JP2020055849A - Tau結合抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明はとりわけ、Tau結合抗体及びこれらの結合フラグメント、このような抗体を作製する方法ならびにアルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症/パーキンソン症−認知症合併症、好銀性粒子病(argyrophilic grain disease)、慢性外傷性脳症、皮質基底核変性、石灰沈着を伴うびまん性神経原線維変化病、ダウン症候群、家族性英国型認知症、家族性デンマーク型認知症、MAPT変異起因性17番染色体連関型前頭側頭型認知症及びパーキンソン症、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病、グアドループ島型パーキンソン症、筋緊張性ジストロフィー、脳内鉄蓄積を伴う神経変性、ニーマン・ピック病C型、神経原線維変化病併発性非グアマニアン型運動ニューロン疾患、ピック病、脳炎後パーキンソン症、プリオンタンパク質性脳アミロイド血管症、進行性皮質下神経膠症、進行性核上性麻痺、SLC9A6関連精神遅滞、亜急性硬化性全脳炎、変化のみの認知症(Tangle−only dementia)、球状神経膠封入体を伴う白質タウオパチー(Clavaguera et al. Brain Pathology 23 (2013) 342−349)のようなタウオパチーを処置及び/又は診断するためのそれらの使用に関する。本発明は、先に説明したタウオパチー、特にアルツハイマー病及び進行性核上性麻痺のようなタウオパチーに罹患している又はであるヒト対象を処置する方法にも関する。
アルツハイマー病(AD)及び進行性核上性(PSP)は、医学的な満たされていない高い需要、社会の健康系に対する高いコスト、及び影響を受ける家族に対する高い負荷を伴う神経変性疾患である。ADの臨床徴候には、記憶、認知、推論、判断及び情動安定性の喪失、ならびに究極的には死亡が含まれる。PSPは、歩行制御及び平衡の重篤な及び進行性の問題、転倒、垂直方向の眼球運動の障害、認知上の問題、うつ、無感情、ならびに軽度認知症を包含する。後期の症状には、霧視、制御されていない眼球運動、不明瞭言語、嚥下困難及び死亡が含まれる。
・3R0Nとも呼ばれるアイソフォーム4型、NCBI参照配列NP_058525.1(352アミノ酸)
・3R1Nとも呼ばれるアイソフォーム7型、NCBI参照配列NP_001190180.1(381アミノ酸)
・3R2Nとも呼ばれるアイソフォーム8型、NCBI参照配列NP_001190181.1(410アミノ酸)
これに対し、その他の3種のTauアイソフォームは4個のMTBRを含有する。
・4R2Nとも呼ばれるアイソフォーム2型、NCBI参照配列NP_005901.2(441アミノ酸)、
・4R0Nとも呼ばれるアイソフォーム3型、NCBI参照配列NP_058518.1(383アミノ酸)、及び
・4R1Nとも呼ばれるアイソフォーム5型、NCBI参照配列NP_001116539.1(412アミノ酸)。
とりわけ、アルツハイマー病(AD)又は進行性核上性麻痺(PSP)のようなタウオパチーを処置又は診断するための薬剤を提供することが、本発明の目的である。さらに、とりわけ、アルツハイマー病(AD)又は進行性核上性麻痺(PSP)のようなタウオパチーを処置又は診断するための方法を提供することが、本発明の目的である。
配列番号4もしくはそれと少なくとも90%同一である配列から選択されるCDR1、配列番号5もしくはそれと少なくとも90%同一である配列から選択されるCDR2、及び/又は配列番号6もしくはそれと少なくとも90%同一である配列から選択されるCDR3を含む重鎖可変部
を含む、分離されたTau結合抗体又はその結合フラグメントを提供する。
配列番号7もしくはそれと少なくとも80%同一である配列を含む軽鎖可変部、及び/又は
配列番号8もしくはそれと少なくとも80%同一である配列を含む重鎖可変部を含む、分離されたTau結合抗体又はその結合フラグメントを提供する。
配列番号9もしくはそれと少なくとも80%同一である配列を含む軽鎖可変部、及び/又は
配列番号10もしくはそれと少なくとも80%同一である配列を含む重鎖可変部を含む、分離されたTau結合抗体又はその結合フラグメントを提供する。
以下において例証として説明される本開示は、本明細書に具体的に開示されていないいかなる要素又は複数の要素、制限又は複数の制限の不在下でも適切に実施され得る。
・フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン(芳香族側鎖を有するアミノ酸)
・リジン、アルギニン及びヒスチジン(塩基性側鎖を有するアミノ酸)
・アスパラギン酸及びグルタミン酸(酸性側鎖を有するアミノ酸)
・アスパラギン及びグルタミン(アミド側鎖を有するアミノ酸)、ならびに
・システイン及びメチオニン(含硫側鎖を有するアミノ酸)。
配列番号1もしくはそれと少なくとも90%同一の配列から選択されるCDR1、配列番号2もしくはそれと少なくとも90%同一の配列から選択されるCDR2、及び配列番号3もしくはそれと少なくとも90%同一の配列から選択されるCDR3、ならびに/又は
配列番号4もしくはそれと少なくとも90%同一の配列から選択されるCDR1、配列番号5もしくはそれと少なくとも90%同一の配列から選択されるCDR2、もしくは配列番号6もしくはそれと少なくとも90%同一の配列から選択されるCDR3
を含む、分離されたTau結合抗体又はその結合フラグメントを準備する。
配列番号7もしくはそれと少なくとも80%同一の配列を含む軽鎖可変部、及び/又は
配列番号8もしくはそれと少なくとも80%同一の配列を含む重鎖可変部
を含む、分離されたTau結合抗体又はその結合フラグメントを提供する。
配列番号9もしくはそれと少なくとも80%同一の配列を含む軽鎖可変部、及び/又は
配列番号10もしくはそれと少なくとも80%同一の配列を含む重鎖可変部
を含む、分離されたTau結合抗体又はその結合フラグメントを提供する。
配列番号9もしくはそれと少なくとも80%同一の配列を含む軽鎖可変部、及び/又は
配列番号11、12,13もしくはそれらと少なくとも80%同一の配列を含む重鎖可変部
を含み得る。
配列番号14もしくはそれと少なくとも70%同一の配列を含む軽鎖、及び/又は
配列番号15もしくはそれと少なくとも70%同一の配列を含む重鎖
を含む、分離されたTau結合抗体又はその結合フラグメントを提供する。
配列番号14もしくはそれと少なくとも70%同一の配列を含む軽鎖、及び/又は
配列番号16、17、18もしくはそれらと少なくとも70%同一の配列を含む重鎖
を含み得る。
配列番号14もしくはそれと少なくとも70%同一の配列を含む軽鎖、及び/又は
配列番号54もしくは配列番号55又はそれと少なくとも70%同一の配列を含む重鎖
を含む、分離されたTau結合抗体又はその結合フラグメントを提供する。
1つの例において、本発明の抗体によって結合されたヒトTauのエピトープは、配列番号35のアミノ酸残基S235、S237、S238、A239、K240、S241、R242、L243、Q244、T245、A246、V248、及びM250を含む。
配列番号7のVL及び配列番号8のVHを含むTau結合抗体又はその結合フラグメントは、前述のエピトープへ結合するTau結合抗体又はその結合フラグメントの代表である。
配列番号7のVL及び配列番号8のVHを含むTau結合抗体又はその結合フラグメントは、前記エピトープへ結合する中和Tau結合抗体又はその結合フラグメントの代表である。
