JP2020033023A - 栓体 - Google Patents

Abstract

【課題】様々な用途で細胞を収容する容器に適用可能な栓体を提供する。【解決手段】栓体が提供される。栓体は、弾性材で構成される本体を有し、容器を液密にシールするための栓体であって、接液部と、前記接液部の外周縁に連続する側周面部とを備える。前記側周面部は、前記容器の内周面に密着する液密領域を有する。前記液密領域の少なくとも一部は、疎水性の多孔質フィルムでラミネートされることにより、前記容器の内外で気体を連通させるように構成される。【選択図】図１Ｂ

Description

本発明は、栓体、特に細胞を収容する容器に適した栓体に関する。

従来から、細胞を培養するための容器が知られている。このような容器は、開口を有する容器本体と蓋体とからなる。容器内で細胞を培養する場合、開口を介して容器本体内に液体培地が充填され、次いで培養される細胞が播種され、蓋体によって容器の開口がシールされる。細胞は大きく嫌気性と好気性に分類される。特許文献１には、効率的に好気性細胞を培養することができる容器が開示されている。この容器の開口部に取り付けられるキャップは、上面に気体透過膜を有する。気体透過膜は、気体を連通させつつ液密性を有する材料で構成される。すなわち、二酸化炭素や酸素等の気体を容器の内外で連通させる一方、容器の液密を維持し、異物の混入や液体の漏洩を防止する。

特開２０１４−１８３７５２号公報

上面等に気体透過膜を有するキャップは、一般にメンブレンキャップと呼ばれる。メンブレンキャップを用いて容器をシールする場合、キャップを取り付けた後の容器内の液体に気泡が残存することがある。本発明者らによれば、残存した気泡が容器内の液体中を移動すると、細胞表面を気泡が撫でることによって細胞の生存や増殖にとって好ましくない刺激（シェアストレス）を与え、細胞の培養が効率的に行われないことがある。しかしながら、容器への取付時や取付後に気泡を除去する脱気操作を行うことは、従来のメンブレンキャップでは困難である。そのため、容器に取り付ける際に液体中に気泡を残存させず、なおかつ容器に取り付けられた後は気体を連通させることができるシール用の栓が望まれていた。このような栓が取り付けられる容器は、細胞の培養用途に限られず、細胞の保管や輸送の用途にも適用し得る。容器の輸送等に伴って気泡が液体内を移動することが防止されると共に、細胞の生存や増殖に必要な気体が容器内に供給されるからである。

本発明は、様々な用途で細胞を収容する容器に適用可能な栓体を提供することを目的とする。

本発明の第１観点に係る栓体は、弾性材で構成される本体を有し、容器を液密にシールするための栓体であって、前記容器の接液側に配置される接液部と、前記接液部の外周縁に連続する側周面部とを備える。前記側周面部は、前記容器の内周面に密着する液密領域を有する。前記液密領域の少なくとも一部は、疎水性の多孔質フィルムでラミネートされることにより、前記容器の内外で気体を連通させるように構成される。

本発明の第２観点に係る栓体は、第１観点に係る栓体であって、前記液密領域の全体が前記多孔質フィルムでラミネートされる。

本発明の第３観点に係る栓体は、第１観点または第２観点に係る栓体であって、前記接液部は前記多孔質フィルムでラミネートされる。

本発明の第４観点に係る栓体は、第１観点から第３観点のいずれかに係る栓体であって、前記多孔質フィルムのポアサイズは０．１μｍ以上である。

本発明の第５観点に係る栓体は、第１観点から第４観点のいずれかに係る栓体であって、前記多孔質フィルムのポアサイズは１．０μｍ以下である。

本発明の第６観点に係る栓体は、第１観点から第５観点のいずれかに係る栓体であって、前記多孔質フィルムは耐薬品性を有する。

本発明の第７観点に係る栓体は、第１観点から第６観点のいずれかに係る栓体であって、前記多孔質フィルムの材料は、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、テトラフルオロエチレン・エチレン共重合体（ＥＴＦＥ）、パーフルオロエチレンプロペンコポリマー（ＦＥＰ）、パーフルオロアルコキシアルカン（ＰＦＡ）、ポリクロロトリフルオロエチレン（ＰＣＴＦＥ）、及び超高分子量ポリエチレン（ＵＨＭＷＰＥ）からなる群より選択される材料からなる。

