JP2020008391A - 密度測定方法および較正基準試料並びにその作製方法 - Google Patents

Abstract

【課題】主として炭酸カルシウムからなる測定対象物の密度を定量的に正確に計測することのできる密度測定方法および再現性の高い測定結果を得ることのできる較正基準試料およびその作製方法を提供すること。【解決手段】炭酸カルシウムからなり、密度が異なる複数種の較正基準試料の各々のカルサイトＣＴ値と密度との相関関係を示す検量線データを予め取得しておき、主として炭酸カルシウムからなる測定対象物および少なくとも一の較正基準試料の両者に同一のＸ線源からのＸ線を同時に照射して１次ＣＴ画像データを取得し、測定対象物の１次ＣＴ画像データにおけるＸ線吸収量変動を較正基準試料の１次ＣＴ画像データに基づいて補正し、これにより得られる２次ＣＴ画像データに基づいて測定対象物のカルサイトＣＴ値を取得し、当該カルサイトＣＴ値を前記検量線データに対照することにより、当該測定対象物の密度を測定する。【選択図】図５

Description

本発明は、主として炭酸カルシウムからなる測定対象物の密度測定方法および当該密度測定方法において用いられる較正基準試料並びにその作製方法に関する。具体的には、例えば、石灰質の殻や骨格を持つ、例えば有殻プランクトンなどの海洋生物の殻密度もしくは骨格密度を測定する密度測定方法および当該密度測定方法において用いられる較正基準試料並びにその作製方法に関する。

大気に放出された二酸化炭素の一部は海洋に吸収されることが知られている。酸性の性質を持つ二酸化炭素が弱アルカリ性の海水に溶けることにより、海水のアルカリ性が弱まって酸性に近づくことになる（海洋の酸性化（ｐＨ変化））。このため、これまでにも、例えば石灰質（炭酸カルシウム）の殻を持つ有殻プランクトンの殻が溶解するなどの海洋の酸性化による生態系への影響が懸念されてきた。近年では、図７に示すように、例えば有殻プランクトン（翼足類）の殻密度が海洋の酸性化（ｐＨ変化）に起因して低下することがわかってきた。図７（ａ）は高殻密度の検体を示し、図７（ｂ）は低殻密度の検体を示す。
そして、海洋の酸性化による生態系への影響を知る、あるいは、将来の海洋の酸性化の程度を予測するためには、有殻プランクトンにおける殻密度または骨格密度を正確に計測することが必要であると考えられる。

一般に、ヒトなどの脊椎動物の骨や歯などの骨密度（骨塩量）を測定する方法の一として、ハイドロキシアパタイトなどの基準物質を含むファントムと測定対象物（検体）とをＸ線ＣＴスキャナーによって同時にスキャンすることにより、骨密度を基準物質の相当量として算出する方法が知られている（例えば特許文献１，２参照。）。このような技術は、例えば骨粗鬆症の診断、経過追跡などに活用されている。

特開２００５−３１２９４５号公報 特開２０１７−０７０４５３号公報

上記の特許文献に記載のＸ線技術を利用した密度測定方法では、測定対象物のサイズが極めて小さいもの（例えば数百ミクロン程度のもの）である場合には、骨密度の計測には様々な技術的課題があり、微小な測定対象物の個々の骨密度を計測することは困難である。
例えば、測定対象物のサイズが微小である場合には、Ｘ線ＣＴ装置におけるＸ線管として焦点径の小さいものを用いる必要がある。しかしながら、Ｘ線管の焦点径が小さくなるほど、発生するＸ線量は減少することから、得られる透過像のコントラストは低下してしまう。そのため、Ｘ線を長時間の時間の間照射することが必要となり、Ｘ線量の変動やエネルギースペクトルの変動によるアーチファクトの影響が増大する。
また、線硬化（ビームハードニング現象）が発生すると、Ｘ線が透過する総距離の違いによって、実際のものと異なる大きさの密度値が算出されてしまうなど、得られる密度推計値には常に不確実性が伴う、といった問題がある。
さらにまた、炭酸塩の殻密度の測定に用いられるもので、かつ微小サイズの測定対象物と形状やサイズが類似するファントムは存在しないのが実情である。また、ヒト用のアパタイトほか金属元素を混合したファントムは、大きさや元素組成に基づくＸ線吸収量の差などの理由から、炭酸塩の殻密度の測定には適用することはできない。

一方、従来における有殻プランクトンの殻密度を測定する技術は、例えば複数個体について同時に重量を計測して平均化し、同様にして採取された複数個体からなるサンプルに対する重量変動から殻密度の変化を推測するものであり、有殻プランクトンの殻密度を正確に計測する技術は存在しないのが実情であった。

