JP2019534000A - 一般的な培地を活用する、多臓器「生体機能チップ」装置 - Google Patents

一般的な培地を活用する、多臓器「生体機能チップ」装置 Download PDF

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Abstract

本明細書では、多組織生体機能チップ装置を含む装置が記載される。一部の実施形態では、前記第１のチャンバー内の肝臓組織；前記第２のチャンバー内の心筋組織；および前記第３のチャンバー内の肺組織など、各チャンバー内の、少なくとも１つの組織と互いに流体連絡した、少なくとも第１、第２、および第３のチャンバー；ならびに前記第１、第２、および第３のチャンバー内の、一般的な水性増殖培地を含む装置が記載される。一部の実施形態では、装置は、前記第４のチャンバー内の精巣組織または卵巣組織を含む第４のチャンバーを含む。一部の実施形態では、装置は、任意選択の、第５または第６のチャンバーを含み、各前記チャンバーは、血管内皮組織、骨格筋組織、腎臓組織、神経組織、脳組織、および腸組織（例えば、小腸組織および／または結腸組織）からなる群から選択される、異なるさらなる組織を含む。また、本発明の装置を使用する方法も記載される。

Description

［関連出願］
本出願は、それらの各々の開示が、その全体が参照により本明細書の一部をなす、２０１６年１０月１４日に出願された米国特許仮出願第６２／４０８，１１３号、および２０１７年６月２０日に出願された米国特許仮出願第６２／５２２，３１８号の利益を主張する。
［政府援助］
本発明は、Ｓｐａｃｅ ａｎｄ Ｎａｖａｌ Ｗａｒｆａｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ Ｃｅｎｔｅｒ Ｐａｃｉｆｉｃ（ＳＳＣ ＰＡＣＩＦＩＣ）下の、Ｄｅｆｅｎｓｅ Ｔｈｒｅａｔ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ Ａｇｅｎｃｙ（ＤＴＲＡ）により与えられる契約第Ｎ６６００１−１３−Ｃ−２０２７号、Ａｒｍｅｄ Ｆｏｒｃｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｃｉｃｉｎｅにより与えられる助成金第Ｗ８１ＸＷＨ−１３−２−００５２号、およびＮａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにより与えられる助成金第ＮＩＨ Ｔ３２ＥＢ０１４８３６号の下における政府援助によりなされた。米国政府は本発明において、一定の権利を有する。
［発明の分野］
本発明は、一般に、それを使用する方法と共に、多組織生体機能チップ装置を含む装置に関する。
有効かつ安全な治療剤の薬物のスクリーニングおよび開発のプロセスに関する総費用は、２０億米国ドルを超える場合がある。これには、臨床試験のために、標的の同定、薬物のスクリーニング、関連法規に則る研究、および治療剤の製造に費やされる費用が含まれる。広範な前臨床試験および高額な費用がかかるにもかかわらず、フェーズＩの臨床試験に進む薬物のうちの９０％は、不合格となる１。薬物、化学物質、および生物学的薬剤の、人体に対する影響を効果的に試験しうる、改善されたモデルシステムが、火急に必要とされている２、３。
現在のところ、早期の薬物用化合物のスクリーニングの標準環境である、従来のインビトロにおける２Ｄ培養物は、インビボにおける組織の３Ｄ微小環境を再現できない４、５。標準的な組織培養物は、天然組織の微小環境との、３つの大きな差違、すなわち、基材のトポグラフィー、基材の硬さ、および最も重要なことに、３Ｄアーキテクチャーではなく、２Ｄアーキテクチャーであるという差違がある。結果として、２Ｄ培養物は、細胞に対して、選択圧をかけ、それらの元の表現型特性を実質的に変更する。薬物拡散動態もまた、２Ｄ組織培養物中では正確にモデル化されず、２Ｄにおいて有効な薬物用量は、患者に合わせてスケール調整する場合には無効であることが多い４、６、７。動物モデルは、生物学的試験のためのゴールドスタンダードとして用いられるが、結果の解釈における不確実性を含む、いくつかの欠点を有する。動物モデルの主要な弱点は、動物における、外部刺激に対する応答が、必ずしも、ヒトにおける応答を予測しないことである８。代謝および免疫における種間差違に起因して、動物モデルは、ヒトにおける有効性および毒性学の予測因子としては不十分であることが多く、薬物撤退率（ａｔｔｒｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ）に寄与している。
細胞凝集物培養システム、およびマイクロエンジニアリング／マイクロフルイディクス技術の進歩は、チップ上の３Ｄヒト組織モデルの進化に寄与している９。現在のところ、多くの生体機能チップシステムが存在する１０、１１ほか、いくつかのオンチップ疾患モデルも存在する１０。現在までの進歩にもかかわらず、生体機能チップモデルは、通常のヒト組織の要素のうちの多くを欠いている。
本発明の一態様は、多組織生体機能チップ装置を対象とする。一部の実施形態では、装置は、互いと流体連絡した、少なくとも第１、第２、および第３のチャンバー；前記第１のチャンバー内の肝臓組織；前記第２のチャンバー内の心筋組織；前記第３のチャンバー内の肺組織；ならびに前記第１、第２、および第３のチャンバー内の、一般的な水性増殖培地を含む。一部の実施形態では、装置は、互いと流体連絡した、少なくとも第１、第２、第３、第４、第５、および第６のチャンバー；前記第１のチャンバー内の肝臓組織、前記第２のチャンバー内の組織、前記第３のチャンバー内の肺組織、前記第４のチャンバー内の脳組織、前記第５のチャンバー内の結腸組織、前記第６のチャンバー内の精巣または卵巣組織；ならびに前記第１、第２、第３、第４、第５、および第６のチャンバー内の、一般的な水性増殖培地を含む。
本発明のさらなる態様は、本発明の装置を使用する方法を対象とする。一部の実施形態では、方法は、（ａ）本発明の装置を用意するステップと；（ｂ）一般的な水性増殖培地を、装置のチャンバーの全てを通して、少なくとも１、４、８、または１１日間にわたり循環させるステップとを含む。一部の実施形態では、方法は、試験化合物を、一般的な水性増殖培地に添加するステップと；次いで、装置内に存在する、少なくとも１つの組織、または複数の組織における、試験化合物に対する薬理学的応答または毒性学的応答を検出するステップとを含む。
本発明の別の態様は、インビトロにおける、薬物スクリーニング、毒性学スクリーニング、および／または疾患モデル化の方法であって、本発明の装置を用意するステップと；装置内に存在する、少なくとも１つの組織、または複数の組織における、薬理学的応答または毒性学的応答を検出するステップとを含む方法を対象とする。
１つの実施形態に関して記載される、本発明の態様は、別段に、それに関すると記載されていなくても、異なる実施形態に組み込まれうることが注目される。すなわち、全ての実施形態および／または任意の実施形態の特徴は、任意の方式および／または組合せで組み合わせることができる。出願人は、元に出願された任意の特許請求の範囲を変化させ、かつ／または、これに応じて、元は、このようにして特許請求されたのではないが、任意の、元に出願された、従属元の請求項を補正し、かつ／または他の任意の、１または複数の請求項の任意の特徴を組み込むことが可能である権利を含む、任意の新たな請求項を出願する権利を留保する。本発明の、これらの目的および他の目的、ならびに／またはこれらの態様および他の態様については、下記で明示される明細書において、詳細に説明する。当業者は、本発明の、さらなる特徴、利点、および詳細を、後続の図面および好ましい実施形態についての詳細な記載を読むことにより理解するであろうが、このような記載は、本発明を例示するにすぎない。
様々なバイオファブリケーション手法を使用する、典型的な６組織生体機能チップシステムのための、全体的デザインおよび実現戦略を示す図である。６組織モデルを維持するために構築された、モジュラー生体機能チップのハードウェアシステムについての例示および写真である。個々のマイクロ流体式マイクロリアクターユニットは、各オルガノイドまたは各組織モデルを格納し、中央流体ルーティングブレッドボードを介して接続されており、簡単な「プラグアンドプレイ」システムによる調製の初期設定を可能とする。 様々なバイオファブリケーション法を使用する、典型的な６組織生体機能チップシステムのための、全体的デザインおよび実現戦略を示す図である。６組織モデルを維持するために構築された、モジュラー生体機能チップハードウェアシステムについての例示および写真である。個々のマイクロ流体式マイクロリアクターユニットは、各オルガノイドまたは各組織モデルを格納し、中央流体ルーティングブレッドボードを介して接続されており、簡単な「プラグアンドプレイ」システムによる調製の初期設定を可能とする。 様々なバイオファブリケーション法を使用する、典型的な６組織生体機能チップシステムのための、全体的デザインおよび実現戦略を示す図である。システムのために、各組織型を、どのようにして調製するのかについての全般的な概観を示す図である。肝臓モジュール、心臓モジュール、および精巣モジュールを、特製のバイオインク中で、球形のオルガノイドをバイオプリンティングすることにより創出する結果として、マイクロリアクターデバイス内に設置された、３Ｄハイドロゲル構築物がもたらされることを示す図である。 様々なバイオファブリケーション法を使用する、典型的な６組織生体機能チップシステムのための、全体的デザインおよび実現戦略を示す図である。システムのために、各組織型を、どのようにして調製するのかについての全般的な概観を示す図である。血管モジュールおよび肺モジュールが、細胞の層を、マイクロ流体デバイス内の多孔性膜上に創出することにより形成されることを示す図である。ＴＥＥＲ（経内皮［または上皮］電気抵抗）センサーの導入は、経時的に、組織障壁機能の完全性をモニタリングすることを可能とする。 様々なバイオファブリケーション法を使用する、典型的な６組織生体機能チップシステムのための、全体的デザインおよび実現戦略を示す図である。システムのために、各組織型を、どのようにして調製するのかについての全般的な概観を示す図である。Ｉ型コラーゲン内の、結腸の平滑筋細胞および結腸の上皮細胞を、ポリマー鋳型内に封入することにより、結腸モジュールを創出することを示す図である。平滑筋細胞は、コラーゲンとアライメントし、オルガノイドを収縮させ、その後、オルガノイドは、ドーナツ様の形状を呈する。次いで、個々のオルガノイドを、マイクロ流体デバイス内に固定化するために、ヒアルロン酸ハイドロゲル内に封入する。 生体機能チップシステム内の、一般的な培地条件下における、６つのオルガノイドの維持を示す図である。統合型システム内の、肝臓、心臓、結腸、肺、血管、および精巣の組織モデルについての、７日間の生存率を示す図である。緑は、カルセインＡＭで染色された生細胞であり、赤は、エチジウムホモ二量体で染色された死細胞である。 生体機能チップシステム内の、一般的な培地条件下における、６つのオルガノイドの維持を示す図である。統合型システム内の、肝臓、心臓、結腸、肺、血管、および精巣の組織モデルについての、１４日間の生存率を示す図である。緑は、カルセインＡＭで染色された生細胞であり、赤は、エチジウムホモ二量体で染色された死細胞である。 生体機能チップシステム内の、一般的な培地条件下における、６つのオルガノイドの維持を示す図である。溶液中のバイオマーカーが、システムが見かけ上の平衡状態に達していることを示す図である。アルブミンおよび尿素の定量化が、培地中のアルブミンおよび尿素の分泌は、経時的に比較的一貫しており、培地対照よりも有意に高度であることを示す図である。 生体機能チップシステム内の、一般的な培地条件下における、６つのオルガノイドの維持を示す図である。溶液中のバイオマーカーが、システムが見かけ上の平衡状態に達していることを示す図である。アルブミンおよび尿素の定量化が、培地中のアルブミンおよび尿素の分泌は、経時的に比較的一貫しており、培地対照よりも有意に高度であることを示す図である。 生体機能チップシステム内の、一般的な培地条件下における、６つのオルガノイドの維持を示す図である。溶液中のバイオマーカーが、システムが見かけ上の平衡状態に達していることを示す図である。細胞の溶解および毒性についての一般的マーカーであるＬＤＨが、培地対照のレベルに近いレベルを維持することから、細胞死が比較的少ないことを示す図である。 生体機能チップシステム内の、一般的な培地条件下における、６つのオルガノイドの維持を示す図である。溶液中のバイオマーカーが、システムが見かけ上の平衡状態に達していることを示す図である。細胞が死ぬと、溶解した心筋細胞により放出されるバイオマーカーであるクレアチンキナーゼが、比較的少ないままである（８日目の定量化におけるスパイク（その後、培地対照レベルに近い低濃度に復帰した）を除く）を示す図である。 生体機能チップシステム内の、一般的な培地条件下における、６つのオルガノイドの維持を示す図である。溶液中のバイオマーカーが、システムが見かけ上の平衡状態に達していることを示す図である。それぞれ、肺上皮および血管内皮から放出されるタンパク質である、ＩＬ−８およびプロスタサイクリンが、当初増大するが、経時的に、ベースラインレベルへと減少することから、肺構築物および血管構築物が、システム始動時には、ストレスを受けたが、経時的に、定常状態へと平衡化したことを示唆する図である。 生体機能チップシステム内の、一般的な培地条件下における、６つのオルガノイドの維持を示す図である。溶液中のバイオマーカーが、システムが見かけ上の平衡状態に達していることを示す図である。それぞれ、肺上皮および血管内皮から放出されるタンパク質である、ＩＬ−８およびプロスタサイクリンが、当初増大するが、経時的に、ベースラインレベルへと減少することから、肺構築物および血管構築物が、システム始動時には、ストレスを受けたが、経時的に、定常状態へと平衡化したことを示唆する図である。 