JP2020034538A - Method of detecting fatty liver disease, or predicting risk thereof, diagnostic kit and biomarker for detecting fatty liver disease, and method and biomarker for determining progression of liver fibrosis in subject - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法に関する。また、本発明は、脂肪性肝疾患のバイオマーカー及び診断薬キットに関する。また、本発明は、対象の肝線維化の進行度の判定方法、及び対象の肝線維化の進行度を判定するためのバイオマーカーにも関する。 The present invention relates to a method for detecting or predicting the risk of fatty liver disease. The present invention also relates to a biomarker and a diagnostic kit for fatty liver disease. The present invention also relates to a method for determining the degree of progression of liver fibrosis in a subject, and a biomarker for determining the degree of progression of liver fibrosis in a subject.
非アルコール性脂肪性肝疾患（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ；ＮＡＦＬＤ）はアルコールを原因としない脂肪肝の総称である。ＮＡＦＬＤは、肝硬変や肝癌の発症母地にもなる非アルコール性脂肪肝炎（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ；ＮＡＳＨ）と、病態がほとんど進行しない非アルコール性脂肪肝（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ；ＮＡＦＬ）とに分類される。ＮＡＦＬＤ及びＮＡＳＨは、近年日本国内及び外国において急激に注目を集めている脂肪性肝疾患である。日本国内においては、約１０００万人がＮＡＦＬＤに、そして約１００万〜２００万人がＮＡＳＨに罹患していると推定される。なお、本明細書においては、用語「ＮＡＳＨ」は、ＮＡＳＨが進行した肝硬変、及びＮＡＳＨが進行した肝細胞癌を含むものとする。 Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a general term for fatty liver that does not cause alcohol. NAFLD is classified into nonalcoholic steatohepatitis (NASH), which also becomes a home of cirrhosis and liver cancer, and nonalcoholic fatty liver (NAFL), whose disease state hardly progresses. NAFLD and NASH are fatty liver diseases that have received a great deal of attention in Japan and overseas in recent years. In Japan, it is estimated that about 10 million people have NAFLD and about 1 to 2 million have NASH. In this specification, the term “NASH” includes cirrhosis in which NASH has progressed and hepatocellular carcinoma in which NASH has progressed.
ＮＡＳＨの確定診断には、肝組織の生検が必須とされている。肝組織の生検により、脂肪量、炎症の程度、及び／又は線維化の進行程度を把握し、ＮＡＳＨを診断することが可能となる。しかしながら、肝組織の生検は、肝臓に針を刺して組織や細胞を一部採取することを含むものであり、患者及び医療従事者に過度の負担を強いるものであると共に、合併症等のリスクを伴うものである。したがって、より簡易的に実施することができ、さらに患者及び医療従事者に負担をかけない、ＮＡＳＨを初めとする脂肪性肝疾患の新たな診断法の開発が望まれている。 For definitive diagnosis of NASH, biopsy of liver tissue is essential. The biopsy of liver tissue makes it possible to grasp the amount of fat, the degree of inflammation, and / or the degree of progression of fibrosis, and to diagnose NASH. However, a biopsy of liver tissue involves puncturing the liver with a needle to collect a portion of the tissue or cells, which places an excessive burden on the patient and healthcare professionals, and also involves complications. It involves risks. Therefore, there is a demand for the development of a new diagnostic method for fatty liver diseases such as NASH, which can be performed more easily and does not burden patients and medical staff.
アシルカルニチンは、生体内において脂肪酸がミトコンドリア内膜へ運搬される場合に、脂肪酸とカルニチンが結合して生成される化合物である。より詳細には、ミトコンドリア外膜に存在するカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩ（ＣＰＴＩ）の作用によりアシルＣｏＡとカルニチンからアシルカルニチンが生成される。またアシルカルニチンはミトコンドリア内膜に入った後に、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩ（ＣＰＴＩＩ）によって再びカルニチンとアシルＣｏＡに分かれ、アシルＣｏＡがβ酸化を受けエネルギー産生に利用される。これらの代謝経路の異常により組織中・血液中アシルカルニチン濃度が変動し、血液及び尿などの生体試料中のアシルカルニチン分析は、新生児を対象とした先天性代謝異常スクリーニングにおいて分析項目とされている。 Acylcarnitine is a compound formed by combining a fatty acid and carnitine when a fatty acid is transported to the inner mitochondrial membrane in a living body. More specifically, acylcarnitine is produced from acyl-CoA and carnitine by the action of carnitine palmitoyltransferase I (CPTI) present in the outer mitochondrial membrane. Also, after the acylcarnitine enters the inner mitochondrial membrane, it is again separated into carnitine and acyl-CoA by carnitine palmitoyltransferase I (CPTII), and the acyl-CoA undergoes β oxidation to be used for energy production. Acylcarnitine concentrations in tissues and blood fluctuate due to abnormalities in these metabolic pathways, and acylcarnitine analysis in biological samples such as blood and urine is an analysis item in the screening of congenital metabolic disorders for neonates .
非特許文献１は、肝細胞癌組織と非癌組織との間でメタボローム解析を行ったところオレオイルカルニチンとパルミトイルカルニチンが、肝細胞癌組織において、非癌組織と比較して多く検出されたことを開示する。非特許文献２は、肝細胞癌に罹患する患者では、健常対象と比較して、血清中のアシルカルニチンレベルが高かったことを開示している。しかしながら、これらの報告において用いられた肝細胞癌組織は、脂肪性肝疾患由来のものではない。より具体的には、これらの報告において用いられた肝細胞癌組織は、ＮＡＳＨが進行して癌化したものではなく、したがって、脂肪性肝疾患とアシルカルニチンレベルとの関連性は依然として不明である。加えて、肝細胞癌が他の組織の代謝機構を変化させることにより、アシルカルニチンが肝臓とは異なる他の組織からも放出される可能性も否定できない。
本発明の目的は、より簡易的に実施することができ、さらに患者及び医療従事者に負担をかけない脂肪性肝疾患の新たな診断法を提供することである。本発明の他の目的は、脂肪性肝疾患に罹患している可能性のある対象における、患者及び医療従事者に負担をかけない新たな肝線維化の進行度の判定方法を提供することである。 An object of the present invention is to provide a new method for diagnosing fatty liver disease which can be carried out more easily and does not burden patients and medical staff. Another object of the present invention is to provide a new method for determining the degree of progression of hepatic fibrosis in a subject who may be suffering from fatty liver disease without placing a burden on patients and healthcare professionals. is there.
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、体液試料、例えば血清中の特定の長鎖アシルカルニチン量を測定し、基準値と比較することで、患者及び医療従事者に負担をかけず簡易的に脂肪性肝疾患の早期診断が可能であること及び肝線維化の進行度の判定が可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
具体的に、本発明は以下のとおりである。
＜１＞対象からの体液試料中の、オクタデセノイルカルニチン、テトラデセノイルカルニチン、テトラデカノイルカルニチン、ヘキサデカノイルカルニチン、オクタデカノイルカルニチン、及びオクタデカジエノイルカルニチンからなる群から選択される長鎖アシルカルニチンのいずれか１つ以上の量を測定することと
測定した前記長鎖アシルカルニチンのいずれか１つ以上の量を基準値と比較することと
を含む、前記対象における脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法、
＜２＞ 前記体液試料が、血液、血清又は血漿である、＜１＞に記載の脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法、
＜３＞ 前記脂肪性肝疾患が、ＮＡＳＨである、＜１＞又は＜２＞に記載の脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法、
＜４＞ 肝臓における線維化の進行度を判断する、＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載の脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法、
＜５＞ アシル基の炭素数が２〜１０である中短鎖アシルカルニチンのいずれか１つ以上の量を測定することと
測定した中短鎖アシルカルニチンのいずれか１つ以上の量を基準値と比較することと
をさらに含む、＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載の脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法、
＜６＞ 前記中短鎖アシルカルニチンが、イソ吉草酸カルニチンである、＜５＞に記載の脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法、
＜７＞対象における脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法であって、以下の計算式を用いて、指標スコアを計算することと：
［式１］
ＡＣ１４：１＋ＡＣ１８：１−ＡＣ５：０
（式中、ＡＣ１４：１は、対象からの体液試料中のテトラデセノイルカルニチンの量を示し、ＡＣ１８：１は、対象からの体液試料中のオクタデセノイルカルニチンの量を示し、そして、ＡＣ５：０は、対象からの体液試料中のイソ吉草酸カルニチンの量を示す）
計算した前記指標スコアを基準値と比較することと
を含む、前記方法、
＜８＞ 対象における脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法であって、以下の計算式を用いて、指標スコアを計算することと：
［式２］
（ＡＣ１６：０＋ＡＣ１８：１）×１００／ＡＣ２：０
（式中、ＡＣ１６：０は、対象からの体液試料中のヘキサデカノイルカルニチンの量を示し、ＡＣ１８：１は、対象からの体液試料中のオクタデセノイルカルニチンの量を示し、そしてＡＣ２：０は、対象からの体液試料中のアセチルカルニチンの量を示す）
計算した前記指標スコアを基準値と比較することと
を含む、前記方法、
＜９＞ 前記体液試料が、血液、血清又は血漿であり、前記脂肪性肝疾患が、ＮＡＳＨが進行した肝細胞癌である、＜８＞に記載の脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法、
＜１０＞ 脂肪性肝疾患を診断するための体液中のバイオマーカーであって、
オクタデセノイルカルニチン、テトラデセノイルカルニチン、テトラデカノイルカルニチン、ヘキサデカノイルカルニチン、オクタデカノイルカルニチン、及びオクタデカジエノイルカルニチンからなる群から選択されることを特徴とする、前記バイオマーカー、
＜１１＞ 前記体液試料が、血液、血清又は血漿である、＜１０＞に記載のバイオマーカー、
＜１２＞ 前記脂肪性肝疾患が、ＮＡＳＨである、＜１０＞又は＜１１＞に記載のバイオマーカー、
＜１３＞ 肝臓における線維化の進行度を判断する、＜１０＞〜＜１２＞のいずれかに記載のバイオマーカー、
＜１４＞脂肪性肝疾患を検出するための診断薬キットであって、オクタデセノイルカルニチン、テトラデセノイルカルニチン、テトラデカノイルカルニチン、ヘキサデカノイルカルニチン、オクタデカノイルカルニチン、及びオクタデカジエノイルカルニチンからなる群から選択される長鎖アシルカルニチンのいずれか１つ以上の量を測定する試薬を含む診断薬キット、
＜１５＞ 脂肪性肝疾患に罹患している可能性のある対象からの体液試料中の、オクタデセノイルカルニチン、テトラデセノイルカルニチン、テトラデカノイルカルニチン、ヘキサデカノイルカルニチン、オクタデカノイルカルニチン、及びオクタデカジエノイルカルニチンからなる群から選択される長鎖アシルカルニチンのいずれか１つ以上の量を測定すること
測定した長鎖アシルカルニチンのいずれか１つ以上の量を基準値と比較すること
を含む、前記対象における肝線維化の進行度の判定方法、
＜１６＞ 前記体液試料が、血液、血清又は血漿である、＜１５＞に記載の対象における肝線維化の進行度の判定方法、
＜１７＞ アシル基の炭素数が２〜１０である中短鎖アシルカルニチンのいずれか１つ以上の量を測定することと
測定した中短鎖アシルカルニチンのいずれか１つ以上の量を基準値と比較すること
をさらに含む、＜１５＞又は＜１６＞に記載の対象における肝線維化の進行度の判定方法、
＜１８＞ 前記中短鎖アシルカルニチンが、イソ吉草酸カルニチンである、＜１７＞に記載の対象における肝線維化の進行度の判定方法、
＜１９＞脂肪性肝疾患に罹患している可能性のある対象における肝線維化の進行度の判定方法であって、以下の計算式を用いて、指標スコアを計算することと
［式１］
ＡＣ１４：１＋ＡＣ１８：１−ＡＣ５：０
（式中、ＡＣ１４：１は、対象からの体液試料中のテトラデセノイルカルニチンの量を示し、ＡＣ１８：１は、対象からの体液試料中のオクタデセノイルカルニチンの量を示し、そして、ＡＣ５：０は、対象からの体液試料中のイソ吉草酸カルニチンの量を示す）
計算した前記指標スコアを基準値と比較することと
を含む、前記方法、並びに
＜２０＞ 脂肪性肝疾患に罹患している可能性のある対象における、肝線維化の進行度を判定するための体液中のバイオマーカーであって、
オクタデセノイルカルニチン、テトラデセノイルカルニチン、テトラデカノイルカルニチン、ヘキサデカノイルカルニチン、オクタデカノイルカルニチン、及びオクタデカジエノイルカルニチンからなる群から選択されることを特徴とする、前記バイオマーカー。
The present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, by measuring the amount of a specific long-chain acylcarnitine in a body fluid sample, for example, serum, and comparing the measured amount with a reference value, a burden is imposed on patients and medical staff. The present inventors have found that early diagnosis of fatty liver disease is possible and that the degree of progression of hepatic fibrosis can be determined simply and without difficulty, thereby completing the present invention.
