JP2020008682A - 顕微観察装置、顕微観察方法および顕微観察装置の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】励起光が照射された観察対象からの蛍光を利用した観察を行うことができる顕微観察装置および顕微観察方法、また、そのような顕微観察装置の製造方法を提供する。【解決手段】観察対象に励起光を照射して前記観察対象から生じる蛍光を観察する顕微観察装置１００であって、前記観察対象に励起光を照射する光源１と、複数の受光部２と、前記複数の受光部２のそれぞれに前記観察対象からの蛍光を導く非結像レンズ系と、前記光源１と前記受光部２との間に配置される第１偏光手段３および第２偏光手段４と、を備え、前記第１偏光手段３および前記第２偏光手段４の偏光特性は、前記第１偏光手段３を通過した前記励起光が前記第２偏光手段４でカットされるように構成される。【選択図】図１

Description

本発明は、顕微観察装置、顕微観察方法および顕微観察装置の製造方法に関する。

従来の光学顕微鏡とは異なり、結像や拡大縮小といった光学系の調整および観察対象の走査を要することなく、観察対象の全体を簡易に観察できる観察方法が提案されている（特許文献１）。

特開２０１８−４２２８３号公報

特許文献１に記載の観察方法は、観察対象に励起光を照射し、観察対象からの蛍光を観察することまでは想定していない。

本発明はこのような問題点に鑑みてなされたものであり、本発明の課題は、励起光が照射された観察対象からの蛍光を利用した観察を行うことができる顕微観察装置および顕微観察方法、また、そのような顕微観察装置の製造方法を提供することである。

本発明の一態様によれば、観察対象に励起光を照射して前記観察対象から生じる蛍光を観察する顕微観察装置であって、前記観察対象に励起光を照射する光源と、半導体基板と、前記半導体基板に形成された複数の受光部と、前記半導体基板および前記複数の受光部を覆う保護層と、前記保護層上に形成され、金属を含む第１偏光手段と、前記保護層および前記金属粒子を覆う酸化物平坦化層と、前記酸化物平坦化層上に形成された樹脂平坦化層と、前記樹脂平坦化層上に形成され、前記複数の受光部のそれぞれに前記観察対象からの蛍光を導く複数の樹脂製マイクロレンズと、前記光源と前記観察対象との間に配置される第２偏光手段と、を備え、前記第１偏光手段および前記第２偏光手段の偏光特性は、前記第２偏光手段を通過した励起光が前記第１偏光手段でカットされるように構成される、顕微観察装置が提供される。

本発明の別の態様によれば、観察対象に励起光を照射して前記観察対象から生じる蛍光を観察する顕微観察装置であって、前記観察対象に励起光を照射する光源と、複数の受光部と、前記複数の受光部のそれぞれに前記観察対象からの蛍光を導く非結像レンズ系と、前記観察対象と前記受光部との間に配置される第１偏光手段と、前記光源と前記観察対象との間に配置される第２偏光手段と、を備え、前記第１偏光手段および前記第２偏光手段の偏光特性は、前記第２偏光手段を通過した前記励起光が前記第１偏光手段でカットされるように構成される、顕微観察装置が提供される。

前記非結像レンズ系の上方に配置され、底面が前記第２偏光手段である載置部を備えてもよい。

前記光源と前記受光部との間に、結像用および拡大縮小用のレンズ系が配置されないのが望ましい。

また、本発明の別の態様によれば、観察対象に励起光を照射して前記観察対象から生じる蛍光を観察する顕微観察装置を製造する方法であって、前記観察対象に励起光を照射する光源、および、前記光源に取り付けられた第１偏光手段を有する光源ユニットと、複数の受光部、前記複数の受光部のそれぞれに前記観察対象からの蛍光を導く非結像レンズ系、および、前記受光部の上方に配置される第２偏光手段を有する受光ユニットと、を、前記第１偏光手段および前記第２偏光手段の偏光特性によって、前記第１偏光手段を通過した前記励起光が前記第２偏光手段でカットされるよう、取り付ける、顕微観察装置の製造方法が提供される。

