を判定する判定工程とを含む方法である。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The method for detecting Streptococcus mutans of the present invention comprises applying at least one oral sample selected from the group consisting of saliva and dental plaque to a solid medium capable of selectively growing Streptococcus mutans. A culturing step of culturing for ~ 40 hours, a collecting step of collecting bacteria growing on a solid medium in a collecting liquid, and a nucleic acid amplification for amplifying a target sequence portion of Streptococcus mutans chromosome using the collecting liquid It is a method including a nucleic acid amplification step and a determination step of determining the presence or absence of amplification of a target sequence portion.
口腔内試料
被験試料としては、唾液、及び歯垢の１種以上を用いることができる。
歯垢は細菌の塊であるため、ストレプトコッカス ミュータンスが含まれているとすればその菌密度は非常に高い。従って、培養により菌数を増やし易く、増幅させた核酸を検出し易い。しかし、歯垢は、通常、被検者自身が採取することができないため、ストレプトコッカス ミュータンス検査を簡単に行うためには、唾液を用いることが望ましい。ところが、唾液中の菌密度は低いため、従来のストレプトコッカス ミュータンスの検出方法では、比較的長い時間培養しなければならなかった。この点、本発明方法であれば、唾液を用いても、短時間の培養と核酸増幅によりストレプトコッカス ミュータンスを検出することができる。従って、唾液は、本発明方法の好適な対象試料である。
Oral sample As a test sample, one or more of saliva and dental plaque can be used.
Dental plaque is a mass of bacteria, so if Streptococcus mutans is contained, its density is very high. Therefore, it is easy to increase the number of bacteria by culturing, and it is easy to detect the amplified nucleic acid. However, plaque cannot usually be collected by the subject himself. Therefore, it is preferable to use saliva in order to easily perform the Streptococcus mutans test. However, since the bacterial density in saliva is low, the conventional method for detecting Streptococcus mutans had to culture for a relatively long time. In this respect, according to the method of the present invention, Streptococcus mutans can be detected even by using saliva by culturing for a short time and amplifying nucleic acid. Therefore, saliva is a suitable target sample for the method of the present invention.
固体培地
ストレプトコッカス ミュータンスを選択的に増殖させることができる固体培地としては、ストレプトコッカス ミュータンスが特異的に高い耐性を示す薬剤であるバシトラシンを含む固体培地を用いることができる。固体培地中のバシトラシン濃度は、０．０５〜０．５Ｕｎｉｔｓ／ｍＬ程度とすればよく、中でも０．１〜０．３Ｕｎｉｔｓ／ｍＬが好ましく、０．２Ｕｎｉｔｓ／ｍＬがより好ましい。
また、培地が比較的高濃度のショ糖を含むと、夾雑菌の生育は困難となるが、ストレプトコッカス ミュータンスは増殖することができるため、固体培地は、例えば５〜３０重量％、中でも１０〜２５重量％、中でも１５〜２０重量％のショ糖を含むことが好ましい。
固体培地は代表的には寒天培地とすればよい。
本発明において、ストレプトコッカス ミュータンスを選択的に増殖させることができる固体培地は、ストレプトコッカス ミュータンス以外の菌を全く増殖させないものに限定されず、ストレプトコッカス ソブリナス（Streptococcus sobrinus）などのストレプトコッカス ミュータンス以外の菌が、本発明方法の結果に影響しない程度に増殖するものであってもよい。
ストレプトコッカス ミュータンスを選択的に増殖させることができる固体培地としては、ＭＳＢ固体培地、ＴＹＣＳＢ（Trypticase-yeast-cysteine-sucrose-bacitracin）固体培地などが挙げられる。
Solid Medium As a solid medium capable of selectively growing Streptococcus mutans, a solid medium containing bacitracin, which is a drug showing high specific resistance to Streptococcus mutans, can be used. The bacitracin concentration in the solid medium may be about 0.05 to 0.5 Units / mL, preferably 0.1 to 0.3 Units / mL, more preferably 0.2 Units / mL.
Further, when the medium contains a relatively high concentration of sucrose, it is difficult for the contaminant bacteria to grow, but Streptococcus mutans can grow. Therefore, the solid medium is, for example, 5 to 30% by weight, and particularly 10 to 10% by weight. It is preferable to contain 25% by weight, and especially 15 to 20% by weight of sucrose.
The solid medium may be typically an agar medium.
In the present invention, the solid medium capable of selectively growing Streptococcus mutans is not limited to those that do not grow bacteria other than Streptococcus mutans at all, and bacteria other than Streptococcus mutans such as Streptococcus sobrinus. However, it may grow to such an extent that the result of the method of the present invention is not affected.
Examples of the solid medium capable of selectively growing Streptococcus mutans include MSB solid medium, TYCSB (Trypticase-yeast-cysteine-sucrose-bacitracin) solid medium, and the like.
固体培地は、容器の１又は複数の凹部に形成すればよい。容器の形状は特に限定されないが、皿状容器、筒袋状容器のような単一の凹部を有する容器、複数の皿状又は筒袋状の凹部が設けられた容器、複数の筒袋状容器のセットなどが挙げられる。例えば、シャーレ、マイクロチューブ、マルチウェルプレートなどの汎用品を利用することができる。 The solid medium may be formed in one or more recesses of the container. The shape of the container is not particularly limited, but a dish-shaped container, a container having a single concave portion such as a tubular bag-shaped container, a container provided with a plurality of dish-shaped or tubular bag-shaped concave portions, a plurality of tubular bag-shaped containers The set etc. For example, general-purpose products such as petri dishes, microtubes, and multiwell plates can be used.
容器の１の凹部に形成される固体培地の表面積（培養可能面積）は、０．２ｃｍ２以上、０．５ｃｍ２以上、１ｃｍ２以上、２ｃｍ２以上、３ｃｍ２以上、４ｃｍ２以上、５ｃｍ２以上、１０ｃｍ２以上、２０ｃｍ２以上、又は５０ｃｍ２以上などとすることができる。また、１００ｃｍ２以下、８０ｃｍ２以下、５０ｃｍ２以下、３０ｃｍ２以下、２０ｃｍ２以下、１５ｃｍ２以下、１０ｃｍ２以下、８ｃｍ２以下、７ｃｍ２以下、６ｃｍ２以下、５ｃｍ２以下、４ｃｍ２以下、３ｃｍ２以下、２ｃｍ２以下、又は１ｃｍ２以下などとすることができる。
シャーレ、マイクロチューブ、マルチウェルプレートなどの凹部に固体培地を作製すれば、この程度の表面積の培地が得られる。
固体培地を収容する容器は、１の凹部の断面が円形のものが汎用されているが、その場合の内直径は、例えば、０．５ｃｍ以上、１ｃｍ以上、１．５ｃｍ以上、２ｃｍ以上、４ｃｍ以上、６ｃｍ以上、又は８ｃｍ以上などとすることができる。また、１０ｃｍ以下、８ｃｍ以下、６ｃｍ以下、５ｃｍ、４ｃｍ以下、３ｃｍ以下、２ｃｍ以下、又は１ｃｍ以下などとすることができる。
本発明は、本発明のストレプトコッカス ミュータンスの検出方法に用いる、又は本発明のストレプトコッカス ミュータンスの検出方法に用いるための、ストレプトコッカス ミュータンスを選択的に増殖させることができる固体培地（特に、容器の１の凹部に形成された固体培地の表面の面積が０．２〜８ｃｍ２である固体培地）を提供する。
The surface area (cultivable area) of the solid medium formed in one concave portion of the container is 0.2 cm 2 or more, 0.5 cm 2 or more, 1 cm 2 or more, 2 cm 2 or more, 3 cm 2 or more, 4 cm 2 or more, 5 cm 2 The above can be 10 cm 2 or more, 20 cm 2 or more, or 50 cm 2 or more. Further, 100 cm 2 or less, 80 cm 2 or less, 50 cm 2 or less, 30 cm 2 or less, 20 cm 2 or less, 15 cm 2 or less, 10 cm 2 or less, 8 cm 2 or less, 7 cm 2 or less, 6 cm 2 or less, 5 cm 2 or less, 4 cm 2 or less, It can be 3 cm 2 or less, 2 cm 2 or less, or 1 cm 2 or less.
