JP2020036598A - Rna−クロマチン相互作用分析のための組成物およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2013年9月5日に出願された米国仮出願第61/873,928号に対する優先権およびその出願日の利益を主張し、その全内容は参照により本明細書に援用される。
特定の態様において、第2二本鎖領域は、第3ポリヌクレオチドに対して5’側を切断する第2制限酵素(RE)に関する第2認識部位を含む。
特定の態様において、前記の第1、第2、第3、および第4ポリヌクレオチドの1つ以上は、修飾ヌクレオチドを含む。
特定の態様において、第1ポリヌクレオチドは、複数のポリヌクレオチドを含み、それぞれがランダム配列プライマー領域においてのみ異なっている。
特定の態様において、ランダム配列プライマーは、4個、5個、6個、7個、8個、またはより多くのヌクレオチドを含む。
特定の態様において、第2二本鎖領域は、RNAリンカーをDNAリンカーと区別する独特の配列を含む。
特定の態様において、第2認識部位の最後のヌクレオチドは、平滑末端における塩基対合したヌクレオチドである。
特定の態様において、第1および第2制限酵素は、独立して以下:AarI、AceIII、AloI、BaeI、Bbr7I、BbvI、BbvII、BccI、Bce83I、BceAI、BcefI、BcgI、BciVI、BfiI、BinI、BplI、BsaXI、BscAI、BseMII、BseRI、BsgI、BsmI、BsmAI、BsmFI、Bsp24I、BspCNI、BspMI、BsrI、BsrDI、BstF5I、BtgZI、BtsI、CjeI、CjePI、EciI、Eco31I、Eco57I、Eco57MI、EcoP15I、Esp3I、FalI、FauI、FokI、GsuI、HaeIV、HgaI、Hin4I、HphI、HpyAV、Ksp632I、MboII、MlyI、MmeI、MnlI、PleI、PpiI、PsrI、RleAI、SapI、SfaNI、SspD5I、Sth132I、StsI、TaqII、TspDTI、TspGWI、TspRIまたはTth111IIから選択される。
特定の態様において、キットは、さらにタンパク質およびポリヌクレオチドを架橋する試薬を含む。
特定の態様において、キットは、さらに、クロマチンの構成要素(例えばヒストン)に特異的または選択的に結合する親和性試薬(例えば、抗体またはモノクローナル抗体)を含む。
特定の態様において、キットは、さらにタンパク質およびポリヌクレオチドの架橋を逆
行させる試薬(例えばプロテイナーゼK)を含む。
特定の態様において、キットは、さらに平滑末端二本鎖DNAのPCR増幅のためのコンカテマー化(concatenating)アダプターの対を含む。
特定の態様において、キットは、さらに逆転写酵素を含む。
本発明の別の側面は、対象のRNAおよびDNAリンカーの第1および第2二本鎖領域を含む中央領域を含むペアエンドタグ(PET)ポリヌクレオチドを提供し、前記の中央領域は、以下:(1)前記の第1二本鎖領域に対して近位の部位において、非コードRNA(ncRNA)の配列タグ;および(2)前記の第2二本鎖領域に対して近位の部位において、ゲノムDNAの配列タグにより隣接されている。
特定の態様において、非コードRNA(ncRNA)の配列タグは、ncRNAが転写されるゲノム領域を独特に同定する。
特定の態様において、ゲノムDNAの配列タグは、前記の第2制限酵素による消化の結果もたらされる遊離末端を有する。
特定の態様において、ゲノムDNAの配列タグは、約8〜30塩基対の長さである。
特定の態様において、ベクターは、複数のコンカテマー化された対象PETポリヌクレオチドを含む。
本発明の別の側面は、ゲノムの非コードRNA(ncRNA)に関するゲノム内の機能的相互作用座位を同定する方法を提供し、その方法は、以下の工程を含む:(1)架橋されたゲノムDNA断片および架橋されたncRNAを含むクロマチン断片を提供し;(2)請求項1に記載のRNAリンカーおよびDNAリンカーを用いて、架橋されたゲノムDNA断片の末端を架橋されたncRNAのcDNAの末端に近接ライゲーションに関する条件下でライゲーションし、ここで架橋されたゲノムDNA断片の前記の末端はDNAリンカーにライゲーションされ、架橋されたncRNAのcDNAの前記の末端はRNAリンカーを含み;(3)請求項29に記載のPETポリヌクレオチドを配列決定分析のために単離し;そして、(4)それぞれの前記のPETポリヌクレオチド内のゲノムDNAの配列タグおよびncRNAの配列タグを、参照ゲノムに対してマッピングし、それにより参照ゲノムの前記の非コードRNA(ncRNA)に関する参照ゲノム内の機能的相互作用座位を同定する。
特定の態様において、クロマチン断片は超音波処理により生成される。
特定の態様において、第2鎖cDNA合成が、近接ライゲーションの後であるが工程(3)の前に実施される。
特定の態様において、DNAリンカーの第3ポリヌクレオチドは、脱リン酸化されており、DNAリンカーは、自己ライゲーションしない。
特定の態様において、方法は、さらに、工程(2)の前にクロマチン断片の部分集合を単離または富化することを含む。
特定の態様において、タンパク質構成要素は、ヒストン、転写因子、ポリコーム群(PcG)ファミリータンパク質;組み換えに関わる因子;クロマチンインスレーターもしくはクロマチンウェーバー(waver);メチルCpG結合タンパク質;またはRNA結合タンパク質である。
本明細書で記載される発明は、ncRNAが核空間における後成的制御の役割を有するならば、それはクロマチン状態および標的遺伝子活性の調節に関する機能が発揮される染色体中の特定の位置においてクロマチンと直接または間接的にのどちらかで相互作用しなければならないであろうという認識に部分的に基づいている。従って、本明細書で記載される発明は、ncRNA−クロマチン相互作用を、RNA−DNAライゲーション、続いてペアエンドタグ配列決定(RICh−PET)により全体的にマッピングするための新規のアプローチを提供する。
チン標的部位の位置を決定するための、RNA−DNAライゲーション産物またはそれに由来するタグ配列(例えばPETポリヌクレオチド)の配列決定およびマッピング分析。
a)RNAリンカーおよびDNAリンカーの対
第1の特定の態様において、本発明の方法は、同じクロマチン断片中の架橋されたRNAおよび染色体DNAをライゲーションするために、RNAリンカーおよびDNAリンカーの対を用いて実施されることができる。
オチドの3’末端における3’オーバーハングであり、ここで両方の3’オーバーハングは、ライゲーションのために互いにアニーリングする。
対象となる場合、本発明の第1ポリヌクレオチドは、その定められた3’末端配列を有する特定のncRNAから特異的に第1鎖cDNA合成を開始するために、ランダム配列プライマー領域において同じマッチする配列を均質に含有していることができる。
特定の態様において、第1および第2(II型)制限酵素は同じである。他の態様において、第1および第2(II型)制限酵素は異なる。
特定の態様において、第1、第2、第3、および第4ポリヌクレオチドの1つ以上は、DNAであり(例えば全てがDNAであり)、またはDNAおよびRNAヌクレオチドの両方を含む。他の態様において、それらの全てがRNAであることができる。
massively parallel signature sequencing)(MPSS);DNAナノボール配列決定;Heliscope単分子配列決定と組み合わせられることもでき、またはカラービーズもしくはレーザーもしくはFACSベースの選別のための他の抗体を用いるLuminex型システムと共に用いられることもできる。
のホスホトリエステル法;Brown et al., 1979, Meth. Enzymol., 68:109-151のホスホジエステル法;Beaucage et al., 1981, Tetrahedron Lett., 22:1859-1862のジエチルホスホルアミダイト法;および米国特許第4,458,066号の固体支持体法、それぞれ参照により本明細書に援用される。オリゴヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドのコンジュゲートの合成法の総説が、本明細書に参照により援用されるGoodchild, 1990, Bioconjugate Chemistry, 1(3):165-187において提供されている。
特定の態様において、キットは、さらにタンパク質およびポリヌクレオチドを架橋する試薬、例えばホルムアルデヒド(例えば1%ホルムアルデヒド)を含む。
本発明の別の側面は、第1および第2ライゲーション適合末端により連結された第1および第2二本鎖領域を含む中央領域を含むペアエンドタグ(PET)ポリヌクレオチドを提供し、前記の中央領域は、(1)第1二本鎖領域に近位の部位において、非コードRN
A(ncRNA)の配列タグ;および(2)第2二本鎖領域に近位の部位において、ゲノムDNAの配列タグにより隣接されている。