また、本発明の別の態様によれば、観察対象に励起光を照射して前記観察対象から生じる蛍光を観察する顕微観察方法であって、顕微観察装置における非結像レンズ系の上方に配置された載置部に観察対象を載置することと、光源から第１偏光手段を介して励起光を前記観察対象に照射することと、前記第１偏光手段を通過した励起光を第２偏光手段の偏光特性を利用してカットしつつ、前記観察対象からの蛍光を前記非結像レンズ系によって前記受光部に導くことと、を備える顕微観察方法が提供される。

励起光が照射された観察対象からの蛍光を利用した観察を行うことができる。

本発明に係る顕微観察の概念を説明する図。 偏光手段３，４の関係を模式的に示す図。 偏光手段３，４の関係を模式的に示す図。 一実施形態に係る顕微観察装置１００の概略構成を示す断面図。 図３Ａの顕微鏡観察装置１００を含む顕微鏡観察システムのシステム構成図。 受光ユニット６０の一部拡大図。 図３の変形例である受光ユニット６０の一部拡大断面図。 図３の別の変形例である受光ユニット６０の一部拡大断面図。 顕微観察装置１００を用いた顕微観察システムを模式的に示す電気ブロック図。

図１は、本発明に係る顕微観察の概念を説明する図である。顕微観察装置１００は、光源１と、受光部２と、偏光手段３，４とを備えている。光源１は観察対象Ｔに対して励起光Ｌ１を照射する。観察対象Ｔは励起光Ｌ１によって励起され蛍光Ｌ２を発する。受光部２は観察対象Ｔからの蛍光Ｌ２を受け、電気信号に変換する。電気信号に基づいて画像を形成することで観察対象Ｔを観察できる。

ここで、光源１からの励起光Ｌ１に比べて観察対象Ｔからの蛍光Ｌ２は弱いことが多い。そのため、仮に光源１からの励起光Ｌ１が受光部２に達すると、励起光Ｌ１の影響が強すぎて、蛍光Ｌ２を利用した正確な観察が困難となる。

そこで、本発明では、光源１と受光部２との間に２つの偏光手段３，４を設ける。偏光手段３，４は、例えば電気的あるいは機械的に偏光作用を切り替えることができる。そして、偏光手段３，４の偏光特性を利用して、光源１側の偏光手段３を通過した励起光Ｌ１が受光部２側の偏光手段４によってカットされるようにする。

一例として、図２Ａに模式図を示すように、光源１側の偏光手段３が所定方向（同図では縦方向）の直線偏光のみを通過させ、受光部２側の偏光手段４が異なる方向（同図では横方向）の直線偏光のみを通過させるように偏光手段３，４を構成・配置することができる。

別の例として、図２Ｂに模式図を示すように、光源１側の偏光手段３が所定方向（同図では時計回り）の円偏光のみを通過させ、受光部２側の偏光手段４が反対方向（同図では反時計回り）の円偏光のみを通過させるように偏光手段３，４を構成・配置してもよい。

以下、顕微観察装置１００の具体的な構成例を説明する。
図３Ａは、一実施形態に係る顕微観察装置１００の概略構成を示す断面図である。顕微観察装置１００は、光源ユニット５０と、受光ユニット６０とを備えている。

光源ユニット５０は、図１に示した光源１と、偏光手段３とを一体化したものである。

受光ユニット６０は、半導体基板１１と、複数のフォトダイオード層１２と、保護層１３と、金属粒子１４と、酸化物平坦化層１５と、樹脂平坦化層１６と、複数のマイクロレンズ１７と、載置部１８とを有する。

半導体基板１１はシリコン基板などである。フォトダイオード層１２は半導体基板１１に形成された不純物拡散層であり、例えばｎ型の半導体基板１１に対してｐ型の不純物を注入することによってｐｎ接合によるフォトダイオードを形成する。複数のフォトダイオード層１２が互いに離間してマトリクス状に形成され、図１における受光部２を構成する。なお、受光部２は入射される光に対して光電変換を行うものであればよく、必ずしもフォトダイオード層１２である必要はない。