配列番号1もしくはそれと少なくとも90%同一である配列から選択されるCDR1、配列番号2もしくはそれと少なくとも90%同一である配列から選択されるCDR2、及び配列番号3もしくはそれと少なくとも90%同一である配列から選択されるCDR3を含む軽鎖可変部、ならびに/又は
配列番号4もしくはそれと少なくとも90%同一である配列から選択されるCDR1、配列番号5もしくはそれと少なくとも90%同一である配列から選択されるCDR2、及び配列番号6もしくはそれと少なくとも90%同一である配列から選択されるCDR3を含む重鎖可変部
を含む、分離されたTau結合抗体又はその結合フラグメント。
配列番号4から選択されるCDR1、配列番号5から選択されるCDR2、及び/又は配列番号6から選択されるCDR3を含む重鎖可変部
を含む、実施形態1に記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
9.アミノ酸残基S238、A239、S241、T245、A246ならびに配列番号35のS235、S237、K240、R242、L243、Q244、V248、及びM250から選択される1つ以上の残基を含むエピトープへ結合する、実施形態1、2、3、4、5、6、7、又は8のいずれかに記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
11.ヒトTauの対形成したらせん状フィラメント(PHF)へ結合する、実施形態1、2、3、4、5、6、6、7、8、又は9のいずれかに記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
13.配列番号7又はそれと少なくとも80%同一である配列を含む軽鎖可変部、及び/又は
配列番号8又はそれと少なくとも80%同一である配列を含む重鎖可変部
を含む、分離されたTau結合抗体又はその結合フラグメント。
14.配列番号7を含む軽鎖可変部、及び
配列番号8を含む重鎖可変部
を含む、実施形態13に記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
15.配列番号8のX1は、Aである、実施形態13、又は13に記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
16.配列番号8のX1は、Tである、実施形態13、又は13に記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
17.モノクローナル抗体である、実施形態13、14、15、又は16のいずれかに記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
18.キメラ抗体である、実施形態17に記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
19.配列番号35のA246、A239、S241、T245、S238のアミノ酸残基を含むエピトープへ結合する、実施形態13、14、15、16、17、又は18のいずれかに記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
20.アミノ酸残基S238、A239、S241、T245、A246ならびに配列番号35のS235、S237、K240、R242、L243、Q244、V248、及びM250から選択される1つ以上の残基を含むエピトープへ結合する、実施形態13、14、15、16、17、18、又は19のいずれかに記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
21.可溶性ヒトTauへ結合する、実施態様13、14、15、16、17、18、19、又は20のいずれかに記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
22.ヒトTauのらせん状フィラメント(PHF)へ結合する、実施形態13、14、15、16、17、18、19、又は20のいずれかに記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
23.可溶性ヒト及びヒトTauのらせん状フィラメント(PHF)へ結合する、実施形態13、14、15、16、17、18、19、又は20のいずれかに記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
24.配列番号9もしくはそれと少なくとも80%同一である配列を含む軽鎖可変部、及び/又は
配列番号10もしくはそれと少なくとも80%同一である配列を含む重鎖可変部
を含む、分離されたTau結合抗体又はその結合フラグメント。
25.配列番号9を含む軽鎖可変部、及び
配列番号10を含む重鎖可変部
を含む、実施形態24に記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
26.配列番号10のX3は、Aである、実施形態24、又は25に記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
27.配列番号10のX3は、Tである、実施形態24、又は25に記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
28.重鎖可変部が、配列番号11又は12を含む、実施形態24に記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
29.モノクローナル抗体である、実施形態24、25、26、27、又は28のいずれかに記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
30.ヒト化抗体である、実施形態29に記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
31.IgG1又はIgG4サブタイプである、実施形態30に記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
32.配列番号35のA246、A239、S241、T245、S238のアミノ酸残基を含むエピトープへ結合する、実施形態24、25、26、27、28、29、30、又は31のいずれかに記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
33.アミノ酸残基S238、A239、S241、T245、A246ならびに配列番号35のS235、S237、K240、R242、L243、Q244、V248、及びM250から選択される1つ以上の残基を含むエピトープへ結合する、実施形態24、25、26、27、28、29、30、31、又は32のいずれかに記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
34.可溶性ヒトTauへ結合する、実施形態24、25、26、27、28、29、30、31、又は32のいずれかに記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
35.ヒトTauの対形成したらせん状フィラメント(PHF)へ結合する、実施形態24、25、26、27、28、29、30、31、又は32のいずれかに記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
36.ヒトTauの可溶性ヒト及び対形成したらせん状フィラメント(PHF)の両方へ結合する、実施形態24、25、26、27、28、29、30、31、又は32のいずれかに記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