本発明の第８観点に係る栓体は、第１観点から第７観点のいずれかに係る栓体であって、セルカルチャーフラスコの栓、バイアル瓶の栓、試験管の栓及びシリンジ用ガスケットのいずれかとして構成される。

本発明によれば、様々な用途で細胞を収容する容器に適用可能な栓体が提供される。

本発明の一実施形態に係る栓体が用いられたセルカルチャーフラスコの断面図。 図１Ａのセルカルチャーフラスコの円筒部位周辺を拡大した断面図。 本発明の一実施形態に係る栓体の断面図。 本発明の一実施形態に係る栓体の平面図。 液滴と固体表面との接触角を説明する図。 脱気操作を説明する図。 脱気操作を説明する図。 本発明の他の実施形態に係る栓体の断面図。 本発明のさらに他の実施形態に係る栓体の断面図。 本発明のさらに他の実施形態に係る栓体の断面図。 本発明の一実施形態に係る栓体の製造工程を説明する図。 本発明の一実施形態に係る栓体の製造工程を説明する図。 本発明の一実施形態に係る栓体の製造工程を説明する図。 変形例に係る栓体の断面図。 別の変形例に係る栓体の断面図。 さらに別の変形例に係る栓体の断面図。 実験結果１を示すグラフ。 実験結果２を示すグラフ。

以下、図面を参照しつつ、本発明の一実施形態に係る栓体について説明する。

＜１．栓体の構成＞
図１Ａは、本実施形態に係る栓体１が用いられたセルカルチャーフラスコ２０（以下、単にフラスコ２０と呼ぶことがある）の断面図である。フラスコ２０は、本体部２１と、本体部２１に連続する円筒状の円筒部位２２とを有する。本体部２１は、底面部と、底面部の周囲を囲む筒状の側面部とを有する。側面部の上端は、円筒部位２２の下端部と連続しており、円筒部位２２は上方に延びている。なお、栓体１及びフラスコ２０の上下方向は図１Ａの通りに規定する。円筒部位２２の上端の周縁は、フラスコ２０の開口Ｓを規定する。図１Ａに示す状態では、円筒部位２２内の適切な位置に栓体１が配置されて、開口Ｓを液密にシールしている。

フラスコ２０は、内部の空間Ｖ内で細胞を培養するためのフラスコである。空間Ｖには、開口Ｓを介して細胞を増殖させるための液体培地が充填される。次いで、培養される細胞が液体培地に播種される。後述するように、栓体１は、開口Ｓを液密にシールする栓として機能するほか、フラスコ２０内外で気体を連通させ、好気性の細胞の生存や培養に必要な気体を供給する。また、栓体１は空間Ｖ内の液体中に気泡を残存させないようにフラスコ２０に取り付けることができる。このことによって、栓体１が用いられたフラスコ２０を細胞の培養のみならず、作成した細胞の保管や、輸送の用途に利用することが可能となる。

図１Ｂは、栓体１が押し込まれた状態の円筒部位２２の周辺を拡大した断面図である。栓体１は、円筒部位２２にフィットするような略円柱形状の外形を有し、接液側（空間Ｖ側）に配置される接液部１１と、接液部１１の外周縁に連続する側周面部１２とを備える（図２参照）。栓体１は、接液部１１が空間Ｖ内の液面に接するように押し込まれて使用される。栓体１の本体は、液体に対して不活性な弾性材料からなり、典型的には、ゴム又は熱可塑性エラストマー製である。このため、栓体１が円筒部位２２内に押し込まれると、側周面部１２が弾性によって円筒部位２０の内周面２２０に密着する。その結果、空間Ｖ内の液体が内周面２２０と栓体１の側周面部１２との隙間を通過することが阻止される。栓体１の側周面部１２のうち、内周面２２０に密着する領域を液密領域Ｌと呼ぶ。