Specifically, the present invention is as follows.
<1> selected from the group consisting of octadecenoylcarnitine, tetradecenoylcarnitine, tetradecanoylcarnitine, hexadecanoylcarnitine, octadecanoylcarnitine, and octadecadienoylcarnitine in a body fluid sample from a subject. Measuring the amount of any one or more of the long-chain acylcarnitines, and comparing the measured amount of any one or more of the long-chain acylcarnitines with a reference value. A method for detecting a disease or predicting a risk,
<2> The method for detecting or predicting risk of fatty liver disease according to <1>, wherein the body fluid sample is blood, serum or plasma,
<3> the method for detecting or predicting a risk of fatty liver disease according to <1> or <2>, wherein the fatty liver disease is NASH;
<4> The method for detecting or predicting a risk of fatty liver disease according to any one of <1> to <3>, wherein the degree of progression of fibrosis in the liver is determined.
<5> measuring the amount of any one or more of the medium- and short-chain acylcarnitines having 2 to 10 carbon atoms in the acyl group, and using the measured amount of any one or more of the medium- and short-chain acylcarnitines as a reference value And a method for detecting or predicting a risk of fatty liver disease according to any one of <1> to <4>,
<6> The method for detecting or predicting a risk of fatty liver disease according to <5>, wherein the medium-and-short-chain acylcarnitine is carnitine isovalerate.
<7> A method for detecting or predicting the risk of fatty liver disease in a subject, comprising calculating an index score using the following formula:
[Equation 1]
AC14: 1 + AC18: 1-AC5: 0
Wherein AC14: 1 indicates the amount of tetradecenoylcarnitine in the body fluid sample from the subject, AC18: 1 indicates the amount of octadecenoylcarnitine in the body fluid sample from the subject, and AC5: 0 indicates the amount of carnitine isovalerate in a body fluid sample from the subject)
Comparing the calculated index score to a reference value,
<8> A method for detecting or predicting the risk of fatty liver disease in a subject, comprising calculating an index score using the following formula:
[Equation 2]
(AC16: 0 + AC18: 1) × 100 / AC2: 0
Wherein AC16: 0 indicates the amount of hexadecanoylcarnitine in the body fluid sample from the subject, AC18: 1 indicates the amount of octadecenoylcarnitine in the body fluid sample from the subject, and AC2: 0 indicates the amount of acetylcarnitine in a body fluid sample from the subject)
Comparing the calculated index score to a reference value,
<9> The method for detecting or predicting a risk of fatty liver disease according to <8>, wherein the body fluid sample is blood, serum or plasma, and the fatty liver disease is hepatocellular carcinoma with advanced NASH. ,
<10> A biomarker in a body fluid for diagnosing fatty liver disease,
Octadecenoylcarnitine, tetradecenoylcarnitine, tetradecanoylcarnitine, hexadecanoylcarnitine, octadecanoylcarnitine, and octadecadienoylcarnitine, wherein the biomarker,
<11> The biomarker according to <10>, wherein the body fluid sample is blood, serum, or plasma.
<12> the biomarker according to <10> or <11>, wherein the fatty liver disease is NASH;
<13> The biomarker according to any one of <10> to <12>, wherein the degree of progression of fibrosis in the liver is determined.
<14> A diagnostic kit for detecting fatty liver disease, comprising octadecenoylcarnitine, tetradecenoylcarnitine, tetradecanoylcarnitine, hexadecanoylcarnitine, octadecanoylcarnitine, and octadecadie. A diagnostic reagent kit comprising a reagent for measuring the amount of any one or more of long-chain acylcarnitines selected from the group consisting of Noylcarnitine,
<15> Octadecenoylcarnitine, tetradecenoylcarnitine, tetradecanoylcarnitine, hexadecanoylcarnitine, octadecanoylcarnitine in a body fluid sample from a subject possibly suffering from fatty liver disease And measuring the amount of any one or more of the long-chain acylcarnitines selected from the group consisting of octadecadienoylcarnitine, and comparing the measured amount of any one or more of the long-chain acylcarnitines with a reference value. Including, a method for determining the degree of progression of liver fibrosis in the subject,
<16> The method according to <15>, wherein the body fluid sample is blood, serum or plasma,
<17> Measuring the amount of any one or more of the medium- and short-chain acylcarnitines having 2 to 10 carbon atoms in the acyl group, and determining the amount of any one or more of the measured medium- and short-chain acylcarnitines as a reference value A method for determining the degree of progression of liver fibrosis in the subject according to <15> or <16>, further comprising comparing with
<18> The method according to <17>, wherein the medium-short-chain acylcarnitine is carnitine isovalerate,
<19> A method for determining the degree of progression of hepatic fibrosis in a subject who may be suffering from fatty liver disease, wherein an index score is calculated using the following formula, and [Expression 1]
AC14: 1 + AC18: 1-AC5: 0
Wherein AC14: 1 indicates the amount of tetradecenoylcarnitine in the body fluid sample from the subject, AC18: 1 indicates the amount of octadecenoylcarnitine in the body fluid sample from the subject, and AC5: 0 indicates the amount of carnitine isovalerate in a body fluid sample from the subject)
Comparing the calculated index score with a reference value, and <20> for determining the degree of progression of liver fibrosis in a subject who may be suffering from fatty liver disease. A biomarker in a body fluid,
The biomarker, wherein the biomarker is selected from the group consisting of octadecenoylcarnitine, tetradecenoylcarnitine, tetradecanoylcarnitine, hexadecanoylcarnitine, octadecanoylcarnitine, and octadecadienoylcarnitine.
本発明によれば、患者及び医療従事者に負担をかけず且つ簡易的に脂肪性肝疾患の診断を行うことができる。本発明によれば、対象の脂肪性肝疾患が、脂肪性肝疾患由来の肝細胞癌に進行する前に、脂肪性肝疾患、例えば、ＮＡＳＨを検出することができる。本発明によれば、患者及び医療従事者に負担をかけず且つ簡易的に、対象における肝線維化の進行度の判定を行うことができる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, a diagnosis of a fatty liver disease can be performed easily, without burdening a patient and a medical worker. According to the present invention, fatty liver disease, for example, NASH, can be detected before the subject's fatty liver disease progresses to hepatocellular carcinoma derived from fatty liver disease. Advantageous Effects of Invention According to the present invention, it is possible to easily determine the degree of progression of liver fibrosis in a subject without burdening a patient and a medical worker.
［１］脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法
（対象からの体液試料）
本発明において分析可能な体液試料としては、主に生体（生物）由来の体液を挙げることができる。本発明において分析可能な体液試料は、より好ましくは、血液、血清、血漿、尿、唾液、喀痰、涙液、耳漏、又は前立腺液であり、さらに好ましくは血液、血清又は血漿であり、さらに好ましくは脂肪性肝疾患（例えば、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨ）に罹患している疑いのある対象の血液、血清又は血漿である。生体又は対象は、ヒト又は動物（例えば、マウス、モルモット、ラット、サル、イヌ、ネコ、ハムスター、ウマ、ウシ、及びブタ）を含み、好ましくはヒトである。
[1] Method for detecting fatty acid or predicting risk (body fluid sample from subject)
Examples of the body fluid sample that can be analyzed in the present invention include a body fluid mainly derived from a living body (organism). The body fluid sample that can be analyzed in the present invention is more preferably blood, serum, plasma, urine, saliva, sputum, tears, otorrhea, or prostate fluid, still more preferably blood, serum or plasma, and further more preferably Is the blood, serum or plasma of a subject suspected of having a fatty liver disease (eg, NAFLD or NASH). The living body or subject includes a human or an animal (eg, mouse, guinea pig, rat, monkey, dog, cat, hamster, horse, cow, and pig), and is preferably a human.
（アシルカルニチン）
本発明において、アシルカルニチンとは、式１で表される化合物群をいう。
式１：（ＣＨ３）３Ｎ+ＣＨ２ＣＨ（ＯＲ１）ＣＨ２ＣＯＯ-
（式１中、Ｒ１は炭素数２〜３０の飽和もしくは不飽和の脂肪酸残基を表し、該脂肪酸残基に結合する水素原子は、酸素原子又はヒドロキシ基で置換されていてもよい。）
(Acylcarnitine)
In the present invention, acylcarnitine refers to a group of compounds represented by
Formula 1: (CH 3 ) 3 N + CH 2 CH (OR 1 ) CH 2 COO −
(In the
アシルカルニチンは、その脂肪酸部分の炭素鎖長、不飽和結合の有無と数、炭素鎖に結合する水素原子の酸素原子又はヒドロキシ基への置換などにより、アセチルカルニチン、プロピオニルカルニチン、ステアロイルカルニチン、オレイルカルニチン、リノレイルカルニチン、マロニルカルニチン、３−ヒドロキシカルニチンなどに細分化されるが、本明細書中においては、それらを総称してアシルカルニチンと記述する。本明細書においては脂肪酸が結合していない遊離カルニチンについては、アシルカルニチンに含めないものとする。 Acylcarnitine can be acetylcarnitine, propionylcarnitine, stearoylcarnitine, oleylcarnitine, or the like, depending on the carbon chain length of the fatty acid portion, the presence and number of unsaturated bonds, the number of unsaturated bonds, the replacement of hydrogen atoms bonded to carbon chains with oxygen atoms or hydroxy groups, and the like. , Linoleyl carnitine, malonyl carnitine, 3-hydroxy carnitine, etc., and they are collectively referred to as acyl carnitine in the present specification. In the present specification, free carnitine to which no fatty acid is bound is not included in acylcarnitine.
飽和又は不飽和の脂肪酸残基としては、表１に記載のものが挙げられる。アシルカルニチンは、脂肪酸代謝異常等の先天性代謝異常スクリーニングにおいても評価項目として使用されている。先天性代謝異常スクリーニングなど臨床での評価項目に使用される主なアシルカルニチンを表２に示す。 The saturated or unsaturated fatty acid residues include those described in Table 1. Acylcarnitine is also used as an evaluation item in screening for inborn errors of metabolism such as fatty acid metabolism abnormality. Table 2 shows the main acylcarnitines used in clinical evaluation items such as screening for inborn errors of metabolism.