37.配列番号14もしくはそれと少なくとも70%同一である配列を含む軽鎖可変部、及び/又は
配列番号15もしくはそれと少なくとも70%同一である配列を含む重鎖可変部
を含む、分離されたTau結合抗体又はその結合フラグメント。
38.配列番号14を含む軽鎖可変部、及び
配列番号15を含む重鎖可変部
を含む、実施形態47に記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
39.配列番号15のX3は、Aである、実施形37、又は38に記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
40.配列番号15のX3は、Tである、実施形態37、又は38に記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
41.重鎖可変部が、配列番号17又は18を含む、実施形態37に記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
42.モノクローナルヒト化抗体である、実施形態37、38、39、40、又は41のいずれかに記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
43.IgG1又はIgG4サブタイプである、実施形態42に記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
44.配列番号35のA246、A239、S241、T245、S238のアミノ酸残基を含むエピトープへ結合する、実施形態37、38、39、40、41、42、又は43のいずれかに記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
45.アミノ酸残基S238、A239、S241、T245、A246ならびに配列番号35のS235、S237、K240、R242、L243、Q244、V248、及びM250から選択される1つ以上の残基を含むエピトープへ結合する、実施形態37、38、39、40、41、42、43、又は44のいずれかに記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
46.可溶性ヒトTauへ結合する、実施形態37、38、39、40、41、42、43、44、又は45のいずれかに記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
47.ヒトTauの対形成したらせん状フィラメント(PHF)へ結合する、実施形態37、38、39、40、41、42、43、44、又は45のいずれかに記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
48.ヒトTauの可溶性ヒト及び対形成したらせん状フィラメント(PHF)の両方へ結合する、実施形態37、38、39、40、41、42、43、44、又は45のいずれかに記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
49.配列番号35のA246、A239、S241、T245、S238のアミノ酸残基を含むエピトープへ結合する、分離されたTau結合抗体又はその結合フラグメント。
50.アミノ酸残基S238、A239、S241、T245、A246ならびに配列番号35のS235、S237、K240、R242、L243、Q244、V248、及びM250から選択される1つ以上の残基を含むエピトープへ結合する、実施形態49に記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
51.モノクローナル抗体である、実施形態50に記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
52.キメラ、ヒト化又は完全にヒトの抗体である、実施形態50又は51に記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
53.当該IgG1又はIgG4サブタイプのモノクローナル抗体ヒト化抗体又はその結合フラグメントである、実施形態52に記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
54.可溶性ヒトTauへ結合する、実施形態50、51、52、又は53のいずれかに記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
55.ヒトTauの対形成したらせん状フィラメント(PHF)へ結合する、実施形態50、51、52、又は53のいずれかに記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
56.ヒトTauの可溶性ヒトTau及び対形成したらせん状フィラメント(PHF)の両方へ結合する、実施形態50、51、52、又は53のいずれかに記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
57.Tauへの結合に対して、実施形態1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、又は56のいずれかに記載のTau結合抗体又はその結合フラグメントと競合する、分離されたTau結合抗体又はその結合フラグメント。
58.Tauへの結合に対して、
配列番号9を含む軽鎖可変部、及び
配列番号12又は13を含む重鎖可変部
を含むTau結合抗体又はその結合フラグメントと競合する、実施形態57に記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
59.実施形態1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、又は56のいずれかに記載のTau結合抗体又はその結合フラグメントと実質的に同じTauエピトープへ結合する、分離されたTau結合抗体又はその結合フラグメント。
60.配列番号9を含む軽鎖可変部、及び
配列番号12又は13を含む重鎖可変部
を含むTau結合抗体又は結合フラグメントと実質的に同じTauエピトープへ結合する、実施形態59に記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
61.モノクローナル抗体である、実施形態57、58、59、又は60のいずれかに記載の分離されたTau結合抗体又はその結合フラグメント。
62.キメラ、ヒト化又は完全にヒトの抗体である、実施形態61に記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
63.IgG1又はIgG4サブタイプのヒト化抗体である、実施形態62に記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
64.配列番号35のA246、A239、S241、T245、S238のアミノ酸残基を含むエピトープへ結合する、実施形態57、58、59、60、61、62、又は63のいずれかに記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
65.アミノ酸残基S238、A239、S241、T245、A246ならびに配列番号35のS235、S237、K240、R242、L243、Q244、V248、及びM250から選択される1つ以上の残基を含むエピトープへ結合する、実施形態57、58、59、60、61、62、63又は64のいずれかに記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