チップ上の血管系を示し、内皮マーカー発現、経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）の測定に対する応答、および物質移動の変化を示す図である。内皮マーカー、ＣＤ３１についての免疫染色を示す図である。 チップ上の血管系を示し、内皮マーカー発現、経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）の測定に対する応答、および物質移動の変化を示す図である。内皮マーカー、ｖＷＦについての免疫染色を示す図である。ヒスタミンの投与に対する、内皮の機能的な応答を示す図である。ヒスタミンは、内皮の破壊を引き起こす結果として、膜を隔てた抵抗の顕著な低下をもたらす。未使用の培地による洗浄は、抵抗の復帰を結果としてもたらす。 チップ上の血管系を示し、内皮マーカー発現、経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）の測定に対する応答、および物質移動の変化を示す図である。内皮マーカー、ＶＥカドヘリンについての免疫染色を示す図である。 チップ上の血管系を示し、内皮マーカー発現、経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）の測定に対する応答、および物質移動の変化を示す図である。血管モジュールの内皮についての、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ生存／細胞傷害作用染色を示す図である。緑は、カルセインＡＭで染色された生細胞であり、赤は、エチジウムホモ二量体で染色された死細胞である。 チップ上の血管系を示し、内皮マーカー発現、経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）の測定に対する応答、および物質移動の変化を示す図である。ＴＥＥＲ測定システムの回路図である。 チップ上の血管系を示し、内皮マーカー発現、経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）の測定に対する応答、および物質移動の変化を示す図である。ベースライン条件下では、内皮が、完全性を維持する結果として、単層を隔てて、比較的大きな抵抗をもたらすことを示す図である。損傷または何らかの刺激の下では、内皮は、不連続となる結果として、単層を隔てた抵抗の降下をもたらす。挿入画像は、ＴＥＥＲセンサーを伴う血管モジュールのものである。 チップ上の血管系を示し、内皮マーカー発現、経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）の測定に対する応答、および物質移動の変化を示す図である。細胞を、半多孔性膜に播種した後、毎日のＴＥＥＲの測定が、培養中の経時的な、単層内の細胞充実度の増大を示す図である。統計学的有意性は、＊ｐ＜０．０５である。 チップ上の血管系を示し、内皮マーカー発現、経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）の測定に対する応答、および物質移動の変化を示す図である。統計学的有意性は、＊ｐ＜０．０５である。 チップ上の血管系を示し、内皮マーカー発現、経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）の測定に対する応答、および物質移動の変化を示す図である。肝臓オルガノイドが、内皮の下方の肝臓バイオインク中に位置する一方で、内皮層上の流動が保存される、チップ上の血管デバイスについての描示を示す図である。統計学的有意性を示す＊および＊＊は、それぞれ、表示の時点における、コンフルエント条件と、非コンフルエント条件との間の、ｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１を描示する。＃は、コンフルエント実験群内では、時点３５、４０、および４５分における蛍光強度が、時点１０、１５、および２０より有意に大きい（ｐ＜０．０５）ことから、ヒスタミン投与の２０分後における、肯定的な色素移動の存在が示されることを表す。 チップ上の血管系を示し、内皮マーカー発現、経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）の測定に対する応答、および物質移動の変化を示す図である。内皮（主に、青に見える）と、肝臓オルガノイド細胞（主に、赤に見える）との緊密な相互作用を示す、２つのマクロ共焦点３Ｄ再構築画像を示す図である。 チップ上の血管系を示し、内皮マーカー発現、経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）の測定に対する応答、および物質移動の変化を示す図である。ヒスタミン投与の影響としての、内皮開通性ベースの、色素の除去および移動を示す図である。通常の培地条件下では、１５ｋＤａの、蛍光可溶性ゼラチン色素は、循環から離れ、下側チャンバー内に保持される。ヒスタミンを投与すると、色素は、内皮を通して、循環へと透過しうる。 チップ上の血管系を示し、内皮マーカー発現、経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）の測定に対する応答、および物質移動の変化を示す図である。ヒスタミン投与の前および後に、モジュールから採取されたアリコートについての、蛍光強度の読み取りを示す図である。蛍光は、励起波長５８４ｎｍおよび発光波長６１２ｎｍを使用して読み取った。 ＦＤＡによりリコールされた薬物に対するスクリーンに応答する、３Ｄの肝臓オルガノイドおよび心臓オルガノイドについてのＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色を示す図である。肝臓における、トログリタゾンおよびミベフラジルを示す図である。緑は、カルセインＡＭで染色された生細胞であり、赤は、エチジウムホモ二量体で染色された死細胞である。 ＦＤＡによりリコールされた薬物に対するスクリーンに応答する、３Ｄの肝臓オルガノイドおよび心臓オルガノイドについてのＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色を示す図である。心臓における、アステミゾール、ペルゴグリド、およびテロジリンを示す図である。緑は、カルセインＡＭで染色された生細胞であり、赤は、エチジウムホモ二量体で染色された死細胞である。 ＦＤＡによりリコールされた薬物についてのスクリーンに応答するＡＴＰ活性についての、３Ｄの肝臓オルガノイドおよび心臓オルガノイド、２Ｄの肝細胞培養物および心筋細胞培養物、ならびに２ＤのＨｅｐＧ２細胞株培養物およびＣ２Ｃ１２細胞株培養物の間の比較を示す図である。トログリタゾンに応答する、肝臓オルガノイド培養物、２Ｄの初代ヒト肝細胞培養物、および２ＤのｈｅｐＧ２細胞株培養物のＡＴＰ活性を示す図である。群間の比較は、薬物を伴わない、ベースラインのＡＴＰ活性レベルに対して正規化した。統計学的有意性は：＊は、両方の２Ｄ培養物と対比した、３Ｄオルガノイドのｐ＜０．０５であり；＃は、３Ｄオルガノイドおよび２Ｄ細胞株の両方と対比した、２Ｄの肝細胞／心筋細胞のｐ＜０．０５であり；＄は、３Ｄオルガノイドおよび２Ｄの肝細胞／心筋細胞の両方と対比した、２Ｄ細胞株のｐ＜０．０５である。 ＦＤＡによりリコールされた薬物についてのスクリーンに応答するＡＴＰ活性についての、３Ｄの肝臓オルガノイドおよび心臓オルガノイド、２Ｄの肝細胞培養物および心筋細胞培養物、ならびに２ＤのＨｅｐＧ２細胞株培養物およびＣ２Ｃ１２細胞株培養物の間の比較を示す図である。ミベフラジルに応答する、肝臓オルガノイド培養物、２Ｄの初代ヒト肝細胞培養物、および２ＤのｈｅｐＧ２細胞株培養物のＡＴＰ活性を示す図である。群間の比較は、薬物を伴わない、ベースラインのＡＴＰ活性レベルに対して正規化した。統計学的有意性は：＊は、両方の２Ｄ培養物と対比した、３Ｄオルガノイドのｐ＜０．０５であり；＃は、３Ｄオルガノイドおよび２Ｄ細胞株の両方と対比した、２Ｄの肝細胞／心筋細胞のｐ＜０．０５であり；＄は、３Ｄオルガノイドおよび２Ｄの肝細胞／心筋細胞の両方と対比した、２Ｄ細胞株のｐ＜０．０５である。 ＦＤＡによりリコールされた薬物についてのスクリーンに応答するＡＴＰ活性についての、３Ｄの肝臓オルガノイドおよび心臓オルガノイド、２Ｄの肝細胞培養物および心筋細胞培養物、ならびに２ＤのＨｅｐＧ２細胞株培養物およびＣ２Ｃ１２細胞株培養物の間の比較を示す図である。ブロムフェナクに応答する、肝臓オルガノイド培養物、２Ｄの初代ヒト肝細胞培養物、および２ＤのｈｅｐＧ２細胞株培養物のＡＴＰ活性を示す図である。群間の比較は、薬物を伴わない、ベースラインのＡＴＰ活性レベルに対して正規化した。統計学的有意性は：＊は、両方の２Ｄ培養物と対比した、３Ｄオルガノイドのｐ＜０．０５であり；＃は、３Ｄオルガノイドおよび２Ｄ細胞株の両方と対比した、２Ｄの肝細胞／心筋細胞のｐ＜０．０５であり；＄は、３Ｄオルガノイドおよび２Ｄの肝細胞／心筋細胞の両方と対比した、２Ｄ細胞株のｐ＜０．０５である。 ＦＤＡによりリコールされた薬物についてのスクリーンに応答するＡＴＰ活性についての、３Ｄの肝臓オルガノイドおよび心臓オルガノイド、２Ｄの肝細胞培養物および心筋細胞培養物、ならびに２ＤのＨｅｐＧ２細胞株培養物およびＣ２Ｃ１２細胞株培養物の間の比較を示す図である。チエニル酸に応答する、肝臓オルガノイド培養物、２Ｄの初代ヒト肝細胞培養物、および２ＤのｈｅｐＧ２細胞株培養物のＡＴＰ活性を示す図である。群間の比較は、薬物を伴わない、ベースラインのＡＴＰ活性レベルに対して正規化した。統計学的有意性は：＊は、両方の２Ｄ培養物と対比した、３Ｄオルガノイドのｐ＜０．０５であり；＃は、３Ｄオルガノイドおよび２Ｄ細胞株の両方と対比した、２Ｄの肝細胞／心筋細胞のｐ＜０．０５であり；＄は、３Ｄオルガノイドおよび２Ｄの肝細胞／心筋細胞の両方と対比した、２Ｄ細胞株のｐ＜０．０５である。 ＦＤＡによりリコールされた薬物についてのスクリーンに応答するＡＴＰ活性についての、３Ｄの肝臓オルガノイドおよび心臓オルガノイド、２Ｄの肝細胞培養物および心筋細胞培養物、ならびに２ＤのＨｅｐＧ２細胞株培養物およびＣ２Ｃ１２細胞株培養物の間の比較を示す図である。アステミゾールに応答する、心臓オルガノイド培養物、２ＤのｉＰＳ由来心筋細胞培養物、および２ＤのＣ２Ｃ１２細胞株培養物のＡＴＰ活性を示す図である。群間の比較は、薬物を伴わない、ベースラインのＡＴＰ活性レベルに対して正規化した。統計学的有意性は：＊は、両方の２Ｄ培養物と対比した、３Ｄオルガノイドのｐ＜０．０５であり；＃は、３Ｄオルガノイドおよび２Ｄ細胞株の両方と対比した、２Ｄの肝細胞／心筋細胞のｐ＜０．０５であり；＄は、３Ｄオルガノイドおよび２Ｄの肝細胞／心筋細胞の両方と対比した、２Ｄ細胞株のｐ＜０．０５である。 ＦＤＡによりリコールされた薬物についてのスクリーンに応答するＡＴＰ活性についての、３Ｄの肝臓オルガノイドおよび心臓オルガノイド、２Ｄの肝細胞培養物および心筋細胞培養物、ならびに２ＤのＨｅｐＧ２細胞株培養物およびＣ２Ｃ１２細胞株培養物の間の比較を示す図である。ペルゴグリドに応答する、心臓オルガノイド培養物、２ＤのｉＰＳ由来心筋細胞培養物、および２ＤのＣ２Ｃ１２細胞株培養物のＡＴＰ活性を示す図である。群間の比較は、薬物を伴わない、ベースラインのＡＴＰ活性レベルに対して正規化した。統計学的有意性は：＊は、両方の２Ｄ培養物と対比した、３Ｄオルガノイドのｐ＜０．０５であり；＃は、３Ｄオルガノイドおよび２Ｄ細胞株の両方と対比した、２Ｄの肝細胞／心筋細胞のｐ＜０．０５であり；＄は、３Ｄオルガノイドおよび２Ｄの肝細胞／心筋細胞の両方と対比した、２Ｄ細胞株のｐ＜０．０５である。 ＦＤＡによりリコールされた薬物についてのスクリーンに応答するＡＴＰ活性についての、３Ｄの肝臓オルガノイドおよび心臓オルガノイド、２Ｄの肝細胞培養物および心筋細胞培養物、ならびに２ＤのＨｅｐＧ２細胞株培養物およびＣ２Ｃ１２細胞株培養物の間の比較を示す図である。テロジリンに応答する、心臓オルガノイド培養物、２ＤのｉＰＳ由来心筋細胞培養物、および２ＤのＣ２Ｃ１２細胞株培養物のＡＴＰ活性を示す図である。群間の比較は、薬物を伴わない、ベースラインのＡＴＰ活性レベルに対して正規化した。統計学的有意性は：＊は、両方の２Ｄ培養物と対比した、３Ｄオルガノイドのｐ＜０．０５であり；＃は、３Ｄオルガノイドおよび２Ｄ細胞株の両方と対比した、２Ｄの肝細胞／心筋細胞のｐ＜０．０５であり；＄は、３Ｄオルガノイドおよび２Ｄの肝細胞／心筋細胞の両方と対比した、２Ｄ細胞株のｐ＜０．０５である。 ＦＤＡによりリコールされた薬物についてのスクリーンに応答するＡＴＰ活性についての、３Ｄの肝臓オルガノイドおよび心臓オルガノイド、２Ｄの肝細胞培養物および心筋細胞培養物、ならびに２ＤのＨｅｐＧ２細胞株培養物およびＣ２Ｃ１２細胞株培養物の間の比較を示す図である。ロフェコキシブに応答する、心臓オルガノイド培養物、２ＤのｉＰＳ由来心筋細胞培養物、および２ＤのＣ２Ｃ１２細胞株培養物のＡＴＰ活性を示す図である。群間の比較は、薬物を伴わない、ベースラインのＡＴＰ活性レベルに対して正規化した。統計学的有意性は：＊は、両方の２Ｄ培養物と対比した、３Ｄオルガノイドのｐ＜０．０５であり；＃は、３Ｄオルガノイドおよび２Ｄ細胞株の両方と対比した、２Ｄの肝細胞／心筋細胞のｐ＜０．０５であり；＄は、３Ｄオルガノイドおよび２Ｄの肝細胞／心筋細胞の両方と対比した、２Ｄ細胞株のｐ＜０．０５である。 ＦＤＡによりリコールされた薬物についてのスクリーンに応答するＡＴＰ活性についての、３Ｄの肝臓オルガノイドおよび心臓オルガノイド、２Ｄの肝細胞培養物および心筋細胞培養物、ならびに２ＤのＨｅｐＧ２細胞株培養物およびＣ２Ｃ１２細胞株培養物の間の比較を示す図である。バルデコキシブに応答する、心臓オルガノイド培養物、２ＤのｉＰＳ由来心筋細胞培養物、および２ＤのＣ２Ｃ１２細胞株培養物のＡＴＰ活性を示す図である。群間の比較は、薬物を伴わない、ベースラインのＡＴＰ活性レベルに対して正規化した。