JP2020061955A - 新生児期〜小児期発症の脳小血管病又はその保因者の検出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
患者
脳小血管病の患者2名を対象とした。患者の両親から書面によるインフォームド・コンセントを得た。実験プロトコールは横浜市立大学医学部の倫理委員会により承認された。患者1及びその両親の白血球よりDNAを抽出した。患者2は、骨格筋剖検サンプルよりDNAを抽出した。
WES及びデータ解析は既報[5]の通りに行なった。検出された変異はサンガーシークエンシングにより確認した。
Prime Star GXL (Takara, 日本国滋賀) 及びKOD-Fx neo (TOYOBO, 日本国大阪)を使用して患者2のゲノムDNAより2箇所のCOLGALT1変異をカバーする4つのアンプリコン(2370〜9961 bp)を増幅した。MinION 1D ligation kit (SQK-LSK108) 及びR9.4 Flow Cellを製造者のプロトコール(Oxford Nanopore Technologies, 英国Oxford)に従って使用し、これらのアンプリコンの配列を決定した。ベースコールはMinKNOW1.10.11を用いて行なった。ヒトゲノムリファレンス(hg19)へのリードのアライメントにはLAST (https://github.com/mcfrith/last-rna/blob/master/last-long-reads.md)を用いた。ジェノタイピング及び2つの変異部位間の領域のフェージングはlast-genotype (https://github.com/mcfrith/last-genotype)を用いて行なった。両変異に対するリファレンスバイアスを回避するため、リードアライメントの前に両部位においてリファレンスをGからSに変更した。
Droplet Digital PCR XQ200 system (BIO-RAD, 米国カリフォルニア州Hercules)を用いてドロップレットデジタルPCRを行なった。患者2のゲノムDNAを20 ngと、c.460G>C変異を標的とするFAM標識ロックド核酸(LNA)プローブ、c.1129G>C変異を標的とするHEX標識LNAプローブ、各標的領域を増幅する2組のプライマーセット、及びddPCR Supermix for Probes (no dUTP) (BIO-RAD)を含む反応液でデジタルPCR反応を行なった。2つの変異のフェージングは既報[6]の通りに行なった。
ヒトColGalT1のモデル構造は、UDP、GalNAc及びMn2+と複合体化したpp-GalNAc-T10の結晶構造 (PDB code 2d7i)[7]より、Protein Homology/analogY Recognition Engine V 2.0 [8]を用いて構築した。同定した変異を含む構造の自由エネルギー変化は、FoldXソフトウェア(バージョン4)[9]を用いて算出し、5回の計算結果の平均値±標準偏差として示した。
ColGalT活性は既報[10]の通りに測定した。以下、手順を簡潔に記載する。熱変性させた牛アキレス腱由来I型コラーゲン(Sigma)をアクセプター基質として用いた。ヒトリンパ芽球由来のミクロソームタンパク質約15μgを、0.5 mg/mlコラーゲンアクセプター、60 μM UDP-Gal (Sigma), 50,000 cpm UDP-[14C]Gal (GE Healthcare), 10 mM MnCl2, 20 mM NaCl, 50 mM モルホリンプロパンスルホン酸 (pH 7.4), 及び1 mM DTTに添加し、総量を100μLとした。反応液を37℃で3時間インキュベートした後、500μLの氷冷5%トリクロロ酢酸−5%リンタングステン酸の添加により反応を停止させた。沈殿物をガラス繊維フィルター(Whatman, Sigma-Aldrich)にアプライし、10 mlの50%エタノールで洗浄、30分間乾燥後、シンチレーションβカウンタ(Packard)で計測した。