制限酵素は、上記の制限酵素、例えばII型RE(IIS型、IIB型、IIG型等)、I型RE、またはIII型REのいずれであることもでき、それはそれらの認識部位の外側を消化することができる。あるいは、遊離末端は、ncRNAに対応するcDNA上に天然に存在するRE部位により生成されることもできる。好ましくは、REは、中央領域の配列に基づいて、REが中央領域の内部を切断して連結されたDNAリンカーおよびRNAリンカーの構造を壊さないように選択される。
特定の態様において、ベクターは、複数のコンカテマー化された対象PETポリヌクレ
オチドを含む。
次いで、細胞が適切な溶解緩衝液(例えば、50mM HEPES、1mM EDTA、0.15M NaCl、1% SDS、1% Triton X−100、0.1%デオキシコール酸ナトリウム、全てAmbionからのもの)中で溶解される。
例えば、特定の態様において、クロマチン断片は、物理的剪断、例えば超音波処理、水力剪断、または皮下注射針を通す吸い込みの繰り返しにより生成される。超音波処理は、
クロマチン線維を破壊してRNA、DNAおよびタンパク質構成要素を含む係留複合体にする一方で、偽の、ランダムな、または弱いncRNA−クロマチン−DNA相互作用を“振るい落とす”ために有利であり得る。
片として単離されることもできる。例えば、ストレプトアビジンを有するDYNABEADS(登録商標)(DYNABEADS(登録商標)MyOne(商標)ストレプトアビジンC1/T1)が、ビオチン化されたクロマチン断片を富化するために用いられることができる。
クロマチン断片は、剪断またはRE消化後、損傷した末端または他の点でDNAリンカーとのライゲーションに適していない末端を有し得る。従って、末端修復が、例えばEpicentreからのEnd−ItキットまたはT4ポリメラーゼ(Promega,R0191)を用いて、製造業者の提案に従って実施されることができる。
特定の態様において、架橋されたncRNAのcDNAは、RNAリンカーのランダム配列プライマーおよびncRNA鋳型から逆転写された第1鎖cDNAを含む。RNAリンカーの存在により、この第1鎖cDNAおよびncRNA鋳型のハイブリッド分子は、既に染色体DNA断片の遊離末端にライゲーションされたDNAリンカーにライゲーションされることができる。
次に、クロマチン断片の架橋された核酸およびタンパク質構成要素は、プロテイナーゼKにより架橋を逆行する(reverse cross−linked)ことができる。典型的な反応条件では、例えば、試料は、20μLの分割量(aliquots)として、15μlの20mg/mlプロテイナーゼK(Ambion)および場合により0.3% SDS(Ambion)の存在下での65℃における一晩インキュベーションにより、架橋を逆行することができる。次の日に、約1μLの10mg/ml RNase A(Qiagen)が、RNAを分解するために(例えば37℃で45分間)添加されることができ、続いてフェノール抽出およびDNAのエタノール沈殿が行われる。
多くの商業的に利用可能なツール、ソフトウェア、またはサービスのいずれかを用いて実施されることができる。
富化されたら、そのようなクロマチン断片は、その特定のncRNAと相互作用するゲノムDNAの領域を同定するために、その方法の残りの工程を受けることができる。
別の/第2の特定の態様において、本発明の方法は、同じクロマチン断片中の架橋されたRNAおよび染色体DNAをライゲーションするために、1つの修飾されたRNAリンカーを用いて(かつDNAリンカーを用いずに)実施されることができる。
別の態様において、ライゲーション適合末端は、制限酵素部位を含むことができ、それは、REにより切断されて、架橋されたゲノムDNA断片の平滑末端へのライゲーションに必要な必須の平滑末端を生成することができる。しかし、制限酵素による切断の前に、ライゲーション適合末端は、平滑末端化されることができ(例えば、自己リン酸化を防ぐための脱リン酸化された平滑末端)、または自己ライゲーションを防ぐ非適合性オーバーハングを有することもできる。
第1および第2ポリヌクレオチドは、別々の容器中で、例えば合成されたポリヌクレオチドとして提供されることができ、それは凍結乾燥された(freeze dried,lyophilized)形態または水もしくは適切な緩衝溶液中のどちらでもよい。あるいは、第1および第2ポリヌクレオチドは、同じ容器中(凍結乾燥状態または溶液中)で、例えば1:1のモル比で、それらが予めアニーリングされた修飾RNAリンカーとして用いられることができるように、組み合わせられることができる。
ライマー領域において同じマッチする配列を均質に含有していることができる。
特定の態様において、修飾RNAリンカーは、その修飾RNAリンカーを他の修飾RNAリンカー(単数または複数)から区別する独特の配列(例えば“バーコード”)を含むことができる。
本発明の別の側面は、以下:(1)ランダム配列プライマーに対して近位の部位において非コードRNA(ncRNA)の配列タグ;および(2)ライゲーション適合末端に対して近位の部位においてゲノムDNAの配列タグにより隣接されている(修飾RNAリンカーの)二本鎖領域を含む中央領域を含むペアエンドタグ(PET)ポリヌクレオチドを提供する。
本発明の別の側面は、ゲノムの非コードRNA(ncRNA)に関するゲノム内の機能的相互作用座位を同定する方法を提供し、その方法は、以下の工程を含む:(1)架橋されたゲノムDNA断片および架橋されたncRNAを含むクロマチン断片を提供し;(2)本発明の修飾RNAリンカーを用いて、架橋されたゲノムDNA断片の末端を架橋されたncRNAのcDNAの末端に近接ライゲーションに関する条件下でライゲーションし、ここで架橋されたゲノムDNA断片の末端は修飾RNAリンカーのライゲーション適合末端にライゲーションされ、架橋されたncRNAのcDNAの末端は修飾RNAリンカーを含み;(3)本発明のPETポリヌクレオチドを配列決定分析のために単離し;そして、(4)それぞれのPETポリヌクレオチド内のゲノムDNAの配列タグおよびncRNAの配列タグを、参照ゲノムに対してマッピングし、それにより参照ゲノムの非コードRNA(ncRNA)に関する参照ゲノム内の機能的相互作用座位を同定する。
別の/第3の特定の態様において、本発明の方法は、ncRNAの3’−OH基を、5’アデニル化された一本鎖DNA(5’App−ssDNA)、例えば後で相補的ポリヌクレオチドにハイブリダイズされるssDNAリンカー、またはncRNAの3’−OH基への直接的なライゲーションのための酵素の基質の役目を果たすことができる5’アデニル化されたオーバーハングを有するdsDNAに直接ライゲーションする特定の酵素(例えば切り詰められたRNAリガーゼ2またはRNL2)を用いて実施されることができる。
Scientific(テキサス州オースティン)からのAIRTM RNAリガーゼ2(RNL2)であり、それは、アダプターのアデニル化された5’末端をRNAの3’末端に特異的にライゲーションする。同様に、その酵素は、ライゲーションに関してATPを必要としないが、アデニル化された基質を必要とし、それは、ランダムRNA分子間のライゲーションの量を劇的に低減する。そのリガーゼは、T4 RNAリガーゼ2の切り詰められたバージョンである。完全長のRNAリガーゼ2とは異なり、AIR(商標)リガーゼは、アデニル化された基質を有しないRNAまたはDNAのリン酸化された5’末端をライゲーションしない。
別の態様において、ライゲーション適合末端は、制限酵素部位を含むことができ、それはREにより切断されて、架橋されたゲノムDNA断片の平滑末端へのライゲーションに必要な必須の平滑末端を生成することができる。しかし、制限酵素による切断の前に、ライゲーション適合末端は、平滑末端化されることができ(例えば自己ライゲーションを防ぐための脱リン酸化された平滑末端)、または自己ライゲーションを防ぐ非適合性オーバーハングを有することができる。
特定の態様において、二本鎖領域は、ライゲーション適合末端において、またはその付近に、第2制限酵素、例えばII型制限酵素(RE)に関する第2制限部位を含むことができる。REは、第2RE認識部位に対して3’側であり第1ポリヌクレオチドに対して3’側(例えば、ライゲーションされたゲノムDNA中)を切断することができる。RE認識部位の方向性は、それが、連結されたゲノムDNAの末端配列に基づいてDNAタグを生成するような方式で配置される。特定の態様において、RE部位の配置は、二本鎖領域の末端である必要はない。より内部の配置は、対応してより短いDNAタグ配列を生成
する。
特定の態様において、直接的なRNAリンカーは、直接的なRNAリンカーを他の直接的なRNAリンカー(単数または複数)から区別する独特の配列(例えば“バーコード”)を含むことができる。
本発明のこの側面に従って生成されたPETポリヌクレオチドは、5’App ssDNAおよびその相補配列(すなわち第2ポリヌクレオチド)の間で形成された二本鎖領域に対応する中央領域を含む。この領域に関する特定の配列の要求は存在せず、その領域の長さは柔軟性がある(例えば数bpほどの短いもの、RNA−DNAリガーゼの基質の要求、そして逆転写酵素に関する基質の要求を支持するために十分に長いもの)が、より長い配列が、あらゆる所望されるRE認識部位、バーコード配列、または修飾ヌクレオチド(例えば親和性精製のためのビオチン化ヌクレオチド)を組み込むために用いられることができる。