統計学的有意性は：＊は、両方の２Ｄ培養物と対比した、３Ｄオルガノイドのｐ＜０．０５であり；＃は、３Ｄオルガノイドおよび２Ｄ細胞株の両方と対比した、２Ｄの肝細胞／心筋細胞のｐ＜０．０５であり；＄は、３Ｄオルガノイドおよび２Ｄの肝細胞／心筋細胞の両方と対比した、２Ｄ細胞株のｐ＜０．０５である。 マルチオルガノイドの相互作用を示し、肝臓モジュールと心臓モジュールとを組み合わせる結果として、薬物に対して、統合された応答が可能な生物学的システムがもたらされることを示す図である。ＥＣＨＯプラットフォーム内の培養時における、心臓オルガノイドについてのリアルタイムの拍動データを捕捉するのに使用された、オンチップのカメラシステムについての描示である。 マルチオルガノイドの相互作用を示し、肝臓モジュールと心臓モジュールとを組み合わせる結果として、薬物に対して、統合された応答が可能な生物学的システムがもたらされることを示す図である。マイクロ流体システム内の心臓オルガノイドの拍動についてのビデオによるスクリーン捕捉を示す図である。 マルチオルガノイドの相互作用を示し、肝臓モジュールと心臓モジュールとを組み合わせる結果として、薬物に対して、統合された応答が可能な生物学的システムがもたらされることを示す図である。閾値を超えたピクセルの動きのスクリーン捕捉による、心臓オルガノイドの拍動の転換（カスタムで書かれたＭａｔＬａｂコードにより生成された）が、拍動数の定量化を可能とすることを示す図である。 マルチオルガノイドの相互作用を示し、肝臓モジュールと心臓モジュールとを組み合わせる結果として、薬物に対して、統合された応答が可能な生物学的システムがもたらされることを示す図である。肝臓オルガノイドの組込みが、０．１μＭのプロプラノロールおよび０．５μＭのエピネフリンの両方に対する、心臓オルガノイドの応答の変更を結果としてもたらすことを示す図である。 マルチオルガノイドの相互作用を示し、肝臓モジュールと心臓モジュールとを組み合わせる結果として、薬物に対して、統合された応答が可能な生物学的システムがもたらされることを示す図である。肝臓の代謝活性の、下流の心拍数に対する影響を示す図である。０．５μＭのエピネフリンにより、ＢＰＭ値は、ベースラインから増大するが、エピネフリンによる増大は、０．１μＭのプロプラノロールにより遮断される。肝臓オルガノイドが存在し、０．１μＭのプロプラノロールを、代謝的に不活化させることが可能な場合、０．１μＭのエピネフリンで、ＢＰＭ値の増大を誘導することが可能である。興味深いことに、２Ｄで培養された肝細胞で、肝臓オルガノイドを代用すると、この影響は、観察されないことから、２Ｄ培養物中では、肝細胞による薬物代謝が、大幅に低減されることが指し示される。統計学的有意性は、＊ｐ＜０．０５である。 マルチオルガノイドの相互作用を示し、肝臓モジュールと心臓モジュールとを組み合わせる結果として、薬物に対して、統合された応答が可能な生物学的システムがもたらされることを示す図である。パネルｅ）で提示された値に対応する、心臓オルガノイドの拍動ピークについてのプロットを示す図である。 マルチオルガノイドの相互作用を示し、肝臓モジュールと心臓モジュールとを組み合わせる結果として、薬物に対して、統合された応答が可能な生物学的システムがもたらされることを示す図である。パネルｅ）で提示された値に対応する、心臓オルガノイドの拍動ピークについてのプロットを示す図である。 マルチオルガノイドの相互作用を示し、肝臓モジュールと心臓モジュールとを組み合わせる結果として、薬物に対して、統合された応答が可能な生物学的システムがもたらされることを示す図である。パネルｅ）で提示された値に対応する、心臓オルガノイドの拍動ピークについてのプロットを示す図である。 マルチオルガノイドの相互作用を示し、肝臓モジュールと心臓モジュールとを組み合わせる結果として、薬物に対して、統合された応答が可能な生物学的システムがもたらされることを示す図である。パネルｅ）で提示された値に対応する、心臓オルガノイドの拍動ピークについてのプロットを示す図である。 流体システム上における、ハイドロゲルバイオインク戦略によるバイオプリンティング、流体システムの概観、およびさらなる表現型評価を示す図である。肝臓バイオインクの形成および実現を示す図である。アクリレートベースの架橋剤（架橋剤１）、アルキンベースの架橋剤（架橋剤２）、チオール化ＨＡ、チオール化ゼラチン、ならびに非修飾ヒアルロン酸（ＨＡ）およびゼラチンから構成される、プリンティング可能なバイオインクの調合戦略を示す図である。 流体システム上における、ハイドロゲルバイオインク戦略によるバイオプリンティング、流体システムの概観、およびさらなる表現型評価を示す図である。肝臓バイオインクの形成および実現を示す図である。バイオプリンティング可能なハイドロゲルバイオインクの実現を示す図である。バイオインク調合物は、調製されると、チオール−アクリレート結合を介して、自発的に架橋する結果として、軟質で、射出可能な材料をもたらす。バイオプリンティングを実施する。最後に、バイオプリンティングされた構造を融合させ、安定化させ、目標の硬さとする。 流体システム上における、ハイドロゲルバイオインク戦略によるバイオプリンティング、流体システムの概観、およびさらなる表現型評価を示す図である。心臓バイオインクの形成および実現を示す図である。 流体システム上における、ハイドロゲルバイオインク戦略によるバイオプリンティング、流体システムの概観、およびさらなる表現型評価を示す図である。作動的な３つのチップ上のオルガノイドによる流体システムを示す図である。３つの流体回路が、並列回路用マイクロ流体ポンプ、培地リザーバー、およびバブルトラップ（図示しない）である、３つのオルガノイドデバイスを支援する。 肝臓オルガノイドが、肝臓特異的マーカーを呈示し、長期にわたり、安定および生存を維持することを示す図である。平均オルガノイド直径が、２８日間にわたり、一定を維持することを示す図である。 肝臓オルガノイドが、肝臓特異的マーカーを呈示し、長期にわたり、安定および生存を維持することを示す図である。ＡＴＰアーゼの発光読み取りにより決定される通り、肝臓オルガノイドが、２８日間にわたり、代謝的な活性を維持することを示す図である。 肝臓オルガノイドが、肝臓特異的マーカーを呈示し、長期にわたり、安定および生存を維持することを示す図である。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色（１４日の時点で示される）が、オルガノイド内の高細胞生存率を示す図である。緑は、カルセインＡＭで染色された生細胞であり、赤は、エチジウムホモ二量体で染色された死細胞であり、直径は、２６１μｍである。 肝臓オルガノイドが、肝臓特異的マーカーを呈示し、長期にわたり、安定および生存を維持することを示す図である。組織学的染色および免疫組織化学的染色が、オルガノイドの構造および構成を描示する図である。Ｈ＆Ｅ染色が、全オルガノイド形状を示す図である。 肝臓オルガノイドが、肝臓特異的マーカーを呈示し、長期にわたり、安定および生存を維持することを示す図である。組織学的染色および免疫組織化学的染色が、オルガノイドの構造および構成を描示する図である。初代ヒト肝細胞が、アルブミンの発現により同定されることを示す図である。 肝臓オルガノイドが、肝臓特異的マーカーを呈示し、長期にわたり、安定および生存を維持することを示す図である。組織学的染色および免疫組織化学的染色が、オルガノイドの構造および構成を描示する図である。初代ヒト肝細胞が、細胞膜周囲のＥカドヘリンの発現により示される、上皮構成を呈示することを示す図である。 肝臓オルガノイドが、肝臓特異的マーカーを呈示し、長期にわたり、安定および生存を維持することを示す図である。組織学的染色および免疫組織化学的染色が、オルガノイドの構造および構成を描示する図である。初代ヒト肝細胞がまた、コネキシン３２も発現させることを示す図である。 肝臓オルガノイドが、肝臓特異的マーカーを呈示し、長期にわたり、安定および生存を維持することを示す図である。組織学的染色および免疫組織化学的染色が、オルガノイドの構造および構成を描示する図である。初代ヒト肝細胞がまた、チトクロームＰ４５０レダクターゼも発現させることを示す図である。 肝臓オルガノイドが、肝臓特異的マーカーを呈示し、長期にわたり、安定および生存を維持することを示す図である。組織学的染色および免疫組織化学的染色が、オルガノイドの構造および構成を描示する図である。肝星細胞およびクッパー細胞が、ＧＦＡＰにより同定されることを示す図である。紫は、ヘマトキシリンで染色された核であり、ピンクは、細胞質であり、茶は、表示の染料であり、スケールバーは、１００μｍである。 肝臓オルガノイドが、肝臓特異的マーカーを呈示し、長期にわたり、安定および生存を維持することを示す図である。組織学的染色および免疫組織化学的染色が、オルガノイドの構造および構成を描示する図である。肝星細胞およびクッパー細胞が、ＣＤ６８により同定されることを示す図である。紫は、ヘマトキシリンで染色された核であり、ピンクは、細胞質であり、茶は、表示の染料であり、スケールバーは、１００μｍである。 ２Ｄ肝細胞培養物と比較して、肝臓オルガノイドが、ベースラインの肝機能および代謝を劇的に増大させて保持することを示す図である。正規化された尿素の、培地への分泌であって、ＥＬＩＳＡおよび比色アッセイにより解析された分泌が、２Ｄ肝細胞サンドイッチ培養物と比較して、３Ｄオルガノイドフォーマットにおける、機能的産生の劇的な増大を示す図である。 ２Ｄ肝細胞培養物と比較して、肝臓オルガノイドが、ベースラインの肝機能および代謝を劇的に増大させて保持することを示す図である。正規化されたアルブミンの、培地への分泌であって、ＥＬＩＳＡおよび比色アッセイにより解析された分泌が、２Ｄ肝細胞サンドイッチ培養物と比較して、３Ｄオルガノイドフォーマットにおける、機能的産生の劇的な増大を示す図である。 主に、ＣＹＰ２Ｃ１９およびＣＹＰ３Ａ４によるジアゼパム代謝物である、テマゼパムの定量化を示す図である。統計学的有意性は、各時点における、３Ｄと２Ｄとの比較について、＊ｐ＜０．０５である。 主に、ＣＹＰ２Ｃ１９およびＣＹＰ３Ａ４によるジアゼパム代謝物である、ノルダゼパムの定量化を示す図である。統計学的有意性は、各時点における、３Ｄと２Ｄとの間の比較について、＊ｐ＜０．０５である。 主に、ＣＹＰ２Ｃ１９およびＣＹＰ３Ａ４によるジアゼパム代謝物である、オキサゼパムの定量化を示す図である。統計学的有意性は、各時点における、３Ｄと２Ｄとの比較について、＊ｐ＜０．０５である。 肝臓オルガノイドにおける、チトクロームｐ４５０アイソフォームによる、ジアゼパムの、テマゼパム、ノルジアゼパム、およびオキサゼパムへの代謝を示す図である。 心臓オルガノイドが、心臓特異的マーカーを呈示し、経時的に、安定および生存を維持することを示す図である。心臓オルガノイドを、パネルａ）ＶＥＧＦ、パネルｂ）アクチニン、パネルｃ）低レベルのミオシン制御軽鎖７（ＭＹＬ７）（赤は、表示の染料であり、青は、ＤＡＰＩである）、パネルｄ）心臓トロポニン−Ｔ（茶）について、ヘマトキシリン対比染色で、パネルｅ）Ｈ＆Ｅで、パネルｆ〜ｈ）Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ生存／細胞傷害作用染料で、培養のパネルｆ）１日目、パネルｇ）２８日目、パネルｈ）３５日目において染色した。緑は、カルセインＡＭで染色された生細胞であり、赤は、エチジウムホモ二量体で染色された死細胞核である。スケールバーは、１５０μｍである。 免疫組織化学による、オンチップ肝臓オルガノイドの生存率および表現型についての解析を示す図である。流体システム上で初代培養された肝臓オルガノイドが、最長で２８日間にわたり、生存を維持することを示す図である。青染色は、ＤＡＰＩで染色された核を指し示す。 免疫組織化学による、オンチップ肝臓オルガノイドの生存率および表現型についての解析を示す図である。流体システム上で初代培養された肝臓オルガノイドが、最長で２８日間にわたり、生存を維持することを示す図である。青染色は、ＤＡＰＩで染色された核を指し示す。 免疫組織化学による、オンチップ肝臓オルガノイドの生存率および表現型についての解析を示す図である。流体システム上で初代培養された肝臓オルガノイドが、最長で２８日間にわたり、生存を維持することを示す図である。青染色は、ＤＡＰＩで染色された核を指し示す。 免疫組織化学による、オンチップ肝臓オルガノイドの生存率および表現型についての解析を示す図である。流体システム上で初代培養された肝臓オルガノイドが、ＣＹＰ３Ａ７（緑）を発現させることを示す図である。青染色は、ＤＡＰＩで染色された核を指し示す。 免疫組織化学による、オンチップ肝臓オルガノイドの生存率および表現型についての解析を示す図である。流体システム上で初代培養された肝臓オルガノイドが、アルブミン（緑）を発現させることを示す図である。青染色は、ＤＡＰＩで染色された核を指し示す。 免疫組織化学による、オンチップ肝臓オルガノイドの生存率および表現型についての解析を示す図である。流体システム上で初代培養された肝臓オルガノイドが、Ｅ−カドヘリン（赤）およびＤＰＰ−４（緑）を発現させることを示す図である。青染色は、ＤＡＰＩで染色された核を指し示す。 免疫組織化学による、オンチップ肝臓オルガノイドの生存率および表現型についての解析を示す図である。流体システム上で初代培養された肝臓オルガノイドが、ＺＯ−１（緑）を発現させることを示す図である。青染色は、ＤＡＰＩで染色された核を指し示す。 免疫組織化学による、オンチップ肝臓オルガノイドの生存率および表現型についての解析を示す図である。流体システム上で初代培養された肝臓オルガノイドが、Ｏｓｔ−α（緑）を発現させることを示す図である。青染色は、ＤＡＰＩで染色された核を指し示す。 免疫組織化学による、オンチップ肝臓オルガノイドの生存率および表現型についての解析を示す図である。流体システム上で初代培養された肝臓オルガノイドが、β−カテニン（緑）を発現させることを示す図である。青染色は、ＤＡＰＩで染色された核を指し示す。 チップ上の肝臓を示し、アセトアミノフェン、および対抗措置であるＮ−アセチル−Ｌ−システインに対するオンチップ応答を示す図である。