図２Ａは栓体１の断面図であり、図２Ｂは栓体１の平面図である。栓体１の接液部１１の逆側に配置される部分を、上面部と呼ぶ。図２に示すように、上面部の中心部付近には、接液部１１側に向かって下方へ略円柱形状に窪んだ凹部Ｒが形成される。凹部Ｒは、接液部１１を構成する底面に概ね平行で、略円形の第１面１３ａと、第１面１３ａの外周縁に連続する周面１３ｂとで規定される。周面１３ｂは、第１面１３ａの外周縁から連続して立ち上がり、上端において第１面１３ａに概ね平行な第２面１３ｃに連続する。第１面１３ａ及び第２面１３ｃは、図１Ａのようにゴム栓１がフラスコ２０に取り付けられたとき、フラスコ２０の外部空間に対向し、空間Ｖ内の液体とは接触しない。

凹部Ｒは、後述する栓体１の製造工程において形成されることが望ましい。凹部Ｒが形成されることにより、栓体１でシールされたフラスコ２０の開栓が容易になる。例えば、栓体１の上面部全体が平坦面で構成され、凹部Ｒが形成されていない場合、栓体１を円筒部位２２から引き出すことは容易でない。これに対し、凹部Ｒが形成されている場合は、栓体１の側周面部１２と周面１３ｂとを挟持して栓体１を引き出すことができるので、容易に開栓ができる。或いは、凹部Ｒをプランジャーロッドの先端と連結可能に構成し、開栓に利用することも可能である。例えば、凹部Ｒをプランジャーロッド先端のねじ山と係合するようなねじ穴に形成しておき、プランジャーロッドの先端を凹部Ｒにねじ込んで、両者を連結した状態でプランジャーロッドを引くことで、円筒部位２２から容易に栓体１を引き出すことができる。

栓体１の接液部１１及び液密領域Ｌを含む側周面部１２全体は、多孔質フィルム２でラミネートされている。多孔質フィルム２は微細な空孔を有する樹脂製のフィルムであり、気体を連通させるとともに、疎水性を有する。ラミネートされた多孔質フィルム２の空孔には、栓体１の本体を構成する弾性材料が一部入り込んでおり、この弾性材料と多孔質フィルム２とは一体化した状態で栓体１を構成する（なお、図面では説明のために多孔質フィルム２が実際よりも厚く描かれている）。液密領域Ｌが多孔質フィルム２でラミネートされることにより、円筒部位２２の内周面２２０との間の摩擦が低減され、栓体１の摺動性が向上する。また、側周面部１２（液密領域Ｌ）と内周面２２０との間には、気体が透過できる程度の連通経路が形成される。従って、栓体１の使用によって、開口Ｓを液密にシールしつつも、フラスコ２０の内外で気体を連通させることができる。

多孔質フィルム２は、疎水性の材料から形成される。ここでいう疎水性とは、固体表面の水に対する濡れ性が小さいことをいう。濡れ性の大小は、接触角の大小で比較することができる。ここでいう接触角θとは、図３に示すように、固体表面Ｈに形成された水滴Ｄの外縁の接線（図３に破線で示す）と固体表面とのなす角θをいい、接触角θが大きければ大きい程濡れ性が小さく、接触角θが小さければ小さいほど濡れ性が大きい。つまり、ここでいう疎水性とは、接触角θがある程度大きいことをいう。一般的には、θ≦３０[°]の場合に固体表面が親水性であると言われ、９０≦θ[°]の場合に固体表面が疎水性であると言われる。しかしながら、栓体１がフラスコ２０を液密にシールできるのであれば、多孔質フィルム２の接触角θは好ましい９０≦θ[°]の範囲に限定されず、例えば６０≦θ[°]とすることもできる。

多孔質フィルム２を形成する材料としては、耐薬品性を有し、液体に対して不活性である材料が望ましい。具体的には、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、テトラフルオロエチレン・エチレン共重合体（ＥＴＦＥ）、パーフルオロエチレンプロペンコポリマー（ＦＥＰ）、パーフルオロアルコキシアルカン（ＰＦＡ）、ポリクロロトリフルオロエチレン（ＰＣＴＦＥ）、及び超高分子量ポリエチレン（ＵＨＭＷＰＥ）等を多孔質化したものが挙げられる。本実施形態では、多孔質フィルム２として、延伸加工されたＰＴＦＥを用いている。ＰＴＦＥは、延伸加工することにより多孔質化して、液体は透過させず、気体を透過させる膜状の材料となる。ポアサイズ（空孔の直径）は、０．１[μｍ]以上であることが好ましい。また、ポアサイズは１．０[μｍ]以上であることが好ましい。本実施形態の多孔質フィルム２の厚みは５０〜１００[μｍ]であり、ポアサイズは、０．１〜１．０[μｍ]である。