If a solid medium is prepared in a recess such as a petri dish, a microtube, and a multiwell plate, a medium having such a surface area can be obtained.
As a container for storing a solid medium, one in which the concave portion has a circular cross section is generally used, and the inner diameter in that case is, for example, 0.5 cm or more, 1 cm or more, 1.5 cm or more, 2 cm or more, 4 cm. As described above, it may be 6 cm or more, or 8 cm or more. Further, it can be 10 cm or less, 8 cm or less, 6 cm or less, 5 cm, 4 cm or less, 3 cm or less, 2 cm or less, or 1 cm or less.
The present invention, for use in the method for detecting Streptococcus mutans of the present invention, or for use in the method for detecting Streptococcus mutans of the present invention, a solid medium capable of selectively growing Streptococcus mutans (particularly in a container The solid medium having a surface area of the solid medium formed in the recess of 1 is 0.2 to 8 cm 2 .
本発明方法は、このような小表面積の固体培地を用いてもストレプトコッカス ミュータンスを検出できるため、多数の被験試料を扱うのに適している。
特に、固体培地を斜面培地として成形すれば、表面積を広げることができるため、小サイズの容器を用いて、より多くの菌を増殖させることができるようになる。
Since the method of the present invention can detect Streptococcus mutans even using such a small surface area solid medium, it is suitable for handling a large number of test samples.
In particular, if the solid medium is molded as a slant medium, the surface area can be increased, so that more bacteria can be grown in a small-sized container.
口腔内試料の塗布・培養
歯垢は、スケーラーなどでかき取った一かきの量をそのまま、又は少量の水などに懸濁して固体培地に塗布すればよい。それ以上の量の歯垢を使用してもよい。
また、唾液は、そのまま固体培地に塗布すればよい。唾液の塗布量は、１０μＬ以上、２０μＬ以上、５０μＬ以上、又は１００μＬ以上などとすることができる。また、唾液量の上限は特に限定されないが、２００μＬもあれば十分である。また、１５０μＬ、１００μＬ以下、又は５０μＬ以下などとすることができる。
As for the application and culture plaque of the oral cavity sample, the amount of one scraped by a scaler or the like may be applied as it is, or may be suspended in a small amount of water or the like and applied to a solid medium. Greater amounts of plaque may be used.
Further, saliva may be applied as it is to the solid medium. The amount of saliva applied can be 10 μL or more, 20 μL or more, 50 μL or more, or 100 μL or more. The upper limit of the amount of saliva is not particularly limited, but 200 μL is sufficient. Further, it may be 150 μL, 100 μL or less, or 50 μL or less.
次いで、口腔内試料を塗布した固体培地をストレプトコッカス ミュータンスの生育に適した温度下に置くことで培養する。
培養時間は、６時間以上であり、８時間以上が好ましく、１０時間以上がより好ましい。また、培養時間は、４０時間以下であり、２４時間以下が好ましく、１２時間以下がより好ましい。本発明方法では、培養を、固体培地上にコロニーが目視又は肉眼で（即ち、顕微鏡などを用いずに）確認できる前までとすることができる。培養時間を長くして菌数を増やす方がストレプトコッカス ミュータンスを検出し易いが、本発明方法では、このような短時間の培養でもストレプトコッカス ミュータンスを検出することができる。本発明方法はこのように培養時間を短くすることができるため、口腔内試料を採取した日に結果を出すこともできる。
培養温度は、３０〜４５℃、中でも３５〜４０℃、中でも３７℃程度とすればよい。
Then, the solid medium to which the sample in the oral cavity is applied is placed at a temperature suitable for the growth of Streptococcus mutans and cultured.
The culture time is 6 hours or longer, preferably 8 hours or longer, more preferably 10 hours or longer. The culture time is 40 hours or less, preferably 24 hours or less, and more preferably 12 hours or less. In the method of the present invention, the culture can be performed before colonies can be visually or visually confirmed (that is, without using a microscope) on the solid medium. Although it is easier to detect Streptococcus mutans when the culture time is increased to increase the number of bacteria, the method of the present invention can detect Streptococcus mutans even in such a short period of culture. Since the method of the present invention can shorten the culture time in this way, it is possible to produce the results on the day when the oral sample was collected.
The culture temperature may be 30 to 45 ° C., especially 35 to 40 ° C., and especially 37 ° C.
集菌
培養後の固体培地の表面（培養面）を集菌用液で洗い、集菌用液を回収することで集菌する。この際、滅菌したコンラージ棒や白金耳などで固体培地上の菌を集菌用液中に擦り取ってもよい。
Washing the surface of the solid medium after harvesting cultured (culture surface) in collecting bacteria for fluid and cells are harvested by collecting the harvested for liquid. At this time, the bacteria on the solid medium may be scraped off into the liquid for collecting cells with a sterilized large rod or a platinum loop.
集菌に用いる液は、核酸増幅を阻害する成分を含まないものであればよい。なお、このような成分が、核酸増幅を阻害しない量含まれていても良い。核酸増幅を阻害する成分としては、ＥＤＴＡのようなキレート剤、ＳＤＳのような界面活性剤、タンパク質分解酵素、強酸、強アルカリなどが挙げられる。
ＤＮＡポリメラーゼの活性には２価陽イオンが必要であることから、ＤＮＡポリメラーゼ活性を阻害しないためにはキレート剤は含まれないことが望ましいが、ＤＮＡ分解酵素の活性にも２価陽イオンが必要であることから、ＤＮＡ分解酵素の活性を抑制するためにはキレート剤が含まれることが望ましい。従って、核酸増幅反応液は適切な濃度の２価陽イオンを含む必要がある。集菌用液がキレート剤を含む場合、核酸増幅反応液中に持ちこまれるキレート剤濃度が、ＤＮＡポリメラーゼの活性を阻害しない程度の低い濃度であることが求められる。
また、集菌用液が界面活性剤を含む場合、核酸増幅反応液中に持ちこまれる界面活性剤濃度が、ＤＮＡポリメラーゼを変性しない程度の低い濃度であることが求められる。
また、集菌用液が強酸または強アルカリを含む場合、核酸増幅反応液中に持ちこまれる強酸または強アルカリ濃度が、反応液のｐＨをＤＮＡポリメラーゼが機能し難いｐＨにならない程度の低い濃度であることが求められる。
集菌用液としては水を用いればよいが、緩衝液（例えば、ＴＥ緩衝液のようなＥＤＴＡを含む緩衝液）、液体培地などを用いてもよい。
The liquid used for collecting bacteria may be any liquid that does not contain a component that inhibits nucleic acid amplification. In addition, such a component may be contained in an amount that does not inhibit nucleic acid amplification. Examples of components that inhibit nucleic acid amplification include chelating agents such as EDTA, surfactants such as SDS, proteolytic enzymes, strong acids, and strong alkalis.