（長鎖アシルカルニチン）
本明細書において「長鎖アシルカルニチン」とは、脂肪酸残基（アシル基）の炭素数が１２〜３０個であるアシルカルニチンを意味する。本発明の脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法においては、オクタデセノイルカルニチン、テトラデセノイルカルニチン、テトラデカノイルカルニチン、ヘキサデカノイルカルニチン、オクタデカノイルカルニチン、及びオクタデカジエノイルカルニチンからなる群から選択される長鎖アシルカルニチン（以下、６種の長鎖アシルカルニチンと称することがある）のいずれか１つ以上の量を測定する。より好ましくは、測定される長鎖アシルカルニチンは、テトラデセノイルカルニチン及びオクタデセノイルカルニチンから選択される１つ以上であり、最も好ましくはオクタデセノイルカルニチンである。
(Long-chain acylcarnitine)
As used herein, “long-chain acylcarnitine” means an acylcarnitine in which the fatty acid residue (acyl group) has 12 to 30 carbon atoms. In the method for detecting or predicting the risk of fatty liver disease of the present invention, octadecenoylcarnitine, tetradecenoylcarnitine, tetradecanoylcarnitine, hexadecanoylcarnitine, octadecanoylcarnitine, and octadecadienoylcarnitine The amount of one or more of long-chain acylcarnitines selected from the group consisting of (hereinafter sometimes referred to as six types of long-chain acylcarnitines) is measured. More preferably, the long chain acylcarnitine measured is one or more selected from tetradecenoylcarnitine and octadecenoylcarnitine, most preferably octadecenoylcarnitine.
細胞内の長鎖脂肪酸は、アシルＣｏＡ（ａｃｙｌ−ＣｏＡ）合成酵素（ＡＣＳＬ）ファミリーによってアシルＣｏＡにエステル化される。次に、このアシルＣｏＡが、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ１（ＣＰＴ１）によってカルニチンに結合することによりアシルカルニチンに変換される。カルニチンアシルカルニチントランスロカーゼ（ＣＡＣＴ）を介してミトコンドリア内膜に入った後、アシルカルニチンはカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ２（ＣＰＴ２）によって再びカルニチンとアシルＣｏＡに再変換され、アシルＣｏＡがβ酸化を受けエネルギー産生に利用される。（図３参照）。 Long-chain fatty acids in cells are esterified to acyl-CoA by the acyl-CoA (acyl-CoA) synthase (ACSL) family. Next, this acyl CoA is converted to acyl carnitine by binding to carnitine by carnitine palmitoyl transferase 1 (CPT1). After entering the inner mitochondrial membrane via carnitine acylcarnitine translocase (CACT), acylcarnitine is again converted to carnitine and acyl-CoA by carnitine palmitoyltransferase 2 (CPT2), and acyl-CoA undergoes β-oxidation to produce energy. Used for (See FIG. 3).
本発明者らは、肥満に関連した肝癌モデルマウスの肝癌組織をサンプリングして、上記経路に関連する遺伝子発現量の変化を調査したところ、ＡＣＳＬファミリーの１つであるＡＣＳＬ４及びＣＰＴ１Ａの発現量が増加し、そしてＣＰＴ２の発現量が減少していることを発見した。これらの発現量の変化によって、肥満に関連した肝癌モデルマウスの肝癌組織では、ＣＰＴ２による長鎖アシルカルニチンのアシルＣｏＡへの再変換が機能しなくなる。したがって、肥満に関連した肝癌モデルマウスの肝癌組織では、長鎖アシルカルニチンの蓄積が生じると考えられる（図５参照）。 The present inventors sampled liver cancer tissue of an obesity-related liver cancer model mouse and examined changes in gene expression levels related to the above pathways. As a result, the expression levels of ACSL4 and CPT1A, one of the ACSL families, were It was found that expression increased and CPT2 expression decreased. Due to these changes in the expression level, reconversion of long-chain acylcarnitine into acyl-CoA by CPT2 does not function in the liver cancer tissue of a liver cancer model mouse related to obesity. Therefore, it is considered that long-chain acylcarnitine accumulates in the liver cancer tissue of an obesity-related liver cancer model mouse (see FIG. 5).
（長鎖アシルカルニチンの量の測定方法）
長鎖アシルカルニチンの量は、例えばキャピラリー電気泳動−質量分析計、及び液体クロマトグラフ−タンデム型質量分析計（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）等により測定することができる。これらの方法を組み合わせて使用することもできる。本明細書において「液体クロマトグラフ−タンデム型質量分析計」又は「ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ」は、液体クロマトグラフ（ＬＣ）により分離した分析対象成分を専用のインターフェースを介してイオン化し、生成するイオンを質量分析計（ＭＳ）で分離して特定の質量を有するイオンを解離及び／又はフラグメント化させ、それらのイオンを質量分析計で検出する装置を意味する。
(Method for measuring the amount of long-chain acylcarnitine)
The amount of long-chain acylcarnitine can be measured by, for example, a capillary electrophoresis-mass spectrometer, a liquid chromatograph-tandem mass spectrometer (LC-MS / MS), or the like. These methods can be used in combination. As used herein, “liquid chromatography-tandem mass spectrometer” or “LC-MS / MS” is an ion generated by ionizing a component to be analyzed separated by liquid chromatography (LC) through a dedicated interface. Are separated by a mass spectrometer (MS) to dissociate and / or fragment ions having a specific mass, and the ions are detected by the mass spectrometer.
（基準値）
本発明の脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法は、６種の長鎖アシルカルニチンのうちのいずれか１つ以上の長鎖アシルカルニチンの量を基準値と比較することを含む。本発明の脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法では、対象における６種の長鎖アシルカルニチンのうちのいずれかの量が、健常人群の前記長鎖アシルカルニチンの量よりも高いことを指標として脂肪性肝疾患の検出およびリスクの予測を行うことができる。具体的には、例えば、対象における６種の長鎖アシルカルニチンのうちのいずれかの量が健常人群との判定用閾値（基準値）以上となった場合に、脂肪性肝疾患を検出するか、又は発症する可能性が高いと判定することができる。
(Standard value)
The method for detecting or predicting the risk of fatty liver disease according to the present invention includes comparing the amount of one or more long-chain acylcarnitines of the six long-chain acylcarnitines with a reference value. In the method for detecting or predicting risk of fatty liver disease according to the present invention, the index indicates that the amount of any of the six types of long-chain acylcarnitines in a subject is higher than the amount of the long-chain acylcarnitine in a healthy group. Can be used to detect fatty liver disease and predict risk. Specifically, for example, when the amount of any of the six types of long-chain acylcarnitines in the subject is equal to or greater than a threshold (reference value) for determining a group of healthy individuals, whether fatty liver disease is detected Or the likelihood of onset is high.
数値の範囲を基準値とすることもできる。脂肪性肝疾患に罹患しているか否かを診断する際には、予め、脂肪性肝疾患に罹患していると診断された対象、および、脂肪性肝疾患ではないと診断された対象の体液試料中の６種の長鎖アシルカルニチンのうちのいずれかの量の範囲を計測しておき、対象の体液試料中の前記長鎖アシルカルニチンの量が、健常な対象の体液試料中の前記長鎖アシルカルニチン量の範囲に入る場合は、この対象は脂肪性肝疾患に罹患していない可能性が高く、脂肪性肝疾患に罹患している対象の体液試料中の前記長鎖アシルカルニチン量の範囲に入る場合は、脂肪性肝疾患に罹患している可能性が高い。 A range of numerical values can be used as the reference value. When diagnosing whether or not the subject has a fatty liver disease, the body fluid of a subject previously diagnosed as having a fatty liver disease and a subject diagnosed as not having a fatty liver disease The range of any one of the six types of long-chain acylcarnitines in the sample is measured, and the amount of the long-chain acylcarnitine in the target body fluid sample is determined to be longer than that in the healthy target body fluid sample. If the amount falls within the range of the amount of the chain acylcarnitine, it is highly possible that the subject does not have fatty liver disease, and the amount of the long-chain acylcarnitine in the body fluid sample of the subject suffering from fatty liver disease is determined. If it falls within the range, it is highly likely that you have fatty liver disease.
判定用閾値（基準値）は、種々条件、例えば、基礎疾患、性別、年齢などにより変化することが予想されるが、当業者であれば、対象に対応する適当な母集団を適宜選択して、その集団から得られたデータを統計学的処理を行うことにより、正常値範囲又は判定用閾値を決定することができる。 The judgment threshold value (reference value) is expected to change depending on various conditions, for example, the underlying disease, gender, age, etc. However, those skilled in the art can appropriately select an appropriate population corresponding to the subject. By performing statistical processing on data obtained from the population, a normal value range or a threshold for determination can be determined.
本発明の脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法では、６種の長鎖アシルカルニチンのうちの特定の１つの長鎖アシルカルニチンの量を基準値と比較してもよく、２つ以上の長鎖アシルカルニチンの量を各々の長鎖アシルカルニチンの基準値と比較してもよい。 In the method for detecting or predicting the risk of fatty liver disease of the present invention, the amount of a specific one long-chain acylcarnitine of the six types of long-chain acylcarnitines may be compared with a reference value, and the amount may be two or more. The amount of long-chain acylcarnitine may be compared to a reference value for each long-chain acylcarnitine.
本発明の脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法では、アシル基の炭素数が２〜１０である中短鎖アシルカルニチンの量を測定すること、及び前記中短鎖アシルカルニチン量を基準値と比較することをさらに含むことが好ましい。前記中短鎖アシルカルニチンが、イソ吉草酸カルニチンであることがより好ましい。なお、以下、アシル基の炭素数が２〜１０である中短鎖アシルカルニチンを、単に中短鎖アシルカルニチンと呼ぶことがある。 In the method for detecting or predicting risk of fatty liver disease of the present invention, measuring the amount of medium- and short-chain acylcarnitine having 2 to 10 carbon atoms in the acyl group, and determining the amount of the medium and short-chain acylcarnitine as a reference value It is preferable to further include comparing with. More preferably, the medium- and short-chain acylcarnitine is carnitine isovalerate. Hereinafter, the medium- and short-chain acylcarnitines having 2 to 10 carbon atoms in the acyl group may be simply referred to as medium- and short-chain acylcarnitines.
具体的には、本発明の脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法では、対象におけるいずれかの中短鎖アシルカルニチンの量が、健常人群の前記中短鎖アシルカルニチンの量よりも低いことを指標として、より精密に脂肪性肝疾患の検出およびリスクの予測を行うことができる。具体的には、例えば、対象におけるいずれかの中短鎖アシルカルニチンの量が健常人群との判定用閾値（基準値）以下となった場合に、脂肪性肝疾患を検出するか、又は発症する可能性がより高いと判定することができる。 Specifically, in the method for detecting or predicting risk of fatty liver disease of the present invention, the amount of any medium-short chain acylcarnitine in a subject is lower than the amount of the medium-short chain acylcarnitine in a healthy group. Using as an index, the fatty liver disease can be more accurately detected and the risk can be predicted. Specifically, for example, when the amount of any medium-and-short-chain acylcarnitine in a subject becomes equal to or less than a threshold (reference value) for determining a group of healthy people, fatty liver disease is detected or developed. It can be determined that the probability is higher.
数値の範囲を基準値とすることもできる。脂肪性肝疾患に罹患しているか否かを診断する際には、予め、脂肪性肝疾患に罹患していると診断された対象、および、脂肪性肝疾患ではないと診断された対象の体液試料中のいずれかの中短鎖アシルカルニチンの範囲を計測しておき、対象の体液試料中の前記中短鎖アシルカルニチンが、健常な対象の体液試料中の前記中短鎖アシルカルニチン量の範囲に入る場合は、この対象は脂肪性肝疾患に罹患していない可能性がより高く、脂肪性肝疾患に罹患している対象の体液試料中の前記中短鎖アシルカルニチン量の範囲に入る場合は、脂肪性肝疾患に罹患している可能性がより高い。 A range of numerical values can be used as the reference value. When diagnosing whether or not the subject has a fatty liver disease, the body fluid of a subject previously diagnosed as having a fatty liver disease and a subject diagnosed as not having a fatty liver disease The range of any medium-short chain acylcarnitine in the sample has been measured, and the medium-short chain acylcarnitine in the target body fluid sample has a range of the medium-short chain acylcarnitine amount in a healthy subject body fluid sample. If the subject is more likely not to have fatty liver disease and falls within the range of said medium and short chain acylcarnitine amounts in a body fluid sample of a subject suffering from fatty liver disease. Are more likely to have fatty liver disease.