ヒトCOLGALT1クローン(MGC:117270 IMAGE:5138787)をpcDNA3.1/myc-His Cベクター (Invitrogen, 米国カリフォルニア州Carlsbad)に導入し、C末端myc-Hisタグ付加したColGalT1を発現させた。 KOD-Plus-Mutagenesis kit (TOYOBO)を用いた部位特異的変異導入により変異COLGALT1ベクター(p.Leu151Arg, p.Ala154Pro, 及びp.Gly377Arg)を作製した。Xfectトランスフェクション試薬 (Takara) を製造者のプロトコールに従って使用し、HT1080細胞をCOLGALT1発現プラスミドでトランスフェクトした。
HT1080細胞へのsiRNAのトランスフェクションは、Lipofectamine RNAiMAX transfection reagent (Invitrogen)を製造者のプロトコールに従い用いて行なった。COLGALT1の3'UTR領域を標的とする合計4種のsiRNA(配列番号13〜16)を用いた。1つはON-TARGET plus Human COLGALT1 siRNA (79709; Dharmacon)であり、他の3つはカスタムデザインした。非サイレンシングコントロールとしてAll Star Negative Control siRNA (Qiagen, 独国Hilden) を用いた。siRNAトランスフェクションの24時間後、6ウェルプレート又はカバーガラス上で培養した細胞を血清枯渇させ、50μg/mlアスコルビン酸で24時間処理した後に解析(ウエスタンブロッティング、又は免疫蛍光)を行なった。既報[4]の通りに細胞溶解物及び培養上清を別個に採取し、ウエスタンブロッティングに供した。
HT1080細胞でのRNA干渉の24時間後、野生型又は変異型のCOLGALT1プラスミド500 ngをトランスフェクトした。その24時間後に細胞を免疫蛍光解析に供した。
HT1080細胞へのCOLGALT1プラスミドのトランスフェクションの48時間後、細胞を10 μg/mlシクロヘキシミドで0, 2, 4, 又は24時間処理し、各時点で細胞溶解物を採取してウエスタンブロッティングに供した。ColGalT1タンパク質レベルは、β−アクチンレベルに対してノーマライズし、0時間におけるサンプルの総ColGalT1タンパク質量で除算して定量化した。
ウエスタンブロッティングはChemiDocTouch Imaging System (BIO-RAD)を用いて行なった。ColGalT1、β−アクチン、Mycの検出には、それぞれウサギポリクローナルGLT25D1抗体(16768-1-AP; Proteintech, 米国イリノイ州Rosemont)、マウス抗β−アクチン抗体(ab6276; Abcam, 英国Cambridge)、マウス抗Myc-tag mAb(MBL, 日本国名古屋)を用いた。COL4A1の検出にはラット抗IV型コラーゲンα1 NC1ドメインモノクローナル抗体(H11)[11]を用いた。バンド強度はImage Lab 5.2.1 (BIO-RAD)のボリュームツールを用いて測定した。
免疫蛍光は既報[4]の通りに行なった。免疫標識は、ラット抗IV型コラーゲンα1 NC1ドメインモノクローナル抗体 (H11, 抗ラットAlexa Fluor 488と共に使用)、ウサギ抗PDI (タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、この酵素は小胞体に存在しコラーゲン生合成に関与する[4]) ポリクローナル抗体 (SPA-890, 抗ウサギAlexa Fluor 546と共に使用, Enzo Life Sciences, 米国ニューヨーク州Farmingdale)、ウサギGLT25D1ポリクローナル抗体 (16768-1-AP, 抗ウサギAlexa Fluor 546と共に使用, Proteintech), 及び抗Mycタグモノクローナル抗体 (抗マウスAlexa Fluor 488又は546と共に使用, MBL)を用いて行なった。FLUOVIEW FV1000-D共焦点顕微鏡 (OLYMPUS, 日本国東京) 又はAll-in-One Fluorescence Microscope BZ-X800 (KEYENCE, 日本国大阪)で画像を取得した。
両アレル性のCOLGATL1変異を有する患者2名の臨床的特徴