＜２．脱気操作＞
上述したように、栓体１は、空間Ｖ内の液体中に気泡を残存させないように開口Ｓをシールすることができる。栓体１は、円筒部位２２内に押し込まれて使用されるため、フラスコ２０への取り付けの際に脱気操作を行うことが可能だからである。以下、図４Ａを参照しつつ、具体的な脱気操作について説明する。まず、細胞を増殖させるための液体培地と細胞とが空間Ｖに充填され、開口Ｓが上方を向いた状態のフラスコ２０を準備する。次に、図４Ａに示すように、栓体１を接液部１１の側から開口Ｓに挿入する。このとき、円筒部位２２の内周面２２０と、栓体１の側周面部１２との隙間に細いナイロン糸３０を挟み込み、ナイロン糸３０の先端が空間Ｖ内の液体に接触するようにする。その状態で栓体１をさらに下方へ押し込み、栓体１が最後まで押し込まれる寸前にナイロン糸３０を上方に引き上げ、隙間から脱出させる（図４Ｂ）。このようにすると、液体から気泡が除去され、空間Ｖ内に気泡が残存することを防止することができる。

液体内に気泡が存在しない状態では、フラスコ２０が傾けられたり動かされたとしても、それに併せて気泡が液体内を移動することがなく、細胞の培養にとって好ましくない刺激が生じることが防止される。これによって同じ姿勢を保ちながらフラスコ２０を静置する必要がなくなり、フラスコ２０を細胞の保管や輸送用の容器として利用し得る。この場合でも、栓体１が気体を連通させることにより、液体培地中で細胞（好気性）が生存することができるばかりか、容器の外部からＣＯ₂を供給して培地のｐＨを制御し、細胞の生存や増殖にとって好ましい環境を維持することもできる。また、微小重力培養や回転培養、宇宙実験などでは、培養容器が液密に密閉され、かつ容器内の液体に気泡が存在しない状態での培養が必要となるが、このような条件での培養にも栓体１を適用した容器を利用し得る。また、細胞の保管、輸送の為に細胞を凍結させることが一般に行われているが、細胞を保管するためには保存用の溶液を用いた凍結手技が、保管用に凍結された細胞を使用するためには解凍手技が必要となる。しかしながら、細胞を再生医療に活用する場合、輸送後すぐに細胞を移植する必要がある。容器に栓体１を適用することにより、再生医療に必要な細胞を凍結させずに輸送することができ、輸送後直ちに細胞を移植することが可能となる。

＜３．その他の実施形態＞
栓体１は、セルカルチャーフラスコの栓に限定されない。別の実施形態に係る栓体１は、様々な容器の栓として構成されることができる。例えば、図５Ａに示すように、栓体１は開口部にフランジ部２３が形成されるバイアル瓶２０ａの栓として構成され得る。この場合、栓体１は第２面１３ｃの外周縁からさらに径方向に延びるフランジ部１４を有していてもよい。フランジ部１４は、下面がフランジ部２３の上面と対面して密着し、バイアル瓶２０ａの開口Ｓをシールするように構成されることができる。なお、図５Ａではフランジ部１４の下面も多孔質フィルム２でラミネートされているが、フランジ部１４の下面が多孔質フィルム２でラミネートされていなくてもよい。また、栓体１は、図５Ｂに示すように試験管２０ｂの栓としても構成され得る。

さらに、栓体１は、図５Ｃに示すように、シリンジ２４のプランジャーロッド２５の先端に装着されるガスケットとして構成され得る。この場合、栓体１は、シリンジ２４のバレル２０ｃを液密にシールする。

＜４．栓体の製造方法＞
次に、図６Ａ及び図６Ｂを参照しつつ、本実施形態に係る栓体１の製造方法について説明する。栓体１は、フラスコ２０用の栓体１である。栓体１を製造するに当たり、まず、金型１０１を用意する。

図６Ａは、栓体１を成形する工程を説明するための断面模式図である。この工程では、栓体１を成形するための金型１０１に、栓体１の本体を形成するための本体材料１１１と、多孔質フィルム２を形成するための多孔質フィルム１１２とをセットする。本体材料１１１は、ゴム又は熱可塑性エラストマーの原料からなり、本実施形態ではシート形状をしている。なお、本体材料１１１は、栓体１本体をゴムで形成する場合には、未加硫のゴムに適宜加硫剤等を混合したものとすることができる。