Since a divalent cation is required for the activity of DNA polymerase, it is desirable that a chelating agent is not included in order not to inhibit the activity of DNA polymerase, but a divalent cation is also required for the activity of DNA degrading enzyme. Therefore, it is desirable to include a chelating agent in order to suppress the activity of the DNA degrading enzyme. Therefore, the nucleic acid amplification reaction solution must contain an appropriate concentration of divalent cations. When the cell-harvesting solution contains a chelating agent, the concentration of the chelating agent carried in the nucleic acid amplification reaction solution is required to be low enough not to inhibit the activity of the DNA polymerase.
In addition, when the cell-harvesting solution contains a surfactant, the concentration of the surfactant brought into the nucleic acid amplification reaction solution is required to be low enough not to denature the DNA polymerase.
Further, when the liquid for collecting bacteria contains a strong acid or a strong alkali, the concentration of the strong acid or strong alkali carried into the nucleic acid amplification reaction liquid is such a low concentration that the pH of the reaction liquid does not become a pH at which the DNA polymerase is hard to function. Is required.
Although water may be used as the liquid for collecting cells, a buffer (for example, a buffer containing EDTA such as TE buffer), a liquid medium, or the like may be used.
集菌用液の使用量は、固体培地の面積にもよるが、３０μＬ以上、５０μＬ以上、１００μＬ以上、２００μＬ以上、５００μＬ以上、又は１ｍＬ以上などとすることができる。この範囲であれば、固体培地上の細菌を十分に回収できる。また、集菌用液の使用量は、２ｍＬ以下、１ｍＬ以下、５００μＬ以下、３００μＬ以下、２００μＬ以下、又は１００μＬ以下などとすることができる。集菌用液の量が余りに多いと、回収した液中の菌密度が少なくなりすぎて核酸増幅によりストレプトコッカス ミュータンスを検出し難くなるが、この範囲であれば、十分に検出できる。 The use amount of the liquid for cell collection depends on the area of the solid medium, but can be 30 μL or more, 50 μL or more, 100 μL or more, 200 μL or more, 500 μL or more, or 1 mL or more. Within this range, the bacteria on the solid medium can be sufficiently recovered. Moreover, the usage amount of the liquid for collecting bacteria can be 2 mL or less, 1 mL or less, 500 μL or less, 300 μL or less, 200 μL or less, or 100 μL or less. If the amount of the cell-harvesting solution is too large, the density of the cells in the collected solution will be too low and it will be difficult to detect Streptococcus mutans due to nucleic acid amplification.
核酸抽出
本発明方法では、回収した菌から核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を抽出しても良いが、抽出せずに菌回収液をそのまま核酸増幅法に供してもストレプトコッカス ミュータンスを検出することができる。
本発明でいう核酸抽出は、細胞の透過性を高めて核酸の少なくとも一部を細胞外に出す処理をいう。このような処理は、当業者に周知であり、例えば、加熱（６５〜１００℃程度の加熱）処理、界面活性剤（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００のような非イオン性界面活性剤、ＳＤＳやグアニジン塩のようなイオン性界面活性剤など）処理、塩化カルシウム処理、酵素（リゾチームのような細胞壁溶解酵素など）処理、パルス電圧印加、浸透圧ショックの付与、電子線照射などが挙げられる。
Nucleic Acid Extraction In the method of the present invention, nucleic acid (DNA or RNA) may be extracted from the recovered bacterium, but Streptococcus mutans can be detected even if the bacterium recovery solution is directly subjected to the nucleic acid amplification method without extraction. ..
The nucleic acid extraction referred to in the present invention refers to a treatment for enhancing the permeability of cells and exposing at least a part of the nucleic acids to the outside of the cells. Such treatments are well known to those skilled in the art, and include, for example, heat treatment (heating at about 65 to 100 ° C.), surfactants (nonionic surfactants such as Triton X-100, SDS and guanidine salts). Ionic surfactants) treatment, calcium chloride treatment, enzyme treatment (cell wall lysing enzyme such as lysozyme) treatment, pulse voltage application, osmotic shock application, electron beam irradiation and the like.
核酸増幅
菌回収液、又は核酸抽出液を核酸増幅に供する。本発明方法は、回収した菌から核酸を抽出しなくても、菌回収液をそのまま核酸増幅に供することで、ストレプトコッカス ミュータンスを検出することができる。
ＤＮＡを増幅する方法としては、ＰＣＲ（Polymerase chain reaction）（Science 239,487-491(1988)）、ＬＣＲ（Ligase chain reaction）(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:189-193(1991))のような二本鎖ＤＮＡの熱変性工程を含む方法；ＬＡＭＰ（Loop-mediated isothermal amplification）（国際公開00/28082）、ＳＤＡ（Strand displacement amplification）(米国特許第5455166号)、ＩＣＡＮ（Isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids）（国際公開00/56877）、ＳＭＡＰ(Smart amplification process)（Seibutsu butsuri kagaku, 52(4):183-187,2008）、３ＳＲ（Self-stranded sequence replication）(Am.Biotechnol.Lab.8,14-25(1990))のような二本鎖ＤＮＡの熱変性工程を含まない等温増幅法などが挙げられる。
A nucleic acid-amplifying bacterium collection liquid or a nucleic acid extraction liquid is used for nucleic acid amplification. According to the method of the present invention, Streptococcus mutans can be detected by directly subjecting the recovered bacterial solution to nucleic acid amplification without extracting the nucleic acid from the recovered bacteria.
As a method for amplifying DNA, PCR (Polymerase chain reaction) (Science 239,487-491 (1988)), LCR (Ligase chain reaction) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 189-193 (1991)) And a method including a thermal denaturation step of double-stranded DNA; LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) (International Publication 00/28082), SDA (Strand displacement amplification) (US Patent No. 5455166), ICAN (Isothermal and chimeric). primer-initiated amplification of nucleic acids) (International publication 00/56877), SMAP (Smart amplification process) (Seibutsu butsuri kagaku, 52 (4): 183-187, 2008), 3SR (Self-stranded sequence replication) (Am. Biotechnol.Lab.8, 14-25 (1990)) and the isothermal amplification method which does not include a heat denaturation step of double-stranded DNA.
また、ＤＮＡに代えてＲＮＡを増幅させることもできる。ＲＮＡを増幅させる場合は、ＲＮＡは最初から１本鎖であるため熱変性させる必要がなく、等温増幅を行える。また、ＲＮＡは細胞内のコピー数が多いため検出感度が高くなり、また種間で多様性が高いためストレプトコッカス ミュータンスの検出精度が高くなる。ＲＮＡを増幅させる核酸増幅法としては、ＴＭＡ（Transcription Mediated Amplification）(In Ferre, F.(ed), Gene quantification, Boston, Birkhauser p189-201(1998))、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification）(In Ferre, F.(ed), Gene quantification, Boston, Birkhauser p169-188(1998))、ＴＲＣ（Transcription-reverse transcription concerted reaction）（J.Clin.Microbiol,.42(9):4284-4292,2004）などが挙げられる。 Also, RNA can be amplified instead of DNA. When amplifying RNA, since the RNA is single-stranded from the beginning, it is not necessary to denature it by heat, and isothermal amplification can be performed. In addition, since RNA has a high copy number in cells, detection sensitivity is high, and since diversity among species is high, detection accuracy of Streptococcus mutans is high. As a nucleic acid amplification method for amplifying RNA, TMA (Transcription Mediated Amplification) (In Ferre, F. (ed), Gene quantification, Boston, Birkhauser p189-201 (1998)), NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) ( In Ferre, F. (ed), Gene quantification, Boston, Birkhauser p169-188 (1998)), TRC (Transcription-reverse transcription concerted reaction) (J.Clin.Microbiol, .42 (9): 4284-4292,2004) ) And the like.