以下の計算式を用いて、指標スコアを計算することと、計算した前記指標スコアを基準値と比較することとにより、脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測をより精密に行うこともできる。
［式１］
ＡＣ１４：１＋ＡＣ１８：１−ＡＣ５：０
（式中、ＡＣ１４：１は、対象からの体液試料中のテトラデセノイルカルニチンの量を示し、ＡＣ１８：１は、対象からの体液試料中のオクタデセノイルカルニチンの量を示し、そして、ＡＣ５：０は、対象からの体液試料中のイソ吉草酸カルニチンの量を示す）
By calculating the index score using the following calculation formula and comparing the calculated index score with a reference value, it is possible to detect fatty liver disease or predict the risk more precisely.
[Equation 1]
AC14: 1 + AC18: 1-AC5: 0
Wherein AC14: 1 indicates the amount of tetradecenoylcarnitine in the body fluid sample from the subject, AC18: 1 indicates the amount of octadecenoylcarnitine in the body fluid sample from the subject, and AC5: 0 indicates the amount of carnitine isovalerate in a body fluid sample from the subject)
以下の計算式を用いて、指標スコアを計算することと、計算した前記指標スコアを基準値と比較することとにより、脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測をより精密に行うこともできる。
［式２］
（ＡＣ１６：０＋ＡＣ１８：１）×１００／ＡＣ２：０
（式中、ＡＣ１６：０は、対象からの体液試料中のヘキサデカノイルカルニチンの量を示し、ＡＣ１８：１は、対象からの体液試料中のオクタデセノイルカルニチンの量を示し、そしてＡＣ２：０は、対象からの体液試料中のアセチルカルニチンの量を示す）
上記式を用いる場合、脂肪性肝疾患は、好ましくはＮＡＳＨが進行した肝細胞癌である。
By calculating the index score using the following calculation formula and comparing the calculated index score with a reference value, it is possible to detect fatty liver disease or predict the risk more precisely.
[Equation 2]
(AC16: 0 + AC18: 1) × 100 / AC2: 0
Wherein AC16: 0 indicates the amount of hexadecanoylcarnitine in the body fluid sample from the subject, AC18: 1 indicates the amount of octadecenoylcarnitine in the body fluid sample from the subject, and AC2: 0 indicates the amount of acetylcarnitine in a body fluid sample from the subject)
When using the above formula, the fatty liver disease is preferably hepatocellular carcinoma with advanced NASH.
（脂肪性肝疾患）
本明細書において「脂肪性肝疾患」とは、肝細胞の線維化及び／又は脂肪沈着によって引き起こされる肝疾患を意味する。脂肪性肝疾患は、好ましくはＮＡＦＬＤである。ＮＡＦＬＤには、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、ＮＡＳＨが進行した肝硬変、及びＮＡＳＨが進行した肝細胞癌が含まれる。脂肪性肝疾患は、より好ましくはＮＡＳＨである。なお、本明細書においては、用語「ＮＡＦＬＤ」及び「ＮＡＳＨ」は、ＮＡＳＨが進行した肝細胞癌を含むことができるが、含まないことが好ましい。
(Fatty liver disease)
As used herein, "fatty liver disease" refers to a liver disease caused by fibrosis and / or fat deposition of hepatocytes. The fatty liver disease is preferably NAFLD. NAFLD includes non-alcoholic fatty liver (NAFL), non-alcoholic steatohepatitis (NASH), cirrhosis with advanced NASH, and hepatocellular carcinoma with advanced NASH. The fatty liver disease is more preferably NASH. As used herein, the terms “NAFLD” and “NASH” can include hepatocellular carcinoma with advanced NASH, but preferably do not.
本発明の脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法では、ＮＡＳＨが、肝細胞癌に進行する前にＮＡＳＨを検出する又はリスクを予測することができる。したがって、脂肪性肝疾患が、肝細胞癌を有しないＮＡＳＨであることが、早期診断の観点からより好ましい。
また、後述の実施例において示すように、長鎖アシルカルニチンの量と肝線維化とは有意な正の相関を有する。したがって、検出感度の観点からは、脂肪性肝疾患は、ＮＡＳＨが進行した肝硬変、又はＮＡＳＨが進行した肝細胞癌であることが好ましく、ＮＡＳＨが進行した肝細胞癌であることが最も好ましい。
In the method for detecting or predicting a risk of fatty liver disease of the present invention, NASH can detect or predict a risk of NASH before it progresses to hepatocellular carcinoma. Therefore, it is more preferable that the fatty liver disease is NASH having no hepatocellular carcinoma from the viewpoint of early diagnosis.
In addition, as shown in Examples described later, the amount of long-chain acylcarnitine and hepatic fibrosis have a significant positive correlation. Therefore, from the viewpoint of detection sensitivity, the fatty liver disease is preferably cirrhosis with advanced NASH or hepatocellular carcinoma with advanced NASH, and most preferably hepatocellular carcinoma with advanced NASH.
（脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法）
本発明の脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法は、脂肪性肝疾患の進行度をモニタリングすることができる。この場合、特定の時点での対象における６種の長鎖アシルカルニチンのうちのいずれかの量を、判定用閾値（基準値）として使用する。一定期間後（例えば、１、３、６、又は１２か月後）に再度この対象におけるこの長鎖アシルカルニチンの量を測定し、以前の測定値と比較してこの長鎖アシルカルニチンの量が多ければ、脂肪性肝疾患が進行していると判断することができる。逆に、以前の測定値と比較してこの長鎖アシルカルニチンの量が同じ程度であるか又は少なければ、脂肪性肝疾患が進行していないと判断することができる。前述のように、６種の長鎖アシルカルニチンのうちのいずれかの量に加えて、アシル基の炭素数がＣ２〜１０である中短鎖アシルカルニチンのいずれか１つ以上の量（好ましくは、イソ吉草酸カルニチンの量）を、特定の時点及び一定期間経過後にさらに測定することもできる。
(Detection method of fatty liver disease or prediction of risk)
The method for detecting or predicting the risk of fatty liver disease according to the present invention can monitor the progress of fatty liver disease. In this case, the amount of any of the six types of long-chain acylcarnitines in the subject at a specific time is used as a determination threshold (reference value). After a period of time (eg, 1, 3, 6, or 12 months), the amount of the long-chain acylcarnitine in the subject is measured again, and the amount of the long-chain acylcarnitine is compared to a previous measurement. If it is large, it can be determined that fatty liver disease is progressing. Conversely, if the amount of this long-chain acylcarnitine is the same or less than the previously measured value, it can be determined that fatty liver disease has not progressed. As described above, in addition to the amount of any of the six types of long-chain acylcarnitines, the amount of any one or more of the medium- and short-chain acylcarnitines having an acyl group of C2 to 10 (preferably , The amount of carnitine isovalerate) can also be measured at specific times and after a certain period of time.
本発明の脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法を行った後、必要に応じて、他の脂肪性肝疾患（例えばＮＡＳＨ）の検出方法の患者への実施、及び／又は脂肪性肝疾患（例えばＮＡＳＨ）の治療薬の患者への投与を実施してもよい。 After performing the method of detecting or estimating the risk of fatty liver disease of the present invention, if necessary, implementing the method of detecting another fatty liver disease (eg, NASH) on a patient and / or treating fatty liver disease Administration of a therapeutic agent (eg, NASH) to a patient may be performed.
［２］脂肪性肝疾患を診断するためのバイオマーカー
本明細書において、バイオマーカーとは、所定の疾患に関連するペプチド、タンパク質、核酸、脂質又はその他の低分子化合物であり、その生体中の濃度の増減が当該疾患の存在又は進行度に反映するものである。本発明の脂肪性肝疾患を診断するためのバイオマーカーでは、対象における６種の長鎖アシルカルニチンのうちのいずれかの量が、健常人群の前記長鎖アシルカルニチンの量よりも高いことを指標として脂肪性肝疾患を診断することができる。具体的には、例えば、対象におけるいずれかの長鎖アシルカルニチンの量が健常人群との判定用閾値（基準値）以上となった場合に、脂肪性肝疾患を検出するか、又は発症する可能性が高いと判定することができる。
[2] Biomarker for diagnosing fatty liver disease In the present specification, a biomarker is a peptide, protein, nucleic acid, lipid or other low molecular compound associated with a predetermined disease, An increase or decrease in the concentration reflects the presence or progress of the disease. The biomarker for diagnosing fatty liver disease of the present invention indicates that the amount of any of the six long-chain acylcarnitines in a subject is higher than the amount of the long-chain acylcarnitine in a healthy group. Can be diagnosed as fatty liver disease. Specifically, for example, when the amount of any long-chain acylcarnitine in a subject is equal to or greater than a threshold (reference value) for determining a group of healthy people, fatty liver disease can be detected or can develop. Can be determined to be high.
本発明の脂肪性肝疾患を診断するためのバイオマーカーでは、数値の範囲を基準値とすることもできる。脂肪性肝疾患に罹患しているか否かを診断する際には、予め、脂肪性肝疾患に罹患していると診断された対象、および、脂肪性肝疾患ではないと診断された対象の体液試料中の６種のうちのいずれかの長鎖アシルカルニチン量の範囲を計測しておき、対象の体液試料中の前記長鎖アシルカルニチンが、健常な対象の体液試料中の前記長鎖アシルカルニチン量の範囲に入る場合は、この対象は脂肪性肝疾患に罹患していない可能性が高く、脂肪性肝疾患に罹患している対象の体液試料中の前記長鎖アシルカルニチン量の範囲に入る場合は、脂肪性肝疾患に罹患している可能性が高い。 In the biomarker for diagnosing fatty liver disease of the present invention, a range of numerical values can be used as a reference value. When diagnosing whether or not the subject has a fatty liver disease, the body fluid of a subject previously diagnosed as having a fatty liver disease and a subject diagnosed as not having a fatty liver disease The range of the amount of the long-chain acylcarnitine in any one of the six types in the sample is measured, and the long-chain acylcarnitine in the target body fluid sample is replaced with the long-chain acylcarnitine in the healthy target body fluid sample. If the amount falls within the range, the subject is likely not to have fatty liver disease and falls within the range of the long-chain acylcarnitine amount in a body fluid sample of the subject suffering from fatty liver disease. If so, it is likely that you have fatty liver disease.
［３］診断薬キット
本発明の脂肪性肝疾患を検出するための診断薬キットは、６種の長鎖アシルカルニチンのいずれか１つ以上の量を測定するための試薬を含む。前記試薬は、特定の１つの長鎖アシルカルニチンの量を測定するための試薬を含んでいてもよく、２つ以上の長鎖アシルカルニチンの量を測定するための試薬を含んでいてもよい。本発明の脂肪性肝疾患を検出するための診断薬キットは、好ましくは、液体クロマトグラフ−タンデム型質量分析計（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用いて６種の長鎖アシルカルニチンのうちの１つ以上の量を測定するための試薬を含む。
[3] Diagnostic Agent Kit The diagnostic agent kit of the present invention for detecting fatty liver disease includes a reagent for measuring the amount of any one or more of the six types of long-chain acylcarnitines. The reagent may include a reagent for measuring the amount of a specific one long-chain acylcarnitine, or may include a reagent for measuring two or more long-chain acylcarnitines. The diagnostic reagent kit for detecting fatty liver disease according to the present invention preferably comprises one of six long-chain acylcarnitines using a liquid chromatography-tandem mass spectrometer (LC-MS / MS). And reagents for measuring one or more quantities.