金型１０１は、上型１０１ａ及び下型１０１ｂとで構成される。下型１０１ｂにおいて上型１０１ａに対面する面には、キャビティー１０２が形成されている。キャビティー１０２は、概ね栓体１の外形に対応する形状を有しており、奥行方向に直交する断面形状が円形である。すなわち、キャビティー１０２は、概ね円柱形状である。

一方、上型１０１ａにおいて下型１０１ｂに対面する面には、円柱形状の凸部１０３が形成されている。上型１０１ａの凸部１０３は、下型１０１ｂのキャビティー１０２と組み合わせて使用される。なお、簡単のため、図６Ａにおいてはキャビティー１０２が３つしか示されていないが、本実施形態では、下型１０１ｂには、所定の間隔で配列される複数のキャビティー１０２が形成されているものとする。また、上型１０１ａにおいても、下型１０１ｂのキャビティー１０２に対応するように、所定の間隔で配列される複数の凸部１０３が形成されているものとする。多孔質フィルム１１２及び本体材料１１１は、キャビティー１０２の奥側から多孔質フィルム１１２、本体材料１１１の順になるように重ねて金型１０１にセットされる。

続く工程では、図６Ｂに示すように、上型１０１ａと下型１０１ｂとを閉じ、多孔質フィルム１１２及び本体材料１１１を加熱しつつ、圧縮成形を行う。このとき、上型１０１ａの凸部１０３の中心軸は、下型１０１ｂのキャビティー１０２の中心軸に位置合わせされる。また、このとき、多孔質フィルム１１２及び本体材料１１１は、上型１０１ａと下型１０１ｂとの間に挟み込まれ、キャビティー１０２内に入り込む。そして、この状態で圧縮成形が行われることにより、多孔質フィルム１１２及び本体材料１１１は軟化してキャビティー１０２内全体を埋め、キャビティー１０２の形状に成形されるとともに、多孔質フィルム１１２と本体材料１１１とが接着される。また、本体材料１１１が未加硫のゴムである場合には、加硫が行われる。なお、本体材料１１１と多孔質フィルム１１２とが接着され、本体材料１１１と多孔質フィルム１１２とを成形することができるのであれば、成形方法は圧縮成形に限られず、公知の方法を適宜用いることが可能である。

以上の処理により、図７に示すような本体材料１１１の層と多孔質フィルム１１２の層とが含まれる成形シート１１３が得られる。成形シート１１３は、上述した下型１０１ｂのキャビティー１０２の間隔に対応する所定の間隔で、栓体１が複数個連結されたものであり、これらの栓体１はバリ部１１５を介して繋がっている。バリ部１１５は、下型１０１ｂにおいて上型１０１ａに対面する面における、キャビティー１０２以外の領域と、上型１０１ａにおいて下型１０１ｂに対面する面における、凸部１０３以外の領域との間に挟まれることにより、形成される。また、成形シート１１３の上型１０１ａ側には、凸部１０３に対応する円柱形状の凹部Ｒが形成される。

続く工程では、成形シート１１３を切断して、成形シート１１３からこれに含まれる複数個の栓体１を分離する。具体的には、成形シート１１３に形成されている各凹部Ｒに図示しない位置決めロッドを嵌め込み、この状態で成形シート１１３を固定する。位置決めロッドは、成形シート１１３に形成された凹部Ｒにそれぞれ嵌め込まれたときに、成形シート１１３のバリ部１１５に概ね均等な引張力が作用するような形状に設計されている。この引張力は、成形シート１１３に含まれる各栓体１を径方向外側へと引っ張るようにバリ部１１５に作用する。この状態で、成形シート１１３を多孔質フィルム１１２側から打ち抜き刃により打ち抜くと、栓体１が得られる。