本発明は、以上のような事情に基づいてなされたものであって、主として炭酸カルシウムからなる測定対象物の密度を定量的に正確に計測することのできる密度測定方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、再現性の高い測定結果を得ることのできる較正基準試料およびその作製方法を提供することを目的とする。

本発明者らが鋭意研究を重ねた結果、空気と炭酸カルシウム（カルサイト）を基準物質とするカルサイトＣＴ値を新たに定義して、既知密度の試料について、Ｘ線ＣＴ法によって得られるカルサイトＣＴ値と密度の値との関係を調べたところ、カルサイトＣＴ値と密度の値との間に特定の相関関係、例えば直線関係があることが判明した。
そして、カルサイトＣＴ値と密度との間の相関関係を示す検量線データを炭酸カルシウム密度が異なる複数種の較正基準試料を用いて予め取得しておき、当該検量線データを利用することにより、測定対象物について得られたカルサイトＣＴ値に基づいて密度を定量的に測定することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。

本発明の密度測定方法は、主として炭酸カルシウムからなる測定対象物の密度を測定する方法であって、
炭酸カルシウムからなり、互いに密度が異なる複数種の較正基準試料の各々についてのカルサイトＣＴ値と、当該複数の較正基準試料の各々の密度との相関関係を示す検量線データを予め取得しておき、
少なくとも一の較正基準試料および測定対象物の両者に同一のＸ線源からのＸ線を同時に照射することにより当該較正基準試料および当該測定対象物の各々の１次ＣＴ画像データを取得し、
測定対象物の１次ＣＴ画像データにおけるＸ線吸収量変動を較正基準試料の１次ＣＴ画像データに基づいて補正して２次ＣＴ画像データを取得し、
当該測定対象物の２次ＣＴ画像データに基づいて得られる当該測定対象物のカルサイトＣＴ値を前記検量線データに対照することにより、当該測定対象物の密度を測定することを特徴とする。

本発明の密度測定方法においては、前記Ｘ線源と、前記測定対象物および前記基準設定物との間のＸ線照射経路上に、Ｘ線の低エネルギー成分を吸収する低エネルギー成分減衰フィルタが配置されることが好ましい。
このような場合には、前記低エネルギー成分減衰フィルタが、アルミニウム板よりなることが好ましい。
さらにまた、本発明の密度測定方法においては、前記Ｘ線源が、１μｍ以下の焦点径を有するマイクロフォーカスＸ線管により構成されることが好ましい。
さらにまた、本発明の密度測定方法においては、測定対象物が、炭酸カルシウムを主成分とする殻または骨格を持つ海洋生物における当該殻または骨格であることが好ましい。

本発明の較正基準試料は、上記の密度測定方法において用いられる較正基準試料であって、実質的に純度が９９．９％以上の炭酸カルシウムのみからなることを特徴とする。
また、本発明の較正基準試料は、粒子径が５μｍ以下である炭酸カルシウム粒子の粉末成形体からなることが好ましい。

本発明の較正基準試料の作製方法は、上記の較正基準試料を作製する方法であって、
純度が９９．９％以上であって、粒子径が５０μｍ以下である炭酸カルシウム粒子により構成された較正基準試料形成材料を圧縮成形して粒子径が５μｍ以下である炭酸カルシウム粒子の粉末成形体を得る成形工程を有し、
当該成形工程においては、較正基準試料形成材料を１．５〜１０ｔｏｎ／ｃｍ² の成形圧力で加圧することを特徴とする。

本発明の密度測定方法によれば、測定対象物のカルサイトＣＴ値を取得することによって、測定対象物の密度を予め取得された検量線データに基づいて正確に求めることができる。当該検量線データは、炭酸カルシウムの密度が異なる複数の較正基準試料の各々についてのカルサイトＣＴ値と密度の値との相関関係が実験による裏づけにより定量的に明らかにされたものであるため、得られる密度値は高い信頼性を有するものとなる。例えば、炭酸カルシウムを主成分とする殻または骨格を持つ数百ミクロンサイズの海洋生物（有殻プランクトン）については、１個体ごとの殻密度または骨格密度を定量的に正確に計測することができ、しかも、殻の破片からでも測定を行うこともできる。
そして、カルサイトＣＴ値の取得に際しては、較正基準試料および測定対象物の両者に同一のＸ線源からのＸ線が同時に照射されることにより、Ｘ線量の変動やエネルギースペクトルの変動によるアーチファクトの影響をキャンセルすることができるので、例えば有殻プランクトンのようにサイズが数百μｍ以下の微小な測定対象物であっても、殻密度の定量を高い確度で行うことができる。

本発明の較正基準試料によれば、実質的に炭酸カルシウムのみからなることにより、均質性の高いものとして構成することができ、上記の密度測定方法によって得られる測定結果に高い再現性を得ることができる。