本発明のさらに別の側面は、ゲノムの非コードRNA(ncRNA)に関するゲノム内の機能的相互作用座位を同定する方法を提供し、その方法は、以下の工程を含む:(1)架橋されたゲノムDNA断片および架橋されたncRNAを含むクロマチン断片を提供し;(2)ncRNAの3’−OHを、5’を予めアデニル化されたssDNAにライゲーションし;(3)ssDNAの相補物を提供してssDNAおよび相補物の間で二本鎖領域を形成し、(4)必要であれば、二本鎖領域の末端において平滑末端を生成し;(5)その平滑末端を、架橋されたゲノムDNA断片の末端に、近接ライゲーションに関する条件下でライゲーションし;(6)PETポリヌクレオチドを配列決定分析のために単離し、ここで、そのPETポリヌクレオチドは、架橋されたゲノムDNA断片のDNAタグおよびncRNAのRNAタグにより隣接された二本鎖領域を含み;そして、(7)そのDNAタグおよびRNAタグを参照ゲノムに対してマッピングし、それにより参照ゲノムの非コードRNA(ncRNA)に関する参照ゲノム内の機能的相互作用座位を同定する。
能的相互作用座位を同定する方法を提供し、その方法は、以下の工程を含む:(1)架橋されたゲノムDNA断片および架橋されたncRNAを含むクロマチン断片を提供し;(2)ncRNAの3’−OHを、二本鎖領域を有するdsDNAの5’を予めアデニル化されたオーバーハングにライゲーションし、(4)必要であれば、二本鎖領域の末端において、5’を予めアデニル化されたオーバーハングに対して遠位に平滑末端を生成し;(5)その平滑末端を、架橋されたゲノムDNA断片の末端に、近接ライゲーションに関する条件下でライゲーションし;(6)PETポリヌクレオチドを配列決定分析のために単離し、ここで、そのPETポリヌクレオチドは、架橋されたゲノムDNA断片のDNAタグおよびncRNAのRNAタグにより隣接された二本鎖領域を含み;そして、(7)そのDNAタグおよびRNAタグを参照ゲノムに対してマッピングし、それにより参照ゲノムの非コードRNA(ncRNA)に関する参照ゲノム内の機能的相互作用座位を同定する。
“非コードRNA(ncRNA)”は、タンパク質に翻訳されないRNA分子を含む。頻度はより低いが、それは、非タンパク質コードRNA(npcRNA)、非メッセンジャーRNA(nmRNA)および機能性RNA(fRNA)と呼ばれる可能性もある。それは、通常は、タンパク質をコードする以外の機能を有する機能性RNAであるが、一部は非機能性である、または既知の機能を有しない可能性がある。時々、小さいRNA(sRNA)という用語が、しばしば短い細菌性ncRNAに関して用いられる。非コードRNAが転写されるDNA配列は、しばしばRNA遺伝子と呼ばれる。
ダーRNA、SmY RNA(mRNAのトランススプライシングに関する)、アンチセンスRNA、シス−天然アンチセンス転写産物、マイクロRNA(遺伝子制御に関する)siRNA(トランス作用性siRNAを含む;遺伝子制御に関する)、exRNA、およびpiRNA(リピート関連siRNAを含む;トランスポゾン防御に関し、他の機能である可能性もある)のようなRNA、7SK RNA(CDK9/サイクリンT複合体の負の制御に関する)、ならびにXistおよびHOTAIRのような例を含む長いncRNAを含む。ヒトゲノム内にコードされているncRNAの数は未知であるが、最近のトランスクリプトームおよび生物情報学の研究は、数千のncRNAの存在を示唆している。新規に同定されたncRNAの多くは、それらの機能に関して検証されていないため、多くが非機能性である可能性がある。
ミド、ウイルスベクターまたは当該技術で既知の他の媒介物を含み得る。そのようなベクターは、適切な宿主増幅のための複製起点、クローニングされた配列の効率的な転写を促進することができるプロモーター配列、クローニングされた配列の直接的な増幅のための隣接しているPCRプライマーを含有し得る。ベクターは、形質転換された細胞の表現型選択を可能にする特定の遺伝子も含み得る。本発明における使用に適したベクターは、例えば、pBlueScript(Stratagene,カリフォルニア州ラホヤ);pBC、pZErO−1(Invitrogen,カリフォルニア州カールスバッド)およびpGEM3z(Promega,ウィスコンシン州マディソン)またはそれらの改変ベクターならびに当業者に既知の他の類似のベクターを含む。例えば、本明細書に参照により援用される米国特許第4,766,072号において開示されているpGEMベクターを参照。
用いられる様々な方法をさす。本発明と共に用いられることができる適切な配列決定技法は、伝統的な鎖終結サンガー法、ならびに多くの商業的な源から利用可能ないわゆる次世代(高スループット)配列決定、例えば大規模並行署名配列決定(またはMPSS、Lynx Therapeutics/Solexa/Illuminaによる)、ポロニー配列決定(Life Technologies)、パイロ配列決定または“454配列決定”(454 Life Sciences/Roche Diagnostics)、ライゲーションによる配列決定(SOLiD配列決定、Applied Biosystems/Life Technologiesによる)、合成による配列決定(Solexa/Illumina)、DNAナノボール配列決定、heliscope配列決定(Helicos Biosciences)、ion半導体またはIon Torrent配列決定(Ion Torrent Systems Inc./Life Technologies)、および単分子リアルタイム(SMRT)配列決定(Pacific Bio)等を含む。数多くの他の高スループット配列決定法が、まだ開発されており、または完成しており、それらも本発明のPETポリヌクレオチドを配列決定するために用いられることができ、それはナノポアDNA配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、質量分析による配列決定、微小流体サンガー配列決定、透過型電子顕微鏡DNA配列決定、PNAP配列決定、およびインビトロウイルス高スループット配列決定等を含む。
“The Sequence of the Human Genome,” Science, 291(5507):1304-1351, 2001を参照
。他の非限定的な参照ゲノムは、数多くの非ヒト霊長類、哺乳類、げっ歯類(ラット、マウス、ハムスター、ウサギ等)、家畜動物(ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ)、鳥類(ニワトリ)、爬虫類、両生類(アフリカツメガエル)、魚類(ゼブラフィッシュ(ダニオ・レリオ(Danio rerio))、フグ)、昆虫(ショウジョウバエ(Drosophila)、蚊)、線虫、寄生生物、真菌(例えば酵母、例えば出芽酵母(S.cerevisae)または分裂酵母)、様々な植物、ウイルス(例えば宿主ゲノム中に組み込まれたウイルス)等を含む。
PNA/DNAの塩基のミスマッチは、DNA/DNA二本鎖における類似のミスマッチよりも大きく不安定化する。この結合強度および特異性は、PNA/RNA二本鎖にも当てはまる。
“二官能性架橋剤/試薬”または“架橋剤/試薬”は、2個以上の反応基を有し、それぞれが1つの部分(例えばDNA、RNA、またはタンパク質)と反応することができ、そうして2つの部分が別々の分子である場合にその2つの部分を架橋して一緒にする修飾剤を含む。そのような二官能性クロスリンカーは、当該技術で周知である(例えば、Isalm and Dent in Bioconjugation, Chapter 5, pp. 218-363, Groves Dictionaries Inc., ニューヨーク, 1999を参照)。例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、またはアルデヒド反応基を有する他の類似の試薬は、タンパク質中の第一級アミノ基を、タンパク質またはDNA中の他の近くの窒素原子と、メチレン(−CH2−)連結により架橋することができる。チオエーテル結合を介した連結を可能にする他の二官能性架橋剤は、マレイミド基を導入するためのN−スクシンイミジル−4−(N−マレイミドメチル)−シクロヘキサン−1−カルボキシレート(SMCC)、またはヨードアセチル基を導入するためのN−スクシンイミジル−4−(ヨードアセチル)−アミノベンゾエート(SIAB)を含む。