保護層１３は、例えばシリコン酸化膜あるいはシリコン窒化膜であり、フォトダイオード層１２および半導体基板１１の露出した部分を覆っている。

金属粒子１４はフォトダイオード層１２より小さい粒子であり、保護層１３上に形成される。半導体基板１１上あるいはフォトダイオード層１２上に直接金属粒子１４を形成してもよいが、保護層１３を設けるのが望ましい。複数の金属粒子１４が図１における偏光手段４として機能する。図１を用いて説明したように、偏光手段４は偏光手段３を通過した励起光をカットするように構成される。

酸化物平坦化層１５は、例えばシリコン酸化膜であり、金属粒子１４および保護層１３の露出した部分を覆っている。樹脂平坦化層１６は酸化物平坦化層１５上に形成される。樹脂平坦化層１６上に樹脂製で複数のマイクロレンズ１７がマトリクス状に形成される。酸化物平坦化層１５上に直接マイクロレンズ１７を形成してもよいが、樹脂平坦化層１６を設けることで、マイクロレンズ１７を樹脂平坦化層１６に密着させることができる。

マイクロレンズ１７のそれぞれはフォトダイオード層１２のそれぞれの直上に形成される。１つのフォトダイオード層１２と、対応する１つのマイクロレンズ１７とで画素が構成される。マイクロレンズ１７は非結像レンズ系であり、フォトダイオード層１２上に結像する必要はなく、特定の視野角θ（後述）から入射する光をフォトダイオード層１２に導くものである。なお、マイクロレンズ１７以外の視野角制御が可能な任意の層を適用してもよい。

載置部１８は観察対象Ｔが載置される部分であり、例えばマイクロレンズ１７上に形成され樹脂製で板状のものであってもよいし、マイクロレンズ１７に埋め込まれる液状あるいは固体状のものであってもよい。

なお、載置部１８、樹脂平坦化層１６、酸化物平坦化層１５および保護層１３は、少なくとも観察対象Ｔからの蛍光を透過させることができる。また、顕微観察装置１００には、光源１とフォトダイオード層１２との間に結像用あるいは拡大縮小用のレンズ系を設ける必要はない。

光源ユニット５０と受光ユニット６０とを取り付けることで顕微観察装置１００が製造される。より具体的には、光源ユニット５０における偏光手段３および受光ユニット６０における偏光手段４の偏光特性によって、偏光手段３を通過した励起光が偏光手段４でカットされるよう、光源ユニット５０と受光ユニット６０とを取り付ける。

図３Ｂは、図３Ａの顕微鏡観察装置１００を含む顕微鏡観察システムのシステム構成図である。図示のように、顕微鏡観察システムは、光源１を制御する光源制御部７１と、偏光手段３（および／または偏光手段４）の偏光作用を電気的あるいは機械的に切り替える偏光制御部７２と、受光ユニット６０を制御する受光ユニット制御部７３と、全体制御装置７０とを備えている。全体制御装置７０は、光源制御部７１、偏光制御部７２および受光ユニット制御部７３を制御するものであり、例えばパーソナルコンピュータやマイクロコンピュータによって構成される。

このような顕微観察装置１００を用い、次のようにして顕微観察が行われる。まず、観察対象Ｔを載置部１８上に載置する。次いで、光源１から偏光手段３を介して励起光を観察対象Ｔに向かって照射する。光源１からの励起光のうち特定の偏光状態のもののみが偏光手段３を通過し、観察対象Ｔに到達する。