本発明の較正基準試料の作製方法によれば、結合助剤としてのバインダーを用いることなく炭酸カルシウム粒子のみを成形することができて所期の較正基準試料を確実に得ることができる。

本発明の密度測定方法において利用されるマイクロフォーカスＸ線ＣＴ装置の一例における構成の概略を示す模式図である。 Ｘ線低エネルギー成分減衰フィルタの効果を説明するための図であって、同一の均質な試料についての（ａ）Ｘ線低エネルギー成分減衰フィルタを利用しなかった場合のＣＴ画像データ、（ｂ）Ｘ線低エネルギー成分減衰フィルタを利用した場合のＣＴ画像データである。 成形圧力と、取得されるカルサイトファントムの炭酸カルシウム密度との関係を示す図である。 人工炭酸塩ファントムのＣＴ画像データの一例を示す図である。 検量線データの一例を示す図である。 実験例１において測定された浮遊性有孔虫の殻密度の値（測定値）と化学分析によって得られた殻密度の値（参考値）との関係を示す図である。 海洋の酸性化による有殻プランクトンへの影響を説明する図である。（ａ）は、高殻密度の検体のサーフェスレンダリング画像であって、上下の画像は同一個体の互いに異なる断面層を示す。（ｂ）は、低殻密度の検体のサーフェスレンダリング画像であって、上下の画像は同一個体の互いに異なる断面層を示す。

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。

本発明の密度測定方法は、新たに定義した空気と炭酸カルシウム（カルサイト）とを基準物質とするカルサイトＣＴ値（空気中におけるカルサイトの密度と等価の値）と、密度値との間の相関関係を示す検量線データを、炭酸カルシウム密度が既知の複数種の較正基準試料（以下、「ファントム」という。）について予め取得しておき、ファントムを利用したＸ線ＣＴ法によって測定対象物について取得されるカルサイトＣＴ値から当該検量線データに基づいて、測定対象物の密度を得るものである。ここに、カルサイトＣＴ値とは、空気と水とを基準物質として用いて定義される医業用ＣＴ値とは異なるものであって、その定義については後述する。

本発明の密度測定方法における測定対象物は、主として炭酸カルシウムからなるものであれば、特に限定されるものではないが、本発明の密度測定方法は、例えば、炭酸カルシウムを主成分とする殻または骨格を持つ数百ミクロンサイズの海洋生物の密度を測定する場合に極めて有用である。このような海洋生物としては、例えば、炭酸カルシウムからなる殻を持つ有殻プランクトンなどが挙げられる。海洋生物が作る炭酸カルシウムには、カルサイト結晶構造のものと、アラゴナイト結晶構造のものとの２種類のものがあるが、測定対象物の殻または骨格を構成する炭酸カルシウムは、いずれの結晶構造を有するものであってもよい。

測定対象物の密度の測定にあっては、例えばマイクロフォーカスＸ線ＣＴ装置が用いられる。
図１は、本発明の密度測定方法において利用されるマイクロフォーカスＸ線ＣＴ装置の一例における構成の概略を示す模式図である。
このマイクロフォーカスＸ線ＣＴ装置は、Ｘ線を照射するＸ線源１０と、測定対象物およびファントムを保持する保持部２０と、測定対象物およびファントムを透過したＸ線を検出するＸ線検出器３０とを備えている。なお、図１においては、便宜上、測定対象物Ｓのみが保持部２０に保持された状態が示してある。

Ｘ線源１０は、焦点径が例えば１μｍ以下の範囲内で適宜設定可能とされたＸ線管により構成されている。
保持部２０は、例えば鉛直方向に延びる軸を中心に回転自在とされた回転ステージにより構成されている。また、保持部２０は、Ｘ線照射方向に移動可能に設けられており、Ｘ線源１０との間の距離が調整されることにより、Ｘ線透過画像の拡大率が変更可能に構成されている。
Ｘ線検出器３０は、例えばフラットパネル検出器により構成されており、測定対象物Ｓおよびファントムの形状および内部構造を反映したＸ線透過（Ｘ線減弱）の差が、例えば１６ビットのグレースケールによる画像の濃淡として表わされたＣＴ画像が得られる。