マレイミド基またはハロアセチル基をポリペプチド上に導入する他の二官能性架橋剤は、当該技術で周知であり(例えば、米国特許出願第2008/0050310号、第2005/0169933号を参照、Pierce Biotechnology Inc. P.O. Box 117,Rockland,IL 61105,米国から入手可能)、以下のものを含むが、それらに限定されない:ビス-マレイミドポリエチレングリコール(BMPEO)、BM(PEO)2、BM(PEO)3、N−(β−マレイミドプロピルオキシ)スクシンイミドエステル(BMPS)、γ−マレイミド酪酸 N−スクシンイミジルエステル(GMBS)、ε−マレイミドカプロン酸 N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(EMCS)、5−マレイミド吉草酸 NHS、HBVS、SMCCの“長鎖”類似体(LC−SMCC)であるN−スクシンイミジル−4−(N−マレイミドメチル)−シクロヘキサン−1−カルボキシ−(6−アミドカプロエート)、m−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)、4−(4−N−マレイミドフェニル)−酪酸ヒドラジドまたはHCl塩(MPBH)、N−スクシンイミジル 3−(ブロモアセトアミド)プロピオネート(SBAP)、N−スクシンイミジル ヨードアセテート(SIA)、κ−マレイミドウンデカン酸 N−スクシンイミジルエステル(KMUA)、N−スクシンイミジル 4−(p−マレイミドフェニル)−ブチレート(SMPB)、スクシンイミジル−6−(β−マレイミドプロピオンアミド)ヘキサノエート(SMPH)、スクシンイミジル−(4−ビニルスルホニル)ベンゾエート(SVSB)、ジチオビス−マレイミドエタン(DTME)、1,4−ビス−マレイミドブタン(BMB)、1,4−ビスマレイミジル−2,3−ジヒドロキシブタン(BMDB)、ビス−マレイミドヘキサン(BMH)、ビス−マレイミドエタン(BMOE)、スルホスクシンイミジル 4−(N−マレイミド−メチル)シクロヘキサン−1−カルボキシレート(スルホ−SMCC)、スルホスクシンイミジル(4−ヨード−アセチル)アミノベンゾエート(スルホ−SIAB)、m−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル(スルホ−MBS)、N−(γ−マレイミドブチリルオキシ)スルホスクシンイミドエステル(N−(γ−maleimidobutryloxy)sulfosuccinimde ester)(スルホ−GMBS)、N−(ε−マレイミドカプロイルオキシ)スルホスクシンイミドエステル(N−(ε−maleimidocaproyloxy)sulfosuccimido ester)(スルホ−EMCS)、N−(κ−マレイミドウンデカノイルオキシ)スルホスクシンイミドエステル(スルホ−KMUS)、およびスルホスクシンイミジル 4−(p−マレイミドフェニル)ブチレート(スルホ−SMPB)。
3.制限酵素
本発明のDNAおよび/またはRNAリンカーが制限酵素認識部位を含むことは、必要とされない。実際、特定の態様において、本発明のDNAおよび/またはRNAリンカーは、制限酵素認識部位を含まないことが望ましい可能性さえある。しかし、特定の態様に
おいて、本発明のDNAおよび/またはRNAリンカーは、少なくとも1個のRE認識部位、例えばII型RE認識部位(例えばIIS型RE部位)を含むことができる。
Molecular Biology, 第2巻, 1995, 編者Ausubel, et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Unit 3.1.15;および最新のNew England Biolabsのカタログまたはウェブサイトの情報(2005年およびそれ以降)を参照。
一例として、IIS型RE、例えばMmeIは、ライゲーションされたRNA−DNAリンカーに隣接する一定の長さのDNAまたはRNAタグを生成するために用いられることができる。特に、MmeI認識部位は、RNAまたはDNAリンカーの二本鎖領域の末端に、MmeI切断の際にそのRNAまたはDNA配列に由来する17〜21bpのタグ配列が今ライゲーションされたRNAリンカーおよびDNAリンカーに連結されているように、配置されることができる。1つのMmeI部位がRNAおよびDNAリンカーのそれぞれの中に現れる場合、2つの生成されたタグ(1つはDNAタグ、別のタグはRNAタグ)が、今ライゲーションされたRNAリンカーおよびDNAリンカーに隣接する。その2つのタグは、さらなる下流の操作、例えばPCR増幅、コンカテマー化、または配列決定が実施されることができるように、平滑末端化により追加で処理されることができる。
長さ(例えば10〜25bp〜数百bp)のタグ配列を生成することができる類似の特性を有する、当該技術で既知の他の適切なRE酵素または後に発見される適切なRE酵素も、本発明を実施するために用いられることができる。
SfaNI(GCATC 5/9)、およびBspI(ACCTGC 4/8)。
よび望ましい認識部位から切断部位までの距離を有する制限エンドヌクレアーゼを調製するように適用されることができる。
DNAリンカーのみがRE認識部位を再生させるように)含有されていることもできる。
al., J. Mol. Biol,. 312: 687-698, 2001; Rao et al., J. Mol. Biol., 209: 599-606, 1989; Hadi et al., J. Mol. Biol,. 134: 655-666, 1979において記載されており、全て参照により本明細書に援用される。III型制限酵素は、New England Biolabs(NEB)から購入されることもできる。特に、本発明の態様を実施するための典型的なIII型REは、III型酵素EcoP15Iである。EcoP15Iの認識部位(単数または複数)は、CAGCAG(25/27)である。
特定の態様において、本発明の単離されたPETポリヌクレオチドは、他の単離されたPETポリヌクレオチドと繋がれて、またはコンカテマー化されて、PETポリヌクレオチドのコンカテマーを形成することができる。あらゆる数のPETポリヌクレオチドが、配列決定の目的のために、または適切なプラスミドもしくはベクター中へのクローニングのために、一緒に繋げられることができる。
願公開第2008/0124707 A1号、参照により本明細書に援用される)が用いられることができる。別の例において、単離されたPETポリヌクレオチドは、必要であれば、両方の末端において、その末端が(II型)制限酵素により消化されることができる1個以上のアダプターオリゴヌクレオチド(単数または複数)に連結される前に、仕上げされる(polished)ことができる。消化産物は、個々のPETポリヌクレオチドのコンカテマー化を促進することができる適合性粘着末端を有することができる。RE部位が、PETポリヌクレオチドの末端に連結された全部のアダプターに関して同じである場合、全部の粘着末端が、ライゲーションおよびコンカテマー化に適合性であり、個々のPETポリヌクレオチドは、ヘッドトゥーテール様式またはヘッドトゥーヘッド様式のどちらでも、独立して一緒に連結されることができる。アダプターが異なる場合、例えば、第1RE部位を有する第1アダプターがRNAタグに連結されることができ、一方で第2(異なる)RE部位を有する第2アダプターがDNAタグに連結されることができる。コンカテマー化の際は、全部のPETポリヌクレオチドが、ヘッドトゥーヘッド様式で連結されるであろう。
特定の態様において、ライブラリーは、ライブラリー内の少なくとも2つのメンバーが、増幅、例えばPCR増幅、ローリングサークル増幅、クローニングされた遺伝物質の生物学的増幅、またはあらゆる他の既知の増幅法に由来するように、増幅されている。PCRプライマーおよびプローブの配列は、PETポリヌクレオチドの末端に連結されたPCRアダプターの情報に基づいて、またはクローニングされたPETポリヌクレオチドもしくはそのコンカテマーに隣接するクローニングベクター上のプライマー配列に基づいて調製されることができる。
特定の態様において、本発明の方法は、特定のncRNA−クロマチン/タンパク質−DNA相互作用を同定するために用いられることができる。例えば、特定の態様において、特定のクロマチン構成要素またはタンパク質と関係するあらゆるncRNA−DNA−クロマチン相互作用を決定することは、興味深い可能性がある。本発明の方法は、さらに、対象のタンパク質を免疫沈降するためにChIPを用いることを含む。
総説されている)。その目的は、タンパク質をDNAと、それらの相互作用の部位において架橋することである。
本発明の方法および組成物は、ncRNAおよびゲノム座位の間の相互作用を、偏りのない全体的なレベルまたは対象の特定のncRNAもしくは特定のクロマチン構成要素のレベルのどちらにおいても同定することを可能にする。本方法を用いて得られる情報は、多種多様な研究および開発設定において用いられることができる。
本発明は、CCAT1 lncRNAの拮抗薬(アンチセンス、siRNA、miRNA、または同じ物をコードする/発現するベクターも提供する。
ス(cancermodels.nci.nih.gov)および癌イメージデータベース(cancerimages.nci.nih.gov)を有するヒト癌のマウスモデル・コンソーシアム、または他の源、例えばジャクソン研究所(jaxmice.jax.org/list/rax3.htmlを参照)により配布される癌研究モデルにおいて見つけられることができる。一次癌生検または細胞株のどちらかを用いるさらなる異種移植モデルが、癌を研究するために有用である。