観察対象Ｔは励起光によって励起されて蛍光を発する。この蛍光は各マイクロレンズ１７によって、対応するフォトダイオード層１２に導かれる。

一方、光源１から偏光手段３を通過した励起光は金属粒子１４から構成される偏光手段４によってカットされ、フォトダイオード層１２にはほとんど到達しない。

これにより、フォトダイオード層１２に入る光は観察対象Ｔからの蛍光が支配的となり、当該光を電気信号に変換することで、観察対象Ｔを観察できる。このように、光源１とフォトダイオード層１２との間に、偏光手段３と、金属粒子１４から構成される偏光手段４と配置された状態で励起光を観察対象Ｔに照射することで、励起光の影響を抑えて蛍光を利用した観察が可能となる。

図４は、受光ユニット６０の一部拡大断面図である。顕微観察装置１００は、マイクロレンズ１７の頂点から所定の距離Ｌ以内に配置される観察対象Ｔを撮影できるものである。ここで、所定の距離Ｌとは、マイクロレンズ１７の視野角θおよびフォトダイオード層１２の間隔Ｐにより決定される距離である。以下に、所定の距離Ｌについて説明する。

観察対象Ｔを撮影できる条件は、図４に示すように、１つのフォトダイオード層１２によって導かれるべき観察対象Ｔの撮影面の距離をＳ、フォトダイオード層１２の間隔をＰとして、以下のように表現される。
２×Ｓ≦Ｐ・・・（式１）

撮影面の距離Ｓが上記式１を満足しない場合、観察対象Ｔからの光は、本来受光されるフォトダイオード層１２において受光される他、当該フォトダイオード層１２に隣接する他のフォトダイオード層１２においても受光されてしまうこととなり、顕微観察装置１００は観察対象Ｔを、いわゆるピンボケした状態で撮影してしまう。

ここで、観察対象Ｔの撮影面の距離Ｓは、マイクロレンズ１７の視野角をθ、マイクロレンズ１７の頂点から観察対象Ｔまでの距離をＬとして、以下のように表現される。
ｔａｎθ＝Ｓ／Ｌ・・・（式２）

以上の式１および式２より、マイクロレンズ１７の頂点から観察対象Ｔまでの距離Ｌは、以下のように表現される。
Ｌ≦Ｐ／（２×ｔａｎθ）・・・（式３）

式３より、本実施形態に係る顕微観察装置１００は、マイクロレンズ１７の頂点からの距離Ｌが、Ｐ／（２×ｔａｎθ）以内に配置される観察対象Ｔを撮影できる。言い換えると、マイクロレンズ１７の頂点からの距離ＬがＰ／（２×ｔａｎθ）以内となるよう観察対象Ｔを載置部１８上に載置すれば、結像操作を行わなくても、ピンボケすることはない。

例えば、フォトダイオード層１２の間隔Ｐ＝１．７６μｍ（Ｓ＝０．８８μｍ）、θ＝１０ｄｅｇである場合、Ｌ≦５μｍとなるため、顕微観察装置１００は、マイクロレンズ１７の頂点からの距離Ｌが５μｍ以内に配置された観察対象Ｔを撮影することができる。

フォトダイオード層１２の間隔Ｐ＝３．５２μｍ（Ｓ＝１．７６μｍ）、θ＝１０ｄｅｇである場合、Ｌ≦１０μｍとなるため、顕微観察装置１００は、マイクロレンズ１７の頂点からの距離Ｌが１０μｍ以内に配置された観察対象Ｔを撮影することができる。

フォトダイオード層１２の間隔Ｐ＝１７．６４μｍ（Ｓ＝８．８２μｍ）、θ＝１０ｄｅｇである場合、Ｌ≦５０μｍとなるため、顕微観察装置１００は、マイクロレンズ１７の頂点からの距離Ｌが５０μｍ以内に配置された観察対象Ｔを撮影することができる。

なお、以上に説明したように、本実施形態に係る顕微観察装置１００は、マイクロレンズ１７の頂点からの距離Ｌが、Ｐ／（２×ｔａｎθ）以内に配置される観察対象Ｔを撮影することができるものである。したがって、載置部１８の表面上で観察する場合の載置部１８の厚さは、Ｐ／（２×ｔａｎθ）以内である必要がある。また、載置部１８の内部に観察対象Ｔがある場合は、マイクロレンズ１７の頂点からの距離Ｌが、Ｐ／（２×ｔａｎθ）以内に配置される観察対象Ｔを撮影できる。