このマイクロフォーカスＸ線ＣＴ装置においては、Ｘ線源１０と、測定対象物Ｓおよびファントムとの間のＸ線照射経路上に、Ｘ線の低エネルギー成分を吸収するＸ線低エネルギー成分減衰フィルタ４０が内挿されて配置されている。Ｘ線低エネルギー成分減衰フィルタ４０としては、例えば純アルミニウム（例えばＡ１０１２）よりなる金属フィルタを用いることができる。Ｘ線低エネルギー成分減衰フィルタ４０は、例えば銅やチタンなどの金属板、塩化ビニルなどの樹脂板などが用いられてもよい。また、Ｘ線低エネルギー成分減衰フィルタ４０の形状は特に限定されない。
ここに、Ｘ線低エネルギー成分減衰フィルタ４０の厚みは、Ｘ線低エネルギー成分減衰フィルタ４０の構成材料のＸ線減弱係数などに基づいて設定することができる。Ｘ線低エネルギー成分減衰フィルタ４０が例えば純アルミニウムよりなる金属フィルタである場合には、その厚みは例えば０．２ｍｍである。

Ｘ線低エネルギー成分減衰フィルタ４０を備えていない場合には、図２（ａ）に示すように、密度が実質的に均一な試料について得られるＣＴ画像データには、ビームハードニングの影響によるアーチファクトの影響（画素値の不均質性）が確認され、この例では、中心部分が低密度でエッジ部分が高密度であるかのような密度分布を示す結果となっている。一方、Ｘ線低エネルギー成分減衰フィルタ４０を備えていることにより、図２（ｂ）に示すように、試料について得られるＣＴ画像データは、Ｘ線のビームハードニングによるアーチファクトの影響（輝度値の不均一性）が少ないものであり、本来の密度分布を示すＣＴ画像データが得られることが示されている。

以上において、Ｘ線源１０とＸ線検出器３０との間の距離Ｄ１は、例えば７３〜３７４ｍｍ、保持部２０（測定対象物Ｓおよびファントム）とＸ線検出器３０との間の距離Ｄ２は、例えば６０〜３７１．５ｍｍ、Ｘ線源１０とＸ線低エネルギー成分減衰フィルタ４０との間の距離Ｄ３は、例えば７１．８〜３７２．８ｍｍである。

本発明の密度測定方法においては、先ず、互いに密度が異なる複数種のファントムを用意し、当該複数種のファントムの各々についてのカルサイトＣＴ値と、当該複数種のファントムの各々の密度との相関関係を示す検量線データを予め取得しておく。検量線データの信頼性の観点から、少なくとも３種以上、好ましくは４〜５種のファントムについてカルサイトＣＴ値を取得することが望ましい。

複数種のファントムの各々は、いずれも、以下の条件を満足するものであることが必要とされる。
（１）測定対象物と同一の結晶構造の炭酸カルシウムからなること。
（２）測定対象物と形状や大きさが類似していること。
（３）内部の密度が一様（内部構造が均質）であること。
（４）炭酸カルシウム密度が既知であること。
例えば、炭酸カルシウム結晶（密度２．７１）を適度な大きさに切り出したものがファントムとしての条件を満たす。

本発明の密度測定方法においては、ファントムとしては、例えば、カルサイト結晶構造を有する炭酸カルシウム粒子の粉体成形体（人工炭酸塩ファントム、以下「カルサイトファントム」という。）、もしくは、「ＮＩＳＴ ＮＢＳ−１９」（炭酸塩基準試料）が好適に用いられる。「ＮＩＳＴ ＮＢＳ−１９」は、国際原子力機関（ＩＡＥＡ）より炭酸カルシウムの酸素・炭素同位体比標準物質として世界中に頒布されており、また均質性が保証されているものである。
カルサイトファントムは、実質的に炭酸カルシウムのみからなることにより、均質性の高いものとして構成することができ、より正確に定量的な測定を行うことができる。

上記のカルサイトファントムにあっては、炭酸カルシウム粒子として、純度が９９．９％以上であるものが用いられる。
また、カルサイトファントムを構成する炭酸カルシウム粒子としては、粒子径が例えば５μｍ以下であるものが好ましい。本明細書において「炭酸カルシウム粒子の粒子径」とは、炭酸カルシウム粒子の最大投影面に外接する長方形の短径をいうものとする。
粒子径が５μｍ以下であることにより、撮影されるＣＴ画像データの解像度よりもおおきな空隙の不均質性を可能な限り小さくすることができ所期のカルサイトファントムを確実に得ることができる。一方、炭酸カルシウム粒子の粒子径が過大である場合には、カルサイトファントムを成形すること自体が困難となる。

上記のカルサイトファントムは、次のようにして作製することができる。
すなわち、先ず、較正基準試料形成材料として、粒子径が５０μｍ以下であって純度が９９．９％以上である例えばカルサイト結晶構造を有する超高純度炭酸カルシウム粒子を用意し、マイクロ天秤を用いて所定量に秤量する。ここに、較正基準試料形成材料の量は、造形すべきカルサイトファントムの厚みが例えば約１ｍｍとなる量である。例えば、成形装置における粉末成形用ダイの型孔の内径寸法がφ１３ｍｍである場合には、超高純度炭酸カルシウム粒子の量は２５０〜３００ｍｇである。較正基準試料形成材料の量がこのように設定されることにより、最終的に得られるカルサイトファントムにおける密度の不均質性が生ずることを回避することができる。