［４］対象の肝線維化の進行度の判定方法
本発明の対象の肝線維化の進行度の判定方法では、対象の体液試料中の６種の長鎖アシルカルニチンのいずれかの量に応じて、肝臓における線維化の進行度を判定することができる。本明細書において「肝線維化」とは、慢性的な肝臓の炎症により、コラーゲン線維などの線維性成分及び／又は細胞外基質を含む結合組織が肝臓に大量に増加し、組織が硬化することを意味する。本発明の対象の肝線維化の進行度の判定方法は、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨに罹患している可能性のある対象において、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨにより生じる肝線維化の進行度の判定を行うことができる。また、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨに既に罹患している対象において、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨにより生じる肝線維化の進行度の判定を行うこともできる。長鎖アシルカルニチンの測定方法や体液試料については、前述のとおりである。
[4] Method of Determining Progress of Liver Fibrosis of Subject In the method of determining the progress of liver fibrosis of a subject according to the present invention, the method depends on the amount of any of the six types of long-chain acylcarnitines in a body fluid sample of the subject. Thus, the degree of progression of fibrosis in the liver can be determined. As used herein, “liver fibrosis” refers to a massive increase in connective tissue containing fibrous components such as collagen fibers and / or extracellular matrix in the liver due to chronic inflammation of the liver and hardening of the tissue. Means The method for determining the degree of progression of hepatic fibrosis of a subject of the present invention can determine the degree of progression of hepatic fibrosis caused by NAFLD or NASH in a subject who may be suffering from NAFLD or NASH. In addition, in a subject already suffering from NAFLD or NASH, the degree of progression of liver fibrosis caused by NAFLD or NASH can be determined. The method for measuring long-chain acylcarnitine and the body fluid sample are as described above.
（基準値）
本発明の対象の肝線維化の進行度の判定方法は、測定した長鎖アシルカルニチンの量を基準値と比較することを含む。本発明の本発明の対象の肝線維化の進行度の判定方法では、数値の範囲を基準値とすることが好ましい。対象の肝線維化の進行度を判定する際には、予め、種々の肝線維化段階の対象の体液試料中の６種の長鎖アシルカルニチンうちのいずれかの量の範囲を計測しておき、この長鎖アシルカルニチンの量が、特定の肝線維化段階の体液試料中の長鎖アシルカルニチンの範囲に入る場合は、対象はその特定の肝線維化段階である可能性が高い。
肝線維化段階の分類は、例えば、Ｆ０：線維化なし、Ｆ１：小葉中心部の線維化、Ｆ２：小葉中心部＋門脈域の線維化、Ｆ３：線維性架橋形成、Ｆ４：肝硬変、ＨＣＣ：肝細胞がんの区別に従うことができる。本発明の対象の肝線維化の進行度の判定方法は、対象の肝臓が上記Ｆ０〜Ｆ４のどの段階にあるかを判定することができる。ただ、上記Ｆ０〜Ｆ４の分類には限定されず、異なる分類を使用してもよい。
(Standard value)
The method for determining the degree of progression of hepatic fibrosis of the subject of the present invention includes comparing the measured amount of long-chain acylcarnitine with a reference value. In the method of the present invention for determining the degree of progression of hepatic fibrosis of a subject, it is preferable that a range of numerical values is used as a reference value. When determining the degree of progression of liver fibrosis of a subject, the range of any one of the six long-chain acylcarnitines in the body fluid sample of the subject at various stages of liver fibrosis is measured in advance. If the amount of this long-chain acylcarnitine falls within the range of the long-chain acylcarnitine in a body fluid sample at a particular liver fibrosis stage, the subject is likely to be at that particular liver fibrosis stage.
The classification of the liver fibrosis stage is, for example, F0: no fibrosis, F1: fibrosis in the central lobule, F2: fibrosis in the central lobule + portal vein area, F3: fibrous cross-link formation, F4: liver cirrhosis, HCC A: The hepatocellular carcinoma can be distinguished. The method for determining the degree of progression of liver fibrosis of a subject according to the present invention can determine which stage of the above-mentioned F0 to F4 the subject liver is in. However, the classification is not limited to F0 to F4, and a different classification may be used.
判定用閾値（基準値）は、種々条件、例えば、基礎疾患、性別、年齢などにより変化することが予想されるが、当業者であれば、対象に対応する適当な母集団を適宜選択して、その集団から得られたデータを統計学的処理を行うことにより、正常値範囲又は判定用閾値を決定することができる。 The judgment threshold value (reference value) is expected to change depending on various conditions, for example, the underlying disease, gender, age, etc. However, those skilled in the art can appropriately select an appropriate population corresponding to the subject. By performing statistical processing on data obtained from the population, a normal value range or a threshold for determination can be determined.
本発明の対象の肝線維化の進行度の判定方法は、対象の肝線維化の進行度をモニタリングすることができる。この場合、特定の時点での対象の体液試料中の６種の長鎖アシルカルニチンうちのいずれかの量を、判定用閾値（基準値）として使用する。一定期間後（例えば、１、３、６、又は１２か月後）に再度この対象のこの長鎖アシルカルニチンを測定し、以前の測定値と比較して量が多ければ、肝線維化が進行していると判断することができる。逆に、以前の測定値と比較して量が同じ程度であるか又は少なければ、肝線維化が進行していないと判断することができる。 The method for determining the degree of progression of hepatic fibrosis of a subject of the present invention can monitor the degree of progression of hepatic fibrosis of a subject. In this case, the amount of any of the six types of long-chain acylcarnitines in the target body fluid sample at a specific point in time is used as a determination threshold (reference value). After a certain period of time (eg, 1, 3, 6, or 12 months), the subject's long-chain acylcarnitine is measured again, and if the amount is large compared to the previous measurement, liver fibrosis progresses Can be determined to be. Conversely, if the amount is the same or less than the previous measurement, it can be determined that liver fibrosis has not progressed.
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。 Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference to Examples, but these do not limit the scope of the present invention.
〔実施例１〕ＨＦＤ−ＨＣＣとＮＤ−ＮＴにおける様々な長鎖アシルカルニチンの量の比較
肥満に関連した肝細胞癌に特徴的な代謝の変化を調べるために、通常食（ＮＤ）又は高脂肪食（ＨＦＤ）を与えた８ヶ月齢のジエチルニトロサミン（ＤＥＮ）投与マウスから得られた非腫瘍組織（ＮＴ）及び肝細胞癌組織（ＨＣＣ）に関して、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）を使用した非標的メタボロミクスプロファイリングを行った。高脂肪食を与えたＤＥＮ投与マウスは、肥満に関連した肝細胞癌モデルマウスとして、広く認知されている。
Example 1 Comparison of Amounts of Various Long-Chain Acylcarnitines in HFD-HCC and ND-NT To examine metabolic changes characteristic of hepatocellular carcinoma associated with obesity, normal diet (ND) or high fat Liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) was performed on non-tumor tissue (NT) and hepatocellular carcinoma tissue (HCC) obtained from 8-month-old diethylnitrosamine (DEN) -treated mice fed a diet (HFD). The non-targeted metabolomics profiling used was performed. DEN-administered mice fed a high-fat diet are widely recognized as obesity-related hepatocellular carcinoma model mice.
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを日本クレア株式会社から購入した。ジエチルニトロサミン（Ｓｉｇｍａ株式会社）をリン酸緩衝生理食塩水に溶解し、出生後１４日目にマウスに腹腔内注射した（２５ｍｇ／ｋｇ）。マウスが６週齢になると、高脂肪食（ＨＦＤ）（Ｄ１２４９２；Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ Ｉｎｃ）又は通常食（ＮＤ）の投与を開始した。８ヶ月齢となるまで、通常食（ＮＤ）又は高脂肪食（ＨＦＤ）の投与を続け、通常食又は高脂肪食を与えたＤＥＮ投与マウスを得た。その後、通常食（ＮＤ）又は高脂肪食（ＨＦＤ）の各々を投与したマウス肝臓から非腫瘍組織（ＮＴ）及び肝細胞癌組織（ＨＣＣ）をサンプリングし、ＮＤ−ＮＴ（通常食・非腫瘍組織）、ＮＤ−ＨＣＣ（通常食・腫瘍組織）、ＨＦＤ−ＮＴ（高脂肪食・非腫瘍組織）、及びＨＦＤ−ＨＣＣ（高脂肪食・腫瘍組織）として、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）を使用した非標的メタボロミクスプロファイリングを以下の手順で行った。 C57BL / 6 mice were purchased from CLEA Japan. Diethylnitrosamine (Sigma) was dissolved in phosphate-buffered saline and injected into the mice intraperitoneally 14 days after birth (25 mg / kg). When the mice were 6 weeks old, administration of a high fat diet (HFD) (D12492; Research Diets Inc) or a normal diet (ND) was started. Administration of a normal diet (ND) or a high fat diet (HFD) was continued until the age of 8 months, to obtain DEN-administered mice fed a normal diet or a high fat diet. Thereafter, non-tumor tissues (NT) and hepatocellular carcinoma tissues (HCC) were sampled from the livers of mice to which a normal diet (ND) or a high fat diet (HFD) was administered, and ND-NT (normal diet / non-tumor tissues) ), ND-HCC (normal diet / tumor tissue), HFD-NT (high fat diet / non-tumor tissue), and HFD-HCC (high fat diet / tumor tissue) as liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). ) Was performed by the following procedure.
（代謝産物の抽出）
代謝産物の抽出と代謝産物の分析を、Ｈｕｍａｎ Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（ＨＭＴ；鶴岡市）において行った。簡潔には、ＣＥ−ＴＯＦＭＳ分析のために、凍結組織約５０ｍｇを内部標準（Ｈ３３０４−１００２；ＨＭＴ）を含有する５０％アセトニトリル／ミリＱ水１，５００μＬ中に０℃で沈降させた。組織を組織ホモジナイザー（Ｍｉｃｒｏ Ｓｍａｓｈ ＭＳ１００Ｒ；富士デジタルバイオロジー社）を用いて１，５００ｒｐｍで１２０秒間３回ホモジナイズした。ホモジネートを２，３００ｘｇ、４℃で５分間遠心分離した。続いて、上部水層８００μＬをＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ５−ｋＤａカットオフフィルター（ＵｌｔｒａｆｒｅｅＭＣ−ＰＬＨＣＣ；ＨＭＴ）を用いて遠心分離し、高分子を除去した（９，１００ｘｇ、４℃、１２０分）。濾液を遠心分離して濃縮し、ＨＭＴでのＣＥ−ＴＯＦＭＳ分析のために、ミリＱ水５０μＬに再懸濁した。
(Extraction of metabolites)
Metabolite extraction and metabolite analysis were performed at Human Metabolome Technologies (HMT; Tsuruoka). Briefly, for CE-TOFMS analysis, approximately 50 mg of frozen tissue was sedimented at 0 ° C. in 1,500 μL of 50% acetonitrile / MilliQ water containing an internal standard (H3304-1002; HMT). The tissue was homogenized three times at 1,500 rpm for 120 seconds using a tissue homogenizer (Micro Smash MS100R; Fuji Digital Biology). The homogenate was centrifuged at 2,300 × g, 4 ° C. for 5 minutes. Subsequently, 800 μL of the upper aqueous layer was centrifuged using a Millipore 5-kDa cut-off filter (UltrafreeMC-PLHCC; HMT) to remove the polymer (9,100 × g, 4 ° C., 120 minutes). The filtrate was concentrated by centrifugation and resuspended in 50 μL of Milli-Q water for CE-TOFMS analysis on HMT.
液体クロマトグラフィーＴＯＦＭＳ（ＬＣ−ＴＯＦＭＳ）分析のために、凍結組織約５０ｍｇを、内部標準溶液（Ｈ３３０４−１００２；ＨＭＴ）を含有する１％ギ酸／アセトニトリル５００μＬ中に０℃で沈降させた。組織を上記のようにホモジナイズし、ミリＱ水１６７μＬの添加後、混合物を再びホモジナイズし、ホモジネートを遠心分離した（２，３００ｘｇ、４℃、５分間）。次に、上清に１％ギ酸／アセトニトリル５００μＬとミリＱ水１６７μＬを混合し、混合溶液を３−ｋＤａカットオフフィルター（ＮＡＮＯＣＥＰ ３Ｋ ＯＭＥＧＡ；ＰＡＬＬ社）を通してろ過し、高分子を除去した。ハイブリッドＳＰＥリン脂質カートリッジ（５５２６１−Ｕ; Ｓｕｐｅｌｃｏ社）を使用してさらにろ過し、リン脂質を除去した。濾液を乾燥させ、ＬＣ−ＴＯＦＭＳ分析のために、イソプロパノール／ミリＱ水１００μＬに再懸濁した。 For liquid chromatography TOFMS (LC-TOFMS) analysis, approximately 50 mg of frozen tissue was sedimented at 0 ° C. in 500 μL of 1% formic acid / acetonitrile containing an internal standard solution (H3304-1002; HMT). The tissue was homogenized as above, and after addition of 167 μL of Milli-Q water, the mixture was homogenized again and the homogenate was centrifuged (2,300 × g, 4 ° C., 5 minutes). Next, 500 μL of 1% formic acid / acetonitrile and 167 μL of Milli-Q water were mixed with the supernatant, and the mixed solution was filtered through a 3-kDa cut-off filter (NANOCEP 3K OMEGA; PALL) to remove polymers. Further filtration was performed using a hybrid SPE phospholipid cartridge (55261-U; Supelco) to remove phospholipids. The filtrate was dried and resuspended in 100 μL of isopropanol / Milli-Q water for LC-TOFMS analysis.