ところで、多孔質化していないＰＴＦＥフィルムをゴム製品のラミネート材料として用いることは広く行われているが、このようなＰＴＦＥフィルムは非接着性である。従って、本体材料１１１のような異種材料と接合するためには、通常、ＰＴＦＥフィルムの表面に凹凸を形成したり、化学的に結合可能とする表面改質等の何らかの接着前処理が必要である。ＰＴＦＥフィルムの表面に凹凸を形成する処理としては、例えば、プラズマやイオンビームをＰＴＦＥフィルムの表面に照射する表面改質処理や、アンモニアと金属ナトリウムとを用いる化学的処理等が挙げられる。しかしながら、このような処理は製造工程を複雑化するとともに、製造コストを増加させる。本実施形態の多孔質フィルム１１２は、ＰＴＦＥからなる材料を延伸加工することにより得られる。多孔質フィルム１１２は、本体材料１１１と一体的に成形されると、特段の接着前処理を行わなくても、本体材料１１１と接着される。これは、本体材料１１１の成形時に、本体材料１１１が多孔質フィルム１１２の無数の空孔に入り込み、アンカー効果を発揮するためである。従って、本実施形態に係る栓体１は、多孔質フィルム１１２をラミネート材料として用いることにより、表面改質処理等の接着前処理を省略し、製造コストを削減することができる。

＜５．変形例＞
以上、本発明の幾つかの実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、その趣旨を逸脱しない限りにおいて、種々の変更が可能である。例えば、以下の変更が可能である。また、以下の変形例の要旨は、適宜組み合わせることができる。

＜５−１＞
多孔質フィルム２は、必ずしも接液部１１と側周面部１２の全体とにラミネートされていなくてもよい。栓体１の側周面部１２のうち、円筒部位２２の内周面２２０に密着する液密領域Ｌで気体の連通経路が形成され、必要な気体連通性が維持されるのであれば、多孔質フィルム２をより狭い範囲にラミネートする構成も可能である。例えば、図８Ａに示すように、接液部１１には多孔質フィルム２をラミネートしないようにゴム栓１を構成することもできる。また、図８Ｂに示すように、液密領域Ｌの一部に多孔質フィルム２がラミネートされてもよい。さらに、接液部１１の形状は適宜変更することができる。例えば図８Ｃに示すように、栓体１は接液部１１が略円錐形状になるように構成されてもよい。栓体１をこのように構成すると、脱気操作の際に気泡が内周面２２０に集まりやすくなり、脱気操作がより容易になる。

＜５−２＞
上記実施形態に係る栓体１は、上記実施形態に係る製造方法以外の方法によっても製造することができる。また、本実施形態の製造工程で、成形シート１１３の打ち抜き方法の一例を記載したが、具体的な方法はこれに限定されず、位置決めロッドを使用しない方法を用いてもよい。

＜５−３＞
上記実施形態の多孔質フィルム２を構成する材料としてＰＴＦＥ、ＥＴＦＥ、ＦＥＰ、ＰＦＡ、ＰＣＴＦＥ、及びＵＨＭＷＰＥを挙げたが、これらの材料を多孔質化する方法は延伸に限定されない。ポアサイズが０．１〜１．０[μｍ]の範囲になるよう多孔質化されるのであれば、他の方法も適宜選択され得る。

同一のセルカルチャーフラスコ（以下、単にフラスコと呼ぶことがある）本体を液密にシールする栓として、気体を殆ど連通させないゴム素地栓（比較例１）、気体透過膜を有するベント（メンブレン）キャップ（比較例２）、及び本実施形態に係る栓体１（実施例）の３種類を用意した。フラスコ本体には液体培地を充填し、次いで細胞を播種した後、比較例１に係るゴム素地栓、比較例２に係るベントキャップ及び実施例に係る栓体１でそれぞれシールし、３種類のシール済みフラスコを作成した。作成したシール済みフラスコを培養環境に５日間静置した後、フラスコから細胞を取り出して、生細胞数（実験結果１）及び低酸素マーカーの発現（実験結果２）のデータを取得した。細胞の培養条件は以下の実験条件の通りである。なお、比較例１、比較例２及び実施例に係るシール済みフラスコは、各々２個用意するものとし、実験結果は同種類の２個のフラスコについて取得されたデータの平均値とした。