別の側面において、本発明は、本発明の方法により同定された様々なCCAT1転写産物、それらのcDNA配列(両方の鎖)、拮抗薬(例えば、これらのCCAT1 ncRNA転写産物の機能に拮抗するアンチセンス配列、siRNAまたはmiRNAコンストラクト)を提供する。
>CCAT1_JAX_1転写産物配列;ゲノム位置:8番染色体:128128655〜128241571 鎖:−
Cは、ヒトゲノムの8番染色体上のヌクレオチド128128655に対応し、5’末端における最後のcDNAヌクレオチドTは、ヒトゲノムの8番染色体上のヌクレオチド128241571に対応する)。
特定の態様において、その拮抗配列は、SEQ ID NO:9に対応するCCAT1
ncRNAの機能に拮抗しない。
特定の態様において、そのアンチセンス配列は、SEQ ID NO:1〜8において示されている“−”鎖cDNA配列のいずれか1つに、生理的条件下(例えば細胞の核中)で、または高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、例えばCold Spring Ha
rbor Laboratory Pressにより出版された、SambrookおよびRussellによるMolecular Cloning:A Laboratory Manual、第3版、2001(本明細書に参照により援用される)にお
いて記載されている条件下でハイブリダイズする(がSEQ ID NO:9において示されている“−”鎖cDNA配列にはハイブリダイズしない)。1つのそのような高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、おおよそ45℃における6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)、続いて50℃における、55℃における、または約60℃における、または約65℃以上における0.2×SSCおよび0.1% SDS中での1回以上の洗浄を含み得る。
特定の態様において、拮抗薬配列は、SEQ ID NO:1〜8において示されている“−”鎖cDNA配列により表されるCCAT1 ncRNAイソ型のいずれか1つ以上の破壊を標的とする(が、SEQ ID NO:9において示されている“−”鎖cDNA配列により表されるCCAT1 ncRNAイソ型の破壊は標的としない)siRNAまたはmiRNA配列である。
関連する側面において、本発明は、癌または前癌病変を診断する方法であって、生物学的試料中のSEQ ID NO:1〜8のいずれか1つまたはその断片の発現のレベルを測定することを含む方法を提供し、ここで、生物学的試料中のSEQ ID NO:1〜8のいずれか1つまたはその断片の発現は、癌または前癌病変を示している。特定の態様において、その断片は、SEQ ID NO:9の断片ではない。
生物学的試料から単離し;(b)単離された核酸中のSEQ ID NO:1〜8のいずれか1つまたはそのいずれかの断片を増幅し;(c)増幅されたCCAT1産物を可視化し;そして(d)CCAT1増幅産物の量を標準と比較する;ここで、より高いレベルのCCAT−1増幅産物の存在は、癌または前癌病変を示している。特定の態様において、その断片は、SEQ ID NO:9の断片ではない。
特定の態様において、その標準は、癌で苦しんでいない対象におけるCCAT−1の発現のレベルを測定することにより決定される。関連する態様において、その標準は、同じ対象の癌ではない組織におけるCCAT−1の発現のレベルを測定することにより決定される。
特定の態様において、前癌病変は、腺腫性ポリープである。
本発明の関連する側面は、プローブまたはプライマーとして有用な、SEQ ID NO:1〜8のいずれか1つまたはその相補物の少なくとも8個の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを提供する。特定の態様において、そのオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:9にはハイブリダイズしない。
本発明の別の関連する側面は、以下の工程を含む、癌または前癌病変を画像化する方法を提供する:(a)対象に本発明のCCAT1プローブを投与し;ここで、そのプローブは指示物質分子にコンジュゲートしており;そして(b)そのプローブにコンジュゲートした指示物質分子(例えば、放射性同位体、蛍光色素、可視色素またはナノ粒子)を、画像化装置により検出する。
特定の態様において、その方法は、インビボで実施され、それを必要とする対象に、対象のCCAT1の拮抗薬配列(例えばアンチセンス、miRNAまたはsiRNA)を投与することを含む。
J. Gait, 編者, 1984);Nucleic Acid Hybridization (B. D. HamesおよびS. J. Higgins. 編者, 1984);PCR Technology - principles and applications for DNA amplification, 1989, (編者 H. A. Erlich) Stockton Press, ニューヨーク;PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, 1990, (編者 M. A. Innis et al.) Academic Press, サンディエゴ;ならびにPCR Strategies, 1995, (編者 M. A. Innis et al.) Academic Press, サンディエゴ;その全部が参照により本明細書に援用される。
RNA−DNAライゲーション、続いてペアエンドタグ配列決定(RICH−PET)を用いて、出願人らは、ncRNA(非コードRNA)およびクロマチンの相互作用を偏りのない全ゲノム方式で研究するための、下記で記載される典型的な方法を開発してきた。
加えて、直接的なRNAリンカーが、RNAの3’末端を5’をアデニル化されたssDNAまたは5’をアデニル化されたオーバーハングに直接連結することができる特定の酵素(例えば切り詰められたRNL2)を利用することにより、RNA−DNAライゲーション工程を実施するために用いられることができ、後者の方法に関する概略図が、図1Cにおいて示されている。
I.細胞培養および架橋
HeLa S3細胞を、5%ウシ胎児血清(FBS)(Life Technologies,カタログ番号10082147)を補ったハムF−12栄養素混合物(Life
Technologies,カタログ番号11765−054)中で増殖させた。架橋された細胞のそれぞれのバッチに関して、EGS(スペーサーアーム:16.1A;Thermo Scientific,カタログ番号21565)およびホルムアルデヒド(スペーサーアーム:2.0A;Merck−Calbiochem,カタログ番号344198−250ML)を用いて、細胞をタンパク質−DNA、タンパク質−RNAおよびタンパク質−タンパク質の二重架橋のために処理し、それはホルムアルデヒドのみを用いるよりも良好な連結性を提供することができた。
5ml−Falconチューブ(Life Technologies,カタログ番号AM1250)に移した。このプロセスを、全ての細胞が収集されることを確実にするために必要に応じて繰り返した。細胞を2000rpmにおいて4℃で5分間遠心沈殿させ、次いで細胞のペレットを使用まで−80℃で保管した。
細胞溶解を、以前に記載されたように実施した(Goh et al., J. Vis. Exp., (62), e3770, doi:10.3791/3770, 2012; Fullwood et al., Nature, 462:58-64, 2009, 両方とも参照により本明細書に援用される)。簡潔には、核のペレットを、氷冷洗浄緩衝液(50mMトリス−HCl pH=8.0、150mM NaCl、1mM EDTA、1% TritonX−100、0.1% SDS)で2回洗浄し、1mLの同じ緩衝液中で懸濁した。クロマチンを、例えば超音波処理により剪断し、約500bpの平均サイズを有する断片にした。次いで、以前に記載されたように(Kalhor et al., Nat. Biotechnol., 30:90-98, 2012, 参照により本明細書に援用される)、SDSを剪断されたクロマチンに約0.5%の終濃度になるように添加し、次いでその混合物を37℃で15分間インキュベートした後、EZlinkヨードアセチル−PEG2−ビオチン(IPB)(Thermo Scientific,カタログ番号21334)と混合し、室温で60分間回転させた。次いで、ストレプトアビジンビーズに結合したクロマチンに対してRICh−PETライブラリー構築を行った。
ストレプトアビジンビーズに結合したクロマチン中に存在するDNA断片を、T4ポリメラーゼ(Promega,R0191)を用いて末端修復した後、Superscript III第1鎖合成システム(Life Technologies,カタログ番号18080051)を用いて第1鎖合成を行った。