中でも、等温増幅法は温度を変化させる必要がないため、簡便で、また装置が安価であり、好ましい。中でも、ＬＡＭＰ法は、１種類の合成酵素を用いて１ステップでＤＮＡを増幅できるため特に簡便である。また、ＬＡＭＰ法は、増幅効率が高いため、標的ＤＮＡが少なくても検出可能に増幅することができると共に、極めて高い特異性を持つため、類縁の菌種の誤検出が抑えられる。
等温増幅法において増幅時の温度は、ＤＮＡポリメラーゼの種類によって異なるが、例えば５０〜７０℃程度とすればよく、中でも６０〜７０℃が好ましく、６２〜６７℃がより好ましい。
Among them, the isothermal amplification method is preferable because it does not need to change the temperature, is simple, and the apparatus is inexpensive. Among them, the LAMP method is particularly simple because it can amplify DNA in one step using one kind of synthetic enzyme. Further, since the LAMP method has high amplification efficiency, it can detectably amplify even with a small amount of target DNA, and has extremely high specificity, so that false detection of related bacterial species can be suppressed.
In the isothermal amplification method, the temperature at the time of amplification varies depending on the type of DNA polymerase, but may be, for example, about 50 to 70 ° C, preferably 60 to 70 ° C, and more preferably 62 to 67 ° C.
核酸増幅法で増幅させる標的配列部分は、ストレプトコッカス ミュータンスの何れかの遺伝子の全領域又は一部とすればよい。また、遺伝子間にまたがる配列部分を増幅させることもできる。例えば、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子（GenBank accession number： M1736）は、ストレプトコッカス属の種間で塩基配列が比較的大きく異なっているため、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の全部又は一部を含む配列部分を標的とすれば、ストレプトコッカス ミュータンスを精度よく検出できる。また、ｃｎｍタンパク質をコードする遺伝子（GenBank accession number： AB465300.1）の全領域又は一部を含む配列部分を標的とすれば、ｃｎｍ−陽性ストレプトコッカス ミュータンスを検出することができ、ＰＡタンパク質をコードする遺伝子（GenBank accession number： KM219946）の全領域又は一部を含む配列部分を標的とすれば、ＰＡ−陽性ストレプトコッカス ミュータンスを検出することができる。 The target sequence portion to be amplified by the nucleic acid amplification method may be the whole region or a part of any gene of Streptococcus mutans. It is also possible to amplify a sequence portion that extends between genes. For example, the glycosyltransferase gene (GenBank accession number: M1736) has a relatively large difference in the nucleotide sequence among species of the genus Streptococcus. Therefore, if the sequence portion containing all or part of the glycosyltransferase gene is targeted, Streptococcus Mutants can be detected accurately. In addition, by targeting a sequence portion containing the entire region or a part of the gene encoding the cnm protein (GenBank accession number: AB465300.1), the cnm-positive Streptococcus mutans can be detected and the PA protein is encoded. Targeting a sequence portion containing the entire region or a part of the gene (GenBank accession number: KM219946) that controls the PA-positive Streptococcus mutans can be detected.
中でも、配列番号１に示す塩基配列からなる、ストレプトコッカス ミュータンスのトランスグルコシダーゼ遺伝子の配列部分を標的とすれば、一層特異性の高い核酸増幅を行うことができ、即ち、他菌種の誤検出やストレプトコッカス ミュータンス検出の誤陰性が少なくなる。
また、配列番号４に示す塩基配列からなる、ストレプトコッカス ミュータンスのｃｎｍタンパク質遺伝子の配列部分を標的とすれば、一層特異性の高い核酸増幅を行うことができ、即ち、他菌種又はｃｎｍ−陰性ストレプトコッカス ミュータンスの誤検出や、ｃｎｍ−陽性ストレプトコッカス ミュータンス検出の誤陰性が少なくなる。
Among them, by targeting the sequence portion of the transglucosidase gene of Streptococcus mutans consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, it is possible to perform nucleic acid amplification with higher specificity, that is, false detection of other bacterial species or False negatives for Streptococcus mutans detection are reduced.
Further, by targeting the sequence portion of the cnm protein gene of Streptococcus mutans consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4, nucleic acid amplification with higher specificity can be performed, that is, other bacterial species or cnm-negative False detection of Streptococcus mutans and false negative detection of cnm-positive Streptococcus mutans are reduced.
また、配列番号１に示す塩基配列部分を増幅するためのＬＡＭＰプライマーとして、配列番号７〜１２の６つのプライマーのセットを用いれば、標的配列の増幅効率及び特異性が高くなる。また、配列番号４に示す塩基配列部分を増幅するためのＬＡＭＰプライマーとして、配列番号１３〜１８の６つのプライマーのセットを用いれば、標的配列の増幅効率及び特異性が高くなる。 Moreover, when a set of 6 primers of SEQ ID NOS: 7 to 12 is used as the LAMP primer for amplifying the base sequence portion shown in SEQ ID NO: 1, the amplification efficiency and specificity of the target sequence are increased. Further, when the set of 6 primers of SEQ ID NOS: 13 to 18 is used as the LAMP primer for amplifying the base sequence portion shown in SEQ ID NO: 4, the amplification efficiency and specificity of the target sequence are increased.
ストレプトコッカス ミュータンスの有無の判定
ストレプトコッカス ミュータンスの標的配列部分の増幅は、例えば、エチジウムブロミド (EtBr)、ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮのような２本鎖核酸に結合するインターカレーター存在下で増幅反応を行い、紫外線ランプ下で蛍光を確認することで行える。また、カルセインのようなキレート剤は、増幅前にはマンガンイオンと結合して消光しているが、核酸増幅反応が進行すると、生成するピロリン酸イオンにマンガンイオンを奪われることで蛍光を発し、さらに反応液中のマグネシウムイオンと結合することで蛍光が増強されるため、紫外線ランプ下で蛍光を確認することで、増幅の有無を確認することができる。
さらに、ＤＮＡ合成酵素による伸長反応では副産物としてピロリン酸が生成するため、反応液中のマグネシウムイオンと反応してピロリン酸マグネシウムが生じる。ＬＡＭＰ法のように増幅産物の生成量が多い方法では、反応液中にピロリン酸マグネシウムが析出して白濁を生じるため、白濁を目視で確認することで、標的配列の増幅を確認することができる。
Determination of presence / absence of Streptococcus mutans Amplification of a target sequence portion of Streptococcus mutans is performed, for example, by performing an amplification reaction in the presence of an intercalator that binds to a double-stranded nucleic acid such as ethidium bromide (EtBr) or SYBR GREEN, and an ultraviolet lamp is used. This can be done by checking the fluorescence below. Further, a chelating agent such as calcein is quenched by binding to manganese ion before amplification, but when the nucleic acid amplification reaction proceeds, pyrophosphate ion generated produces fluorescence by depriving manganese ion, Furthermore, since the fluorescence is enhanced by binding with magnesium ions in the reaction solution, the presence or absence of amplification can be confirmed by confirming the fluorescence under an ultraviolet lamp.
Furthermore, since pyrophosphate is produced as a by-product in the extension reaction by the DNA synthase, it reacts with magnesium ions in the reaction solution to produce magnesium pyrophosphate. In a method such as the LAMP method in which a large amount of an amplification product is produced, magnesium pyrophosphate is precipitated in the reaction solution to cause white turbidity. Therefore, by visually checking the white turbidity, amplification of the target sequence can be confirmed. ..