なお、以上説明した図３の受光ユニット６０では、受光部２を構成するフォトダイオード層１２と、マイクロレンズ１７との間に、偏光手段４を構成する金属粒子１４を形成する例を示したが、偏光手段４の位置に特に制限はない。例えば、金属粒子１４に代えて、偏光作用パターン、具体的には反射・吸収作用のある樹脂あるいは金属パターンを適用してもよい。金属パターンであれば、公知の半導体プロセスを適用できる。また、パターンを用いなくとも偏光性を有する材料を用いてもよい。

図５は、図３の変形例である受光ユニット６０の一部拡大断面図である。この受光ユニット６０は、マイクロレンズ１７を覆うように樹脂平坦化層１６上に偏光手段４が形成される。そして、偏光手段４上に載置部１８が配置される。この受光ユニット６０では、マイクロレンズ１７と観察対象Ｔとの間に偏光手段４が配置されることとなる。

図６は、図３の別の変形例である受光ユニット６０の一部拡大断面図である。この受光ユニット６０は、シャーレ１８’が載置部としてマイクロレンズ１７の上方に配置される。そして、そのシャーレ１８’の底面が偏光手段４となっている。この場合も、マイクロレンズ１７と観察対象Ｔとの間に偏光手段４が配置されることとなる。

図７は、顕微観察装置１００を用いた顕微観察システムを模式的に示す電気ブロック図である。顕微観察システムは、顕微観察装置１００、信号処理回路であるロジック回路部２００、および、表示装置３００によって構成される。

ロジック回路部２００は、顕微観察装置１００のフォトダイオード層１２による光電変換により得られた電圧信号（ｒａｗ ｄａｔａ）に対して色補正（ホワイトバランス、カラーマトリクス）、ノイズ補正（ノイズリダクション、傷補正）、画質補正（エッジ強調、ガンマ補正）など所定の信号処理を施し、信号処理された電圧信号を画像信号として出力する。

本実施形態においては、顕微観察装置１００に結像用あるいは拡大縮小用のレンズ系が含まれないため、ロジック回路部２００には、このようなレンズ収差の補正やシェーディング補正するための補正回路はなくてよい。

このようなロジック回路部２００は、例えば半導体基板１１において、フォトダイオード層１２が形成された領域の周囲に形成することによって受光ユニット６０に内蔵させてもよいし、受光ユニット６０とは別基板に設けられた、受光ユニット６０とは別部品あってもよい。

また、表示装置３００はロジック回路部２００から出力される画像信号に基づいて観察対象Ｔの画像を形成し、表示する。表示装置３００は顕微観察装置１００の載置部１８に配置された観察対象Ｔの全体を一度にリアルタイム表示できる。

以上説明したように、本実施形態では、光源１と受光部２との間に２つの偏光手段３，４を配置し、偏光手段３を通過した光源１からの励起光が偏光手段４によってカットされ、受光部２にほとんど達しないようにする。そのため、励起光の影響を抑えて観察対象Ｔからの蛍光を利用した観察を行うことができる。

なお、通常の顕微観察装置（例えば、光学顕微鏡）には、結像用や拡大縮小用のレンズ系が設けられる。そのため、このような顕微観察装置に偏光手段を設けると、観察対象Ｔからの蛍光は、偏光手段を通過する際に弱くなり、上記レンズ系を通過する際にさらに弱くなる。そのため、蛍光を利用した観察を行う際には、偏光手段を設けるようなことは行われない。

しかしながら、本実施形態の構成によれば、顕微観察装置１００は結像用や拡大縮小用のレンズ系を備えないため、偏光手段４を設けることが可能となる。しかも、ピントや倍率調整といった光学系の調整や、観察対象Ｔの走査を要することなく、観察対象Ｔの全体を簡易に観察できる。