肝臓オルガノイドが、アセトアミノフェン毒性に応答し、ＮＡＣによりレスキューされることを示す図である。１４日目に、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色により決定された生存である。オルガノイドを、０ｍＭのＡＰＡＰ対照に曝露した。緑は、カルセインＡＭで染色された生細胞であり、赤は、エチジウムホモ二量体で染色された死細胞である。 チップ上の肝臓を示し、アセトアミノフェン、および対抗措置であるＮ−アセチル−Ｌ−システインに対するオンチップ応答を示す図である。肝臓オルガノイドが、アセトアミノフェン毒性に応答し、ＮＡＣによりレスキューされることを示す図である。１４日目に、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色により決定された生存である。オルガノイドを、１ｍＭのＡＰＡＰに曝露した。緑は、カルセインＡＭで染色された生細胞であり、赤は、エチジウムホモ二量体で染色された死細胞である。 チップ上の肝臓を示し、アセトアミノフェン、および対抗措置であるＮ−アセチル−Ｌ−システインに対するオンチップ応答を示す図である。肝臓オルガノイドが、アセトアミノフェン毒性に応答し、ＮＡＣによりレスキューされることを示す図である。１４日目に、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色により決定された生存である。オルガノイドを、１０ｍＭのＡＰＡＰに曝露した。緑は、カルセインＡＭで染色された生細胞であり、赤は、エチジウムホモ二量体で染色された死細胞である。 チップ上の肝臓を示し、アセトアミノフェン、および対抗措置であるＮ−アセチル−Ｌ−システインに対するオンチップ応答を示す図である。肝臓オルガノイドが、アセトアミノフェン毒性に応答し、ＮＡＣによりレスキューされることを示す図である。１４日目に、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色により決定された生存である。オルガノイドを、２０ｍＭのＮ−アセチル−Ｌ−システインを伴う、１０ｍＭのＡＰＡＰに曝露した。緑は、カルセインＡＭで染色された生細胞であり、赤は、エチジウムホモ二量体で染色された死細胞である。 チップ上の肝臓を示し、アセトアミノフェン、および対抗措置であるＮ−アセチル−Ｌ−システインに対するオンチップ応答を示す図である。培地アリコートについての解析は、ＡＰＡＰが、機能の喪失および細胞死を誘導するのに対し、ＮＡＣは、これらの負の影響を緩和する能力を有することを指し示す図である。ヒトアルブミンの定量化を示す図である。アルブミンおよび尿素の産生量が、ＡＰＡＰ処理による負の影響を受けるのに対し、ＮＡＣは、この分泌量の低減を減少させる。統計学的有意性は：＊は、対照とＡＰＡＰとの間でｐ＜０．０５であり；＃は、ＡＰＡＰ＋ＮＡＣとＡＰＡＰとの間でｐ＜０．０５である。 チップ上の肝臓を示し、アセトアミノフェン、および対抗措置であるＮ−アセチル−Ｌ−システインに対するオンチップ応答を示す図である。培地アリコートについての解析は、ＡＰＡＰが、機能の喪失および細胞死を誘導するのに対し、ＮＡＣは、これらの負の影響を緩和する能力を有することを指し示す図である。尿素の定量化を示す図である。アルブミンおよび尿素の産生量が、ＡＰＡＰ処理による負の影響を受けるのに対し、ＮＡＣは、この分泌量の低減を減少させる。統計学的有意性は：＊は、対照とＡＰＡＰとの間でｐ＜０．０５であり；＃は、ＡＰＡＰ＋ＮＡＣとＡＰＡＰとの間でｐ＜０．０５である。 チップ上の肝臓を示し、アセトアミノフェン、および対抗措置であるＮ−アセチル−Ｌ−システインに対するオンチップ応答を示す図である。培地アリコートについての解析は、ＡＰＡＰが、機能の喪失および細胞死を誘導するのに対し、ＮＡＣは、これらの負の影響を緩和する能力を有することを指し示す図である。乳酸デヒドロゲナーゼの定量化を示す図である。対照群およびＡＰＡＰ＋ＮＡＣ群では、ＬＤＨおよびアルファ−ＧＳＴが、低いことから、細胞が機能的であることが裏付けられるのに対し、ＡＰＡＰは、レベルの上昇を誘導することから、アポトーシス、ならびにＬＤＨおよびアルファ−ＧＳＴの、培地への放出が指し示される。統計学的有意性は：＊は、対照とＡＰＡＰとの間でｐ＜０．０５であり；＃は、ＡＰＡＰ＋ＮＡＣとＡＰＡＰとの間でｐ＜０．０５である。 チップ上の肝臓を示し、アセトアミノフェン、および対抗措置であるＮ−アセチル−Ｌ−システインに対するオンチップ応答を示す図である。培地アリコートについての解析は、ＡＰＡＰが、機能の喪失および細胞死を誘導するのに対し、ＮＡＣは、これらの負の影響を緩和する能力を有することを指し示す図である。アルファ−ＧＳＴの定量化を示す図である。対照群およびＡＰＡＰ＋ＮＡＣ群では、ＬＤＨおよびアルファ−ＧＳＴが、低いことから、細胞が機能的であることが裏付けられるのに対し、ＡＰＡＰは、レベルの上昇を誘導することから、アポトーシス、ならびにＬＤＨおよびアルファ−ＧＳＴの、培地への放出が指し示される。統計学的有意性は：＊は、対照とＡＰＡＰとの間でｐ＜０．０５であり；＃は、ＡＰＡＰ＋ＮＡＣとＡＰＡＰとの間でｐ＜０．０５である。 心臓オルガノイドが、薬物処置への応答として、拍動数をモジュレートすることを示す図である。ベースライン条件下の拍出量であって、拍動数を決定する拍出量を示す図である。 心臓オルガノイドが、薬物処置への応答として、拍動数をモジュレートすることを示す図である。イソプレテレノールへの曝露から生じる、心臓オルガノイドの拍動数の変化を示す図である。 心臓オルガノイドが、薬物処置への応答として、拍動数をモジュレートすることを示す図である。キニジンへの曝露から生じる、心臓オルガノイドの拍動数の変化を示す図である。 心臓オルガノイドが、薬物処置への応答として、拍動数をモジュレートすることを示す図である。エピネフリンおよびプロプラノロールに対する、心臓オルガノイドの応答を示す図である。心臓オルガノイドは、エピネフリン濃度の増大と共に、１〜２倍の範囲で、拍動数の用量依存的増大をもたらした後、５μＭおよびこれを超えるエピネフリンにより、プラトーに達する。プロプラノロール濃度を、０〜２０μＭの範囲とする、初期のインキュベーションは、５μＭのエピネフリンの投与後に、拍動数の用量依存的減少を結果としてもたらす。 心臓オルガノイドが、薬物処置への応答として、拍動数をモジュレートすることを示す図である。エピネフリンおよびプロプラノロールに対する、心臓オルガノイドの応答を示す図である。心臓オルガノイドは、エピネフリン濃度の増大と共に、１〜２倍の範囲で、拍動数の用量依存的増大をもたらした後、５μＭおよびこれを超えるエピネフリンにより、プラトーに達する。プロプラノロール濃度を、０〜２０μＭの範囲とする、初期のインキュベーションは、５μＭのエピネフリンの投与後に、拍動数の用量依存的減少を結果としてもたらす。 疾患モデル化、薬物開発、および試験のための、３Ｄ肺オルガノイドの作出を示す図である。３Ｄ肺オルガノイドが、気道上皮細胞、気道間質細胞、および肺微小血管内皮細胞から構成されることを示す図である。層状化された３Ｄオルガノイドは、天然の気道組織内で見られる細胞構成と同様の細胞構成であって、気液界面に曝露されて、極性化された上皮表面と、組織構造をもたらす間質成分と、液体培地に曝露されて、薄層の血管障壁を形成する内皮とを伴う細胞構成を迅速にもたらす。層状化されたオルガノイドは、経上皮抵抗および細胞生存率を維持しながら、培養物中で、４週間を超えて維持することができる。オルガノイド形成の層状化法の利点は、通常の気道構造を表す、組織化された組織を、迅速に確立する能力である。 疾患モデル化、薬物開発、および試験のための、３Ｄ肺オルガノイドの作出を示す図である。経上皮電気抵抗のモニタリングを示す図である。 疾患モデル化、薬物開発、および試験のための、３Ｄ肺オルガノイドの作出を示す図である。３Ｄ肺オルガノイドが、ＣＦＴＲ活性化医薬またはＣＦＴＲ阻害性医薬に対する生理学的応答を裏付けることを示す図である。 疾患モデル化、薬物開発、および試験のための、３Ｄ肺オルガノイドの作出を示す図である。３Ｄ肺オルガノイドが、ＣＦＴＲ活性化医薬またはＣＦＴＲ阻害性医薬に対する生理学的応答を裏付けることを示す図である。 疾患モデル化、薬物開発、および試験のための、３Ｄ肺オルガノイドの作出を示す図である。短絡電流（Ｉｓｃ）およびＴＥＥＲを介して、ＣＦＴＲイオンチャネル活性について評価することにより裏付けられるヒスタミンを示す図である。 ３Ｄ精巣オルガノイドの作出および薬物毒性試験を示す図である。Ｐｅｒｆｅｃｔａ３Ｄ（登録商標）９６−Ｗｅｌｌ Ｈａｎｇｉｎｇ Ｄｒｏｐ Ｐｌａｔｅを示す図である。これらの培養物プレートは、３Ｄ培養物の形成、およびその後の細胞構築物の評価のための、多用途のハイスループットシステムをもたらす。 ３Ｄ精巣オルガノイドの作出および薬物毒性試験を示す図である。９６ウェル超低接着培養プレートのウェル内の精巣オルガノイドの視覚化を示す図である。挿入写真は、懸滴培養物中で、４８時間後に、完全に形成された精巣オルガノイドの位相差画像を表す。 ３Ｄ精巣オルガノイドの作出および薬物毒性試験を示す図である。内部形状の特徴付けのために、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色された、ヒト精巣オルガノイドを示す図である。 ３Ｄ精巣オルガノイドの作出および薬物毒性試験を示す図である。ヒト精巣細胞に対する薬物の影響を示す図である。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙアッセイを介して、ＡＴＰ含量を決定する前に、４８時間にわたり、薬物に曝露された細胞（上パネルにおける２Ｄ培養物対下パネルにおける３Ｄオルガノイド）を示す図である。用量応答曲線を作成した（ｎ＝３）。平均値±ＳＤとして提示されたデータである。 ３Ｄ精巣オルガノイドの作出および薬物毒性試験を示す図である。急性薬物処理後の、精巣オルガノイド遺伝子の発現変化を示す図である。精原（ＰＬＺＦ（ＺＴＢＴ１６））、ライディッヒ（ＣＹＰ１１Ａ１、ＳＴＡＲ）、およびセルトリ（ＳＯＸ９）の細胞マーカーの倍数変化（ＲｅｌＱ、２−ΔΔＣＴ）を測定して、３Ｄで培養された精巣オルガノイドを、対応する、２Ｄの精巣細胞培養物対照と、４つの、臨床的に関連性がある化学療法薬である、Ａ．ブスルファン、Ｂ．シスプラチン、Ｃ．ドキソルビシン、Ｄ．エトポシドについて比較した（ｎ＝３）。平均値±ＳＤとして提示されたデータである。有意性は、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１である。 結腸構築物の形状、コラーゲン線維のアライメント、および上皮腺房の形成を示す図である。パネルＡ）結腸構築物の断面形状であって、平滑筋細胞が、一方の側に凝集し、内側への収縮を引き起こす、断面形状を示す図である。パネルＢ）結腸構築物についてのピクロシリウスレッド染色であって、オレンジ／赤シグナルが、高度に束状化した線維を指し示し、緑シグナルが、網状線維を指し示す、ピクロシリウスレッド染色を示す図である。パネルＣ）コラーゲン線維束の拡大画像を示す図である。パネルＤ）結腸構築物内の上皮腺房の形成を描示し、発生した腺房が、平滑筋リモデリング（図示しない）を伴わずには形成されないことを描示する図である。パネルＥおよびＦ）腺房の上皮特異的染色が、結腸上皮内で典型的に見出される、腺房細胞の間の細胞間相互作用を裏付けることを示す図である。 ロフェコキシブおよびバルデコキシブによる薬物スクリーンに応答する心臓オルガノイドについての生存率評価を示す図である。緑は、カルセインＡＭで染色された生細胞であり、赤は、エチジウムホモ二量体で染色された死細胞である。 アステミゾールに応答する、心臓オルガノイドの拍動動態についての評価を示す図である。 ペルゴグリドに応答する、心臓オルガノイドの拍動動態についての評価を示す図である。 テロジリンに応答する、心臓オルガノイドの拍動動態についての評価を示す図である。 マイクロ流体デバイスの作製およびオルガノイドの形成を示す図である。パターン形成された接着性フィルムを、ガラス製スライド（下）と、流体の流入口および流出口をドリル加工したポリスチレン製スライド（上）との間で層状化させて、マイクロ流体チャネルを、迅速かつ容易に形成することを示す図である。 マイクロ流体デバイスの作製およびオルガノイドの形成を示す図である。インサイチューにおける３Ｄ細胞培養物の微小構築物形成のワークフローを示す図である。全ての流体チャネル（ｉ）を、光硬化型ハイドロゲル前駆体、標的細胞、およびさらなる構成要素の混合物で満たす（明るい赤、ｉｉ）。プリントされた透明フォトマスク、またはパターン形成されたフォイル（グレー）を利用して、構築物の形状を規定する（ｉｉｉ）。ＵＶへの曝露後、チャネル内では、架橋されたハイドロゲル（破線）が形成され（ｉｖ）、残りの溶液を、清明な緩衝液で置きかえる（ｖ）。落射蛍光イメージング（ｖｉ）は、構築物の形成を裏付ける。 マイクロ流体デバイスの作製およびオルガノイドの形成を示す図である。肝臓組織、肺組織、心臓組織、脳組織、血管組織、および精巣組織を支援する、小型６組織チップを示す図である。 マイクロ流体デバイスの作製およびオルガノイドの形成を示す図である。搭載された６組織の高生存率を示す図である。緑は、生細胞であり、赤は、死細胞である。 肝臓オルガノイドの、タリウム、鉛、グリホサート、および水銀に対する応答を示す予備結果を示す図である。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色（緑は、生細胞であり、赤は、死細胞である）を示す図である。 肝臓オルガノイドの、タリウム、鉛、グリホサート、および水銀に対する応答を示す予備結果を示す図である。ＡＴＰ活性を示す図である。 タリウム、鉛、グリホサート、および水銀への曝露後における、心臓オルガノイドの、ＡＴＰ活性の減少を示す予備結果を示す図である。 肝臓オルガノイドによる、予備的環境毒素スクリーンを示す図である。