66.可溶性ヒトTauへ結合する、実施形態57、58、59、60、61、62、63、64又は65のいずれかに記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
67.ヒトTauの対形成したらせん状フィラメント(PHF)へ結合する、実施形態57、58、59、60、61、62、63、64又は65のいずれかに記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
68.ヒトTauの可溶性ヒト及び対形成したらせん状フィラメント(PHF)の両方へ結合する、実施形態57、58、59、60、61、62、63、64又は65のいずれかに記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
69.Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd及びFv、scFv、Fab−Fv、Fab−scFv、Fab−dsFv、Fab−scFc、scFv−scFc、dsscFv、dsscFv−scFc、ダイアボディ、トライアボディ(triabody)、テトラボディ、線形抗体、又はVHH含有抗体である、実施形態1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、又は68のいずれかに記載の分離されたTau結合抗体又はその結合フラグメント。
70.実施形態1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、又は69のいずれかに記載のTau結合抗体又はその結合フラグメントの軽鎖及び/又は重鎖をコードする、分離された核酸分子。
71.実施形態70に記載の1つ以上の核酸配列を含む、クローニングベクター又は発現ベクター。
72.実施形態70に記載の1つ以上の核酸配列又は実施形態71に記載の1つ以上のクローニングベクターもしくは発現ベクターを含む、宿主細胞。
73.ヒト胚性幹細胞ではない、実施形態72に記載の宿主細胞。
74.少なくとも
a)実施形態72又は73に記載の宿主細胞を培養するステップ、及び
b)当該Tau結合抗体又はその結合フラグメントを分離するステップ
を含む、実施形態1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、又は69のいずれかに記載のTau結合抗体又はその結合フラグメントを生成する方法。
75.治療活性のある薬剤としての使用のための、実施形態1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、又は68のいずれかに記載の分離されたTau結合抗体又はその結合フラグメント。
76.タウオパチーを処置する上での使用のための、実施形態1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、又は68のいずれかに記載の分離されたTau結合抗体又はその結合フラグメント。
77.当該タウオパチーは、アルツハイマー病である、実施形態76に記載の使用のための、分離されたTau結合抗体又はその結合フラグメント。
78.当該タウオパチーは、進行性核上性麻痺である、実施形態76に記載の使用のための、分離されたTau結合抗体又はその結合フラグメント。
79.処置する必要のある対象へ、実施形態1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、又は68のいずれかに記載のTau結合抗体又はその結合フラグメントを投与するステップを含む、タウオパチーを処置する方法。
80.当該タウオパチーは、アルツハイマー病である、実施形態79に記載の方法。
81.当該タウオパチーは、進行性核上性麻痺である、実施形態79に記載の方法。
82.診断薬としての使用のための、実施形態1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、又は68のいずれかに記載の分離されたTau結合抗体又はその結合フラグメント。
83.タウオパチーを診断する上での使用のための、実施形態1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、又は68のいずれかに記載の分離されたTau結合抗体又はその結合フラグメント。
84.当該タウオパチーは、アルツハイマー病である、実施形態83に記載の使用のための、分離されたTau結合抗体又はその結合フラグメント。
85.当該タウオパチーは、進行性核上性麻痺である、実施形態83に記載の使用のための、分離されたTau結合抗体又はその結合フラグメント。
さて、本発明は、制限するものとして解釈されることのない一部の実施例に関して説明される。
実験1−Tau結合抗体の作製
1.1 組換えTau発現
ヒトTauタンパク質は、2つの宿主系、大腸菌(E. coli)BL21 (DE3)及びHEK293細胞(ヒト胚性腎臓細胞株)で発現された。Tauの4つの異なるアイソフォームが、大腸菌(E. coli)、アイソフォーム2、3、4&5型及びHEK293細胞中の1つのアイソフォーム、アイソフォーム2型で産生された。産生された全ての発現ベクター及びタンパク質の完全な配列は、図5〜14に含まれる。
大腸菌(E. coli)におけるTau産生
異なるTauアイソフォームをコードする遺伝子を、合成的に作製し、コドンは大腸菌(E. coli)における発現のために最適化した。標準的な分子生物学技術を用いて、N末端6His−TEV tagを有するTauを精製するように操作された改変pET32ベクター中にサブクローニングした。
大腸菌(E. coli)BL21(DE3)細胞を、上記ベクターで形質転換し、タンパク質を、標準的な技術を用いて発現させた。
大腸菌(E. coli)を次に、遠心分離によって回収し、溶解し、Tauタンパク質を、NiNTA(Qiagen)を使用するアフィニティークロマトグラフィーにより可溶性画分から捕獲した。6His tagを、TEVプロテアーゼを使用して除去し、続いて第2のNiNTAクロマトグラフィー工程を行った。精製されたTauは、適用に応じて適切な緩衝液に緩衝液交換した。免疫化のために生成した試料は、Proteus NoEndo(商標)カラム(Vivaproducts)を使用してエンドトキシン除去した。
タンパク質発現を、タンパク質への15N、13C及び2Hの取り込みのために最小培地を使用したことを除いて、上記のように行った。大腸菌(E. coli)ペレットを溶解し、NiNTA(Qiagen)アフィニティークロマトグラフィー工程を使用してTauタンパク質を精製し、6His tagをTEVプロテアーゼで除去し、次にTauタンパク質を、Superdex 200ユニット(GE−Healthcare)を使用するゲルろ過により精製した。
HEK293におけるTauの生成
Tauアイソフォーム2型をコードする遺伝子を、野生型DNA配列を使用して合成的に作製した。標準的な分子生物学技術を用いて、N末端10His−TEV tag(配列番号51)とのTauを生成するように操作された発現ベクターpMV−10HisTEV(CMVプロモーターを含む)にサブクローニングした。
得られたベクターを、製造者のプロトコルに従ってExpi293(商標)Expression System (Invitrogen)を使用して形質転換した。このシステムは、HEK203細胞株に由来するExpi293Fヒト細胞を使用する。
Tauタンパク質は、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーNi Sepharose Excel (GE Healthcare)を使用して回収された培養培地中に蓄積した。次に10His tagを、Ni Sepharoseに再適用し、フロースルーで切断されたTauを回収する前に、TEVプロテアーゼを使用して除去した。精製されたTauを、適用に応じて適切な緩衝液に交換した。