次いで、所定量に秤量された較正基準試料形成材料を常温常圧下で粉末成形用ダイの型孔に充填し、上下パンチで加圧して圧縮成形する成形工程を行う。
成形工程においては、較正基準試料形成材料を粉末成形用ダイの型孔内に充填した後、粉末成形用ダイに対して振動を与える振動付与工程が行われることが好ましい。これにより、超高純度炭酸カルシウム粒子間の空隙を密にすることができ、得られるカルサイトファントムを均質なものとすることができる。振動付与工程に要する時間は、数分間程度である。
また、較正基準試料形成材料の加圧は、成形圧力を連続的に変更して行っても、多段階に変更して行ってもよい。成形圧力を多段階に変更して加圧を行う場合には、最終的に得られるカルサイトファントムにおける密度の不均質性が生ずることを確実に回避することができる。
成形圧力は、１．５〜１０ｔｏｎ／ｃｍ² の範囲内の大きさに設定される。成形工程は、較正基準試料形成材料に対する圧力が設定成形圧力となるまで徐々に加圧していき、設定成形圧力で所定時間の間加圧することにより行う。これにより、炭酸カルシウム粒子が圧縮により破壊されて粒子径が５μｍ以下の大きさとされた粉末成形体を得ることができる。
加圧時間は、例えば５〜１５分間であることが好ましく、例えば１０分間である。

その後、成形された円盤状のカルサイトファントム前駆体を粉末成形用ダイより静かに取り出し、これを所定の大きさに切り出すことにより、密度測定用のカルサイトファントムを得ることができる。

カルサイトファントムの炭酸カルシウム密度と成形圧力の大きさとの間には、図３に示すように、比例関係があることから、成形圧力の大きさを制御することによりカルサイトファントムの炭酸カルシウム密度を調整することができる。例えば、成形圧力を１．５ｔｏｎ／ｃｍ² とした場合には、炭酸カルシウム密度が１．９３である均質なカルサイトファントムを得ることができる。また、成形圧力を１０ｔｏｎ／ｃｍ² （上限値）とした場合には、炭酸カルシウム密度が２．２３である均質なカルサイトファントムを得ることができる。
カルサイトファントムの炭酸カルシウム密度は、例えば次のようにして測定することができる。すなわち、先ず、マイクログラム単位の重量が計測可能な天秤（マイクロ天秤）を用いて、作製したカルサイトファントム前駆体の重量を計測する。次いで、当該カルサイトファントム前駆体の体積を例えばマイクロフォーカスＸ線ＣＴによって計測する。ここに、撮像の空間解像度は１０μｍ以下とする。そして、カルサイトファントムの密度、炭酸カルシウム密度が計測された重量と体積とに基づいて計算によって求める。
本発明においては、互いに炭酸カルシウム密度の異なる複数種のカルサイトファントム前駆体を作製し、作製した複数種のカルサイトファントム前駆体の各々の炭酸カルシウム密度を測定する。
図４に、カルサイトファントム前駆体のＣＴ画像データの一例を示す。図４の（ａ）に示すカルサイトファントム前駆体の炭酸カルシウム密度は２．３０μｇ／μｍ³ 、（ｂ）に示すカルサイトファントム前駆体の炭酸カルシウム密度は２．００μｇ／μｍ³ 、（ｃ）に示すカルサイトファントム前駆体の炭酸カルシウム密度は１．９３μｇ／μｍ³ である。スケールは３００μｍである。

本発明における検量線データは、次のようにして得られたものである。
先ず、実体顕微鏡下において、作製したカルサイトファントム前駆体の中央部分からマイクロサージェリーメスを用いて長径最大３００μｍの大きさの粒子を切り出す処理を、作製した複数種のカルサイトファントム前駆体の各々について行い、これにより、数百ミクロンサイズの密度測定用のカルサイトファントムを得る。ここに、切り出す粒子（カルサイトファントム）のサイズは、ビームハードニング補正が可能な最大の厚さに一致する大きさである。

次いで、各々のカルサイトファントムについてのＣＴ画像データをマイクロフォーカスＸ線ＣＴ装置によって取得する。
図１を参照して説明すると、同一のＸ線源１０からのＸ線を、Ｘ線低エネルギー成分減衰フィルタ４０を介して、カルサイトファントムおよび上述の炭酸塩基準試料（カルサイト結晶）の両者に同時に照射する。このとき、カルサイトファントムおよび炭酸塩基準試料の両者を保持する保持部２０を回転させることにより、カルサイトファントムおよび炭酸塩基準試料の両者のＸ線透過像を全周方向から撮影する。これにより得られるカルサイトファントムおよび炭酸塩基準試料の各々についての一連のＸ線透過像に対して再構成処理を行うことにより、カルサイトファントムおよび炭酸塩基準試料の各々の１次ＣＴ画像データを取得する。