正規化されたＡＴＰ活性およびＩＣ５０値の推定を示す図である。＊は、各毒素スクリーンについて、薬物を伴わない状態と比較したｐ＜０．０５である。 肝臓オルガノイドによる、予備的環境毒素スクリーンを示す図である。正規化されたＡＴＰ活性およびＩＣ５０値の推定を示す図である。＊は、各毒素スクリーンについて、薬物を伴わない状態と比較したｐ＜０．０５である。 肝臓オルガノイドによる、予備的環境毒素スクリーンを示す図である。正規化されたＡＴＰ活性およびＩＣ５０値の推定を示す図である。＊は、各毒素スクリーンについて、薬物を伴わない状態と比較したｐ＜０．０５である。 肝臓オルガノイドによる、予備的環境毒素スクリーンを示す図である。正規化されたＡＴＰ活性およびＩＣ５０値の推定を示す図である。＊は、各毒素スクリーンについて、薬物を伴わない状態と比較したｐ＜０．０５である。 肝臓オルガノイドによる、予備的環境毒素スクリーンを示す図である。グリホサート、鉛、タリウム、および水銀で処理された肝臓オルガノイドについての、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色およびマクロ共焦点イメージングを示す図である。緑は、生細胞であり、赤は、死細胞である。 肝臓オルガノイドが、カペシタビンを、心臓オルガノイドおよび肺オルガノイドにおける細胞死の増大を誘導する、薬物の活性５−ＦＵ形態へと代謝するように要請されることを示す、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ結果の画像を示す図である。 小型システムにおける、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ結果の画像を示し、肝臓が存在すると、カペシタビンは、毒性の薬物である５−ＦＵへと代謝され、心毒性および肺毒性を引き起こすことを示す図である。肝臓を伴わなければ、この代謝は、生じず、心臓オルガノイドおよび肺オルガノイドの生存率は、低下しない。 標準的サイズシステムおよび小型システムにおける、初期バイオマーカー解析についてのグラフを示す図である。赤および青のデータ点は、標準的サイズシステムによるのに対し、黄色の「マイクロ」データ点は、小型システムによる。 フルイディクス用テープおよび接着性フィルム、ならびに／または両面テープ（ＤＳＴ）、ポリ（メタクリル酸メチル）（ＰＭＭＡ）、およびポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）構成要素を組み込む、ハイブリッド型のマイクロリアクター作製戦略についての例示を示す図である。 肝臓オルガノイドによる環境毒素スクリーンからの結果を示し、正規化されたＡＴＰ活性およびＩＣ５０値の推定を示す図である。＊は、各毒素スクリーンについて、薬物を伴わない状態と比較したｐ＜０．０５である。 肝臓オルガノイドによる環境毒素スクリーンからの結果を示し、正規化されたＡＴＰ活性およびＩＣ５０値の推定を示す図である。＊は、各毒素スクリーンについて、薬物を伴わない状態と比較したｐ＜０．０５である。 肝臓オルガノイドによる環境毒素スクリーンからの結果を示し、正規化されたＡＴＰ活性およびＩＣ５０値の推定を示す図である。＊は、各毒素スクリーンについて、薬物を伴わない状態と比較したｐ＜０．０５である。 肝臓オルガノイドによる環境毒素スクリーンからの結果を示し、正規化されたＡＴＰ活性およびＩＣ５０値の推定を示す図である。＊は、各毒素スクリーンについて、薬物を伴わない状態と比較したｐ＜０．０５である。 肝臓オルガノイドによる環境毒素スクリーンからの結果を示し、グリホサート、鉛、タリウム、および水銀で処理された肝臓オルガノイドについての、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色およびマクロ共焦点イメージングを示す図である。 心臓オルガノイドによる環境毒素スクリーンからの結果を示し、正規化されたＡＴＰ活性およびＩＣ５０値の推定を示す図である。＊は、各毒素スクリーンについて、薬物を伴わない状態と比較したｐ＜０．０５である。 心臓オルガノイドによる環境毒素スクリーンからの結果を示し、正規化されたＡＴＰ活性およびＩＣ５０値の推定を示す図である。＊は、各毒素スクリーンについて、薬物を伴わない状態と比較したｐ＜０．０５である。 心臓オルガノイドによる環境毒素スクリーンからの結果を示し、正規化されたＡＴＰ活性およびＩＣ５０値の推定を示す図である。＊は、各毒素スクリーンについて、薬物を伴わない状態と比較したｐ＜０．０５である。 心臓オルガノイドによる環境毒素スクリーンからの結果を示し、正規化されたＡＴＰ活性およびＩＣ５０値の推定を示す図である。＊は、各毒素スクリーンについて、薬物を伴わない状態と比較したｐ＜０．０５である。 心臓オルガノイドによる環境毒素スクリーンからの結果を示し、グリホサート、鉛、タリウム、および水銀で処理された肝臓オルガノイドについての、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色およびマクロ共焦点イメージングを示す図である。 環境毒素への曝露の影響としての、心臓オルガノイド拍動数の変化を示す図である。
ここで、本明細書の以下では、本発明の実施形態が示される、添付の図面を参照しながら、本発明について、より完全に記載する。しかし、本発明は、多くの異なる形態で具体化することができ、本明細書で明示される実施形態に限定されるものと見なされるべきではなく、むしろ、これらの実施形態は、本開示が、徹底的かつ完全であり、本発明の範囲を、当業者に、完全に伝えるように提示される。
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態だけについて記載することを目的とするものであり、本発明について限定的であることを意図するものではない。文脈により、そうでないことが明確に指し示されない限りにおいて、本明細書で使用される、単数形の「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、および「その」は、複数形も含むことを意図する。本明細書で使用される場合の、「〜を含む」または「〜を含むこと」という用語は、言明された特徴、整数、ステップ、操作、要素、構成要素、および／もしくは群、またはこれらの組合せの存在を指定するが、１もしくは複数の、他の特徴、整数、ステップ、操作、要素、構成要素および／もしくは群、またはこれらの組合せの存在または追加を除外しないことがさらに理解されるであろう。本明細書で使用される「および／または」という用語は、関連する、列挙された項目のうちの１または複数の、任意および全ての組合せを含む。
ある要素について、別の要素「の上に」ある、これに「接合されている」、これに「接続されている」、これと「カップリングしている」、これに「接触している」などと言及する場合、この要素は、直接他の要素の上にあるか、これに接合されているか、これに接続されているか、これとカップリングしているか、またはこれに接触している場合もあり、または介在的要素が存在する場合もあることが理解されるであろう。これに対し、ある要素について、例えば、別の要素「の上に直接」ある、これに「直接接合されている」、これに「直接接続されている」、これと「直接カップリングしている」、またはこれに「直接接触している」と言及する場合、介在的要素は存在しない。当業者はまた、別の特徴に「隣接して」配置された構造または特徴への言及は、隣接する特徴と重複するか、またはこの基底をなす部分を有しうることも理解するであろう。
本明細書では、図で例示される、１つの要素または特徴の、別の要素または特徴との関係について記載するのに、記載を容易とするために、「の下に」、「下側」、「下」、「の上に」、「上」など、空間に関する用語を使用する場合がある。空間に関する用語は、図で描示される配向性に加えて、使用中または作動中のデバイスの、異なる配向性を包含することを意図することが理解されるであろう。例えば、図中のデバイスが倒立している場合、他の要素または特徴「の下に」またはこれら「の下方に」記載される要素は、他の要素または特徴「の上に」方向付けられるであろう。したがって、例示的な「の下に」という用語は、「の上に」および「の下に」の両方の配向性を包含しうる。デバイスは、他の形で方向付けられる場合もあり（９０度回転しているか、または他の配向性にある）、本明細書で使用される記述子は、これに応じて解釈される。同様に、そうでないことが別段に指し示されない限りにおいて、本明細書では、説明だけを目的として、「上向きに」、「下向きに」、「垂直な」、「水平な」などの用語が使用される。
本明細書では、多様な要素について記載するのに、「第１の」、「第２の」などの用語を使用する場合があるが、これらの要素は、これらの用語により限定されないものとすることが理解されるであろう。これらの用語は、１つの要素を、別の要素と識別するためだけに使用される。したがって、本発明の教示から逸脱することなく、下記で論じられる「第１の」要素はまた、「第２の」要素とも称することができよう。操作（またはステップ）の順番は、そうでないことが別段に指し示されない限りにおいて、特許請求の範囲または図面において提示された順序に限定されない。
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される全ての用語（技術用語および科学用語を含む）は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。一般に使用される辞書において規定される用語などの用語は、本明細書および特許請求の範囲の文脈におけるそれらの意味と符合する意味を有するものとして解釈されるべきであり、本明細書で、そのように明示的に規定されない限りにおいて、理想化された意味または過度に形式的な意味で解釈されるべきではないことがさらに理解されるであろう。周知の機能または構造については、簡潔さおよび／または明確さのために記載しない場合がある。本明細書で本発明の記載に使用される用語は、特定の実施形態だけについて記載することを目的とするものであり、本発明について限定的であることを意図するものではない。本明細書で言及される、全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。用語に矛盾がある場合は、本明細書が優先する。
本発明で使用される「細胞」は、一般に、動物細胞、特に、哺乳動物細胞および霊長動物細胞であり、それらの例は、ヒト、イヌ、ネコ、ウサギ、サル、チンパンジー、ウシ、ブタ、ヤギを含むがこれらに限定されない。細胞は、少なくとも部分的に、肝臓、腸、膵臓、リンパ節、平滑筋、骨格筋、中枢神経、末梢神経、皮膚、免疫系など、特定の細胞型または組織型へと分化させることができる。一部の細胞は、下記でさらに論じられる通り、がん細胞の場合があり、この場合、また下記でさらに論じられる通り、細胞は、任意選択で、検出可能な化合物を発現させうる（天然で、または組換え法により）。
本明細書では、「三次元組織構築物」および「オルガノイド」は、互換的に使用され、本明細書で使用される通り、典型的に、担体培地中に、三次元構成または多層構成（単層と対照的に）で配置された、生細胞の組成物を指す。適切な担体培地は、下記で記載される通りの架橋ハイドロゲルなどのハイドロゲルを含む。さらなるハイドロゲルの例は、その内容が、それらの全体が参照により本明細書の一部をなす、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５５６９９において記載されているハイドロゲルを含むがこれらに限定されない。このような構築物は、モデル化または模倣されている、特定の組織または臓器に応じて、１つの分化細胞型、または２つもしくはこれを超える分化細胞型を含みうる。一部のオルガノイドは、下記でさらに論じられる通り、がん細胞を含みうる。構築物が、がん細胞を含む場合、構築物は、組織細胞を含むことが可能であり、かつ／または、それらの組合せを含む、細胞外マトリックス（またはタンパク質もしくはこれに由来するポリマー）、ヒアルロン酸、ゼラチン、コラーゲン、アルギン酸などの、細胞を伴わない組織模倣体を含みうる。したがって、一部の実施形態では、細胞を、細胞外マトリックスまたは架橋マトリックスと併せて混合して、構築物を形成するのに対し、他の実施形態では、スフェロイドまたはオルガノイドなどの細胞凝集物を、あらかじめ形成し、次いで、細胞外マトリックスと組み合わせることもできる。一部の実施形態では、組織構築物および／またはオルガノイドは、ヒト由来の細胞である細胞を含み、一部の実施形態では、組織構築物および／またはオルガノイドは、ヒト由来の細胞からなる細胞を含む。本発明の組織構築物および／またはオルガノイドは、インビボにおいて細胞により産生されるバイオマーカーと同じ、１つまたは複数のバイオマーカー（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、またはこれを超える）を発現させ、かつ／またはこれらを産生しうる。例えば、インビボにおける肝細胞は、アルブミンを産生し、肝細胞を含む、本発明のオルガノイドは、アルブミンを発現させうる。一部の実施形態では、組織構築物および／またはオルガノイドは、バイオマーカーを、インビボにおける、対応する細胞が産生し、かつ／または発現させる平均量と同じ量で、またはこの±２０％、±１０％、もしくは±５％である量で発現させうる。バイオマーカーの例は、アルブミン、尿素、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）（例えば、α−ＧＳＴ）、ケモカイン（例えば、ＩＬ−８、ＩＬ−１βなど）、プロスタサイクリン、ＳＢ１００Ｂ、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ホルモン（例えば、テストステロン、エストラジオール、プロゲステロンなど）、インヒビンＡ／Ｂ、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、および／または腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を含むがこれらに限定されない。