bion)およびプロテイナーゼK(Ambion)による65℃で一晩のインキュベーションにより逆行させた。cDNA−DNA断片を、フェノール/クロロホルム イソプロパノール沈殿により精製した。次いで、精製されたcDNA−DNAを、1μlのMmeI(NEB)により、適切な緩衝液(5μl 10×NEBuffer4、5μlの過剰なMmeIを停止させるためのビオチン化されていない半分のリンカー(Half linker)、5μl 10×SAM)中で、37℃において少なくとも2時間消化し、cDNAタグ−RNAリンカー−DNAリンカー−DNAタグ構造(ペアエンドタグ、PET)を解除した。
EDTA、1M NaCl)中で固定し、室温で45分間揺り動かした。次いで、それぞれのPET構造の末端を、アダプターに、1μlのT4 DNAリガーゼ(Thermo Scientific,カタログ番号EL0013)により、アダプターライゲーション緩衝液(4μlアダプターA、4μlアダプターB、5μl 10×T4 DNAリガーゼ緩衝液、36μlヌクレアーゼ無含有水)中で、16℃で混合しながら一晩ライゲーションした。次いで、ビーズを1×B&W緩衝液(5mMトリス−HCl pH7.5、0.5mM EDTA、1M NaCl)で3回洗浄した。
本明細書で用いられる様々なポリヌクレオチドまたはプライマーが、下記で列挙されている:
3つのRICh−PETライブラリーデータセットを、HeLa S3細胞からの技術的および生物学的複製を用いて生成した。
ある。
RICh−PETデータの再現性を評価するため、2つの技術的複製(並行ライブラリー構築および配列決定分析のために2つの分割量(aliquots)に分けられた同じ細胞調製物)および2つの生物学的複製(わずかな修正を加えたほぼ同一の手順を用いてライブラリー構築における使用のために異なる時点で収集された異なる細胞調製物)を実施した。結果として得られた複製の結果は、真の再現性を示した(図3)。例えば、癌に関わっていることが知られている2つの十分に研究されたlncRNAであるNEAT1およびMALAT1は、3つのライブラリー全部において再現性よく検出された(データは示されていない)。
実施例4 RICh−PETデータの検証
得られたRICh−PETマッピングデータに基づいて、たとえこれらの2つのncRNAが同じ転写工場中で同時転写されているとしても、それらの相互作用特性は非常に異なることは、興味深い。具体的には、NEAT1のRNAは限定的にシス性であり、それ
が転写された場所にのみ結合している;一方で、MALAT1は大部分がトランス性で外向きであり、ゲノム中の多くの座位と相互作用している(図4A)。
RNAおよびDNAタグクラスターを、ヒトゲノムの遺伝子コードV14アノテーションに基づいて特性付けた。RNAタグクラスターの3%のみが、タンパク質をコードするエキソンと重複しており、RNAタグクラスターの大多数は、非コード領域にマッピングされ、その多くは以前に知られているncRNAである(172、24%)。残りは、タンパク質をコードするイントロン領域、アンチセンス、および遺伝子間領域に位置する新規のncRNAである可能性がある(図5A)。
(単集合PETを含む)MALAT1に結び付けられた全てのRICh−PETデータを用いて、出願人らは、全染色体および全ゲノムのMALAT1相互作用プロフィールを生成し、それは、MALAT1がゲノム中の大きな領域と相互作用している可能性を有することを示している(データは示されていない)。50より多い高信頼度相互作用(タグ計数が2以上のPETクラスター)の内で、約半分は既知の遺伝子のプロモーター中に位置しており、4分の1はイントロン領域中に位置している(図6A)。同じ細胞からのRNA−SeqおよびRNA Pol2 ChIP−seqデータは、それらのプロモーター中にMALAT1が存在する遺伝子は、それらのイントロン領域においてMALAT1と相互作用する遺伝子よりも有意に高い転写活性を有することを示した(図6B;データは示されていない)。MALAT1は、SRSF2を含むいくつかのスプライシング因子と相互作用することによりスプライシング機能の調節に関わっていることが報告されていた(Tripathi et al., 2011)。
最も十分に特性付けられているlncRNAは、XISTであり、それはX染色体の1コピーから転写され、X染色体のその他のコピー中の同じ部位に結合し(シス作用性)、さらに拡張して染色体全体を不活性化のために覆う(示されていない)。RICh−PETマッピングデータは、実際、XISTのRNAタグと対になったDNAタグがX染色体において非常に富んでおり、一方でバックグラウンドノイズはゲノム全体にわたって点在しており、これは、XISTが予想されたようにX染色体に特異的に結合していることを示している。
本明細書で示されたRICh−PETデータは、ncRNA相互作用ネットワークの複雑なシステムへの最初の一瞥(glimpse)を提供してきた。1つのncRNAがゲノムにおいて多数の標的を有し得るという古典的な見解(MALAT1)に加えて、ある座位がncRNAにより相互作用されることが分かり、そしてそこから相互作用するncRNAが別の座位とも相互作用することが検出された点で、多くの推定上のncRNA座位は“内および外”のRICh−PETデータを有することが分かっていた。
RICh−PET法を用いて、全体的なncRNA−ゲノムDNA相互作用を同定した。同定された相互作用の中で、1つのncRNA−結腸癌関連転写産物1−が特に興味深かった。
が正常な組織では過剰発現されておらず、それによりそれを可能性のある疾患特異的バイオマーカーにすることが最近発見された(Nissan et al., Int. J. Cancer, 130(7):1598-606, 2012; Alaiyan et al., BMC Cancer, 13:196, 2013)。
新規の複雑なモデルを明らかにした(データは示されていない)。加えて、CCAT1は、子宮頚癌細胞株HeLa細胞において高度に転写されている。
上記のRICh−PET法と実質的に同じRICh−PET法を用いて、出願人らは、RICh−PET法の一般的な適用可能性をさらに支持するため、ヒトBリンパ芽球様細胞GM12878およびショウジョウバエS2細胞から追加のデータを得た。
本発明は以下の態様を含む。
[態様1]以下:
(1)以下:
(i)第1ポリヌクレオチド、および
(ii)第2ポリヌクレオチド
を含むRNAリンカー、ここで、該第1および該第2ポリヌクレオチドは、第1ライゲーション適合末端および該第1ポリヌクレオチドの3’末端の3’オーバーハングにより隣接される第1二本鎖領域を形成しており、ここで、該3’オーバーハングは、ランダム配列プライマーを含む;ならびに
(2)以下:
(iii)第3ポリヌクレオチド、および
(iv)第4ポリヌクレオチド
を含むDNAリンカー、ここで、該第3および該第4ポリヌクレオチドは、平滑末端および第2ライゲーション適合末端により隣接される第2二本鎖領域を形成する;
を含むキットであって、該第1および該第2ライゲーション適合末端が、互いにライゲーションし、または互いにライゲーションするように適合可能である前記キット。
[態様2]該第1ライゲーション適合末端が、該第2ポリヌクレオチドの3’末端における3’オーバーハングであり、該第2ライゲーション適合末端が、該第3ポリヌクレオチドの3’末端における3’オーバーハングであり、両方の3’オーバーハングが、ライゲーションのために互いにアニーリングする、請求項1に記載のキット。
[態様3]該第1二本鎖領域が、該ランダム配列プライマーに対して3’側を切断する第1制限酵素(RE)に関する第1認識部位を含む、態様1に記載のキット。
[態様4]該第2二本鎖領域が、該第3ポリヌクレオチドに対して5’側を切断する第2制限酵素(RE)に関する第2認識部位を含む、態様1に記載のキット。
[態様5]前記の第1、第2、第3、および第4ポリヌクレオチドの1以上がDNAである、態様1に記載のキット。
[態様6]前記の第1、第2、第3、および第4ポリヌクレオチドの1以上が修飾ヌクレオチドを含む、態様1に記載のキット。
[態様7]前記の修飾ヌクレオチドがビオチン化T(チミジン)である、態様6に記載のキット。
[態様8]前記の第1ポリヌクレオチドが、複数のポリヌクレオチドを含み、それぞれがランダム配列プライマー領域においてのみ異なっている、態様1に記載のキット。
[態様9]前記の第1ポリヌクレオチドが、同一のランダム配列プライマーを有するポリヌクレオチドの均一な集団を含む、態様1に記載のキット。
[態様10]前記のランダム配列プライマーが、4個、5個、6個、7個、8個、またはより多くのヌクレオチドを含む、態様1に記載のキット。
[態様11]該第1二本鎖領域が、該RNAリンカーを該DNAリンカーと区別する独特の配列を含む、態様1に記載のキット。
[態様12]該第2二本鎖領域が、該RNAリンカーを該DNAリンカーと区別する独特の配列を含む、態様1に記載のキット。
[態様13]該第1認識部位の最後のヌクレオチドが、該ランダム配列プライマーに対して5’側の最後の塩基対合したヌクレオチドである、態様1に記載のキット。