而して、得られた１次ＣＴ画像データは、Ｘ線低エネルギー成分減衰フィルタ４０の作用によって、ビームハードニングによるアーチファクトの影響が低減されたものであり、また、カルサイトファントムおよび炭酸塩基準試料は内部構造が均質なものであることから、得られる１次ＣＴ画像データは画素値が平滑なものであるはずである。しかしながら、照射される連続Ｘ線のエネルギー密度は、様々な要因により、時間の経過とともに刻一刻と不可避的に変動するため、実際に得られる１次ＣＴ画像データは、Ｘ線のエネルギースペクトルの変動によるアーチファクトの影響を含んだものとなる。
このようなアーチファクトによる影響は、カルサイトファントムおよび炭酸塩基準試料の両方に等しく生ずるものと予想される。このため、再構成処理においては、炭酸塩基準試料について得られた１次ＣＴ画像データにおける画素値を一定とする（平滑なものとする）ような補正を、カルサイトファントムについて得られた１次ＣＴ画像データに対しても同様に行う。これにより、カルサイトファントムの１次ＣＴ画像データにおけるＸ線のエネルギースペクトルの変動によるアーチファクトの影響を低減することができ、解像度の高い２次ＣＴ画像データを得ることができる。ここに、画素値が一定（画素値が平滑）とは、単位面積あたり（２０ボクセル四方）のカルサイトファントム中心部分と外周部との平均画素値の差が２．５％未満の範囲内にあることをいう。
そして、カルサイトファントムおよび炭酸塩基準試料の各々について、Ｘ線透過像の撮影および再構成処理を同様にして繰り返して行うことにより、カルサイトファントムにおける所定数の断面層の２次ＣＴ画像データを取得する。

次いで、カルサイトファントムについて得られた２次ＣＴ画像データに基づいて、カルサイトファントムのカルサイトＣＴ値を取得する。
一般に、測定対象物の元素組成が均一であれば、ここで示される２次ＣＴ画像データの濃淡のコントラストはＸ線減弱係数と相関があり、測定対象物質の密度と同義である。本発明においては、測定対象物である海洋生物における殻または骨格を構成する主成分である炭酸カルシウム（ＣａＣＯ₃ ）に着目し、空気とカルサイトとを基準物質とするＸ線減弱係数の比で表したカルサイトＣＴ値を新たに定義する。
本発明において定義するカルサイトＣＴ値は、下記式（１）によって表され、カルサイトファントムにおける任意の複数の断面層の２次ＣＴ画像データ（画像の濃淡）の各々から取得される値の平均値が、カルサイトファントムのカルサイトＣＴ値（代表値）として用いられる。
式（１） カルサイトＣＴ値＝ｋ×［（μ_sample −μ_air ）／（μ_std −μ_air ）］

上記式（１）において、ｋは、ハンスフィールドユニットに準じた定数であって、例えば１０００とされる。μ_sample ,μ_air ,およびμ_std は、それぞれ、カルサイトファントム、空気および炭酸塩基準試料のＸ線減弱係数を示す。測定対象物のカルサイトＣＴ値を取得するに際しては、μ_sample の値として、測定対象物のＸ線減弱係数が用いられ、μ_std の値として、カルサイトファントムのＸ線減弱係数が用いられる。
上記式（１）により得られるカルサイトＣＴ値は、０（空気）〜１，０００（炭酸カルシウム結晶）の数値範囲内の値であって、従って、測定対象物のカルサイトＣＴ値は、当該数値範囲内の値で示される。

そして、一のカルサイトファントムについて得られた複数の２次ＣＴ画像データの各々からカルサイトＣＴ値を取得し、これらの平均値を当該カルサイトファントムのカルサイトＣＴ値（代表値）として取得する。
このような処理を複数種のカルサイトファントムの各々について行うことにより、各々のカルサイトファントムのカルサイトＣＴ値を取得する。

上記のようにして取得された各々のカルサイトファントムのカルサイトＣＴ値および炭酸カルシウム密度の両者の関係を示す複数の実測値を、横軸を例えば炭酸カルシウム密度〔μｇ／μｍ³ 〕とし、縦軸をカルサイトＣＴ値とする座標系にプロットする。これらのプロット（実測値）を例えば直線で近似することにより、検量線データを取得することができる。なお、複数の実測値を多項式の曲線で近似することにより検量線データを取得してもよい。検量線データの一例を図５に示す。図５におけるαで示すプロットは、炭酸塩基準試料（ＮＢＳ１９）についての実測値である。図５における近似式は、炭酸カルシウム密度をＤとすると、下記式（２）により示される。
式（２） カルサイトＣＴ値＝３５１．６４×Ｄ＋４４．１２３