（代謝産物の分析）
メタボローム分析を、Ｏｏｇａら Ｍｏｌ Ｂｉｏｓｙｓｔ ２０１１；７：１２１７〜１２２３頁及びＳｕｇｉｍｏｔｏら Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ ２０１０；６：７８−９５頁に記載の方法に基づいて、イオンおよび非イオン代謝産物に関して、それぞれ、ＣＥ−ＴＯＦＭＳ及びＬＣ−ＴＯＦＭＳを用いて、ＨＭＴのＤｕａｌＳｃａｎパッケージを用いて行った。簡潔には、Ａｇｉｌｅｎｔ ６２１０ ＴＯＦＭＳ、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ｉｓｏｃｒａｔｉｃ ＨＰＬＣポンプ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇ１６０３Ａ ＣＥ−ＭＳアダプターキット、及びＡｇｉｌｅｎｔ Ｇ１６０７Ａ ＣＥ−ＥＳＩ−ＭＳスプレーキット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を搭載したＡｇｉｌｅｎｔ ＣＥシステムを使用してＣＥ−ＴＯＦＭＳ分析を行った。このシステムは、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇ２２０１Ａ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアバージョンＢ．０３．０１ ｆｏｒ ＣＥ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって制御されており、溶融シリカキャピラリー（５０μｍ i.d.×８０ｃｍ全長）により、電解液としての市販の電気泳動バッファー（カチオン及びアニオン分析に関して、それぞれＨ３３０１−１００１及びＨ３３０２−１０２１；ＨＭＴ）に接続していた。分光光度計を５０〜１，０００ｍ／ｚで走査した。ＬＣ−ＴＯＦＭＳ分析を、Ａｇｉｌｅｎｔ ６２３０ ＴＯＦＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を搭載したＡｇｉｌｅｎｔ ＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ １２００シリーズＲＲＬＣシステムＳＬ）を用いて行った。このシステムをＯＤＳカラム（２ｘ５０ ｍｍ、２μｍ）を搭載したＡｇｉｌｅｎｔ Ｇ２２０１Ａ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアバージョンＢ．０３．０１（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって制御した。
(Analysis of metabolites)
Metabolome analysis was performed for CE-TOFMS and CE-TOFMS for ionic and non-ionic metabolites, respectively, based on the method described in Oga et al. Mol Biosystem 2011; 7: 1217-1223 and Sugimoto et al. Metabolics 2010; This was performed using LC-TOFMS using the DualScan package of HMT. Briefly, an Agilent CE-TCE system equipped with an Agilent 6210 TOFMS, an Agilent 1100 isocratic HPLC pump, an Agilent G1603A CE-MS adapter kit, and an Agilent G1607A CE-ESI-MS spray kit (Agilent Technologies). Was done. This system is based on Agilent G2201A ChemStation software version B.11. 03.01 for CE (Agilent Technologies) controlled by fused silica capillaries (50 μm id × 80 cm full length) with commercially available electrophoresis buffers (H3301-1001 and H3302- for cation and anion analysis, respectively) as electrolytes. 1021; HMT). The spectrophotometer was scanned from 50 to 1,000 m / z. LC-TOFMS analysis was performed using an Agilent LC System (Agilent 1200 series RRLC system SL) equipped with an Agilent 6230 TOFMS (Agilent Technologies). This system was equipped with an Agilent G2201A ChemStation software version B.1 equipped with an ODS column (2 × 50 mm, 2 μm). Controlled by 03.01 (Agilent Technologies).
ＭａｓｔｅｒＨａｎｄｓ ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ（慶應義塾大学、鶴岡市）を使用してピークを抽出し、ｍ／ｚ、ピーク面積、泳動時間（ＭＴ）を含むピーク情報を得た。既知のメタボライトのアイソトポマー、アダクトイオン、その他のプロダクトイオンに対応するシグナルピークは除外し、残りのピークは、ＴＯＦＭＳを使用して決定されたＭＴおよびＲＴとそれらのｍ／ｚ値とに基づいて、ＨＭＴ代謝産物データベースによりアノテートした。次に、アノテートしたピークの領域を、内部標準レベルおよびサンプル量に基づいて正規化して、各代謝産物の相対レベルを得た。それぞれの標準化合物を用いた１点較正に基づいて、１１０種類の主要代謝産物を絶対的に定量した。階層的クラスター分析と主成分分析（ＰＣＡ）を、それぞれＨＭＴ独自のソフトウェアであるＰｅａｋＳｔａｔとＳａｍｐｌｅＳｔａｔを使用して行った。検出された代謝産物を、ＶＡＮＴＥＤソフトウェアを用いて代謝経路マップ上に表示した。 Peaks were extracted using MasterHands automatic integration software (Keio University, Tsuruoka City) to obtain peak information including m / z, peak area, and migration time (MT). Signal peaks corresponding to known metabolite isotopomers, adduct ions, and other product ions are excluded, and the remaining peaks are based on MT and RT determined using TOFMS and their m / z values. , Annotated by the HMT metabolite database. Next, the area of the annotated peak was normalized based on the internal standard level and the sample volume to obtain the relative levels of each metabolite. Based on a one-point calibration using each standard compound, 110 major metabolites were absolutely quantified. Hierarchical cluster analysis and principal component analysis (PCA) were performed using PeakStat and SampleStat, proprietary software of HMT, respectively. Detected metabolites were displayed on metabolic pathway maps using VANTED software.
４種の組織において種々の長鎖アシルカルニチンの量を分析した。結果を図１及び２に示す。図１において、ＡＣ（２０：１）の「２０」はアシル基の炭素数を示し、「１」は不飽和結合の数を示す。図１において、数字「９．８」及び円の大きさは、ＮＤ−ＮＴにおけるＡＣ（２０：１）を１とした場合の、ＨＦＤ−ＨＣＣにおけるＡＣ（２０：１）の相対的な量を示す。
ＨＦＤ−ＨＣＣでは、ＮＤ−ＮＴと比較して、様々な種類の長鎖アシルカルニチン（ＡＣ）の量が増加していることが分かった（図１）。
Four tissues were analyzed for the amount of various long-chain acylcarnitines. The results are shown in FIGS. In FIG. 1, “20” in AC (20: 1) indicates the number of carbon atoms in the acyl group, and “1” indicates the number of unsaturated bonds. In FIG. 1, the numeral “9.8” and the size of the circle indicate the relative amount of AC (20: 1) in HFD-HCC when AC (20: 1) in ND-NT is 1. Show.
HFD-HCC was found to have increased amounts of various types of long-chain acylcarnitines (AC) as compared to ND-NT (FIG. 1).
図２において、データは、ＮＤ−ＮＴ組織における平均量に対する相対的な量として表示されている。＊は、ＮＤ−ＮＴ組織に対してＰ＜０．０５であることを示し、†は、ＮＤ−ＨＣＣ組織に対してＰ＜０．０５であることを示し、‡は、ＨＦＤ−ＮＴ組織に対してＰ＜０．０５であることを示す。
ＨＦＤ−ＨＣＣでは、ＮＤ−ＨＣＣ及びＨＦＤ−ＮＴの各々よりも、長鎖アシルカルニチン量が多い傾向があった。特にＡＣ１２：１、ＡＣ１６：０、及びＡＣ１８：１の３種は、ＨＦＤ−ＨＣＣ組織において他の３種の組織の全てに対して、有意に多い量が確認できた。
In FIG. 2, data is displayed as a relative amount to the average amount in the ND-NT tissue. * Indicates P <0.05 for ND-NT tissue, † indicates P <0.05 for ND-HCC tissue, ‡ indicates HFD-NT tissue In contrast, it shows that P <0.05.
HFD-HCC tended to have a larger amount of long-chain acylcarnitine than each of ND-HCC and HFD-NT. In particular, three types of AC12: 1, AC16: 0, and AC18: 1 were confirmed to have significantly larger amounts in all the other three types of tissues in the HFD-HCC tissue.
〔実施例２〕肥満に関連したＨＣＣにおけるアシルカルニチン代謝関連遺伝子の発現の検証
実施例１において得た、通常食又は高脂肪食を与えたＤＥＮ注入マウスを実験に用いた。ＮＤ−ＮＴ、ＮＤ−ＨＣＣ、ＨＦＤ−ＮＴ、及びＨＦＤ−ＨＣＣの各々の組織において、アシルカルニチン代謝に関連するＡＣＳＬ４、ＣＰＴ１Ａ、ＣＡＣＴ、及びＣＰＴ２の遺伝子発現量をリアルタイムＰＣＲを用いて調査した。結果を図４に示す。
Example 2 Verification of Expression of Acylcarnitine Metabolism-Related Gene in Obesity-Related HCC The DEN-injected mouse obtained in Example 1 and fed a normal diet or a high fat diet was used for the experiment. In each tissue of ND-NT, ND-HCC, HFD-NT, and HFD-HCC, the gene expression levels of ACSL4, CPT1A, CACT, and CPT2 related to acylcarnitine metabolism were investigated using real-time PCR. FIG. 4 shows the results.
図４において、データは、ＮＤ−ＮＴ組織における遺伝子発現量に対する相対的な量として表示されている。＊は、ＮＤ−ＮＴ組織に対してＰ＜０．０５であることを示し、†は、ＮＤ−ＨＣＣ組織に対してＰ＜０．０５であることを示し、‡は、ＨＦＤ−ＮＴ組織に対してＰ＜０．０５であることを示す。ＮＤ−ＨＣＣ及びＨＦＤ−ＨＣＣ組織において、ＣＰＴ１Ａ及びＡＣＳＬ４の強い発現が検出された。一方で、ＣＰＴ２は、ＮＤ−ＨＣＣ及びＨＦＤ−ＨＣＣ組織において発現量が低下しており、特にＨＦＤ−ＨＣＣ組織における発現量低下は、ＮＤ−ＮＴ、ＮＤ−ＨＣＣ、及びＨＦＤ−ＮＴの全てに対して有意差があった。ＨＦＤ−ＨＣＣでは、ＣＡＣＴに関してもＮＤ−ＮＴに対して有意に発現量が低下していた。この結果は、肝細胞癌組織において、脂肪酸の長鎖アシルカルニチンへの変換がＨＦＤ−ＨＣＣ組織において増加している一方で、長鎖アシルカルニチンのアシルＣｏＡへの再変換が抑制されていることを示している。すなわち、この結果は、肝細胞癌組織において、長鎖アシルカルニチン種が蓄積する理由を説明している（図５参照）。なお、ＣＰＴ１Ａ及びＣＰＴ２に関しては、ウエスタンブロット分析を用いて各々の組織における発現量を確認する試験を行ったが、同様の傾向が見られた。 In FIG. 4, the data is displayed as a relative amount to the gene expression level in the ND-NT tissue. * Indicates P <0.05 for ND-NT tissue, † indicates P <0.05 for ND-HCC tissue, ‡ indicates HFD-NT tissue In contrast, it shows that P <0.05. Strong expression of CPT1A and ACSL4 was detected in ND-HCC and HFD-HCC tissues. On the other hand, the expression level of CPT2 is decreased in ND-HCC and HFD-HCC tissues, and particularly, the decrease in the expression level in HFD-HCC tissues is lower than that of ND-NT, ND-HCC, and HFD-NT. There was a significant difference. In HFD-HCC, the expression level of CACT was significantly lower than that of ND-NT. This result indicates that in hepatocellular carcinoma tissues, the conversion of fatty acids to long-chain acylcarnitines is increased in HFD-HCC tissues, while reconversion of long-chain acylcarnitines to acyl-CoA is suppressed. Is shown. That is, the results explain the reason why long-chain acylcarnitine species accumulate in hepatocellular carcinoma tissues (see FIG. 5). Regarding CPT1A and CPT2, a test was performed to confirm the expression level in each tissue using Western blot analysis, but a similar tendency was observed.