一部の実施形態では、組織構築物および／またはオルガノイドは、例えば、約２００、２５０、３００、または３５０μｍなど、約２００μｍ〜約３５０μｍの直径である。組織構築物および／またはオルガノイドは、合計約１，５００または２，０００〜約３，０００または３，５００個の細胞を含みうる。
本明細書で使用される「増殖培地」は、本発明を実行するのに使用される細胞を保持する、任意の天然増殖培地または人工増殖培地（典型的には、水性の液体）であってよい。例としては、必須培地もしくは最小必須培地（ＭＥＭ）、またはイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）およびダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）など、これらの変化形のほか、それらの合成模倣体を含む、血液、血清、血漿、リンパ液などを含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、増殖培地は、色によるｐＨ変色指示薬（例えば、フェノールレッド）を含む。
本明細書で使用される「試験化合物」または「候補化合物」とは、心臓組織および／もしくは他の組織に対する薬理学的活性もしくは生理学的活性、または２つの試験化合物の間の相互作用が決定される、任意の化合物でありうる。例証を目的として述べると、イソプレテレノールおよびキニジンが、それらについて、独立に検討するように、下記では、試験化合物として、別個に使用されるのに対し、プロプラノロールおよびエピネフリンは、これらの間の相互作用について検討するように、試験化合物として、同時に、または互いと組み合わせて投与される。しかし、任意の化合物を使用することができ、典型的には、タンパク質、ペプチド、核酸、および低分子有機化合物（脂肪族、芳香族、および脂肪族／芳香族混合化合物）などの有機化合物を使用することができる。候補化合物は、コンビナトリアル法により、ランダムに作出および／または特定の標的に基づいて合理的にデザインすることを含む、任意の適切な技法により作出することができる。薬物の相互作用について研究する場合は、２つの（またはこれを超える）試験化合物を、同時に投与することができ、一方（または両方）は、可能な、組合せによる影響が決定される、公知の化合物でありうる。一部の実施形態では、試験化合物は、アルミニウム、鉛などなどであるがこれらに限定されない金属である。一部の実施形態では、試験化合物は、ヒ素、カドミウム、クロム、鉛、および／または水銀などであるがこれらに限定されない重金属である。一部の実施形態では、試験化合物は、殺虫剤である。
本発明の組成物を使用して、本発明の組織構築物を調製することができる。本発明の組成物は、「バイオインク」中に、生細胞を含むことが可能であり、ここで、「バイオインク」は、架橋型プレポリマー、沈着後架橋基または沈着後架橋剤；および増殖因子、（例えば、架橋の）開始剤、（平衡させるための）水などを含むがこれらに限定されない、他の任意選択の成分から構成される。一部の実施形態では、組成物は、ハイドロゲルの形態である。組成物の多様な構成要素および特性については、さらに下記で論じる。
細胞。上記で言及した通り、本発明を実行するのに使用されうる細胞は、動物細胞（例えば、鳥類細胞、爬虫類細胞、両生類細胞など）であることが可能であり、一部の実施形態では、哺乳動物細胞（例えば、イヌ、ネコ、マウス、ラット、サル、類人猿、ヒト）である。細胞は、分化細胞の場合もあり、未分化細胞の場合もあるが、一部の実施形態では、組織細胞（例えば、肝細胞などの肝臓細胞、膵臓細胞、心筋細胞、骨格筋細胞など）である。
細胞の選択は、創出されている特定のオルガノイドに依存するであろう。例えば、肝臓オルガノイドのためには、肝臓の肝細胞を使用することができる。末梢神経オルガノイドまたは中枢神経オルガノイドのためには、末梢神経細胞、中枢神経細胞、神経膠細胞、またはこれらの組合せを使用することができる。骨オルガノイドのためには、骨の骨芽細胞、骨の破骨細胞、またはこれらの組合せを使用することができる。肺オルガノイドのためには、肺の気道上皮細胞を使用することができる。リンパ節オルガノイドのためには、濾胞樹状細胞性リンパ球、細網線維芽細胞性リンパ球、白血球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、またはこれらの組合せを使用することができる。平滑筋オルガノイドまたは骨格筋オルガノイドのためには、平滑筋細胞、骨格筋細胞、またはこれらの組合せを使用することができる。皮膚オルガノイドのためには、皮膚角化細胞、皮膚メラニン細胞、またはこれらの組合せを使用することができる。細胞は、組成物への初期の組込み時に分化させることもでき、その後に分化される未分化細胞を使用することもできる。さらなる細胞を、上記の組成物のいずれかに添加することができ、下記で記載される通りのがん細胞を、下記で記載される通り、主要オルガノイドまたは「第１の」オルガノイドに添加することができる。
任意選択的に、本発明で使用されるがん細胞は、黒色腫細胞、癌細胞、肉腫細胞、線維芽細胞腫細胞、神経膠腫細胞、および星状細胞腫細胞などを含むがこれらに限定されない、任意の種類のがん細胞でありうる。
一部の実施形態では、細胞は、例えば、がんのための処置を受けているおよび／もしくはがんを有する対象もしくは患者、ならびに／または免疫系に障害がある対象などの対象から得ることができる。一部の実施形態では、細胞は、例えば、患者生検由来の腫瘍細胞などの腫瘍細胞であり、このような細胞から調製されたオルガノイドを使用して、潜在的に有効な薬物および／または処理をスクリーニングすることができる。細胞は、少なくとも部分的に、脳、肝臓、腸、膵臓、リンパ節、平滑筋、骨格筋、中枢神経、末梢神経、皮膚、免疫系など、特定の細胞型または組織型へと分化させることができる。
一部の実施形態では、本発明のオルガノイドは、不死化細胞株に由来する細胞から調製されず、かつ／またはこれらを含まない。本発明のオルガノイドは、初代細胞および／または幹細胞、例えば、人工多能性幹細胞および／またはｉＰＳ由来の分化細胞などであるがこれらに限定されない高機能細胞を含むことが可能であり、かつ／またはこれらを使用して調製されうる。
細胞は、非封入細胞として、またはスフェロイド内、もしくはあらかじめ形成されたオルガノイド（上記で言及した）内にあらかじめ封入された細胞として含む、任意の適切な形態で組成物に組み込むことができる。ポリマースフェロイド内に封入されるか、または含有される動物組織細は、公知の技法に従い作製しうるか、または、場合によって、市販されている（例えば、Ｉｎｓｐｈｅｒｏ ＡＧ，３Ｄ Ｈｅｐｇ２ Ｌｉｖｅｒ Ｍｉｃｒｏｔｉｓｓｕｅ Ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ（２０１２）；Ｉｎｓｐｈｅｒｉｏ ＡＧ，３Ｄ ＩｎＳｉｇｈｔＴＭ Ｈｕｍａｎ Ｌｉｖｅｒ Ｍｉｃｒｏｔｉｓｓｕｅｓ（２０１２）を参照されたい）。
本発明のオルガノイドは、例えば、任意の三次元形状または多層形状など、任意の適切な形状および／または形態でありうる。一部の実施形態では、本発明のオルガノイドは、スフェロイドの形態でありうる。本発明のオルガノイドは、懸濁液または培地中で、自己組織化することが可能であり、任意選択的には、スフェロイドの形態でありうる。一部の実施形態では、オルガノイド内で形成し、かつ／または存在する細胞は、本発明の組成物および／またはバイオインク中に懸濁させることができる。一部の実施形態では、例えば、肺オルガノイドおよび／または消化管（例えば、結腸）オルガノイドなど、本発明のオルガノイドは、半多孔性膜の一方の側における内皮細胞と、半多孔性膜の反対側における上皮細胞とを含みうる。したがって、オルガノイドは、半多孔性膜により隔てられた、内皮細胞層と、上皮細胞層とを含みうる。内皮細胞および上皮細胞は各々、半多孔性膜の表面（すなわち、反対面）上で培養することができる。半多孔性膜は、シリコンベースの膜の場合もあり、かつ／またはポリカーボネートベースの膜の場合もある。
架橋型プレポリマー。本明細書で記載される方法において利用される場合、沈着の後、その弾性係数を増大させるように、さらに架橋しうる限りにおいて、任意の適切なプレポリマーを使用して、本発明を実行することができる。
一部の実施形態では、プレポリマーは、（ｉ）オリゴ糖（例えば、ヒアルロン酸、コラーゲン、これらの組合せ、および、特に、これらのチオール置換された誘導体）；および（ｉｉ）第１の架橋剤（例えば、それらの組合せを含む、ポリアルキレングリコールジアクリレート、ポリアルキレングリコールメタクリレートなど、特に、ポリエチレングリコールジアクリレートなどのチオール反応性架橋剤；チオール間ジスルフィド結合を創出する、チオール化架橋剤；チオール−金結合を形成する、金ナノ粒子による金官能化架橋剤など）の、少なくとも部分的な架橋反応から形成される。
架橋基。一部の実施形態では、組成物は、沈着後架橋基を含む。それらの組合せを含む、ポリエチレングリコールジアルキン、他のアルキン官能化基、アクリレート基またはメタクリレート基など、マルチアームのチオール反応性架橋剤を含むがこれらに限定されない、任意の適切な架橋基を使用することができる。
開始剤。本発明の組成物は、任意選択であるが、一部の実施形態では、好ましくは、開始剤（例えば、熱性開始剤または光開始剤）を含みうる。前記プレポリマーと、第２の（または沈着後）架橋基（例えば、加熱時または光への曝露時）との反応を触媒する、任意の適切な開始剤を利用することができる。
増殖因子。本発明の組成物は、任意選択であるが、一部の実施形態では、好ましくは、少なくとも１つの増殖因子（例えば、含まれる、特定の細胞、および／または作製される、特定の組織代用物に適切な増殖因子）を含みうる。一部の実施形態では、増殖因子および／または他の増殖促進性タンパク質を、組織細胞に対応する組織に由来する、脱細胞処理された細胞外マトリックス組成物（「ＥＣＭ」）（例えば、動物生細胞が、肝細胞である場合は、脱細胞処理された肝臓細胞外マトリックス；動物生細胞が、心筋細胞である場合は、脱細胞処理された心筋細胞外マトリックス；動物生細胞が、骨格筋細胞である場合は、脱細胞処理された骨格筋細胞外マトリックスなど）中に用意することができる。さらなる、コラーゲン、グリコサミノグリカン、および／またはエラスチン（例えば、細胞外マトリックス組成物に補充するように添加される）などもまた、含めることができる。
弾性係数。本発明の組成物は、室温および大気圧下で、操作し、いかなる沈着法を利用するのであれ（例えば、射出沈着）、これにより、基材上に沈着させうるように、十分に小さな弾性係数を有しうる。さらに、組成物は、任意選択であるが、一部の実施形態では、好ましくは、ここでもまた、室温および大気圧下で、その後の架橋（この架橋が、自発的架橋であれ、熱性架橋であれ、光開始架橋などであれ）まで、それを沈着させる形状または構成を実質的に保持するように、十分に大きな弾性係数を有する。一部の実施形態では、組成物は、沈着の前に、室温および大気圧下で、０．０５、０．１、もしくは０．５〜１、５、もしくは１０キロパスカル、またはこれを超える硬さを有する。
一部の実施形態では、本発明の方法は、心臓構築物を作り出す方法であって、哺乳動物の心臓生細胞（例えば、個々の細胞、オルガノイド、またはスフェロイド）、フィブリノーゲン、ゼラチン、および水を含む混合物を、支持体上に沈着させて、中間体心臓構築物を形成するステップと；任意選択的に、構造的支持材料（例えば、ポリカプロラクトン）を、中間体構築物を支持する構成で、混合物と共沈着させるステップと；次いで、トロンビンを、フィブリノーゲンを架橋し、フィブリンハイドロゲル内で、併せて、自発的に拍動する、心臓生細胞から構成された心臓構築物を作製する（まず、心臓細胞の成熟度に依存して、必要に応じた、介在的インキュベーションにより）のに有効な量で、構築物と接触させるステップとを含む方法を提供する。
一部の実施形態では、心臓細胞は、心筋細胞の懸滴培養により作製されたオルガノイドの形態である。例えば、ＳｔｏｐｐｉｎｉによるＵＳ２０１１／０２８７４７０を参照されたい。
一部の実施形態では、心臓構築物（とりわけ、その中の心臓細胞）は、有効量のイソプレテレノールの投与により頻度が上昇し、有効量のキニジンの投与により頻度が低下する自発的拍動を呈示する。
一部の実施形態では、心臓構築物（とりわけ、その中の心臓細胞）は、ＶＥＧＦ、アクチニン、および／または心臓トロポニンＴを発現させる。
上記の一般的バイオインクと同様に、それを、バイオプリンティングデバイスを使用してバイオプリンティングされうる、射出可能な材料へと増粘化するために、非修飾ゼラチンを、フィブリノーゲンに添加することができる。このゼラチンは、生理学的温度（摂氏３７度）におけるインキュベーション時に、架橋されないので、心臓構築物をバイオプリンティングした後で、ゼラチンは、最終的に、溶解され、構築物から滲出し、架橋されたフィブリンおよび拍動する心臓構築物だけが後に残る。
本発明の一部の実施形態によると、本発明の装置内で、組織構築物を作り出す方法が提供される。非限定的な一方法では、本発明の組成物を、本発明の装置内で、特定の構築物を作り出す方法において使用する。一部の実施形態では、本発明の方法は、
（ａ）上記の、射出可能なハイドロゲル組成物を含有するリザーバーを用意するステップと、次いで、
（ｂ）ハイドロゲル組成物を、基材に沈着させるステップ（例えば、シリンジを通した射出により）と、次いで、
（ｃ）任意選択的に（任意の適切な手段により、副次的構築物を作製しうるので）、組成物全般およびそれらの組織構築物のために、プレポリマーを、前記ハイドロゲルの硬さを増大させ、前記三次元臓器構築物を形成する（例えば、ハイドロゲルを加熱すること、ハイドロゲル組成物に光（例えば、環境光、ＵＶ光）を照射すること、ハイドロゲルのｐＨを変更することなどにより）のに十分な量だけ、第２の架橋基により架橋するステップと、