450μMでTauタンパク質を、滅菌ろ過し、サーモミキサー(Eppendorf)を使用して1.5mlEppendorfチューブ中で、750rpm、37℃で310時間振盪した。原繊維形成を、Thioflavin−T色素を使用してモニターし、Fluostar Omega分光光度計(BMG Labtech)で吸光度を読み取った。対形成したらせん状フィラメント(PHF)形成を、陰性染色電子顕微鏡によって確認した。
10匹の雌Sprague Dawleyラット(260〜280g)を、注射器で激しく混合することにより等量の完全フロイントアジュバント(CFA)に乳化した50μgの組み換えTauタンパク質で皮下的に免疫化した。ラットを、不完全フロイントアジュバント(IFA)を用いて、14日間隔でブースター注射を行い、尾尻からも採血した。−80℃のウシ胎児血清(FCS)中の10%ジメチルスルホキシド(DMSO)で調製及び凍結された脾臓及び骨髄の単細胞懸濁液を用いて最終ブーストの14日後に終了した。組換えヒトTauタンパク質を、免疫前にインビトロで精製および凝集した大腸菌(E. coli)で発現させた。可溶性Tauおよび不溶性原繊維を含むTauの4つのアイソフォーム(2、3、4&5型)の等モル混合物の最終サンプルを免疫化に使用した。
B細胞培養物を、Zublerら(1985年)によって説明された方法と類似の方法を用いて調製した。簡潔には、免疫化したラットからのPBMC由来B細胞を、10%FCS(PAA laboratories ltd)、2%HEPES(Sigma Aldrich)、1% L−グルタミン(Gibco BRL)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン溶液(Gibco BRL)、0.1%β−メルカプトエタノール(Gibco BRL)、3%活性化型脾細胞培養上清及びガンマ照射済み変異EL4ネズミ胸腺腫細胞(5×104/ウェル)を補充した200μl/ウェルのRPMI1640培地(Gibco BRL)を用いたバーコード入り96穴組織培養プレート中に1ウェルあたりおよそ3000細胞の密度で、37℃、5%CO2の雰囲気下で7日間培養した。総じて、およそ1.2×108個のB細胞を採取した。
B細胞培養上清中のTau結合抗体の存在を、セクション1.1で説明したようにして得られたビオチン化可溶性又は不溶性Tauを用いてコーティングしたSuperavidin(商標)ビーズ(Bangs Laboratories)を用いる均質蛍光系結合アッセイを用いて判定した。発生したTauは、可溶性画分及び不溶性画分の両方を有していた。不溶性Tauを、10分間、14,500RPMで、ベンチトップEppendorfミニスピンプラス遠心分離を使用して遠心分離で混合物から除去した。各画分を、製造元の指示に従って、EZ−リンクスルホ−NHS−LC−ビオチン化キットを使用して、別々にビオチン化した。可溶性ビオチン化画分を、製造元の指示に従って、Zebaスピン脱塩カラムを使用して遊離ビオチンから除去した。不溶性画分を、Eppendorfミニスピンプラス遠心分離機で14,500RPMで、10分間、混合物を遠心分離し、それを1.5mlリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中に再懸濁し、5回このプロセスを繰りかえすことによって、遊離ビオチンから除去した。このアッセイは、可溶性Tau形態又は不溶性Tau形態のいずれかへ結合することを示す上清についてスクリーニングすることができた。10μlの上清を、Matrix Platemate液体取り扱い装置を用いて、バーコード入り96穴組織培養プレートから、ビーズ(10μl/ウェル)上に免疫化した可溶性又は不溶性Tauを含むバーコード入りの384穴黒色壁アッセイプレート中へと転移させた。ヤギ抗ラットIgG Fcγ特異的Cy−5共役体(Jackson)を用いて、結合を評価した。プレートをApplied Biosystems 8200細胞検出システム上で読み取った。
一次スクリーニング後、陽性上清を96穴バーコード入りマスタープレートに、Aviso Onyxヒットピッキングロボットを用いてまとめ、細胞培養プレート中のB細胞を−800℃で凍結させた。次に、マスタープレートを可溶性Tau画分に関して、ELISAアッセイにおいてスクリーニングした。このことは、より厳格なスクリーニングにおいて、抗体がTauに結合する能力を決定し、それらが一次スクリーニングにおいてビーズを結合していないことを確認するために行われた。ELISAアッセイは、炭酸塩コーティング緩衝液(dH2O+0.16%Na2CO3+0.3%NaHCO3)中、3μg/mlで可溶性Tauのコーティングを384穴Maxisorpプレート(ThermoScientific/Nunc)上への可溶性Tauのコーティングを含む。プレートを、PBS中1%w/vカゼイン+1%w/vBSAでブロックし、次に、B細胞培養上清と一緒にインキュベートした。二次HRP共役したヤギ抗ウサギIgG Fc抗体(Stratech Scientific Ltd/Jackson ImmunoResearch)をプレートへ添加した後、TMB基質(3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン、EMD Millipore製、10μl/ウェル)を用いた結合の可視化を行った。光学密度を、BioTek Synergy 2マイクロプレートリーダーを用いて630nMで測定した。Tauに対する特異性を実証するB細胞上清を、可変領域回復のために選択した。
目的のウェルの選択からの抗体可変部遺伝子の回復を可能にするために、逆重畳積分のステップは、B細胞の異種性集団を含有する付与されたウェルにおける抗原特異的B細胞の同定を可能にするために実施しなければならなかった。このことは、蛍光焦点法(Clargoら,2014年)を用いて達成された。簡潔には、陽性ウェルからの免疫グロブリン分泌B細胞を、ビオチン化可溶性Tau及び1:1200の最終希釈のヤギ抗ラットFcγフラグメント特異的FITC共役体(Jackson)でコーティングしたストレプトアビジンビーズ(New England Biolabs)と混合した。37℃で1時間の静的インキュベーション後、抗原特異的B細胞を、当該B細胞を取り囲む蛍光ハローの存在により識別することができた。次に、Olympus顕微鏡を用いて識別したこれらの個々のB細胞を、Eppendorf微小操作装置を用いて拾い、PCRチューブへと入れた。
2.1 PHF調製
対形成したらせん状フィラメント(PHF)−Tauタンパク質を、アルツハイマー病又は進行性核上性麻痺(PSP)又は前頭側頭型認知症に罹患しているドナー由来の脳試料から、Ksiezak−Reding及びWall(Neurobiology of Aging 15,11−19,1994)によって公開されたプロトコルにより精製した。PHF−Tauが豊富であることがすでに説明されてきた画分8(この参照におけるスクロース勾配遠心分離前の粗PHF−Tauに相当する)及び画分11(画分A2に相当する、この参照において説明されるSDS可溶性PHF)を回収し、BIAcoreアッセイ及び実験3の細胞アッセイに使用した。