測定対象物の殻密度または骨格密度の測定に際しては、測定対象物の予想される殻密度値または骨格密度値を基準として同等またはそれ以上の炭酸カルシウム密度の値を有する少なくとも一のカルサイトファントムが選択されて用いられる。
そして、例えば図１に示すマイクロフォーカスＸ線ＣＴ装置を用いて、上記と同様の方法により、測定対象物Ｓおよびカルサイトファントムの両者の複数の断面層の１次ＣＴ画像データを取得し、測定対象物の１次ＣＴ画像データに対する再構成処理をカルサイトファントムについて得られた１次ＣＴ画像データに基づいて行う。
次いで、測定対象物について得られた２次ＣＴ画像データに基づいて、測定対象物のカルサイトＣＴ値を取得し、得られたカルサイトＣＴ値を予め取得しておいた検量線データに対照することにより当該測定対象物Ｓの殻密度または骨格密度を求める。

而して、上記の密度測定方法によれば、測定対象物である有殻プランクトンなどの海洋生物における殻または骨格を構成する炭酸カルシウムに着目し、測定対象物について、新たに定義した空気と炭酸カルシウム（カルサイト）を基準物質とするカルサイトＣＴ値を、ファントムを利用したＸ線ＣＴ法によって、取得することにより、測定対象物の殻密度または骨格密度を予め取得された検量線データに基づいて正確に求めることができる。当該検量線データは、炭酸カルシウム密度が互いに異なる複数種のカルサイトファントムの各々についてのカルサイトＣＴ値と密度の値との相関関係を、実験による裏づけにより定量的に明らかにしたものであるため、当該検量線データによって得られる密度値は高い信頼性を有するものとなる。そして、上記の密度測定方法によれば、例えば、有殻プランクトンについては、個体ごとの殻密度の測定だけでなく、殻の破片からでも測定を行うこともできる。
また、カルサイトＣＴ値の測定に際しては、測定対象物Ｓおよびカルサイトファントムの両者に同一のＸ線源１０からのＸ線を同時に照射してＸ線透過画像を撮影することにより、Ｘ線量の変動やエネルギースペクトルの変動によるアーチファクトの影響をファントムについて得られたＣＴ画像データに基づいてキャンセルすることができるので、例えば有殻プランクトンのようにサイズが数百μｍ以下の微小な測定対象物であっても、殻密度の定量を高い確度で行うことができる。

さらにまた、マイクロフォーカスＸ線Ｔ装置において、Ｘ線源１０と、測定対象物Ｓおよびカルサイトファントムとの間のＸ線照射経路上に、Ｘ線低エネルギー成分減衰フィルタ４０が配置されることにより、得られるＣＴ画像データにおけるビームハードニングによるアーチファクトの影響を確実に低減することができ、殻密度（または骨格密度）の定量を一層高い信頼性をもって行うことができる。

以下、本発明の効果を確認するために行った実験例について説明する。

＜実験例１＞
北太平洋に生息する動物プランクトンである浮遊性有孔虫（サイズ１５０μｍ程度）を１８個体用意した。各個体の炭酸カルシウムを主成分とする殻を測定対象物とし、測定対象物の殻密度を１個体ごとに求めた。殻密度の測定は、図１に示すマイクロフォーカスＸ線ＣＴ装置において、較正基準試料として炭酸カルシウム密度が２．７１であるカルサイトファントムを用い、以下に示す撮像条件で、測定対象物の各々の１次ＣＴ画像データを取得した。取得された測定対象物の１次ＣＴ画像データに対する再構成処理をカルサイトファントムについて得られた１次ＣＴ画像データに基づいて行った後、得られた２次ＣＴ画像データと、上記式（１）とに基づいて、カルサイトＣＴ値を求めた。取得されたカルサイトＣＴ値に基づいて、上記式（２）で示される検量線データから殻密度を求めた。
そして、以下に示す化学分析によって求められる殻密度を参考値としたとき、検量線データに基づいて測定された殻密度の値（測定値）と参考値との関係を調べた。結果を図６に示す。ここに、図６における横軸は参考値としての殻密度であり、縦軸は検量線データに基づいて取得される殻密度である。また、破線で示す直線は、測定値と参考値との誤差が０である理想曲線である。
参考値の取得にあっては、先ず、高分解能ＩＣＰ−ＭＳ（誘導結合プラズマ質量分析計）によって、１個体ずつカルシウム含有量（重量）の定量を行い、得られたカルシウム重量から炭酸カルシウム重量（殻重量）を演算により求めた。また、上記において取得された測定対象物の２次ＣＴ画像データに基づいて、各々の測定対象物の殻体積を求めた。そして、取得された殻重量と殻体積とに基づいて、測定対象物の殻密度を１個体ごとに算出した（殻密度＝殻重量／殻体積）。