上述した実施形態は、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者が本発明を実施できることを目的として記載されたものである。上記実施形態の種々の変形例は、当業者であれば当然になしうることであり、本発明の技術的思想は他の実施形態にも適用しうることである。したがって、本発明は、記載された実施形態に限定されることはなく、特許請求の範囲によって定義される技術的思想に従った最も広い範囲とすべきである。

１ 光源
２ 受光部
３，４ 偏光手段
１１ 半導体基板
１２ フォトダイオード層
１３ 保護層
１４ 金属粒子
１５ 酸化膜平坦化層
１６ 樹脂平坦化層
１７ マイクロレンズ
１８ 載置部
１８’ シャーレ
５０ 光源ユニット
６０ 受光ユニット
７０ 全体制御装置
７１ 光源制御部
７２ 偏光制御部
７３ 受光ユニット制御部
１００ 顕微観察装置
２００ ロジック回路
３００ 表示装置

Claims (6)

1. 観察対象に励起光を照射して前記観察対象から生じる蛍光を観察する顕微観察装置であって、
   前記観察対象に励起光を照射する光源と、
   半導体基板と、
   前記半導体基板に形成された複数の受光部と、
   前記半導体基板および前記複数の受光部を覆う保護層と、
   前記保護層上に形成され、金属を含む第１偏光手段と、
   前記保護層および前記金属粒子を覆う酸化物平坦化層と、
   前記酸化物平坦化層上に形成された樹脂平坦化層と、
   前記樹脂平坦化層上に形成され、前記複数の受光部のそれぞれに前記観察対象からの蛍光を導く複数の樹脂製マイクロレンズと、
   前記光源と前記観察対象との間に配置される第２偏光手段と、を備え、
   前記第１偏光手段および前記第２偏光手段の偏光特性は、前記第２偏光手段を通過した励起光が前記第１偏光手段でカットされるように構成される、顕微観察装置。
2. 観察対象に励起光を照射して前記観察対象から生じる蛍光を観察する顕微観察装置であって、
   前記観察対象に励起光を照射する光源と、
   複数の受光部と、
   前記複数の受光部のそれぞれに前記観察対象からの蛍光を導く非結像レンズ系と、
   前記観察対象と前記受光部との間に配置される第１偏光手段と、
   前記光源と前記観察対象との間に配置される第２偏光手段と、を備え、
   前記第１偏光手段および前記第２偏光手段の偏光特性は、前記第２偏光手段を通過した前記励起光が前記第１偏光手段でカットされるように構成される、顕微観察装置。
3. 前記非結像レンズ系の上方に配置され、底面が前記第２偏光手段である載置部を備える、請求項２に記載の顕微観察装置。
4. 前記光源と前記受光部との間に、結像用および拡大縮小用のレンズ系が配置されない、請求項１乃至３のいずれかに記載の顕微観察装置。
5. 観察対象に励起光を照射して前記観察対象から生じる蛍光を観察する顕微観察装置を製造する方法であって、
   前記観察対象に励起光を照射する光源、および、前記光源に取り付けられた第１偏光手段を有する光源ユニットと、
   複数の受光部、前記複数の受光部のそれぞれに前記観察対象からの蛍光を導く非結像レンズ系、および、前記受光部の上方に配置される第２偏光手段を有する受光ユニットと、を、
   前記第１偏光手段および前記第２偏光手段の偏光特性によって、前記第１偏光手段を通過した前記励起光が前記第２偏光手段でカットされるよう、取り付ける、顕微観察装置の製造方法。
6. 観察対象に励起光を照射して前記観察対象から生じる蛍光を観察する顕微観察方法であって、
   顕微観察装置における非結像レンズ系の上方に配置された載置部に観察対象を載置することと、
   光源から第１偏光手段を介して励起光を前記観察対象に照射することと、
   前記第１偏光手段を通過した励起光を第２偏光手段の偏光特性を利用してカットしつつ、前記観察対象からの蛍光を前記非結像レンズ系によって前記受光部に導くことと、を備える顕微観察方法。