ELISAアッセイはまた、可溶性Tauの、炭酸塩コーティング緩衝液(dH2O+0.16%Na2CO3+0.3%NaHCO3)中の3μg/mlで384穴Maxisorpプレート(ThermoScientific/Nunc)上への捕捉を包含した。プレートをPBS中1% w/vカゼイン+1% BSAでブロッキングし、次に、10μl/ウェル精製抗体を用いてインキュベートした。二次HRP共役型ヤギ抗マウスIgG Fc抗体(Stratech Scientific Ltd/Jackson ImmunoResearch)をプレートへ添加した後、HRP基質TMB基質(3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン、EMD Millipore製、10μl/ウェル)を用いて結合を可視化した。光学密度を、BioTek Synergy 2マイクロプレートリーダーを用いて、630nMで測定した。
選択されたモノクローナルFabフラグメント(mFab)を、製造元のプロトコルに従って、Pierce Ficin開裂キット(カタログ番号44980,Thermo Scientific)を用いて、キメラmIgGI抗体から調製した。
3.1 細胞アッセイ
Tau凝集を誘導するための、Tauトランスジェニックマウスからの粗可溶性画分及び粗不溶性画分の調製
これらの実験について、ヒトTauP301S(Allenら,2002 J.Neurosci.22(21):9340−51)及びP301L(Lewisら,2000 Nat Genet.(4):402−5、Gotz Jら,2001 J Biol Chem.276(1):529−34)を発現するトランスジェニックマウスを使用した。
HEK−293−F細胞(Life Technologies)に、P301S変異を有するヒトTauアイソフォーム2型を発現するpcDNA3.1(+)ベクターを、293フェクチン(Life Technologies)を用いて製造元の説明書によりトランスフェクトした。一定分量のトランスフェクトした細胞を液体窒素中で保存した。
図3は、Tau治療用抗体の活性を特徴づけるために使用される細胞凝集アッセイの異なるステップを示す。1日目に、P301S変異を有するヒトTauアイソフォーム2型を発現するHEK−293−F細胞(P301S−tau)を37℃で解凍し、10%ウシ胎仔血清及び1%ペニシリン−ストレプトマイシン(FFBS)を含有する293発現培地(Life Technologies)中に希釈した。細胞を自動細胞計数機(Vi−CELL XR,Beckman Coulter)を用いて計数した後、ウェルあたり25,000個の生細胞密度で、ポリ−D−リジンでプレコーティングしておいた96穴プレート(Greiner Bio−One)の中に播種した。細胞を37℃、5%CO2で維持した。同日、アルツハイマー病患者(AD−PHF、画分8)又は進行性核上性麻痺患者(PSP−PHF、画分8)又は前頭側頭型認知症(FTD−PHF)又はP301SもしくはP301Lのトランスジェニックマウス脳に由来する脳画分(Tau凝集を誘導するためのシードとして使用)からの超音波処理されたヒト不溶性Tauを、4℃のFFBS培地中で抗Tau抗体ととともに又はそれなしで、緩徐に撹拌しながら一晩インキュベートした。AD−PHF(画分8)をAD試料及びPSP試料についてそれぞれ80ng/μl及び60ng/μlで使用し、トランスジェニックマウスP301S及びP301L由来の可溶性能画分をそれぞれ0.1μg/μl、1.2μg/μlで使用した。2日目に、シード又はシード/抗体混合物を細胞へ24時間適用した。3日目に、培地を、抗体を含有する新鮮FFBS培地と交換し、細胞を培養物中でさらに24時間維持した。4日目に、Tau凝集を、均質時間分解性蛍光エネルギー転移(HTRF)を基にしたTau凝集アッセイキット(Cisbio)を用いて、製造元の説明書により測定した。SpectraMax Padadigm(Molecular Devices)を用いて蛍光を測定した。凝集を、抗体の非存在下で外来性の原線維又は画分によって誘導される最大凝集応答に相当する、対照(−)に対する%凝集として報告した。誘導したTau凝集に及ぼすAB1及び従来技術の他のTau結合抗体の効果を検査した。従来技術の抗体は、WO2014/028777A2のIPN002、WO2013/096380A2のPT3、WO2010/142423A2のmAb2.10.3、及びWO 2014/008404のHJ8.5とした。
配列番号7のラットVL及び配列番号8のラットVHを有するAB1ならびに従来技術の抗体IPN002、PT3及びMab2.10.3をアッセイして、病理学的Tau構造を含有することがAT8免疫染色を用いて既に示されてきたアルツハイマー疾患に罹患しているドナー由来のヒト海馬の凍結切片を用いて至適濃度を判定した(Braak及びBraak,1995年,Neurobiol Aging; 16(3):271−8において説明されるように)。AB1抗体及び全部の従来技術の抗体は、101.4(陰性対照抗体)を除き、特異的なかつ濃度依存的な免疫反応性を呈した。これらのデータから、抗体の単一の至適濃度を選択し、6個のヒト脳試料のパネルをスクリーニングするために使用した。3個の試料は、アルツハイマー病に罹患しているドナー又は高レベルのTau病理(AT8免疫染色を用いて検出された陽性Tau病理)を呈する非常に高齢のドナーから得、3個はTau病理に罹患していない(AT8免疫染色を用いて検出された陰性Tau病理)ドナーから得た。
実験2及び3の結果を、以下の表2及び3に要約する。
化学発光読み出しを用いて実施したウエスタンブロット:AD、PSP又は対照ヒトから調製したホモジネートを10%ポリアクリルアミドゲルへと充填した(レーン当たり20μgタンパク質)。タンパク質をSDS−PAGE(ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法)によって分離し、PVDF(ポリビニリデンフルオリド)膜上へと電気泳動で転写した。膜を4%BSA(ウシ血清アルブミン(TBST溶液:50mM Tris、150mM NaCl、0.05%Tween20、HClを用いてpHをpH7.6に調整)中でブロッキングした。膜を4℃で一晩、一次抗体又は非免疫IgG対照抗体とともにインキュベートし、TBSTですすぎ、二次抗体とともに1時間インキュベートし(マウス抗ビオチン)、TBSTですすぎ、三次抗体とともに1時間インキュベートし(抗マウスIgG−ペルオキシダーゼ)、TBSTですすぎ、ECL(増強化学発光法)、すなわち2〜5分間のフィルム露光を用いて発光させた。
配列番号7のVL及び配列番号8のVHを有する抗体AB1のエピトープ結合を、抗体のFabフラグメントを使用する異核単一量子コヒーレンス核磁気共鳴(HSQC NMR)を使用して、決定した。