[態様14]該第2認識部位の最後のヌクレオチドが、該平滑末端における塩基対合したヌクレオチドである、態様1に記載のキット。
[態様15]該第1および該第2制限酵素が同じである、態様1に記載のキット。
[態様16]該第1および該第2制限酵素が独立して以下:AarI、AceIII、AloI、BaeI、Bbr7I、BbvI、BbvII、BccI、Bce83I、BceAI、BcefI、BcgI、BciVI、BfiI、BinI、BplI、BsaXI、BscAI、BseMII、BseRI、BsgI、BsmI、BsmAI、BsmFI、Bsp24I、BspCNI、BspMI、BsrI、BsrDI、BstF5I、BtgZI、BtsI、CjeI、CjePI、EciI、Eco31I、Eco57I、Eco57MI、EcoP15I、Esp3I、FalI、FauI、FokI、GsuI、HaeIV、HgaI、Hin4I、HphI、HpyAV、Ksp632I、MboII、MlyI、MmeI、MnlI、PleI、PpiI、PsrI、RleAI、SapI、SfaNI、SspD5I、Sth132I、StsI、TaqII、TspDTI、TspGWI、TspRIまたはTth111IIから選択される、態様1に記載のキット。
[態様17]該第1および該第2制限酵素の切断部位が、該認識部位の最後のヌクレオチドに対して少なくとも約10、12、14、16、18、20ヌクレオチド、またはより多くのヌクレオチド3’側である、態様1に記載のキット。
[態様18]該第1および該第4ポリヌクレオチドが脱リン酸化されている、態様1に記載のキット。
[態様19]さらにタンパク質およびポリヌクレオチドを架橋する試薬を含む、態様1に記載のキット。
[態様20]該試薬がホルムアルデヒドを含む、態様19に記載のキット。
[態様21]さらにクロマチンの構成要素(例えばヒストン)に特異的にまたは選択的に結合する親和性試薬(例えば抗体またはモノクローナル抗体)を含む、態様1に記載のキット。
[態様22]さらに損傷した、または不適合な5’および/または3’突出末端を含有するDNAを、5’リン酸化された平滑末端DNAに変換する末端修復混合物を含む、態様1に記載のキット。
[態様23]さらにDNAリガーゼ(例えばT4リガーゼ)を含む、態様1に記載のキット。
[態様24]さらにタンパク質およびポリヌクレオチドの架橋を逆行させる試薬(例えばプロテイナーゼK)を含む、態様1に記載のキット。
[態様25]さらに該第1および/または該第2制限酵素(単数または複数)を含む、態様1に記載のキット。
[態様26]さらに平滑末端二本鎖DNAのPCR増幅のためのコンカテマー化アダプターの対を含む、態様1に記載のキット。
[態様27]さらにTaq DNAポリメラーゼを含む、態様1に記載のキット。
[態様28]さらに逆転写酵素を含む、態様1に記載のキット。
[態様29]態様1に記載の該第1および第2二本鎖領域を含む中央領域を含むペアエンドタグ(PET)ポリヌクレオチドであって、前記の中央領域が、以下:
(1)前記の第1二本鎖領域に対して近位の部位において、非コードRNA(ncRNA)の配列タグ;および
(2)前記の第2二本鎖領域に対して近位の部位において、ゲノムDNAの配列タグ;
により隣接されている、前記PETポリヌクレオチド。
[態様30]該非コードRNA(ncRNA)の配列タグが、前記の第1制限酵素による消化の結果もたらされる遊離末端を有する、態様29に記載のPETポリヌクレオチド。
[態様31]該非コードRNA(ncRNA)の配列タグが、該ncRNAが転写されるゲノム領域を独特に同定する、態様29に記載のPETポリヌクレオチド。
[態様32]該非コードRNA(ncRNA)の前記の配列タグが、約8〜30塩基対の長さである、態様29に記載のPETポリヌクレオチド。
[態様33]該ゲノムDNAの配列タグが、前記の第2制限酵素による消化の結果もたらされる遊離末端を有する、態様29に記載のPETポリヌクレオチド。
[態様34]該ゲノムDNAの配列タグが、該ゲノムDNAが位置しているゲノム領域を独特に同定する、態様29に記載のPETポリヌクレオチド。
[態様35]該ゲノムDNAの前記の配列タグが、約8〜30塩基対の長さである、態様29に記載のPETポリヌクレオチド。
[態様36]態様29に記載のPETポリヌクレオチドの2以上のメンバーを含むペアエンドタグ(PET)ライブラリーであって、該PETライブラリーのそれぞれのメンバーが、同じ前記の中央領域、および態様29に記載の非コードRNA(ncRNA)の異なる前記の配列タグまたは態様29に記載のゲノムDNAの異なる前記の配列タグまたは両方を含む前記PETライブラリー。
[態様37]態様29に記載のPETポリヌクレオチドを含むベクター。
[態様38]複数のコンカテマー化された態様29に記載のPETポリヌクレオチドを含む、態様37に記載のベクター。
[態様39]2以上の態様29に記載のPETポリヌクレオチドのコンカテマー。
[態様40]ゲノムの非コードRNA(ncRNA)に関するゲノム内の機能的相互作用座位を同定する方法であって、該方法が以下の工程:
(1)架橋されたゲノムDNA断片および架橋されたncRNAを含むクロマチン断片を提供し;
(2)態様1に記載のRNAリンカーおよびDNAリンカーを用いて、架橋されたゲノムDNA断片の末端を架橋されたncRNAのcDNAの末端に近接ライゲーションに関する条件下でライゲーションし、ここで該架橋されたゲノムDNA断片の前記の末端は該DNAリンカーにライゲーションされ、該架橋されたncRNAのcDNAの前記の末端は該RNAリンカーを含み;
(3)態様29に記載のPETポリヌクレオチドを配列決定分析のために単離し;そして、
(4)それぞれの前記のPETポリヌクレオチド内の該ゲノムDNAの配列タグおよび該ncRNAの配列タグを、参照ゲノムに対してマッピングし、
それにより該参照ゲノムの前記の非コードRNA(ncRNA)に関する該参照ゲノム内の機能的相互作用座位を同定する;
を含む、前記方法。
[態様41]該ncRNAおよび該ゲノムDNAが、生きた細胞中でホルムアルデヒドに媒介される架橋により架橋される、態様40に記載の方法。
[態様42]クロマチン断片が超音波処理により生成される、態様40に記載の方法。
[態様43]該架橋されたncRNAのcDNAが、該RNAリンカーのランダム配列プライマーおよび該ncRNA鋳型から逆転写された第1鎖cDNAを含む、態様40に記載の方法。
[態様44]第2鎖cDNA合成が、近接ライゲーションの後であるが工程(3)の前に実施される、態様40に記載の方法。
[態様45]さらに工程(2)の前に該架橋されたゲノムDNA断片の末端を修復して5’リン酸化された平滑末端DNAにすることを含む、態様40に記載の方法。
[態様46]該DNAリンカーの第3ポリヌクレオチドが脱リン酸化されており、該DNAリンカーが自己ライゲーションしない、態様40に記載の方法。
[態様47]さらに該ゲノムDNAの重複している配列タグおよび該ncRNAの重複している配列タグを有する2以上のPETポリヌクレオチドのクラスターを同定することを含む、態様40に記載の方法。
[態様48]さらにrRNAの配列タグを含むPETポリヌクレオチドを除外することを含む、態様47に記載の方法。
[態様49]さらに工程(2)の前にクロマチン断片の部分集合を単離または富化することを含む、態様40に記載の方法。
[態様50]該クロマチン断片の部分集合が、該クロマチン断片の部分集合のタンパク質構成要素に特異的な抗体を用いた免疫沈降により単離または富化される、態様49に記載の方法。
[態様51]該タンパク質構成要素がヒストン、転写因子、ポリコーム群(PcG)ファミリータンパク質;組み換えに関わる因子;クロマチンインスレーターもしくはクロマチンウェーバー;メチルCpG結合タンパク質;またはRNA結合タンパク質である、態様50に記載の方法。
Claims (51)
- 以下:
(1)以下:
(i)第1ポリヌクレオチド、および
(ii)第2ポリヌクレオチド
を含むRNAリンカー、ここで、該第1および該第2ポリヌクレオチドは、第1ライゲーション適合末端および該第1ポリヌクレオチドの3’末端の3’オーバーハングにより隣接される第1二本鎖領域を形成しており、ここで、該3’オーバーハングは、ランダム配列プライマーを含む;ならびに
(2)以下:
(iii)第3ポリヌクレオチド、および
(iv)第4ポリヌクレオチド
を含むDNAリンカー、ここで、該第3および該第4ポリヌクレオチドは、平滑末端および第2ライゲーション適合末端により隣接される第2二本鎖領域を形成する;
を含むキットであって、該第1および該第2ライゲーション適合末端が、互いにライゲーションし、または互いにライゲーションするように適合可能である前記キット。 - 該第1ライゲーション適合末端が、該第2ポリヌクレオチドの3’末端における3’オーバーハングであり、該第2ライゲーション適合末端が、該第3ポリヌクレオチドの3’末端における3’オーバーハングであり、両方の3’オーバーハングが、ライゲーションのために互いにアニーリングする、請求項1に記載のキット。
- 該第1二本鎖領域が、該ランダム配列プライマーに対して3’側を切断する第1制限酵素(RE)に関する第1認識部位を含む、請求項1に記載のキット。