〔実施例３〕ヒト血清サンプルを用いた検証
ＮＡＦＬＤ患者保存血清２４１検体を用いて、液体クロマトグラフ−タンデム型質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法）及びＮｅｏＳＭＡＡＴ（登録商標）（積水メディカル社製）を用いて様々なアシルカルニチンの濃度を測定し、ＮＡＦＬＤの病態との関連性を検討した。また、血清中アシルカルニチン濃度と血清中炎症性サイトカイン濃度又は血清中発癌リスクマーカー濃度との関連性を検討した。
[Example 3] Validation using human serum sample Using 241 samples of serum stored in a NAFLD patient, liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS / MS method) and NeoSMAAT (registered trademark) (manufactured by Sekisui Medical Co., Ltd. ) Was used to measure the concentration of various acylcarnitines, and the relevance to the pathology of NAFLD was examined. In addition, the relationship between serum acylcarnitine concentration and serum inflammatory cytokine concentration or serum carcinogenic risk marker concentration was examined.
１．患者血清サンプル
ＮＡＦＬＤ患者血清を線維化の程度に応じて、以下のようにＦ０〜４及び肝細胞癌に分類した。
Ｆ０：線維化なし
Ｆ１：小葉中心部の線維化
Ｆ２：小葉中心部＋門脈域の線維化
Ｆ３：線維性架橋形成
Ｆ４：肝硬変
ＨＣＣ：肝細胞癌
２４１検体の内訳は、線維化レベルＦ０が３８検体、Ｆ１が７４検体、Ｆ２が６３検体、Ｆ４が２５検体、肝細胞癌が２３検体である。
1. Patient serum samples NAFLD patient sera were classified into F0-4 and hepatocellular carcinoma according to the degree of fibrosis as follows.
F0: No fibrosis F1: Fibrosis in the center of the lobule F2: Fibrosis in the center of the lobule + portal vein F3: Fibrous cross-link formation F4: Cirrhosis HCC: 241 hepatocellular carcinoma 38 specimens, 74 specimens of F1, 63 specimens of F2, 25 specimens of F4, and 23 specimens of hepatocellular carcinoma.
２．血清中の長鎖アシルカルニチン量の測定
採取した血清サンプルを、液体クロマトグラフ−タンデム型質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法）及びＮｅｏＳＭＡＡＴ（登録商標）を用いて測定した。ＮｅｏＳＭＡＡＴ（登録商標）には、重水素で同位体標識した、カルニチン（Ｃ０）、アセチルカルニチン（Ｃ２）、プロピオニルカルニチン（Ｃ３）、ブチリルカルニチン（Ｃ４）、イソ吉草酸カルニチン（Ｃ５）、３−ヒドロキシ−イソ吉草酸カルニチン（Ｃ５ＯＨ）、グルタリルカルニチン（Ｃ５ＤＨ）、オクタノイルカルニチン（Ｃ８）、デカノイルカルニチン（Ｃ１０）、ドデカノイルカルニチン（Ｃ１２）、テトラデカノイルカルニチン（Ｃ１４）、テトラデセノイルカルニチン（Ｃ１４：１）、パルミトイルカルニチン（Ｃ１６）、及びステアロイルカルニチン（Ｃ１８）が内部標準として含まれている。測定対象物質であるそれぞれのアシルカルニチン又は遊離カルニチンのピーク面積と内部標準物質とのピーク面積の比を算出することにより、血清サンプル中に存在する測定対象物質の量及び濃度を求めることができる。
2. Measurement of Long-Chain Acylcarnitine Amount in Serum The collected serum sample was measured using liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS / MS method) and NeoSMAAT (registered trademark). NeoSMAAT (registered trademark) includes carnitine (C0), acetylcarnitine (C2), propionylcarnitine (C3), butyrylcarnitine (C4), carnitine isovalerate (C5), and 3-isotopically labeled with deuterium. Carnitine hydroxy-isovalerate (C5OH), glutarylcarnitine (C5DH), octanoylcarnitine (C8), decanoylcarnitine (C10), dodecanoylcarnitine (C12), tetradecanoylcarnitine (C14), tetradecenoyl Carnitine (C14: 1), palmitoylcarnitine (C16), and stearoylcarnitine (C18) are included as internal standards. By calculating the ratio of the peak area of each acylcarnitine or free carnitine that is the measurement target substance to the peak area of the internal standard substance, the amount and concentration of the measurement target substance present in the serum sample can be obtained.
ヒト血清検体１０μＬにＮｅｏＳＭＡＡＴ（登録商標）に添付の内部標準原液１０μＬを添加した。エタノール２００μＬをさらに添加して１０秒間撹拌した。遠心分離（１００００ｒｐｍ、４℃、５分）を実施し、上清をガラス製試験管に移した。窒素気流下（４０℃）で濃縮乾固した。ギ酸／アセトニトリル（０．０５：１０）１００μＬを添加し、ボルテックスミキサーで１０秒間撹拌した。アセトニトリル１００μＬを添加し、ボルテックスミキサーで１０秒間撹拌した。遠心分離（２０００ｒｐｍ、４℃、３分）を実施し、上清をＨＰＬＣバイアルに移し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳでアシルカルニチン量の測定を行った。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの条件は以下のとおりである。 To 10 μL of a human serum specimen, 10 μL of an internal standard stock solution attached to NeoSMAAT (registered trademark) was added. 200 μL of ethanol was further added and stirred for 10 seconds. Centrifugation (10000 rpm, 4 ° C., 5 minutes) was performed, and the supernatant was transferred to a glass test tube. The mixture was concentrated to dryness under a stream of nitrogen (40 ° C.). 100 μL of formic acid / acetonitrile (0.05: 10) was added and stirred with a vortex mixer for 10 seconds. 100 μL of acetonitrile was added, and the mixture was stirred with a vortex mixer for 10 seconds. Centrifugation (2000 rpm, 4 ° C., 3 minutes) was performed, the supernatant was transferred to an HPLC vial, and the amount of acylcarnitine was measured by LC-MS / MS. The conditions of LC-MS / MS are as follows.
システム：ＬＣ−２０Ａシリーズ（島津製作所社製）および４０００ＱＴＲＡＰ（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製）
＜ＬＣ条件＞
ＨＰＬＣ ｃｏｌｕｍｎ：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ Ａｍｉｄｅ (２．１×２５０ｍｍ, ３μｍ, ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ)
Ｍｏｂｉｌｅ Ｐｈａｓｅ Ａ：２００ ｍｍｏｌ/Ｌ Ａｍｍｏｎｉｕｍ ｆｏｒｍａｔｅ
Ｍｏｂｉｌｅ Ｐｈａｓｅ Ｂ：Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ
Ｇｒａｄｉｅｎｔ：
System: LC-20A series (manufactured by Shimadzu Corporation) and 4000QTRAP (manufactured by AB Sciex)
<LC condition>
HPLC column: Inertsil Amide (2.1 × 250 mm, 3 μm, GL Sciences)
Mobile Phase A: 200 mmol / L Ammonium format
Mobile Phase B: Acetonitrile
Gradient:
なお、３−ヒドロキシ−ヘキサデカノイルカルニチン（Ｃ１６ＯＨ）量は、予め濃度既知の重水素置換Ｃ１６ＯＨピーク面積値と重水素置換Ｃ１６ピーク面積値を測定しておき、換算係数として換算件数＝重水素置換Ｃ１６ＯＨピーク面積値／重水素置換Ｃ１６ピーク面積値を算出し、Ｃ１６ＯＨピーク面積値と内部標準Ｃ１６ピーク面積値より算出した濃度値を前記換算係数にて除して得られた換算濃度値を基にして算出した。オクタデセノイルカルニチン（Ｃ１８：１）の量は、予め濃度既知の重水素置換Ｃ１８：１面積値と重水素置換Ｃ１８ピーク面積値を測定しておき、換算係数として換算件数＝重水素置換Ｃ１８：１ピーク面積値／重水素置換Ｃ１８面積値を算出し、Ｃ１８：１ピーク面積値と内部標準Ｃ１８ピーク面積値より算出した濃度値を前記換算係数にて除して得られた換算濃度値を基にして算出した。３−ヒドロキシ−オクタデセノイルカルニチン（Ｃ１８：１ＯＨ）の量は、予め濃度既知の重水素置換Ｃ１８：１ＯＨ面積値と重水素置換Ｃ１８ピーク面積値を測定しておき、換算係数として換算件数＝重水素置換Ｃ１８：１ＯＨピーク面積値／重水素置換Ｃ１８面積値を算出し、Ｃ１８：１ＯＨ面積値と内部標準Ｃ１８ピーク面積値より算出した濃度値を前記換算係数にて除して得られた換算濃度値を基にして算出した。 The amount of 3-hydroxy-hexadecanoylcarnitine (C16OH) is determined by measuring the peak area values of deuterium-substituted C16OH and deuterium-substituted C16 peaks of known concentrations in advance, and calculating the conversion number = deuterium substitution as a conversion coefficient. C16OH peak area value / deuterium-substituted C16 peak area value was calculated, and the concentration value calculated from the C16OH peak area value and the internal standard C16 peak area value was divided by the conversion coefficient to obtain a conversion concentration value. Was calculated. The amount of octadecenoylcarnitine (C18: 1) is determined by measuring the area value of deuterium-substituted C18: 1 and the peak area value of deuterium-substituted C18 having a known concentration in advance, and calculating the conversion factor = deuterium-substituted C18 as a conversion coefficient. : 1 peak area value / deuterium-substituted C18 area value was calculated, and the converted concentration value obtained by dividing the concentration value calculated from the C18: 1 peak area value and the internal standard C18 peak area value by the conversion coefficient was obtained. Calculated based on The amount of 3-hydroxy-octadecenoylcarnitine (C18: 1OH) is determined by measuring the deuterium-substituted C18: 1OH area value and the deuterium-substituted C18 peak area value of known concentrations in advance, and calculating the conversion number as Deuterium-substituted C18: 1OH peak area value / deuterium-substituted C18 area value was calculated, and the conversion value obtained by dividing the concentration value calculated from the C18: 1OH area value and the internal standard C18 peak area value by the conversion coefficient was used. It was calculated based on the density value.
ＡＣ１４：１（テトラデセノイルカルニチン）及びＡＣ１８：１（オクタデセノイルカルニチン）の測定結果を図６に示す。ＡＣ１４：１及びＡＣ１８：１は、肝線維化と有意な正の相関を示した。（ＡＣ１４：１はトレンド検定のｐ値が０．００８７であり、ＡＣ１８：１はトレンド検定のｐ値が０．０１１１である）。したがって、生体中のこれらの長鎖アシルカルニチン濃度を測定することにより、脂肪性肝疾患を検出でき、そして脂肪性肝疾患における線維化の進行度を判定できることが分かった。また長鎖アシルカルニチンと短鎖アシルカルニチンを組み合わせた計算式ＡＣ１４：１＋ＡＣ１８：１−ＡＣ５：０は、肝線維化とより強い正の相関を示した（ｐ値０．０００７２１）（図９）。 FIG. 6 shows the measurement results of AC14: 1 (tetradecenoylcarnitine) and AC18: 1 (octadecenoylcarnitine). AC14: 1 and AC18: 1 showed a significant positive correlation with liver fibrosis. (AC14: 1 has a p-value of 0.0087 for the trend test, and AC18: 1 has a p-value of 0.0111 for the trend test). Therefore, it was found that by measuring the concentration of these long-chain acylcarnitines in the living body, fatty liver disease can be detected and the degree of progression of fibrosis in fatty liver disease can be determined. In addition, the calculation formula AC14: 1 + AC18: 1-AC5: 0 combining the long-chain acylcarnitine and the short-chain acylcarnitine showed a stronger positive correlation with liver fibrosis (p value 0.000721) (FIG. 9).