NMR試料は、Shigemiチューブ中の270μMの2H/13C/15N標識ヒトTauアイソフォーム4型のタンパク質濃度の容量で典型的には350μlであった。5mm緩衝液条件は、100mM NaCl、25mMリン酸ナトリウムpH6.4、10μM AEBSF、0.02%NaN3であった。全ての実験は、低温冷却プローブを取り付けた600MHz Bruker DRX又は800MHz Bruker Avance分光器のいずれかで20℃を記録した。タンパク質、HN(i)−N(i)−N(i±1)中の残基の骨格NMRシグナル間の逐次的接続を、1640、1640及び7000Hzのスペクトル幅及び120 (F1)、120(F2)及び150(F3)msの時間間隔で記録され、ならびにインクレメント毎に8スキャン及び1.5秒の緩和遅延を伴う、それぞれ15N、15N及び1H次元において、3D (H)N(CA)NNH実験(Weisemanら、1993年 3D Triple―resonance NMR techniques for the sequential assignment of NH and 15N resonances in 15N― and 13C―labelled proteins.(15N及び13C標識タンパク質におけるNH及び15N共鳴の逐次割り当てのための3D三重共鳴NMR技術) J. Biomol. NMR 3. doi:10.1007/BF00242479)を使用して行った。不均一試料を、3.5日の合計取得時間を与える13%のサンプリング密度(40000個の多元点のうち5200個)で行った。連続した接続が確認され、残基のタイプを、HNCA(Grzesiek及びBax、1992年 Improved 3D triple−resonance NMR techniques applied to a 31 kDa protein.(31kDaタンパク質に適用される改良された3D三重共鳴NMR技術) J. Magn. Reson. 96, 432−440. doi:10.1016/0022−2364(92)90099―S)及びHNCACB(Wittekind及びMueller, 1993年 HNCACB, a High−Sensitivity 3D NMR Experiment to Correlate Amide−Proton and Nitrogen Resonances with the Alpha− and Beta−Carbon Resonances in Proteins.(HNCACB、タンパク質におけるα−及びβ−炭素共鳴との相関アミド−たんぱく質及び窒素共鳴に対する高感度3D NMR実験) J. Magn. Reson. Ser. B 101, 201-205. doi:10.1006/jmrb.1993.1033)実験を使用して同定した。HNCA実験は、それぞれ15N、13C及び1H次元で、1640、4830及び6600Hzのスペクトル幅及び24(F1)、6.6(F2)及び80(F3)msの取得時間で記録したが(増加あたり8スキャン、1.5秒緩和遅延、19時間総取得時間)、HNCACBは、それぞれ15N、13C及び1H次元で、9800、1640及び6600Hzのスペクトル幅及び6(F1)、24(F2)及び80(F3)msの取得時間で記録した(増加あたり8スキャン、1.5秒緩和遅延、1.5日総取得時間)。NMRスペクトルを、Harvard反復ソフト閾値処理法を使用して実施されたNUSデータの再構成を伴うNMRPipe(Delaglioら、1995年 NMRPipe: a multidimensional spectral processing system based on UNIX(登録商標) pipes. J. Biomol. NMR 6, 277−93)を使用して処理した(Hybertsら、2012年)。データ分析を、Sparky(Goddard及びKneller, , D. G. SPARKY 3. In., University of California, San Francisco)を使用して実施し、残基の96%に相当する304残基のアミドプロトン及び窒素源(プロリン残基及びN末端グリシンを除く)の割り当てを得た。
AB1の結合部位のマッピングを、80〜150μMの濃度範囲で、対応するAB1 Fabの10%モル過剰を含む2H/13C/15N標識ヒトTauアイソフォーム4型の試料を使用して行った。試料を、Tauの骨格割り当てについて上記と同じ緩衝液中で調製した。1H、15N及び13Cの化学シフトの変化を、Tau/Fab複合体試料並びに遊離Tauの試料(上記)に記録されたHNCO(Grzesiek及びBax, 1992年 Improved 3D triple―resonance NMR techniques applied to a 31 kDa protein. J. Magn. Reson. 96, 432−440. doi:10.1016/0022−2364(92)90099−S)スペクトルから決定した。HNCO実験を、それぞれ15N、13C及び1H次元において、2190、2210及び8800Hzのスペクトル幅及び25(F1)、29(F2)及び80(F3)msの取得時間を用いて記録し(増加あたり8スキャン、1.8秒緩和遅延)、NUSは、25〜35%の思料密度を使用しており、総取得時間を60時間から15〜21時間に短縮した。化学シフト変化を、最小シフトアプローチを用いて分析し(Williamsonら、1997年 Mapping the binding site for matrix metalloproteinase on the N―terminal domain of the tissue inhibitor of metalloproteinases―2 by NMR chemical shift perturbation.(NMR化学シフト摂動によるメタロプロテイナーゼ−2の組織阻害剤のN末端ドメイン上でのマトリックスメタロプロテイナーゼの結合部位のマッピング) Biochemistry 36, 13882−9. doi:10.1021/bi9712091)、カルボニル化学シフトを含むあわせた化学シフト変化(Δδ)を計算するために使用される方程式の変更を除いて、本質的には、以前に記載されたとおりであり(Veverkら、2008年 Structural characterization of the interaction of mTOR with phosphatidic acid and a novel class of inhibitor: compelling evidence for a central role of the FRB domain in small molecule―mediated regulation of mTOR.(ホスファチジン酸とのmTORの相互作用の構造的禿頭付け及び阻害剤の新規クラス:mTORの小分子媒介調節におけるFRBの中心的役割についての説得力のある証拠) Oncogene 27, 585-95. doi:10.1038/sj.onc.1210693)、以下ので得られる:
式中、ΔδHN、ΔδN及びΔδCは、それぞれ1H、15N及び13C化学シフトの差である。αN及びαCは、アミドプロトン、窒素およびカルボニル化学シフトの化学シフト範囲で差を説明するために使用される、それぞれ0.2及び0.35のスケーリング因子に相当する。
配列番号7のVL及び配列番号8のVHを有する抗体AB1を、ラット抗体V部由来のCDRをヒト生殖系列抗体V部フレームワークへと移植することによってヒト化した。
融解温度(Tm)又はアンフォールディングの中間点での温度を、Thermofluorアッセイを使用して測定した。この方法において、蛍光色素SYPROオレンジを用いて、温度上昇するにつれて曝露される疎水性領域に結合することによって、タンパク質アンフォールディングプロセスをモニターした。
配列番号14の軽鎖及び配列番号18の重鎖を有するTau結合抗体(L14H18)ならびに配列番号35(ペプチド)で定義されるTauの残基234〜250、配列番号で定義されるN−アセチル−KSPSSAKSRLQTAPVPM−アミドからなるペプチドの間の相互作用を、X線結晶額によって研究した。
結晶化
L14H18 Fab/tauペプチド234−250複合体は、MRCプレートで、1〜2週間の間、30%w/vポリエチレングリコール4000、0.1M HEPES、pH7.5、0.2M塩化カルシウム脱水物を含むリザーバーに対する気相を介した着滴から結晶化した。
結晶は、空間群P31 2 21に属し、非対称単位中に2コピーのL14H18 Fab/tauペプチド234−250を有する。