以下、実施例を挙げて、本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
（１）標的配列のクローニング
ヒト口腔内から単離した、ストレプトコッカス ミュータンス（Streptococcus mutans）及びｃｎｍ−陽性ストレプトコッカス ミュータンス（Streptococcus mutans）を培養した後、ＤＮＡゲノム抽出キット（GenCheck DNA Extraction Reagent・FASMAC）を用いて染色体ＤＮＡを調製した。
ストレプトコッカス ミュータンスの染色体ＤＮＡを鋳型とし、下記プライマーセットを用いて、ＰＣＲキット（Expand long renge、Roche社）にて、配列番号１に示す、トランスグルコシダーゼ遺伝子の部分配列を増幅した。
Forwardプライマー：TGAGCTGCTGTTTGTCTT（配列番号２）
Reverseプライマー：GTTTCAGCAGAAACAGAACA（配列番号３）
また、ｃｎｍ−陽性ストレプトコッカス ミュータンスの染色体ＤＮＡを鋳型とし、下記プライマーセットを用いて、ＰＣＲキット（Expand long renge、Roche社）にて、配列番号４に示す、ｃｎｍタンパク質遺伝子の部分配列を増幅した。
Forwardプライマー：CAGACTGAATGTCATCTTCAA（配列番号５）
Reverseプライマー：GCAGTAACATTTCATCGCTG（配列番号６）
ＰＣＲ産物を、pGEM-T Easy Vector System I（Promega社）を用いてＴＡクローニングした。即ち、ＰＣＲ産物を、このキットに含まれるベクター及びリガーゼ含有バッファーと混合してライゲーションし、Escherichia coli DH5αコンピテントセル（タカラバイオ株式会社）を形質転換した。
配列番号１に示すトランスグルコシダーゼ遺伝子の部分配列を含むプラスミドをＳＭプラスミドと称し、配列番号４に示すｃｎｍタンパク質遺伝子の部分配列を含むプラスミドをｃｎｍプラスミドと称する。
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.
(1) Cloning of target sequence After culturing Streptococcus mutans and cnm-positive Streptococcus mutans isolated from human oral cavity, DNA genome extraction kit (GenCheck DNA Extraction Reagent / FASMAC) Was used to prepare chromosomal DNA.
A partial sequence of the transglucosidase gene shown in SEQ ID NO: 1 was amplified with a PCR kit (Expand long renge, Roche) using the chromosomal DNA of Streptococcus mutans as a template and the following primer set.
Forward primer: TGAGCTGCTGTTTGTCTT (SEQ ID NO: 2)
Reverse primer: GTTTCAGCAGAAACAGAACA (SEQ ID NO: 3)
In addition, a partial sequence of the cnm protein gene shown in SEQ ID NO: 4 was amplified with a PCR kit (Expand long renge, Roche) using the chromosomal DNA of cnm-positive Streptococcus mutans as a template and the following primer set. ..
Forward primer: CAGACTGAATGTCATCTTCAA (SEQ ID NO: 5)
Reverse primer: GCAGTAACATTTCATCGCTG (SEQ ID NO: 6)
The PCR product was TA cloned using pGEM-T Easy Vector System I (Promega). That is, the PCR product was mixed with the vector contained in this kit and a ligase-containing buffer and ligated to transform Escherichia coli DH5α competent cells (Takara Bio Inc.).
A plasmid containing the partial sequence of the transglucosidase gene shown in SEQ ID NO: 1 is called an SM plasmid, and a plasmid containing the partial sequence of the cnm protein gene shown in SEQ ID NO: 4 is called a cnm plasmid.
（２）プライマー感度の検討
配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡ（トランスグルコシダーゼ遺伝子の部分）を含むＳＭプラスミド、及び配列番号４の塩基配列を有するＤＮＡ（ｃｎｍタンパク質遺伝子の部分）を含むｃｎｍプラスミドを鋳型として、ＬＡＭＰ法試薬（Loopamp DNA増幅試薬、栄研化学社）を用いて、ＤＮＡを増幅した。
ＬＡＭＰ反応用液２５μＬ中に含まれる各成分量は、以下の通りとした。
プライマー：1600nM FIP、1600nM BIP、800nM LF、800nM LB、400nM F3、400nM R3
標的ＤＮＡ液：1μL
Loopamp蛍光・目視検出試薬（栄研化学社）1μL
0.8Mベタイン
上記ＬＡＭＰ反応用液を調製した後、反応チューブに移し換えて、転倒混和後６４℃で２時間反応させた。
用いたプライマーセットは下記の通りである。
トランスグルコシダーゼ遺伝子増幅用プライマーセット（「ＳＭプライマー」と称する）
F3: GAAGTTTGTGCTTCTTCTGA（配列番号７）
B3: GATAAGGCGGCATCTGAA（配列番号８）
FIP: GCATAACTAAGGAAACTCCTTCACACGTATTTGTTACTGTTTTGTCAT（配列番号９）
BIP: CTTGTATCAGCAACGTTTGCCTGCCAAACAGATGCACCTAA（配列番号１０）
LF: TATTACAACACAAGCCAACT（配列番号１１）
LB: TGGGCCTGCG TTTGTTCTGT（配列番号１２）
ｃｎｍタンパク質遺伝子増幅用プライマーセット（「ｃｎｍプライマー」と称する）
F3: CCAGTAATACTGTCATTGAAAGT（配列番号１３）
B3: CGCTTTGAGTTTGATGAGC（配列番号１４）
FIP: AACCATTAAGCTGGAGGTTCAGGAACTGCTTTGTCTTGCGT（配列番号１５）
BIP: CGTATAACCTGTTCCTCTGACTGTAATATTAAAGCAGGCGACAC（配列番号１６）
LF: GCAAGTATGTTGGTGATTTG（配列番号１７）
LB: CCTGAATTCTGCCAGTTAAC（配列番号１８）
ＬＡＭＰ反応用液に加える標的ＤＮＡの量は、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０６、又は１×１０８に変化させた。
(2) Examination of primer sensitivity An SM plasmid containing DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 (portion of transglucosidase gene) and a cnm plasmid containing DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 (portion of cnm protein gene) were prepared. DNA was amplified using a LAMP method reagent (Loopamp DNA amplification reagent, Eiken Chemical Co., Ltd.) as a template.
The amount of each component contained in 25 μL of the LAMP reaction liquid was as follows.
Primers: 1600nM FIP, 1600nM BIP, 800nM LF, 800nM LB, 400nM F3, 400nM R3
Target DNA solution: 1 μL
Loopamp fluorescence / visual detection reagent (Eiken Chemical Co., Ltd.) 1 μL
0.8M betaine
After the above LAMP reaction liquid was prepared, it was transferred to a reaction tube, mixed by inversion and allowed to react at 64 ° C. for 2 hours.
The primer set used is as follows.