（ｄ）心臓構築物の組成物のために、上記で言及した通り、ハイドロゲルを、トロンビンと接触させて、フィブリノーゲンを架橋し、フィブリンハイドロゲルを形成するステップと
を含む。
沈着させるステップは、Ｈ．−Ｗ．Ｋａｎｇ、Ｓ．Ｊ．Ｌｅｅ、Ａ．Ａｔａｌａ、およびＪ．Ｊ．Ｙｏｏ、米国特許出願公開第ＵＳ２０１２／００８９２３８号（２０１２年４月１２日）において記載されている３ｄバイオプリンティング法などの３ｄバイオプリンティング法（射出式３ｄバイオプリンティングを含む）を含むがこれらに限定されない、任意の適切な装置により実行することができる。一部の実施形態では、沈着させるステップは、沈着させるステップのパターン化である。すなわち、沈着は、沈着させる組成物を、規則的または不規則的な格子、グリッド、渦巻きなど、規則的または不規則的なパターンの形態で沈着させるように実行する。
一部の実施形態では、細胞を含有するハイドロゲル組成物を、細胞を伴わない、あらかじめ形成された３Ｄオルガノイド基材の中央領域に適用する結果として、外側のオルガノイドゾーンの内側に、別個の細胞含有ゾーン（例えば、腫瘍細胞含有ゾーン）をもたらす。
一部の実施形態では、オルガノイド基材内に、無細胞の、ゼラチンだけのチャネルを形成することから、構築物内に、拡散を支援しうるチャネルを形成することができる。
一般的構築物についての、一部の実施形態では、架橋するステップは、室温および大気圧下で、前記ハイドロゲルの硬さを、１もしくは５〜１０、２０、もしくは５０キロパスカル、またはこれを超えて増大させる。一部のこのような実施形態では、ハイドロゲルは、前記架橋するステップ（ｃ）の後の、室温および大気圧下で、１もしくは５〜１０、２０、もしくは５０キロパスカルの硬さを有する。
一部の実施形態では、方法は、支持ポリマー（例えば、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）など、それらのコポリマーを含む、ポリ−Ｌ−乳酸、ポリ（グリコール酸）、ポリカプロラクトン；ポリスチレン；ポリエチレングリコールなど）を、前記基材上の、前記ハイドロゲル組成物の位置に隣接する位置に沈着させるステップを（例えば、前記ハイドロゲルを沈着させるステップと同時に、この後で、またはこれと交互に反復して、および、一部の実施形態では、架橋するステップの前に）さらに含む。
沈着のために、有機基材および無機基材を含み、その上に形成された、ウェル、チャンバー、またはチャネルなどの特徴を伴うかまたは伴わない基材を含む、任意の適切な基材を使用することができる。本明細書で記載される特定の製品のために、基材は、増殖培地を循環させうる、主要流体管路により接続された、少なくとも２つのチャンバー（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、またはこれを超えるチャンバー）（チャンバーは、任意選択であるが、好ましくは、流入口チャネルおよび／または流出口チャネルと関連する）を有するマイクロ流体デバイスを含むことが可能であり、沈着させるステップは、各チャンバー内で、個別に実行する。代替法では、基材は、第１および第２の平面状のメンバー（例えば、顕微鏡のカバースリップ）を含むことが可能であり、沈着させるステップは、この平面状のメンバー上で実行することができ、方法は、各平面状のメンバーを、マイクロ流体デバイスの個別のチャンバーに挿入するステップをさらに含みうる。チャンバーをシーリングするステップ、細胞の生存率を維持するステップなどの加工後ステップは、公知の技法に従って実行することができる。
本発明について、主に、単一の副次的チャンバーに言及しながら記載するが、所望の場合、同じまたは異なるオルガノイドを伴う、複数の副次的チャンバーも、基材上に含めうることが理解されるであろう。したがって、副次的チャンバーは、直列（in series）、並列、またはこれらの組合せを含む、任意の適切な構成で、互いおよび主要チャンバーと接続することができる。
一部の実施形態では、本発明の装置は、少なくとも３つのチャンバー（例えば、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、またはこれを超えるチャンバー）を含むことが可能であり、各チャンバーは、別のチャンバーと同じであるか、または異なる、細胞、組織、および／またはオルガノイドを含有する。少なくとも３つのチャンバーは、少なくとも３つのチャンバーを、任意の方式で、配置および／または接続した、単一の灌流プラットフォームで提供することができる。一部の実施形態では、少なくとも３つのチャンバーおよび／または前記少なくとも３つのチャンバー内の組織のうちの少なくとも１つは、転移性細胞および／または悪性細胞を含む。装置は、互いと流体連絡した、少なくとも第１、第２、および第３のチャンバーを、例えば、前記第１のチャンバー内の肝臓組織；前記第２のチャンバー内の心筋組織；および前記第３のチャンバー内の肺組織と共に含みうる。一部の実施形態では、装置は、少なくとも６つのチャンバーを含み、各チャンバーは、例えば、肝臓組織、心臓組織、血管組織、肺組織、結腸組織、または精巣組織もしくは卵巣組織のいずれかなど、６つの異なる組織のうちの１つを含む。一部の実施形態では、装置は、少なくとも６つのチャンバーを含み、各チャンバーは、例えば、肝臓組織、心臓組織、脳組織、肺組織、結腸組織、または精巣組織もしくは卵巣組織のいずれかなど、６つの異なる組織のうちの１つを含む。一部の実施形態では、装置は、少なくとも５つのチャンバーを含み、各チャンバーは、例えば、肝臓組織、心臓組織、脳組織、肺／血管組織、または精巣組織もしくは卵巣組織のいずれかなど、５つの異なる組織のうちの１つを含む。一部の実施形態では、装置は、少なくとも６つのチャンバーを含み、各チャンバーは、例えば、肝臓組織、心臓組織、脳組織、肺組織、血管組織、または精巣組織もしくは卵巣組織のいずれかなど、６つの異なる組織のうちの１つを含む。
一部の実施形態では、一般的な水性増殖培地は、装置のチャンバーのうちの１つまたは複数（例えば、少なくとも３つまたは全て）に存在しうる。一般的な水性増殖培地は、無血清内皮細胞用培地および／または精巣細胞用培地を含みうる。一般的な水性増殖培地は、任意の方式で、少なくとも３つのチャンバーに導入することができる。例えば、一部の実施形態では、一般的な水性増殖培地を、まず、精巣組織を含むチャンバーに導入し、次いで、心臓組織を含むチャンバーなどに導入することができる。一般的な水性増殖培地は、灌流を循環させることにより、１つまたは複数のチャンバーの各々を通して、循環および／または流動させることができる。装置は、一般的な水性増殖培地を、リザーバーから、約５μＬ／分〜約５０μＬ／分の範囲、もしくは任意の範囲、および／またはこれらの中の個々の値の速度で汲み出し、１つまたは複数のチャンバーを通して、培地を循環させる。一部の実施形態では、装置は、一般的な水性増殖培地を、リザーバーから、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０μＬ／分、または任意の範囲、および／あるいはこれらの中の個々の値の速度で汲み出す。
一般的な水性増殖培地は、グルタミン、グルコース、ヒドロコルチゾン、アスコルビン酸、ヘパリン、抗菌剤、抗微生物剤、血清、インターロイキン、ニューロトロフィン、骨形成タンパク質、アンジオポエチン、エリスロポエチン、幹細胞因子、および／または、例えば、上皮増殖因子、血管内皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子ベータ、肝細胞増殖因子、血小板由来の増殖因子、神経膠細胞株由来の神経栄養因子、角化細胞増殖因子、胎盤増殖因子、および／もしくはインスリン様増殖因子１など、１つもしくは複数の増殖因子（特に、例えば、ヒトなど、哺乳動物の増殖因子）を含むがこれらに限定されない、１つまたは複数のさらなる成分を含みうる。
一部の実施形態では、一般的な水性増殖培地は、グルタミンを含むことが可能であり、任意選択的に、グルタミンを、約０．１ｍＭ〜約５ｍＭの範囲の濃度で含みうる。
一般的な水性増殖培地は、グルコースを含むことが可能であり、任意選択的に、グルコースを、約５ｍＭ〜約６０ｍＭの範囲の濃度で含みうる。
一般的な水性増殖培地は、（哺乳動物、特に、ヒトの）上皮増殖因子を含むことが可能であり、任意選択的に、上皮増殖因子を、約０．１ｎｇ／ｍＬ〜約２０ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度で含みうる。
一般的な水性増殖培地は、ヒドロコルチゾンを含むことが可能であり、任意選択的に、ヒドロコルチゾンを、約０．１μｇ／ｍＬ〜約２μｇ／ｍＬの範囲の濃度で含みうる。
一般的な水性増殖培地は、アスコルビン酸を含むことが可能であり、任意選択的に、アスコルビン酸を、約０．１μｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬの範囲の濃度で含みうる。
一般的な水性増殖培地は、（哺乳動物、特に、ヒトの）血管内皮増殖因子を含むことが可能であり、任意選択的に、血管内皮増殖因子を、約０．１ｎｇ／ｍＬ〜約１０ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度で含みうる。
一般的な水性増殖培地は、（哺乳動物、特に、ヒトの）線維芽細胞増殖因子ベータを含むことが可能であり、任意選択的に、線維芽細胞増殖因子ベータを、約０．１〜約１０ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度で含みうる。
一般的な水性増殖培地は、インスリン様増殖因子１を含むことが可能であり、任意選択的に、インスリン様増殖因子１を、約０．１ｎｇ／ｍＬ〜約１５ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度で含みうる。
一部の実施形態では、一般的な水性増殖培地は、ヘパリンを含むことが可能であり、任意選択的に、ヘパリンを、１ｍＬ当たり約０．１単位〜１ｍＬ当たり約５単位の範囲の濃度で含みうる。
一般的な水性増殖培地は、抗菌剤および／または抗微生物剤（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、アンフォテリシンＢ）を含むことが可能であり、任意選択的に、抗菌剤および／または抗微生物剤を、約０．１体積％〜約１体積％の範囲の濃度で含みうる。
一部の実施形態では、一般的な水性増殖培地は、血清（例えば、ウシ胎仔血清、ウシ血清など）を含み、任意選択で、血清を、体積で約０．１％〜約１０％の範囲の濃度で含む。
一部の実施形態では、一般的な水性増殖培地は、例えば、金属（例えば、重金属）、薬物、および／または殺虫剤などの試験化合物を含む。
本発明の装置は、一般的な水性増殖培地と作動的に関連したセンサーを含みうる。センサーは、（ｉ）ＩＬ−８；（ｉｉ）プロスタサイクリン；（ｉｉｉ）アルブミン；（ｉｖ）尿素；（ｖ）ＬＤＨ；（ｖｉ）クレアチンキナーゼ；（ｖｉｉ）アルファ−グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ；（ｖｉｉｉ）カルセインＡＭで染色された生細胞；（ｉｘ）ヨウ化プロピジウムもしくはエチジウムホモ二量体で染色された死細胞；（ｘ）ＡＴＰ活性；および／または（ｘｉ）ミトコンドリア代謝のうちの１または複数の、存在、低減および／または増大を報告することにより、応答することなどにより、薬物、薬物候補物質、化合物、生物学的薬剤、化学的薬剤などに対する毒性応答を感知するように構成することができる。センサーは、ＥＬＩＳＡセンサー；比色アッセイセンサー、リアルタイムの抗体センサーもしくはアプタマーセンサー、ウェスタンブロットセンサー、経内皮電気抵抗センサー、経上皮電気抵抗センサー、組織の形状を示すように構成された光学ビデオ捕捉装置、および／または心臓組織内の拍動の動態もしくは拍動挙動の変化を示すように構成された光学ビデオ捕捉装置を含みうる。
本発明の装置は、生理学的または高度に生理学的（hyperphysiological）な、流体対組織体積比をもたらすように構成することができる。例えば、装置内の１つまたは複数のチャンバーは、約２μＬ〜約１０μＬの範囲の平均容量を有しうる。一部の実施形態では、装置内の１つまたは複数のチャンバーは、約２、３、４、５、６、７、８、９、または１０μＬの平均容量を有しうる。一部の実施形態では、本発明の装置（例えば、少なくとも６つのチャンバーを含む装置）は、例えば、約９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０μＬ、またはこれ未満など、約１００μＬ未満の量の液体を使用することが可能であり、かつ／またはこの容量を有しうる。本明細書で使用される装置の容量とは、装置のチャンバーおよびチャネルを満たす容量を指す。一部の実施形態では、本発明の装置（例えば、少なくとも６つのチャンバーを含む装置）は、約５０μＬ未満の量の液体を使用することが可能であり、かつ／またはこの容量を有しうる。一部の実施形態では、装置の容量は、外部流体リザーバーとの統合および／または併用により増大させることができる。外部流体リザーバーは、全システム容量を増大させることが可能であり、かつ／または装置の容量を制御する一助となりうる。