患者1、患者2の臨床的特徴の概要をTable 1に示す。
患者1は研究時年齢12歳、非近親婚の両親の第2子(図1A)。妊娠経過は問題なく、妊娠満期に誘発分娩により合併症なく出産。5か月齢で首がすわらず、筋緊張低下が見られたため、医療機関を受診。脳CTで石灰化と左側脳室拡大を認めた。7か月齢でてんかん発作が出現。単純ないし複雑部分発作と、時にてんかん重積状態が見られ、抗てんかん剤を多剤併用投与した。21か月齢時の脳MRIでは、左半球に孔脳症と、軽度の萎縮を伴う両側性の白質脳症を認めた。現在までに、粗大運動機能及びコミュニケーションを退行なくゆっくりと獲得している。現在、患者1は痙性四肢麻痺を有し、日常生活にフルサポートが必要である。重度の知的障害もあり、K式発達検査による発達指数(DQ)は認知機能11、言語分野14である。12歳時の脳MRIでは変化を認めなかった(図1B, C)。
患者1についてのトリオのWESでは、COL4A1遺伝子及びCOL4A2遺伝子中にレアな変異は検出されなかったが(平均リードカバレッジはそれぞれ72.9×及び80.8×、コーディング領域の98.3%及び100%を少なくとも10×でカバー)、COLGALT1遺伝子(NM_024656)中にc.452T>G (p.Leu151Arg)とc.1096delG (p.Glu366Argfs*15)の複合ヘテロ変異が同定された。患者2のWESでは、COL4A1遺伝子、COL4A2遺伝子、NOTCH3遺伝子のいずれにも変異が検出されず(平均カバレッジはそれぞれ82.9×、72.6×及び64.0×、コーディング領域の95.2%、97.2%及び92.7%を少なくとも10×でカバー)、COLGALT1遺伝子にc.460G>C (p.Ala154Pro)とc.1129G>C (p.Gly377Arg)の2変異が検出された。
同定された4つの変異のうち、p.Ala154ProのみがExome Aggregation Consortium(ExAC)(http://exac.broadinstitute.org/)に頻度8.241 × 10-6(121,344アレル中に1つ)で登録されていたが、そのホモ接合性は登録されていなかった。他の変異は、公的に利用可能なゲノム変異データベース(ExAC; NHLBI Exome Sequencing Project Exome Variant Server(http://evs.gs.washington.edu/EVS/); 及びHuman Genetic Variation(http://www.hgvd.genome.med.kyoto-u.ac.jp/))のいずれにも存在しなかった。インシリコ解析ツール(SIFT、PolyPhen-2、及びMutationTaster)は、3つのミスセンス変異の全てが病原性と予測した。ColGalT1タンパク質は推定グリコシルトランスフェラーゼドメインを2箇所に有するが[12]、同定された4種の変異はいずれもColGalT1タンパク質におけるグリコシルトランスフェラーゼの触媒ドメインにマップされた。置換を受けたアミノ酸はいずれも進化的に強く保存された残基であり、これらの変異が酵素活性を大いに変化させるであろうことを暗示している(図1L)[12, 13]。同定されたCOLGALT1遺伝子変異の構造的な影響を評価するため、ColGalT1タンパク質の48〜291番残基の領域をカバーするモデルを構築し、L151R変異とA154P変異を予測構造にマップした(図1M)。151番Leu及び154番Alaの側鎖は当該タンパク質の疎水性コアに関与しているようであり、従ってL151R変異とA154P変異はタンパク質のフォールディングを不安定化して酵素活性を損なわせるものと考えられる。これらの置換変異の自由エネルギー変化をFoldXソフトウェア(バージョン4)[9]で推定するといずれも2.0 kcal/molを超えており(図1N)、上記の構造観察結果と合致した。377番Glyを含む信頼性の高い構造モデルは構築できなかったため、G377R変異がタンパク質の機能に及ぼす効果の構造レベルでの評価は行わなかった。