Primer set for transglucosidase gene amplification (referred to as "SM primer")
F3: GAAGTTTGTGCTTCTTCTGA (SEQ ID NO: 7)
B3: GATAAGGCGGCATCTGAA (SEQ ID NO: 8)
FIP: GCATAACTAAGGAAACTCCTTCACACGTATTTGTTACTGTTTTGTCAT (SEQ ID NO: 9)
BIP: CTTGTATCAGCAACGTTTGCCTGCCAAACAGATGCACCTAA (SEQ ID NO: 10)
LF: TATTACAACACAAGCCAACT (SEQ ID NO: 11)
LB: TGGGCCTGCG TTTGTTCTGT (SEQ ID NO: 12)
cnm protein gene amplification primer set (referred to as "cnm primer")
F3: CCAGTAATACTGTCATTGAAAGT (SEQ ID NO: 13)
B3: CGCTTTGAGTTTGATGAGC (SEQ ID NO: 14)
FIP: AACCATTAAGCTGGAGGTTCAGGAACTGCTTTGTCTTGCGT (SEQ ID NO: 15)
BIP: CGTATAACCTGTTCCTCTGACTGTAATATTAAAGCAGGCGACAC (SEQ ID NO: 16)
LF: GCAAGTATGTTGGTGATTTG (SEQ ID NO: 17)
LB: CCTGAATTCTGCCAGTTAAC (SEQ ID NO: 18)
The amount of target DNA added to the LAMP reaction solution was changed to 1 × 10 2 , 1 × 10 3 , 1 × 10 4 , 1 × 10 6 , or 1 × 10 8 .
紫外線ランプ下で各反応チューブを観察した結果を図１に示す。トランスグルコシダーゼ遺伝子増幅用のＳＭプライマーを用いた場合、ＳＭプラスミドが１×１０６分子以上あれば検出でき、ｃｎｍタンパク質遺伝子増幅用のｃｎｍプライマーを用いた場合、ｃｎｍプラスミドが１×１０３分子以上あれば検出できた。 The result of observing each reaction tube under an ultraviolet lamp is shown in FIG. When the SM primer for transglucosidase gene amplification is used, it can be detected if the SM plasmid is 1 × 10 6 molecules or more, and when the cnm primer for cnm protein gene amplification is used, the cmn plasmid is 1 × 10 3 molecules or more. I was able to detect.
（３）唾液の培養方法の検討
ｃｎｍ−陽性ストレプトコッカス ミュータンスを保有することが分かっている被験者から採取した唾液２０μＬを２ｍＬのＢＨＩ (Brain heart infusion）液体培地に移して、1日間培養後の培養液を回収した（唾液のＢＨＩ液体培地による培養液）。
別途、同唾液２０μＬを、内直径６ｃｍのシャーレ（商品名：BioLite 60mm Tissue Culture Dish、型番：130181、Thermo Fisher Scientific社）中に作成したＭＳＢ寒天培地（Becton, Dickinson and Company, 229810）上に載せて、３７℃で２４時間静置培養した。この培養後にコロニーは目視観察により認められなかった。次いで、このＭＳＢ寒天培地上に５０μＬのＢＨＩ液体培地を注入して、培地表面を洗った後、回収した（ＭＳＢ寒天培地上の菌の回収液）。
(3) Examination of a method for culturing saliva 20 μL of saliva collected from a subject known to have a cmm-positive Streptococcus mutans was transferred to 2 mL of BHI (Brain heart infusion) liquid medium, and culturing after 1 day of culturing The liquid was collected (a culture solution of saliva in a BHI liquid medium).
Separately, 20 μL of the same saliva was placed on an MSB agar medium (Becton, Dickinson and Company, 229810) prepared in a petri dish (product name: BioLite 60mm Tissue Culture Dish, model number: 130181, Thermo Fisher Scientific) with an inner diameter of 6 cm. Then, static culture was carried out at 37 ° C. for 24 hours. No colonies were observed by visual observation after this culture. Next, 50 μL of BHI liquid medium was injected onto this MSB agar medium to wash the surface of the medium and then collected (collection solution of bacteria on MSB agar medium).
唾液のＢＨＩ液体培地による培養液、及びＭＳＢ寒天培地上の菌の回収液を、それぞれ１μＬずつ用いてＬＡＭＰ反応用液を調製した。別途、ＳＭプラスミド、及びｃｎｍプラスミドを、それぞれ１μＬずつ用いてＬＡＭＰ反応用液を調製した。
ＬＡＭＰ反応用液の組成は、標的ＤＮＡ液１μＬに代えて、培養液又は菌回収液又は各プラスミド液１μＬを用いた他は、「（２）プライマー感度の検討」の項目に記載した通りである。
プライマーは、「（２）プライマー感度の検討」の項目に記載したトランスグルコシダーゼ遺伝子増幅用のＳＭプライマーと、ｃｎｍタンパク質遺伝子増幅用のｃｎｍプライマーを、それぞれ用いた。
A LAMP reaction solution was prepared by using 1 μL each of the culture solution of saliva in a BHI liquid medium and the recovery solution of the bacteria on the MSB agar medium. Separately, 1 μL each of the SM plasmid and the cmm plasmid was used to prepare a LAMP reaction solution.
The composition of the LAMP reaction solution is as described in the item "(2) Examination of primer sensitivity" except that 1 μL of the target DNA solution was replaced with 1 μL of the culture solution or the bacterial collection solution or each plasmid solution. ..
As the primers, the SM primer for transglucosidase gene amplification and the cnm primer for cnm protein gene amplification described in the item "(2) Examination of primer sensitivity" were used.
６４℃で２時間反応させた後、紫外線ランプ下で各反応チューブを観察した。結果を図２に示す。
唾液をＢＨＩ液体培地で培養した培養液を核酸増幅法に供しても、ストレプトコッカス ミュータンスの上記両遺伝子の増幅を検出することはできなかったが、唾液をＭＳＢ固体培地で培養した後、菌を回収した液を核酸増幅法に供した場合は、ストレプトコッカス ミュータンスのトランスグルコシダーゼ遺伝子及びｃｎｍタンパク質遺伝子の増幅を検出することができた。
After reacting at 64 ° C. for 2 hours, each reaction tube was observed under an ultraviolet lamp. The results are shown in Figure 2.
Even when the culture solution obtained by culturing saliva in BHI liquid medium was subjected to the nucleic acid amplification method, amplification of both genes of Streptococcus mutans could not be detected. However, after culturing saliva in MSB solid medium, the bacteria were When the recovered solution was subjected to the nucleic acid amplification method, amplification of the transglucosidase gene and the cnm protein gene of Streptococcus mutans could be detected.
（４）菌数の検出限界の検討
滅菌した爪楊枝で、保存菌液（保菌者から得られた、ストレプトコッカス ミュータンス及びｃｎｍ−陽性ストレプトコッカス ミュータンス）からピックアップして、別途シャーレ中に作製したＭＳＢ寒天培地に、１プレート当たり１コロニー、５コロニー、１０コロニー、又は２０コロニーが形成されるように接種した。ＭＳＢ寒天培地の組成は、「（３）唾液の培養方法の検討」で用いたものと同じである。また、コロニーを接種しないＭＳＢ寒天培地をネガティブコントロールとして用意した。これらの培地を３７℃で２４時間静置培養した。
次いで、これらのＭＳＢ寒天培地上に５０μＬのＢＨＩ液体培地を注入して、培地表面を洗った後、回収した。回収液１μＬを用いてＬＡＭＰ反応用液を調製した。ＬＡＭＰ反応用液は、標的ＤＮＡ液１μＬに代えて回収液１μＬを用いた他は、「（２）プライマー感度の検討」の項目に記載した通りである。
プライマーは、「（２）プライマー感度の検討」の項目に記載したトランスグルコシダーゼ遺伝子増幅用のＳＭプライマーと、ｃｎｍタンパク質遺伝子増幅用のｃｎｍプライマーをそれぞれ用いた。
(4) Examination of detection limit of the number of bacteria MSB agar prepared separately in a petri dish with a sterilized toothpick and picked up from a preserved bacterial solution (Streptococcus mutans and cnm-positive Streptococcus mutans obtained from a carrier). The medium was inoculated to form 1 colony, 5 colonies, 10 colonies, or 20 colonies per plate. The composition of the MSB agar medium is the same as that used in “(3) Examination of saliva culture method”. In addition, MSB agar medium not inoculated with colonies was prepared as a negative control. These media were statically cultured at 37 ° C. for 24 hours.