ＡＣ５：０（イソ吉草酸カルニチン）の測定結果を図７に示す。イソ吉草酸カルニチンではトレンド検定のｐ値が０．００２４９となり、肝線維化と有意な負の相関を示した。したがって、生体中のこれらの短鎖アシルカルニチン濃度を測定することにより脂肪性肝疾患を検出でき、そして脂肪性肝疾患における線維化の進行度を判定できることが分かった。 The measurement results of AC5: 0 (carnitine isovalerate) are shown in FIG. For carnitine isovalerate, the p-value of the trend test was 0.00249, indicating a significant negative correlation with liver fibrosis. Therefore, it was found that fatty liver disease can be detected by measuring the concentration of these short-chain acylcarnitines in the living body, and the degree of progression of fibrosis in fatty liver disease can be determined.
ＨＣＣを有しないＮＡＦＬＤ患者（Ｆ０〜４の合計）、及びＨＣＣを有するＮＡＦＬＤ患者におけるＡＣ１８：１の測定結果を図８に示す。ＡＣ１８：１は、ＨＣＣを有するＮＡＦＬＤ患者において、有意に高い値を示した。したがって、生体中のＡＣ１８：１の量を測定することにより、ＮＡＳＨが進行した肝細胞癌を検出できることが分かった。 The measurement results of AC18: 1 in NAFLD patients without HCC (sum of F0 to F4) and NAFLD patients with HCC are shown in FIG. AC18: 1 showed significantly higher values in NAFLD patients with HCC. Therefore, it was found that by measuring the amount of AC18: 1 in a living body, hepatocellular carcinoma in which NASH has been advanced can be detected.
ＨＣＣを有しないＮＡＦＬＤ患者（Ｆ０〜４の合計）、及びＨＣＣを有するＮＡＦＬＤ患者において、式（ＡＣ１６：０＋ＡＣ１８：１）×１００／ＡＣ２：０（式中、ＡＣ１６：０は、対象からの体液試料中のヘキサデカノイルカルニチンの量を示し、ＡＣ１８：１は、対象からの体液試料中のオクタデセノイルカルニチンの量を示し、そしてＡＣ２：０は、対象からの体液試料中のアセチルカルニチンの量を示す）の計算値を比較した結果を図１０に示す。
前記式（ＡＣ１６：０＋ＡＣ１８：１）×１００／ＡＣ２：０の計算値は、ＨＣＣを有するＮＡＦＬＤ患者において高い値を示した。したがって、前記式の計算値を計算することにより、ＮＡＳＨが進行した肝細胞癌を検出できることが分かった。
In NAFLD patients without HCC (sum of F0-4) and NAFLD patients with HCC, the formula (AC16: 0 + AC18: 1) × 100 / AC2: 0, where AC16: 0 is the body fluid sample from the subject Indicates the amount of hexadecanoylcarnitine in the sample, AC18: 1 indicates the amount of octadecenoylcarnitine in the body fluid sample from the subject, and AC2: 0 indicates the amount of acetylcarnitine in the body fluid sample from the subject. Are shown in FIG. 10.
The calculated value of the above formula (AC16: 0 + AC18: 1) × 100 / AC2: 0 showed a high value in NAFLD patients with HCC. Therefore, it was found that the hepatocellular carcinoma with advanced NASH can be detected by calculating the calculated value of the above equation.
ＡＣ１８：１と血清炎症性サイトカイン濃度との関連性を示す図を図１１に示す。ＡＣ１８：１と血清発癌リスクマーカー濃度との関連性を示す図を図１２に示す。ＡＣ１８：１は、血清炎症性サイトカイン濃度及び血清発癌リスクマーカー濃度の各々と正の相関を示した。したがって、ＡＣ１８：１は、脂肪性肝疾患に関連した炎症及び発癌のマーカーとして使用できることが分かった。 FIG. 11 shows the relationship between AC18: 1 and the serum inflammatory cytokine concentration. FIG. 12 shows the relationship between AC18: 1 and the serum carcinogenic risk marker concentration. AC18: 1 showed a positive correlation with each of serum inflammatory cytokine concentration and serum carcinogenic risk marker concentration. Therefore, it was found that AC18: 1 can be used as a marker for inflammation and carcinogenesis associated with fatty liver disease.
本発明によれば、患者及び医療従事者に負担をかけず且つ簡易的に脂肪性肝疾患の診断を行うことができる。本発明によれば、対象が肝細胞癌に進行する前に、ＮＡＳＨを検出することができる。本発明によれば、患者及び医療従事者に負担をかけず且つ簡易的に、対象における肝線維化の進行度の判定を行うことができる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, a diagnosis of a fatty liver disease can be performed easily, without burdening a patient and a medical worker. According to the present invention, NASH can be detected before the subject progresses to hepatocellular carcinoma. Advantageous Effects of Invention According to the present invention, it is possible to easily determine the degree of progression of liver fibrosis in a subject without burdening a patient and a medical worker.
Claims (20)
測定した前記長鎖アシルカルニチンのいずれか１つ以上の量を基準値と比較することと
を含む、前記対象における脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法。 A long chain selected from the group consisting of octadecenoylcarnitine, tetradecenoylcarnitine, tetradecanoylcarnitine, hexadecanoylcarnitine, octadecanoylcarnitine, and octadecadienoylcarnitine in a body fluid sample from the subject Measuring any one or more amounts of acylcarnitine and comparing the measured amount of any one or more of the long-chain acylcarnitines with a reference value, detecting fatty liver disease in the subject Or risk prediction method.
測定した中短鎖アシルカルニチンのいずれか１つ以上の量を基準値と比較することと
をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の脂肪性肝疾患の検出又はリスクの予測方法。 Measuring the amount of any one or more of the medium- and short-chain acylcarnitines having 2 to 10 carbon atoms of the acyl group and comparing the measured amount of any one or more of the medium- and short-chain acylcarnitines with a reference value; The method for detecting fatty acid disease or predicting risk according to any one of claims 1 to 4, further comprising:
［式１］
ＡＣ１４：１＋ＡＣ１８：１−ＡＣ５：０
（式中、ＡＣ１４：１は、対象からの体液試料中のテトラデセノイルカルニチンの量を示し、ＡＣ１８：１は、対象からの体液試料中のオクタデセノイルカルニチンの量を示し、そして、ＡＣ５：０は、対象からの体液試料中のイソ吉草酸カルニチンの量を示す）
計算した前記指標スコアを基準値と比較することと
を含む、前記方法。 A method for detecting or predicting the risk of fatty liver disease in a subject, comprising calculating an index score using the following formula:
[Equation 1]
AC14: 1 + AC18: 1-AC5: 0
Wherein AC14: 1 indicates the amount of tetradecenoylcarnitine in the body fluid sample from the subject, AC18: 1 indicates the amount of octadecenoylcarnitine in the body fluid sample from the subject, and AC5: 0 indicates the amount of carnitine isovalerate in a body fluid sample from the subject)
Comparing the calculated index score to a reference value.
［式２］
（ＡＣ１６：０＋ＡＣ１８：１）×１００／ＡＣ２：０
（式中、ＡＣ１６：０は、対象からの体液試料中のヘキサデカノイルカルニチンの量を示し、ＡＣ１８：１は、対象からの体液試料中のオクタデセノイルカルニチンの量を示し、そしてＡＣ２：０は、対象からの体液試料中のアセチルカルニチンの量を示す）
計算した前記指標スコアを基準値と比較することと
を含む、前記方法。 A method for detecting or predicting the risk of fatty liver disease in a subject, comprising calculating an index score using the following formula:
[Equation 2]
(AC16: 0 + AC18: 1) × 100 / AC2: 0
Wherein AC16: 0 indicates the amount of hexadecanoylcarnitine in the body fluid sample from the subject, AC18: 1 indicates the amount of octadecenoylcarnitine in the body fluid sample from the subject, and AC2: 0 indicates the amount of acetylcarnitine in a body fluid sample from the subject)
Comparing the calculated index score to a reference value.
オクタデセノイルカルニチン、テトラデセノイルカルニチン、テトラデカノイルカルニチン、ヘキサデカノイルカルニチン、オクタデカノイルカルニチン、及びオクタデカジエノイルカルニチンからなる群から選択されることを特徴とする、前記バイオマーカー。 A biomarker in a body fluid for diagnosing fatty liver disease,
The biomarker, wherein the biomarker is selected from the group consisting of octadecenoylcarnitine, tetradecenoylcarnitine, tetradecanoylcarnitine, hexadecanoylcarnitine, octadecanoylcarnitine, and octadecadienoylcarnitine.
測定した長鎖アシルカルニチンのいずれか１つ以上の量を基準値と比較すること
を含む、前記対象における肝線維化の進行度の判定方法。 Octadecenoylcarnitine, tetradecenoylcarnitine, tetradecanoylcarnitine, hexadecanoylcarnitine, octadecanoylcarnitine, and octadecanoylcarnitine in a body fluid sample from a subject likely to have fatty liver disease. Determining the amount of any one or more of the long-chain acylcarnitines selected from the group consisting of decadienoylcarnitine Including comparing the measured amount of any one or more of the long-chain acylcarnitines with a reference value And a method for determining the degree of progression of liver fibrosis in the subject.
測定した中短鎖アシルカルニチンのいずれか１つ以上の量を基準値と比較すること
をさらに含む、請求項１５又は１６に記載の対象における肝線維化の進行度の判定方法。 Measuring the amount of any one or more of the medium- and short-chain acylcarnitines having 2 to 10 carbon atoms of the acyl group and comparing the measured amount of any one or more of the medium- and short-chain acylcarnitines with a reference value; 17. The method for determining the degree of progression of liver fibrosis in a subject according to claim 15 or 16, further comprising:
［式１］
ＡＣ１４：１＋ＡＣ１８：１−ＡＣ５：０
（式中、ＡＣ１４：１は、対象からの体液試料中のテトラデセノイルカルニチンの量を示し、ＡＣ１８：１は、対象からの体液試料中のオクタデセノイルカルニチンの量を示し、そして、ＡＣ５：０は、対象からの体液試料中のイソ吉草酸カルニチンの量を示す）
計算した前記指標スコアを基準値と比較することと
を含む、前記方法。 A method for determining the degree of progression of hepatic fibrosis in a subject who may be suffering from fatty liver disease, comprising: calculating an index score using the following formula;
AC14: 1 + AC18: 1-AC5: 0
Wherein AC14: 1 indicates the amount of tetradecenoylcarnitine in the body fluid sample from the subject, AC18: 1 indicates the amount of octadecenoylcarnitine in the body fluid sample from the subject, and AC5: 0 indicates the amount of carnitine isovalerate in a body fluid sample from the subject)
Comparing the calculated index score to a reference value.
オクタデセノイルカルニチン、テトラデセノイルカルニチン、テトラデカノイルカルニチン、ヘキサデカノイルカルニチン、オクタデカノイルカルニチン、及びオクタデカジエノイルカルニチンからなる群から選択されることを特徴とする、前記バイオマーカー。 In a subject who may be suffering from fatty liver disease, a biomarker in a body fluid for determining the degree of progression of liver fibrosis,
The biomarker, wherein the biomarker is selected from the group consisting of octadecenoylcarnitine, tetradecenoylcarnitine, tetradecanoylcarnitine, hexadecanoylcarnitine, octadecanoylcarnitine, and octadecadienoylcarnitine.
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