我々は、単一のL14H18 Fab/tauペプチド234−250結晶を介してX線回折データを収集した。30%ポリエチレングリコール4000、0.2M塩化カルシウム、0.1M HEPES緩衝液pH7.5及び10%エチレングリコールを含む凍結保護剤溶液を短時間通過させた後、結晶を、リソループに懸濁し、液体窒素下で急速凍結した。回折データは、Diamondシンクロトロン, Didcot, Oxfordshire、英国で、I04−1ビームラインステーションのPilatis 6Mで収集した。単色X線ビームの波長は、0.92819Åであった。逆格子空間を、φゴニスタット軸周りの0.2°振動ステップでサンプリングした。シンクロトン施設から提供された加工データXIAファイルを、構造決定に使用した。
Fab位置は、分子置換プログラムPhaser (Read,RJ, Acta Cryst. D57, 1373−1382(2001年))によって、PDBコード4HIXを有するFabを使用して位置付けた。Matthews計数は、単位細胞における100kDaのある分子量を示し、溶液は、非対称単位中にFabの2つのコピーを見出した。
2Fo−Fc及びFo−Fc電子密度マップを使用して、Fab分子中の残基を、L14H18 Fabの配列に従って、電子密度マップによって誘導された位置に置換した。
Fabの第2のコピーについてのFab鎖C及びDは、第1のコピー(鎖H及びL)よりも明瞭な密度を有した。
モデルのR因子は、0.234であり、Rフリーは、36483回の反射に対して0.291である。標準形状からのrms偏差は、結合長さで0.0145、結合角度で1.93°である。
抗体L14H18及びtauペプチドであるN−アセチル−KSPSSAKSRLQTAPVPM−アミド(ヒトtauアイソフォーム2型配列234−250に基づく)の間の相互作用を、ペプチドでインキュベートされたL14H18 Fabフラグメントから調製された共複合体を用いたX線結晶学によって調べた。得られた構造は、L14H18 Fabとtauタンパク質の間の主要な接触部位を明らかにし、主に抗体のCDRループでクラスター化され、tauタンパク質の残基235−244に対応するペプチド残基SPSSAKSRLQとして同定された。ナンバリング配列によれば、配列番号35で示されるように、5.0A内のL14H18のCDR領域と最も密接に相互作用する残基は、S235、P236、S237、S238、A239、K240、R242、L243、Q244及びT245である。
Claims (20)
- 分離されたTau結合抗体又はその結合フラグメントあって、
配列番号1から選択されるCDR1、配列番号2から選択されるCDR2、及び配列番号3から選択されるCDR3を含む軽鎖可変部、ならびに
配列番号4から選択されるCDR1、配列番号5から選択されるCDR2、及び/又は配列番号6から選択されるCDR3を含む重鎖可変部
を含む、前記Tau結合抗体又はその結合フラグメント。 - 分離されたTau結合抗体又はその結合フラグメントあって、
配列番号9を含む軽鎖可変部、及び
配列番号10を含む重鎖可変部
を含む、前記Tau結合抗体又はその結合フラグメント。 - 軽鎖可変部が、配列番号11又は12を含む、請求項2に記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
- Tau結合抗体又はその結合フラグメントが、
配列番号14又はそれらと少なくとも80%同一の配列を含む軽鎖、及び/あるいは
配列番号17もしくは18を含む重鎖
を含む、請求項2、又は3に記載の分離されたTau結合抗体あるいはその結合フラグメント。 - 分離されたTau結合抗体又はその結合フラグメントであって、Tauへの結合について、請求項1、2、3、又は4のいずれかに記載のTau結合抗体又はその結合フラグメントと競合する、前記Tau結合抗体又はその結合フラグメント。
- 分離されたTau結合抗体又はその結合フラグメントであって、請求項1、2、3、又は4のいずれかに記載のTau結合抗体又はその結合フラグメントと実質的に同じエピトープへ結合する、前記Tau結合抗体又はその結合フラグメント。
- Tau結合抗体又はその結合フラグメントが、モノクローナルヒト化抗体である、請求項1、2、3、4、5、又は6のいずれかに記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
- Tau結合抗体又はその結合フラグメントが、配列番号35の、S238、A239、S241、T245、A246のアミノ酸残基を含むエピトープに結合する、請求項1、2、3、4、5、6、又は7のいずれかに記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
- Tau結合抗体又はその結合フラグメントが、アミノ酸残基S238、A239、S241、T245、A246及び配列番号35のS235、S237、K240、R242、L243、Q244、V248、及びM250から選択される1つ以上の残基を含むエピトープに結合する、請求項1、2、3、4、5、6、又は7のいずれかに記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
- Tau結合抗体又はその結合フラグメントが、ヒトTauの可溶性ヒト及び対形成したらせん状フィラメント(PHF)の両方に結合する、請求項1、2、3、4、5、6、7、8、又は9のいずれかに記載のTau結合抗体又はその結合フラグメント。
- 請求項1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10のいずれかに記載のTau結合抗体又はその結合フラグメントの軽鎖及び/又は重鎖をコードする、分離された核酸分子。
- 請求項11に記載の1つ以上の核酸配列を含む、クローニングベクター又は発現ベクター。
- 請求項11に記載の1つ以上の核酸配列又は請求項11に記載の1つ以上のクローニングベクターもしくは発現ベクターを含む、宿主細胞。
- 少なくとも
c)請求項13に記載の宿主細胞を培養するステップ、及び
d)前記Tau結合抗体又はその結合フラグメントを分離するステップ
を含む、請求項1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10のいずれかに記載のTau結合抗体又はその結合フラグメントを作製する方法。 - 治療活性のある薬剤としての使用のための、請求項1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10のいずれかに記載の分離されたTau結合抗体又はその結合フラグメント。
- タウオパチーを処置する上での使用のための、請求項1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10のいずれかに記載の分離されたTau結合抗体又はその結合フラグメント。
- 前記タウオパチーは、アルツハイマー病又は進行性核上性麻痺である、請求項16に記載の使用のための分離されたTau結合抗体又はその結合フラグメント。
- 診断薬としての使用のための、請求項1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10のいずれかに記載の分離されたTau結合抗体又はその結合フラグメント。
- タウオパチーを診断する上での使用のための、請求項1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10のいずれかに記載の分離されたTau結合抗体又はその結合フラグメント。
- 前記タウオパチーは、アルツハイマー病又は進行性核上性麻痺である、請求項19に記載の使用のための分離されたTau結合抗体又はその結合フラグメント。
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