COLGALT1遺伝子がコードするコラーゲンβ(1-O)ガラクトシルトランスフェラーゼ1は、ヘテロ三量体形成及び細胞外分泌の前のプロコラーゲンペプチドの翻訳後修飾として、ガラクトースをヒドロキシリジンに付加する。COLGALT1遺伝子はヒト組織中に恒常的に発現し、IV型コラーゲンに対して強いColGalT活性を示す[10]。従って、ColGalT活性の低下は、脳血管系の基底膜中に豊富なIV型コラーゲンの分泌に影響を及ぼす可能性がある。これを調べるため、患者1及び年齢をマッチングしたコントロール3名に由来するリンパ芽球様細胞株(LCL)を用いてColGalT1タンパク質発現及びColGalT活性の検証を行なった。ウエスタンブロッティングの結果、患者1由来のLCL中にはColGalT1タンパク質が乏しいことがわかった(図2A)。ColGalT活性を測定したところ、患者のLCLは検出可能なColGalT活性を有しなかった(Table 2)。
既に死亡した患者2からは組織や培養細胞を入手できないため、インビトロ研究を行なって患者2で同定された2つの変異の病原性を検証した。患者1では、ColGalT1タンパク質発現、ColGalT酵素活性のいずれも検出不能であった。患者2で同定された2種のミスセンス変異のメカニズムとして、(1) 変異ColGalT1タンパク質が不安定で分解されやすい、(2) 変異ColGalT1タンパク質は安定だが、酵素活性が損なわれている、という2通りの可能性が考えられる。まずはColGalT1タンパク質の不安定性を調べた。野生型又は変異型のCOLGALT1を発現するプラスミドをトランスフェクトしたHT1080細胞をシクロヘキシミドで処理し、細胞内タンパク質合成を阻害した。各時点で採取・調製した細胞溶解物のウエスタンブロッティングを行ない、トランスフェクトしたプラスミド由来のColGalT1タンパク質を抗myc抗体で検出した。p.Leu151Arg変異タンパク質及びp.Ala154Pro変異タンパク質では、野生型に観察される標準バンドに加えて、より小さいバンドが全ての時点で観察された(図3A)。24時間の野生型ColGalT1タンパク質サンプルにおいても、同じバンドが弱い強度で観察された。この低分子量の異常バンドは、異なるグリコフォームないしはタンパク質分解断片であると考えられる。これら2種の変異タンパク質では、野生型と比べて、標準ColGalT1タンパク質の量が各時点でより速やかに減少しており、24時間後には野生型との間で有意差が認められた(図3B)。この結果は、p.Leu151Arg変異型及びp.Ala154Pro変異型のColGalT1タンパク質が不安定であることを示唆している。
ColGalT酵素活性を検証するため、内因性のCOLGALT1遺伝子をノックダウンしたHT1080細胞と、野生型又は変異型のCOLGALT1遺伝子cDNAプラスミドとを用いてレスキュー実験を行ない、正常なCOL4A1産生が回復するかどうかを調べた。レスキューが成功していることを確認した上で(図3B)、野生型又は変異型のCOLGALT1 cDNAでレスキューした条件下での細胞内COL4A1産生を免疫蛍光法により調べた。野生型COLGALT1遺伝子でレスキューした場合には、COL4A1の免疫染色シグナルが、天然のHT1080細胞において観察される顆粒状パターンに回復した。既に報告されるように、顆粒状パターンのCOL4A1の一部は、該タンパク質が小胞体から原形質膜に輸送される場であるところの分泌小胞内に局在する可能性がある[4]。野生型COLGALT1遺伝子でレスキューされた細胞では、顆粒状パターンのCOL4A1シグナルは、myc陽性トランスフェクト細胞のうちのおよそ45%に観察された。しかしながら、いずれかのCOLGALT1変異体でレスキューされた場合には、顆粒状パターンを伴うmyc陽性トランスフェクト細胞の数が有意に減少した(p.Leu151Arg変異及びp.Ala154Pro変異のCOLGALT1遺伝子でレスキューされた細胞では2%〜3%、p.Gly377Arg変異のCOLGALT1遺伝子でレスキューされた細胞では13%; 少なくとも4回の独立実験の平均値)(Table 3)。その上、回復したCOL4A1シグナルは、大部分のmyc陽性細胞において、細胞質内(顆粒状パターンなし)に拡散して分布していた。変異型ColGalT1タンパク質を発現する細胞内でのCOL4A1の拡散分布は、機能的なColGalT1タンパク質を発現する細胞で観察されるように、小胞体出口部位の代わりに小胞体内腔にコラーゲン分子が蓄積していることを示唆している。この結果は、COLGALT1遺伝子における3種のアミノ酸置換変異が酵素活性に悪影響を及ぼし、細胞内COL4A1輸送の回復が不十分になることを示している(図3C及びTable 3)。