Then, 50 μL of BHI liquid medium was injected onto these MSB agar medium to wash the surface of the medium and then collected. A LAMP reaction solution was prepared using 1 μL of the recovered solution. The LAMP reaction liquid was as described in the item “(2) Examination of primer sensitivity” except that 1 μL of the recovery liquid was used instead of 1 μL of the target DNA liquid.
As the primers, the SM primer for transglucosidase gene amplification and the cnm primer for cnm protein gene amplification described in the item "(2) Examination of primer sensitivity" were used.
６４℃で２時間反応させた後、紫外線ランプ下で各反応チューブを観察した。結果を図３に示す。
ストレプトコッカス ミュータンスのトランスグルコシダーゼ遺伝子及びｃｎｍタンパク質遺伝子の何れをターゲットとした場合も、ＭＳＢ寒天培地上に１コロニーあれば、ネガティブコントロールより明らかに強い蛍光が観察され、ＤＮＡの増幅が確認された。
After reacting at 64 ° C. for 2 hours, each reaction tube was observed under an ultraviolet lamp. Results are shown in FIG.
When targeting either the transglucosidase gene of Streptococcus mutans or the cnm protein gene, if one colony was present on the MSB agar medium, a clearer fluorescence was observed as compared with the negative control, and DNA amplification was confirmed.
（５）ｃｎｍ−陽性ストレプトコッカス ミュータンスの検出限界の検討
口腔内にはｃｎｍ−陽性ストレプトコッカス ミュータンスとｃｎｍ−陰性ストレプトコッカス ミュータンスが混在していることから、ＭＳＢ寒天培地上に両ストレプトコッカス ミュータンスが混在している場合に、ｃｎｍ−陽性ストレプトコッカス ミュータンスを特異的に検出できるか否かを検討した。
(5) Examination of detection limit of cmm-positive Streptococcus mutans Since both nmm-positive Streptococcus mutans and cmm-negative Streptococcus mutans are mixed in the oral cavity, both Streptococcus mutans are mixed on the MSB agar medium. It was examined whether or not the cmn-positive Streptococcus mutans can be specifically detected in the case of the above.
シャーレ中に作製したＭＳＢ寒天培地の１プレート上に、保菌者から得られたｃｎｍ−陽性ストレプトコッカス ミュータンスを１コロニーが形成されるように接種すると共に、保菌者から得られたｃｎｍ−陰性ストレプトコッカス ミュータンスを１コロニー、９コロニー、又は４９コロニーが形成されるように接種した。ネガティブコントロールとして、ＭＳＢ寒天培地に、ｃｎｍ−陽性ストレプトコッカス ミュータンスを接種せず、ｃｎｍ−陰性ストレプトコッカス ミュータンスのみ４９コロニーが形成されるように接種したものも作製した。ＭＳＢ寒天培地の組成は、「（３）唾液の培養方法の検討」で用いたものと同じである。これらの培地を３７℃で２４時間静置培養した。
次いで、これらのＭＳＢ寒天培地上に５０μＬのＢＨＩ液体培地を注入して、培地表面を洗った後、回収した。回収液を１μＬ用いてＬＡＭＰ反応用液を調製した。ＬＡＭＰ反応用液は、標的ＤＮＡ液１μＬに代えて回収液１μＬを用いた他は、「（２）プライマー感度の検討」の項目に記載した通りである。
プライマーは、「（２）プライマー感度の検討」の項目に記載したトランスグルコシダーゼ遺伝子増幅用のＳＭプライマーと、ｃｎｍタンパク質遺伝子増幅用のｃｎｍプライマーをそれぞれ用いた。
One plate of MSB agar medium prepared in a petri dish was inoculated with cmn-positive Streptococcus mutans obtained from the carrier so that one colony was formed, and cmn-negative Streptococcus mu obtained from the carrier was obtained. Closets were inoculated to form 1, 9, or 49 colonies. As a negative control, an MSB agar medium was also inoculated so that cnm-positive Streptococcus mutans was not inoculated but only cnm-negative Streptococcus mutans was inoculated so that 49 colonies were formed. The composition of the MSB agar medium is the same as that used in “(3) Examination of saliva culture method”. These media were statically cultured at 37 ° C. for 24 hours.
Then, 50 μL of BHI liquid medium was injected onto these MSB agar medium to wash the surface of the medium and then collected. A LAMP reaction solution was prepared by using 1 μL of the recovered solution. The LAMP reaction liquid was as described in the item “(2) Examination of primer sensitivity” except that 1 μL of the recovery liquid was used instead of 1 μL of the target DNA liquid.
As the primers, the SM primer for transglucosidase gene amplification and the cnm primer for cnm protein gene amplification described in the item "(2) Examination of primer sensitivity" were used.
６４℃で２時間反応させた後、紫外線ランプ下で各反応チューブを観察した。結果を図４に示す。
全コロニー数に占めるｃｎｍ-陽性ストレプトコッカス ミュータンスのコロニー数の比率が２％（ｃｎｍ−陽性ストレプトコッカス ミュータンス：ｃｎｍ−陰性ストレプトコッカス ミュータンスのコロニー数比が１：４９）以上の場合に、ｃｎｍ−陽性ストレプトコッカス ミュータンスのｃｎｍ結合タンパク質遺伝子を増殖させることができた。
このことは、口腔内に存在するストレプトコッカス ミュータンス中のｃｎｍ-陽性ストレプトコッカス ミュータンスの比率が２％以上の場合にｃｎｍ-陽性ストレプトコッカス ミュータンスを検出できることを意味する。一般に、口腔内ストレプトコッカス ミュータンスの約３０％がｃｎｍ-陽性ストレプトコッカス ミュータンスであるため、本発明方法でｃｎｍ-陽性ストレプトコッカス ミュータンスを検出すれば、ｃｎｍ-陰性ストレプトコッカス ミュータンスの存在による偽陰性が極めて少ないことが分かる。
After reacting at 64 ° C. for 2 hours, each reaction tube was observed under an ultraviolet lamp. The results are shown in Fig. 4.
When the ratio of the number of colonies of cnm-positive Streptococcus mutans to the total number of colonies is 2% (cnm-positive Streptococcus mutans: cnm-negative Streptococcus mutans colony ratio is 1:49) or more, cnm-positive The cnm binding protein gene of Streptococcus mutans could be propagated.
This means that the cnm-positive Streptococcus mutans can be detected when the ratio of the cmm-positive Streptococcus mutans in the Streptococcus mutans present in the oral cavity is 2% or more. In general, about 30% of oral Streptococcus mutans are cnm-positive Streptococcus mutans. Therefore, when the cnm-positive Streptococcus mutans is detected by the method of the present invention, false negatives due to the presence of cnm-negative Streptococcus mutans are extremely high. You can see that there are few.