- 該第2二本鎖領域が、該第3ポリヌクレオチドに対して5’側を切断する第2制限酵素(RE)に関する第2認識部位を含む、請求項1に記載のキット。
- 前記の第1、第2、第3、および第4ポリヌクレオチドの1以上がDNAである、請求項1に記載のキット。
- 前記の第1、第2、第3、および第4ポリヌクレオチドの1以上が修飾ヌクレオチドを含む、請求項1に記載のキット。
- 前記の修飾ヌクレオチドがビオチン化T(チミジン)である、請求項6に記載のキット。
- 前記の第1ポリヌクレオチドが、複数のポリヌクレオチドを含み、それぞれがランダム配列プライマー領域においてのみ異なっている、請求項1に記載のキット。
- 前記の第1ポリヌクレオチドが、同一のランダム配列プライマーを有するポリヌクレオチドの均一な集団を含む、請求項1に記載のキット。
- 前記のランダム配列プライマーが、4個、5個、6個、7個、8個、またはより多くのヌクレオチドを含む、請求項1に記載のキット。
- 該第1二本鎖領域が、該RNAリンカーを該DNAリンカーと区別する独特の配列を含む、請求項1に記載のキット。
- 該第2二本鎖領域が、該RNAリンカーを該DNAリンカーと区別する独特の配列を含む、請求項1に記載のキット。
- 該第1認識部位の最後のヌクレオチドが、該ランダム配列プライマーに対して5’側の最後の塩基対合したヌクレオチドである、請求項1に記載のキット。
- 該第2認識部位の最後のヌクレオチドが、該平滑末端における塩基対合したヌクレオチドである、請求項1に記載のキット。
- 該第1および該第2制限酵素が同じである、請求項1に記載のキット。
- 該第1および該第2制限酵素が独立して以下:AarI、AceIII、AloI、BaeI、Bbr7I、BbvI、BbvII、BccI、Bce83I、BceAI、BcefI、BcgI、BciVI、BfiI、BinI、BplI、BsaXI、BscAI、BseMII、BseRI、BsgI、BsmI、BsmAI、BsmFI、Bsp24I、BspCNI、BspMI、BsrI、BsrDI、BstF5I、BtgZI、BtsI、CjeI、CjePI、EciI、Eco31I、Eco57I、Eco57MI、EcoP15I、Esp3I、FalI、FauI、FokI、GsuI、HaeIV、HgaI、Hin4I、HphI、HpyAV、Ksp632I、MboII、MlyI、MmeI、MnlI、PleI、PpiI、PsrI、RleAI、SapI、SfaNI、SspD5I、Sth132I、StsI、TaqII、TspDTI、TspGWI、TspRIまたはTth111IIから選択される、請求項1に記載のキット。
- 該第1および該第2制限酵素の切断部位が、該認識部位の最後のヌクレオチドに対して少なくとも約10、12、14、16、18、20ヌクレオチド、またはより多くのヌクレオチド3’側である、請求項1に記載のキット。
- 該第1および該第4ポリヌクレオチドが脱リン酸化されている、請求項1に記載のキット。
- さらにタンパク質およびポリヌクレオチドを架橋する試薬を含む、請求項1に記載のキット。
- 該試薬がホルムアルデヒドを含む、請求項19に記載のキット。
- さらにクロマチンの構成要素(例えばヒストン)に特異的にまたは選択的に結合する親和性試薬(例えば抗体またはモノクローナル抗体)を含む、請求項1に記載のキット。
- さらに損傷した、または不適合な5’および/または3’突出末端を含有するDNAを、5’リン酸化された平滑末端DNAに変換する末端修復混合物を含む、請求項1に記載のキット。
- さらにDNAリガーゼ(例えばT4リガーゼ)を含む、請求項1に記載のキット。
- さらにタンパク質およびポリヌクレオチドの架橋を逆行させる試薬(例えばプロテイナーゼK)を含む、請求項1に記載のキット。
- さらに該第1および/または該第2制限酵素(単数または複数)を含む、請求項1に記載のキット。
- さらに平滑末端二本鎖DNAのPCR増幅のためのコンカテマー化アダプターの対を含む、請求項1に記載のキット。
- さらにTaq DNAポリメラーゼを含む、請求項1に記載のキット。
- さらに逆転写酵素を含む、請求項1に記載のキット。
- 請求項1に記載の該第1および第2二本鎖領域を含む中央領域を含むペアエンドタグ(PET)ポリヌクレオチドであって、前記の中央領域が、以下:
(1)前記の第1二本鎖領域に対して近位の部位において、非コードRNA(ncRNA)の配列タグ;および
(2)前記の第2二本鎖領域に対して近位の部位において、ゲノムDNAの配列タグ;により隣接されている、前記PETポリヌクレオチド。 - 該非コードRNA(ncRNA)の配列タグが、前記の第1制限酵素による消化の結果もたらされる遊離末端を有する、請求項29に記載のPETポリヌクレオチド。
- 該非コードRNA(ncRNA)の配列タグが、該ncRNAが転写されるゲノム領域を独特に同定する、請求項29に記載のPETポリヌクレオチド。
- 該非コードRNA(ncRNA)の前記の配列タグが、約8〜30塩基対の長さである、請求項29に記載のPETポリヌクレオチド。
- 該ゲノムDNAの配列タグが、前記の第2制限酵素による消化の結果もたらされる遊離末端を有する、請求項29に記載のPETポリヌクレオチド。
- 該ゲノムDNAの配列タグが、該ゲノムDNAが位置しているゲノム領域を独特に同定する、請求項29に記載のPETポリヌクレオチド。
- 該ゲノムDNAの前記の配列タグが、約8〜30塩基対の長さである、請求項29に記載のPETポリヌクレオチド。
- 請求項29に記載のPETポリヌクレオチドの2以上のメンバーを含むペアエンドタグ(PET)ライブラリーであって、該PETライブラリーのそれぞれのメンバーが、同じ前記の中央領域、および請求項29に記載の非コードRNA(ncRNA)の異なる前記の配列タグまたは請求項29に記載のゲノムDNAの異なる前記の配列タグまたは両方を含む前記PETライブラリー。
- 請求項29に記載のPETポリヌクレオチドを含むベクター。
- 複数のコンカテマー化された請求項29に記載のPETポリヌクレオチドを含む、請求項37に記載のベクター。
- 2以上の請求項29に記載のPETポリヌクレオチドのコンカテマー。
- ゲノムの非コードRNA(ncRNA)に関するゲノム内の機能的相互作用座位を同定する方法であって、該方法が以下の工程:
(1)架橋されたゲノムDNA断片および架橋されたncRNAを含むクロマチン断片を提供し;
(2)請求項1に記載のRNAリンカーおよびDNAリンカーを用いて、架橋されたゲノムDNA断片の末端を架橋されたncRNAのcDNAの末端に近接ライゲーションに関する条件下でライゲーションし、ここで該架橋されたゲノムDNA断片の前記の末端は該DNAリンカーにライゲーションされ、該架橋されたncRNAのcDNAの前記の末端は該RNAリンカーを含み;
(3)請求項29に記載のPETポリヌクレオチドを配列決定分析のために単離し;そして、
(4)それぞれの前記のPETポリヌクレオチド内の該ゲノムDNAの配列タグおよび該ncRNAの配列タグを、参照ゲノムに対してマッピングし、
それにより該参照ゲノムの前記の非コードRNA(ncRNA)に関する該参照ゲノム内の機能的相互作用座位を同定する;
を含む、前記方法。 - 該ncRNAおよび該ゲノムDNAが、生きた細胞中でホルムアルデヒドに媒介される架橋により架橋される、請求項40に記載の方法。
- クロマチン断片が超音波処理により生成される、請求項40に記載の方法。
- 該架橋されたncRNAのcDNAが、該RNAリンカーのランダム配列プライマーおよび該ncRNA鋳型から逆転写された第1鎖cDNAを含む、請求項40に記載の方法。
- 第2鎖cDNA合成が、近接ライゲーションの後であるが工程(3)の前に実施される、請求項40に記載の方法。
- さらに工程(2)の前に該架橋されたゲノムDNA断片の末端を修復して5’リン酸化された平滑末端DNAにすることを含む、請求項40に記載の方法。
- 該DNAリンカーの第3ポリヌクレオチドが脱リン酸化されており、該DNAリンカーが自己ライゲーションしない、請求項40に記載の方法。
- さらに該ゲノムDNAの重複している配列タグおよび該ncRNAの重複している配列タグを有する2以上のPETポリヌクレオチドのクラスターを同定することを含む、請求項40に記載の方法。
- さらにrRNAの配列タグを含むPETポリヌクレオチドを除外することを含む、請求項47に記載の方法。
- さらに工程(2)の前にクロマチン断片の部分集合を単離または富化することを含む、請求項40に記載の方法。
- 該クロマチン断片の部分集合が、該クロマチン断片の部分集合のタンパク質構成要素に特異的な抗体を用いた免疫沈降により単離または富化される、請求項49に記載の方法。
- 該タンパク質構成要素がヒストン、転写因子、ポリコーム群(PcG)ファミリータンパク質;組み換えに関わる因子;クロマチンインスレーターもしくはクロマチンウェーバー;メチルCpG結合タンパク質;またはRNA結合タンパク質である、請求項50に記載の方法。
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