本研究では、COL4A1/COL4A2遺伝子関連疾患に関連する、新生児期〜小児期発症の脳小血管病の新たな遺伝的原因として、ColGalT1活性に悪影響を及ぼす両アレル性のCOLGALT1遺伝子変異を発見した。本研究は、ColGalT1活性の低下によりCOL4A1の産生が減少し、それにより、COL4A1/COL4A2遺伝子関連疾患でみられるようにCOL4A1分泌が低下する[3,4]ことを示唆している。COL4A1タンパク質の低下又は非グリコシル化は、過去の報告[3]で示唆されるように、血管基底膜の脆弱性、又は他の細胞外分子とのタンパク質間相互作用の崩壊をもたらすであろう。
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Claims (7)
- 被検者由来の核酸を含む試料を用いて、当該被検者がCOLGALT1遺伝子に有害な変異を有するか否かを調べることを含む、新生児期〜小児期発症の脳小血管病又はその保因者の検出方法。
- COLGALT1遺伝子の有害な変異がホモ接合又は複合ヘテロ接合で検出された場合に、当該被検者が脳小血管病を発症している又は将来発症することが検出され、ヘテロ接合で検出された場合に保因者が検出される、請求項1記載の方法。
- ゲノムDNA試料を用いてゲノム配列を調べることにより行なわれる、請求項1又は2記載の方法。
- 前記有害な変異は、ColGalT1タンパク質の発現量、安定性、又は酵素活性を低下させる変異である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記有害な変異は、ミスセンス変異、ナンセンス変異、フレームシフト変異、スプライシング異常を生じる変異、並びにCOLGALT1遺伝子領域の全体又は一部を欠失する変異から選択される変異である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 被検者の少なくとも一方のアレルに、新生児期〜小児期発症の脳小血管病の指標となる下記のCOLGALT1遺伝子変異のいずれかが存在するか否かを調べることを含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
(1) COLGALT1遺伝子コード領域の第452位のT(配列番号3中の第285位)がGになる変異
(2) COLGALT1遺伝子コード領域の第460位のG(配列番号3中の第293位)がCになる変異
(3) COLGALT1遺伝子コード領域の第1096位のG(配列番号7中の第437位)が欠失する変異
(4) COLGALT1遺伝子コード領域の第1129位のG(配列番号7中の第470位)がCになる変異 - ColGalT1タンパク質、又は該タンパク質を生体内で発現可能な組換えベクターを有効成分とする、新生児期〜小児期発症の脳小血管病の治療剤又は症状緩和剤。
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医学のあゆみ, vol. 235, no. 6, JPN6022022892, 2010, pages 745 - 748, ISSN: 0004790268 * |
神経治療, vol. 34, no. 1, JPN6022022893, 2017, pages 9 - 12, ISSN: 0004790267 * |
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Publication number | Publication date |
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JP7301326B2 (ja) | 2023-07-03 |
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