（６）ＬＡＭＰ法以外の増幅法でのストレプトコッカス ミュータンスの検出限界の検討
「（５）ｃｎｍ−陽性ストレプトコッカス ミュータンスの検出限界の検討」の項目と同様にして、ｃｎｍ−陽性ストレプトコッカス ミュータンス：ｃｎｍ−陰性ストレプトコッカス ミュータンスのコロニー数が０：４９、１：１、１：９、又は１：４９となるように生育させたＭＳＢ寒天培地を用意した。
次いで、これらのＭＳＢ寒天培地上に５０μＬのＢＨＩ液体培地を注入して、培地表面を洗った後、回収した。
回収液１μＬを用いて、KOD FX Neo(TOYOBO社)を用いて、ＰＣＲでＤＮＡ増幅した。反応は、PCR Thermal Cycler Diceを用いて９４℃で２分熱変性させた後、９８℃で１０秒、５５℃で２０秒、６８℃で２０秒のサイクルを３２回行った。プライマーは、ストレプトコッカス ミュータンスのトランスグルコシダーゼ遺伝子を増幅させるために配列番号２及び３のプライマーセットを用い、ｃｎｍ−陽性ストレプトコッカス ミュータンスのｃｎｍタンパク質遺伝子を増幅させるために配列番号５及び６のプライマーセットを用いた。
ＰＣＲでＤＮＡ増幅した後、３％アガロースで電気泳動し、ＧｅｌＲｅｄ染色（Biotium社）してバンドを確認した。
(6) Examination of detection limit of Streptococcus mutans by an amplification method other than LAMP method In the same manner as the item of "(5) Examination of detection limit of cnm-positive Streptococcus mutans", cnm-positive Streptococcus mutans: cnm -A negative Streptococcus mutans colony was prepared with an MSB agar medium grown to have a colony count of 0:49, 1: 1, 1: 9, or 1:49.
Then, 50 μL of BHI liquid medium was injected onto these MSB agar medium to wash the surface of the medium and then collected.
Using 1 μL of the collected solution, DNA was amplified by PCR using KOD FX Neo (TOYOBO). The reaction was heat-denatured at 94 ° C. for 2 minutes using a PCR Thermal Cycler Dice, and then cycled 32 times at 98 ° C. for 10 seconds, 55 ° C. for 20 seconds and 68 ° C. for 32 times. As the primers, the primer sets of SEQ ID NOs: 2 and 3 were used to amplify the transglucosidase gene of Streptococcus mutans, and the primer sets of SEQ ID NOs: 5 and 6 were used to amplify the cnm protein gene of cnm-positive Streptococcus mutans. Using.
After DNA amplification by PCR, electrophoresis was performed on 3% agarose, and GelRed staining (Biotium) was performed to confirm bands.
結果を図５に示す。全コロニー数に占めるｃｎｍ-陽性ストレプトコッカス ミュータンスのコロニー数の比率が２％（ｃｎｍ−陽性ストレプトコッカス ミュータンス：ｃｎｍ−陰性ストレプトコッカス ミュータンスのコロニー数比が１：４９）以上の場合に、ｃｎｍ−陽性ストレプトコッカス ミュータンスのｃｎｍ結合タンパク質遺伝子を増殖させることができた。ＬＡＭＰ法以外の方法でもＬＡＭＰ法（図３）と同様の結果となった。 Results are shown in FIG. When the ratio of the number of colonies of cnm-positive Streptococcus mutans to the total number of colonies is 2% (cnm-positive Streptococcus mutans: cnm-negative Streptococcus mutans colony number ratio is 1:49) or more, cnm-positive The cnm binding protein gene of Streptococcus mutans could be propagated. The results other than the LAMP method were similar to those of the LAMP method (FIG. 3).
（７）ＭＳＢ寒天培地の形状の検討
「（３）唾液の培養方法の検討」で使用したＭＳＢ寒天培地は、内直径６ｃｍのシャーレ中に作製したものである。今回、より小さい培地面積で培養してもｃｎｍ−陽性ストレプトコッカス ミュータンスを検出できるかを検討した。
即ち、「（３）唾液の培養方法の検討」と同じ操作を行い、但し、ＭＳＢ寒天培地は、内直径６ｃｍのシャーレ（商品名：BioLite 60mm Tissue Culture Dish、型番：130181、Thermo Fisher Scientific社）中に作製したもの、及び２ｍＬ容マイクロチューブ（商品名：2.0ml Graduated Microcentrifuge Tube with Flat Top Cap、型番：508-GRD-Q、Thermo Fisher Scientific社）（内直径９ｍｍ）中に斜め４５度に傾けて作製したものを使用した。
また、回収した菌液に代えて、ｃｎｍプラスミドを１μＬ用いてＬＡＭＰ反応用液を調製したものをポジティブコントロールとし、回収した菌液もプラスミドも加えずにＬＡＭＰ反応用液を調製したものをネガティブコントロールとした。
(7) Examination of the shape of MSB agar medium The MSB agar medium used in "(3) Examination of saliva culture method" was prepared in a petri dish having an inner diameter of 6 cm. This time, it was examined whether or not cmn-positive Streptococcus mutans could be detected even when cultured in a smaller medium area.
That is, the same operation as "(3) Examination of culture method of saliva" is performed, except that the MSB agar medium is a dish having an inner diameter of 6 cm (trade name: BioLite 60 mm Tissue Culture Dish, model number: 130181, Thermo Fisher Scientific). It is tilted at an angle of 45 degrees into the one manufactured inside and the 2 mL volume micro tube (Product name: 2.0 ml Graduated Microcentrifuge Tube with Flat Top Cap, model number: 508-GRD-Q, Thermo Fisher Scientific) (inner diameter 9 mm). What was produced by using was used.
In addition, the LAMP reaction solution prepared by using 1 μL of cnm plasmid in place of the recovered bacterial solution was used as a positive control, and the LAMP reaction solution prepared without adding the recovered bacterial solution and the plasmid was used as a negative control. And
結果を図６に示す。ＭＳＢ寒天培地を作製する容器を小さくし、口腔内試料を塗布する表面積を小さくしても、その後の核酸増幅によりｃｎｍ−陽性ストレプトコッカス ミュータンスを含むストレプトコッカス ミュータンスを検出できることが示された。 Results are shown in FIG. It was shown that Streptococcus mutans containing the cmm-positive Streptococcus mutans can be detected by subsequent nucleic acid amplification even if the container for producing the MSB agar medium is made small and the surface area for applying the intraoral sample is made small.
本発明のストレプトコッカス ミュータンスの検出方法は、簡便に短時間で行えるため、多数の口腔内試料を処理する病院検査や集団検診などで行い易い。ストレプトコッカス ミュータンスの中でもｃｎｍ−陽性ストレプトコッカス ミュータンスの存在は、脳微小出血とそれによる脳卒中や認知症、炎症性腸炎、ＮＡＳＨの発症と関連しているため、本発明方法により、これらの疾患の発症を予測し、早期に予防できるようになり、医療費の削減につながる。成人の約９割がストレプトコッカス ミュータンスを保有し、その約３割がｃｎｍ−陽性ストレプトコッカス ミュータンスを保有しているとされている。従って、本発明方法を用いた検査は市場価値が高い。 Since the method for detecting Streptococcus mutans of the present invention can be carried out simply and in a short time, it can be easily carried out in a hospital examination or a mass examination in which a large number of intraoral samples are processed. Among the Streptococcus mutans, the presence of the cmm-positive Streptococcus mutans is associated with cerebral microhemorrhage and stroke, dementia, inflammatory bowel inflammation, and the onset of NASH due to the occurrence of these diseases. It will be possible to predict, prevent early and lead to reduction of medical expenses. It is said that about 90% of adults have Streptococcus mutans, and about 30% of them have cnm-positive Streptococcus mutans. Therefore, the inspection using the method of the present invention has a high market value.
Claims (9)
A solid medium used in the method for detecting Streptococcus mutans according to claim 1, wherein a solid medium capable of selectively growing Streptococcus mutans is formed in one or more recesses of the container. The solid medium having a surface area of 0.2 to 8 cm 2 of the solid medium formed in the concave portions of.
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