＜実験条件＞
セルカルチャーフラスコ：Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）ベントキャップタイプフラスコ２５ｍＬ（ＢＤＦａｌｃｏｎ社製）
細胞の種類：Ｌ６
Ｌ６の播種数：３．８×１０⁵個／ｃｍ²
液体培地：ＤＭＥＭ−ＨＧ、１０％ＦＢＳ、１％ＰＧ／ＳＭ
培養環境：３７℃、５％ＣＯ₂、９５％ＡＩＲ、９９％Ｈｕｍｉｄｉｔｙ
培養期間：５日
なお、比較例１に係るゴム素地栓は、オートクレーブ滅菌処理を施している。比較例２に係るベントキャップとは、上述したＦａｌｃｏｎ（登録商標）ベントキャップタイプフラスコ２５ｍＬに付属のキャップであり、ＰＴＦＥを材料とする気体透過膜を上面に有する。

＜実験結果１＞
実験開始から５日間経過後の生細胞数をそれぞれカウントすると、表１及び図９のグラフに示す結果が得られた。生細胞数のカウント方法は、トリパンブルー染色及び血球計算盤を用いた方法である。さらに、表１に増殖率も示す。なお、増殖率とは、５日後の生細胞数を、播種数で割ったものである。すなわち、数値が大きければ大きい程、一定期間内に細胞が多く増殖したことを示す。実施例では、比較例１及び２よりも増殖率が大きく、細胞の培養がより効率的に行われたことが分かる。

＜実験結果２＞
実験開始から５日間経過後の生細胞に発現した低酸素マーカーＣａ９の発現量をリアルタイムＰＣＲにて解析すると、図１０のグラフに示す結果が得られた。ただし、ローディングコントロールにβアクチンを用いている。低酸素マーカーＣａ９は、酸素供給量が不足した細胞に誘導されてくる低酸素誘導性因子（ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ：ＨＩＦ）の下流にある炭酸脱水酵素（ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ ＩＸ）である。すなわち、低酸素マーカーＣａ９の発現量が多ければ多い程、当該細胞が低酸素状態に陥っていることを示す。比較例１及び２では、実施例よりもＣａ９の発現量が多く、細胞への酸素供給量がより不足しやすいということが分かる。言い換えると、実施例は細胞へより多くの酸素が供給できるため、細胞の生存及び培養により適することが分かる。

１ 栓体
２ 多孔質フィルム
１１ 接液部
１２ 側周面部
２０ フラスコ（本体）
２０ａ バイアル瓶
２０ｂ 試験管
２０ｃ バレル
２１ 本体部
２２ 円筒部位
１０１ 金型
１０２ 金型のキャビティー
１０３ 凸部
１１１ 本体材料
１１２ 多孔質フィルム
１１３ 成形シート
２２０ 内周面
Ｌ 液密領域
Ｒ 凹部
Ｓ 開口

Claims (8)

1. 弾性材で構成される本体を有し、容器を液密にシールするための栓体であって、
   前記容器の接液側に配置される接液部と、
   前記接液部の外周縁に連続する側周面部と、
   を備え、
   前記側周面部は、前記容器の内周面に密着する液密領域を有し、
   前記液密領域の少なくとも一部は、疎水性の多孔質フィルムでラミネートされることにより、前記容器の内外で気体を連通させるように構成される、
   栓体。
2. 前記液密領域の全体が前記多孔質フィルムでラミネートされる、
   請求項１に記載の栓体。
3. 前記接液部は前記多孔質フィルムでラミネートされる、
   請求項１又は２に記載の栓体。
4. 前記多孔質フィルムのポアサイズは０．１μｍ以上である、
   請求項１から３のいずれかに記載の栓体。
5. 前記多孔質フィルムのポアサイズは１．０μｍ以下である、
   請求項１から４のいずれかに記載の栓体。
6. 前記多孔質フィルムは耐薬品性を有する、
   請求項１から５のいずれかに記載の栓体。
7. 前記多孔質フィルムの材料は、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、テトラフルオロエチレン・エチレン共重合体（ＥＴＦＥ）、パーフルオロエチレンプロペンコポリマー（ＦＥＰ）、パーフルオロアルコキシアルカン（ＰＦＡ）、ポリクロロトリフルオロエチレン（ＰＣＴＦＥ）、及び超高分子量ポリエチレン（ＵＨＭＷＰＥ）からなる群より選択される材料からなる、
   請求項１から６のいずれかに記載の栓体。
8. セルカルチャーフラスコの栓、バイアル瓶の栓、試験管の栓及びシリンジ用ガスケットのいずれかとして構成される、
   請求項１から７のいずれかに記載の栓体。