［撮像条件］
Ｘ線管に対する印加電圧：８０ｋｅＶ
Ｘ線管に対する印加電流：４０μＡ
Ｘ線管の焦点径：０．８μｍ
Ｘ線管とＸ線検出器との間の距離（Ｄ１）：３７４ｍｍ
保持部とＸ線検出器との間の距離（Ｄ２）：３７１ｍｍ
Ｘ線管とＸ線低エネルギー成分減衰フィルタとの間の距離（Ｄ３）：３７２．８ｍｍ
撮影回数（断面層の数）：１２００回
拡大率：１２６．９４倍
撮影時間（Ｘ線照射時間）：６６分間
Ｘ線低エネルギー成分減衰フィルタ：材質：純アルミニウム、厚さ：０．２ｍｍ

図６に示されるように、検量線データを利用してカルサイトＣＴ値に基づいて得られる殻密度の値（測定値）の、殻重量と殻体積とから化学分析によって求められる殻密度の値（参考値）に対する誤差は、最大でも０．２５μｇ／μｍ³ 、平均すると０．０７μｇ／μｍ³ 程度であって、数百ミクロンサイズの測定対象物の殻密度を高い精度で測定することができることが確認された。

本発明の密度測定方法によれば、有殻プランクトンの１個体ごとの殻密度を正確に定量的に計測することができるようになるので、世界各地で報告されている季節単位、年単位で起こっている海洋環境の変化、とくに地球温暖化現象や海洋酸性化に対する、個々の海洋生物のボディサイズや骨格密度の変化を正確にとらえることができ、環境変化と生物との相互関係についてより一層の理解を深めることができるようになることが期待される。

１０ Ｘ線源
２０ 保持部
３０ Ｘ線検出器
４０ 低エネルギー成分減衰フィルタ
Ｓ 測定対象物

Claims (8)

1. 主体として炭酸カルシウムからなる測定対象物の密度を測定する方法であって、
   炭酸カルシウムからなり、互いに密度が異なる複数種の較正基準試料の各々についてのカルサイトＣＴ値と、当該複数の較正基準試料の各々の密度との相関関係を示す検量線データを予め取得しておき、
   少なくとも一の較正基準試料および測定対象物の両者に同一のＸ線源からのＸ線を同時に照射することにより当該較正基準試料および当該測定対象物の各々の１次ＣＴ画像データを取得し、
   測定対象物の１次ＣＴ画像データにおけるＸ線吸収量変動を較正基準試料の１次ＣＴ画像データに基づいて補正して２次ＣＴ画像データを取得し、
   当該測定対象物の２次ＣＴ画像データに基づいて得られる当該測定対象物のカルサイトＣＴ値を前記検量線データに対照することにより、当該測定対象物の密度を測定することを特徴とする密度測定方法。
2. 前記Ｘ線源と、前記測定対象物および前記基準設定物との間のＸ線照射経路上に、Ｘ線の低エネルギー成分を吸収する低エネルギー成分減衰フィルタが配置されることを特徴とする請求項１に記載の密度測定方法。
3. 前記低エネルギー成分減衰フィルタが、アルミニウム板よりなることを特徴とする請求項２に記載の密度測定方法。
4. 前記Ｘ線源が、１μｍ以下の焦点径を有するマイクロフォーカスＸ線管により構成されることを特徴とする請求項１乃至請求項３のいずれかに記載の密度測定方法。
5. 測定対象物が、炭酸カルシウムを主成分とする殻または骨格を持つ海洋生物における当該殻または骨格であることを特徴とする請求項１乃至請求項４のいずれかに記載の密度測定方法。
6. 請求項１乃至請求項５のいずれかの密度測定方法において用いられる較正基準試料であって、
   実質的に純度が９９．９％以上の炭酸カルシウムのみからなることを特徴とする較正基準試料。
7. 粒子径が５μｍ以下である炭酸カルシウム粒子の粉末成形体からなることを特徴とする請求項６に記載の較正基準試料。
8. 請求項７に記載の較正基準試料の作製方法であって、
   純度が９９．９％以上であって、粒子径が５０μｍ以下である炭酸カルシウム粒子により構成された較正基準試料形成材料を圧縮成形して粒子径が５μｍ以下である炭酸カルシウム粒子の粉末成形体を得る成形工程を有し、
   当該成形工程においては、較正基準試料形成材料を１．５〜１０ｔｏｎ／ｃｍ² の成形圧力で加圧することを特徴とする較正基準試料の作製方法。