本発明の装置および／または方法は、各々が、少なくとも１、２、３、４週間、またはこれを超える期間にわたり生存する、１つまたは複数の（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、またはこれを超える）異なる組織および／またはオルガノイド（例えば、３Ｄオルガノイド）を含むことが可能であり、かつ／またはこれらを提供しうる。一部の実施形態では、本発明の装置および／または方法は、互いおよび一般的な水性増殖培地と流体連絡し、各々が、少なくとも１、２、３、４週間、またはこれを超える期間にわたり生存する、１つまたは複数の（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、またはこれを超える）異なる３Ｄ組織構築物を含み、かつ／または提供する。したがって、一部の実施形態では、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはこれを異なる３Ｄ組織構築物は、互いおよび一般的な水性増殖培地と流体連絡し、各々が、少なくとも１、２、３、４週間、またはこれを超える期間にわたり生存する。一部の実施形態では、３Ｄ組織構築物のうちの１つまたは複数は、生存することが可能であり、１、２、３、４週間後、またはこれを超える期間後に、構築物中に存在する細胞の平均数に基づき、少なくとも約７５％またはこれを超える（例えば、約８０％、８５％、９０％、９５％またはこれを超える）生存細胞を含みうる。組織および／またはオルガノイドは、一般的な細胞試料（例えば、対象から回収された皮膚試料などの試料）からの分化により作出することができる。組織構築物のうちの１つまたは複数は、対応する天然（例えば、ヒト）組織内に存在する細胞の比率と同様の比率で、細胞を含みうる。一部の実施形態では、組織構築物のうちの少なくとも１つは、転移性細胞および／または悪性細胞を含む。一部の実施形態では、組織および／またはオルガノイドの機能および／または特性を、決定および／または測定し、対応する天然組織の機能および／または特性と比較することができる（例えば、肝臓オルガノイドの特性を測定し、対象における肝臓組織の同じ特性と比較することができる）。一部の実施形態では、組織および／またはオルガノイドの機能および／または特性は、対応する天然組織の機能および／または特性と同様でありうる。
主要チャンバーおよび副次的チャンバー、関連するオルガノイド、流入口、流出口、ならびに管路を保有する基材は、使用のためのさらなる構成要素と組み合わせた、大型の装置内に設置されうる、独立の「カートリッジ」またはサブコンビネーションの形態で提供することができる。したがって、一部の、このような大型装置についての実施形態では、装置は、主要チャンバーと作動的に関連したポンプであって、増殖培地を、主要チャンバーから副次的チャンバーに循環させるためのポンプをさらに含む。
本発明の装置は、装置のチャンバーのうちの１つまたは複数と作動的に関連したポンプを含みうる。一部の実施形態では、ポンプは、装置のチャンバーの全てと関連しうる。ポンプは、一般的な水性増殖培地を、装置のチャンバーのうちの１つまたは複数（または全て）を通して循環させうる。
一部の実施形態では、装置は、装置のチャンバーのうちの１つまたは複数（または全て）と作動的に関連し、流体連絡した酸素化チャンバー（例えば、培地リザーバー）を含む。
一部の実施形態では、装置は、装置のチャンバーのうちの１つもしくは複数に隣接して、かつ／または１つもしくは複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つなど）の装置のチャンバーの間に配置された、（手動で操作されるか、または自動的に制御される）流体バルブを含む。流体バルブは、チャンバー内に存在する組織の１つまたは組合せを、互いから隔絶させうる。
一部の実施形態では、装置は、（ｃ）心臓構築物と作動的に関連し（例えば、心臓構築物の拍動数または拍動頻度をモニタリングするために）、任意選択的に、ウィンドウと作動的に関連した心臓モニターまたは拍動モニター（例えば、カメラ、電極、または電極アレイなど）をさらに含む。
一部の実施形態では、装置は、主要チャンバーと作動的に関連した、増殖培地リザーバーおよび／またはバブルトラップをさらに含む。
一部の実施形態では、装置は、主要チャンバーおよび副次的チャンバー（ならびにポンプ、ならびに、存在する場合、リザーバーおよび／またはバブルトラップ）と作動的に関連した戻し導管であって、副次的チャンバーから主要チャンバーに循環させた増殖培地を戻すための戻し導管をさらに含む。
作製された後、上記の、サブコンビネーションデバイスまたは「カートリッジ」デバイスは、即座に使用することもでき、保管および／または輸送のために調製することもできる。
製品を保管および輸送するために、水と混合したゼラチンなど、室温（例えば、２５℃）では、流動性の液体であるが、冷蔵温度（例えば、４℃）では、ゲル化または固体化する、一過性の保護的支持培地を、デバイスに添加して、チャンバー、および好ましくはまた、関連する管路を、実質的または完全に満たすことができる。任意の流入ポートおよび流出口ポートは、適切なキャッピングエレメント（例えば、プラグ）またはキャッピング材料（例えば、蝋）でキャッピングすることができる。次いで、デバイスを、冷却エレメント（例えば、氷、ドライアイス、熱電冷却器など）と併せて、パッケージングし、全てを、（好ましくは、絶縁）パッケージに入れることができる。
代替的に、製品を保管および輸送するために、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）とポリ（エチレングリコール）とのブロックコポリマーなど、低温（例えば、４℃）では、流動性の液体であるが、室温（例えば、２０℃）または体温（例えば、３７℃）など、温暖温度では、ゲル化または固体化する、一過性の保護的支持培地を使用することができる。
エンドユーザーは、デバイスを受け取った後、関連するパッケージおよび冷却エレメントから簡単に取り出し、温度を上昇または降下させ（一過性の保護的支持培地の選択に応じて）、任意のポートのキャップを外し、一過性の保護的支持培地を、シリンジで除去する（例えば、増殖培地でフラッシュすることにより）ことができる。
本発明の装置は、インビトロにおける、薬物スクリーニング、毒性学スクリーニング、および／または疾患モデル化の方法において使用することができる。方法は、本発明の装置を用意するステップと；装置内に存在する、少なくとも１つまたは複数の組織における、薬理学的応答または毒性学的応答を検出するステップとを含みうる。一部の実施形態では、本発明の装置は、
（ａ）本発明の装置を用意するステップと；
（ｂ）任意選択的に、増殖培地（例えば、一般的な水性増殖培地）を、第１のチャンバーから、第２のチャンバーに循環させるステップと；
（ｃ）少なくとも１つの試験化合物を、装置内の組織構築物に投与するステップ（例えば、試験化合物を、増殖培地に添加することにより）ステップと；ならびに
（ｄ）少なくとも１つの試験化合物に対する薬理学的応答および／または毒性学的応答を検出する（例えば、心臓構築物などの拍動頻度の変化を、例えば、心臓モニターにより決定する）ステップと
により、少なくとも１つの試験化合物を、生理学的活性および／または毒性についてスクリーニングするために使用することができる。一部の実施形態では、薬理学的応答および／または毒性学的応答を検出することは、応答を、試験化合物を投与しない場合に観察される応答（または応答の欠如）と比較することを含みうる。
一部の実施形態では、少なくとも１つの試験化合物は、少なくとも２つの、顕著に異なる試験化合物であって、例えば、これらの間の薬物相互作用について試験するために、互いと同時に投与される試験化合物を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つの試験化合物は、重金属を含み、例えば、各組織構築物について、環境の重金属毒性をモデル化するのに使用することができる。
一部の実施形態では、試験化合物は、例えば、ＣｄＣｌ２などのカドミウムを、任意選択的に、約０．１μＭ〜約１００μＭの範囲の濃度で含みうる。
一部の実施形態では、試験化合物は、例えば、ＣｒＯ３などのクロム（ＶＩ）を、任意選択的に、約０．１μＭ〜約１０μＭの範囲の濃度で含みうる。
一部の実施形態では、試験化合物は、クロム（ＩＩＩ）を、任意選択的に、約１μＭ〜約１００μＭの範囲の濃度で含みうる。
一部の実施形態では、試験化合物は、例えば、ＰｂＣｌ２などの鉛を、任意選択的に、約５μＭ〜約５ｍＭの範囲の濃度で含みうる。
一部の実施形態では、試験化合物は、例えば、ＨｇＣｌ２などの水銀を、任意選択的に、約０．２μＭ〜約２０μＭの範囲の濃度で含みうる。
一部の実施形態では、試験化合物は、例えば、ヒ素（ＩＩＩ）（例えば、Ａｓ２Ｏ３）などのヒ素を、任意選択的に、約０．０５μＭ〜約５０μＭの範囲の濃度で含みうる。
一部の実施形態では、検出するステップを、互いから間隔を置いて、逐次的に、複数回（例えば、少なくとも１日の間隔を置いた、少なくとも２回の機会）実行する。
一部の実施形態では、方法は、増殖培地を、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはこれを超える日数など、１または複数の日数にわたり、装置内のチャンバーの全てを通して循環させるステップを含む。一部の実施形態では、循環させるステップは、例えば、ストレスについてのバイオマーカーなどのバイオマーカーが、およそ無細胞培地による対照レベルを達成することを可能とするのに、少なくとも十分な時間にわたり実行することができる。循環させるステップは、少なくとも（ｉ）前記一般的な水性増殖培地中の、ＩＬ−８および／もしくはプロスタサイクリンの炎症性マーカー濃度が低下するのに十分な時間；（ｉｉ）前記培地中のアルブミンおよび／もしくは尿素の濃度が、実質的に安定を維持する時間；（ｉｉｉ）前記培地中のＬＤＨおよび／もしくはクレアチンキナーゼのレベルが、対照条件下の同じ培地と、実質的に同じレベルを維持する時間；ならびに／または（ｉｖ）前記培地中のアルファ−グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼレベルが、対照条件下の同じ培地と、実質的に同じレベルを維持する時間にわたり、実行することができる。一部の実施形態では、循環させるステップを、無細胞培地による対照レベルを達成し、かつ／または上記の通りの（ｉ）〜（ｉｖ）を達成するのに十分な時間にわたり実行した後で、少なくとも１つの試験化合物を投与することができる。
一部の実施形態では、方法は、装置のチャンバー内の、組織および／またはオルガノイドの機能および／または特性を決定および／または測定するステップと、組織および／またはオルガノイドの機能および／または特性を、対応する天然組織の機能および／または特性と比較するステップと（例えば、肝臓オルガノイドの特性を、対象の肝臓組織の同じ特性と比較することができる）を含みうる。
一部の実施形態では、方法は、例えば、キレート剤を、増殖培地に添加することなどにより、キレート剤を、装置内の組織構築物および／またはオルガノイドに投与するステップを含みうる。キレート剤の例は、ジメルカプロール、ジメルカプトコハク酸、ジメルカプトプロパンスルホン酸塩、ペニシラミン、エチレンジアミン四酢酸、システイン、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、グルタチオン、アルファ−リポ酸、アスコルビン酸、アルファ−トコフェロール、セレニウム、ケルセチン、および／またはコーヒー酸を含むがこれらに限定されない。
本発明の方法および／または装置は、とりわけ、特定の試験化合物の代謝を含む、細胞による代謝、もしくは前記特定の試験化合物により誘導される細胞への毒性、またはこれらの相互作用を評価するために使用することができる。
本発明の態様は、以下の非限定的な実施例で、さらに説明される。
［実施例１］
生体機能チッププラットフォームを創出する、生体工学処理された組織の使用について調査した。本発明者らは既に、生体工学処理された組織を、患者に埋め込むことに成功している１２〜１４。薬物発見への適用のための、肝細胞１５および心筋細胞１６、１７など、高度に特化した初代細胞の実現は、技術的に困難で、高価なプロセスであることが分かっている１８。本発明者らの生体工学処理された構築物に十分な、組織特異的ヒト細胞を調達することが可能であることに加えて、内皮細胞および線維芽細胞などの支持細胞、ならびに構造的マトリックスタンパク質の組込みは、細胞の、互いおよび細胞微小環境との動的相互作用の再現を可能としうる。
次の難題は、複数の組織型または臓器型を、単一のマイクロ流体デバイス内で組み合わせて、薬物研究および治療研究のために、単純なチップ上の生物をモデル化することである。ともあれ、人体内では、組織および臓器は、互いに相互接続され、高度に相互依存的である。ヒト組織を、総合的かつ正確に模倣し、疾患をモデル化する生体機能チップシステムは、限定的であり、複数の臓器を、統合的に再提示するものは、さらに少数である。人体内の組織および臓器の発生および機能は、孤立しては生じないので、これは、重要な技術的限界である。逆に、臓器は、正常に機能するには、血管、神経、代謝、およびホルモンのシグナルおよび支援を受け取ることが不可欠である。薬物スクリーニングでは、例えば、副次的組織における毒性の影響も、標的部位における影響と同様に重要でありうる。検出されない場合でも、これらの影響は、否定的な副作用のために、不必要に高い不合格率または市場からの撤退率をもたらしうる。同様に、悪性腫瘍細胞が、１つの組織から、別の場所へと遊走する、腫瘍の転移でも、複数の組織部位または臓器部位、ならびに循環系（血管系またはリンパ系）は、システムの鍵となる構成要素である１９。それ自体、多くの適用に有用であるが、単一のオルガノイドモデルは、人体内で自然発生する、複数の組織間の、複雑な生理学的相互作用を再現するための有効性が限定されている。マルチオルガノイドプラットフォームは、生体機能チップ技術の、必須かつ論理的な前進である。近年のこのようなシステムのいくつかは、近年になって開発された。このような一例では、４組織システムが、単一デイス内の、肝臓コンパートメント、心臓コンパートメント、骨格筋コンパートメント、および神経コンパートメントの、２Ｄ組織培養物を統合した、ポンプを伴わない、灌流プラットフォーム内で開発された。ドキソルビシン、アトルバスタチン、バルプロ酸、アセトアミノフェン、およびＮ−アセチル−ｍ−アミノフェノールを伴う薬物スクリーンにおいて、このプラットフォームを利用して、基礎細胞毒性を裏付けた２０。別の例では、あらかじめ形成された腸構築物および皮膚構築物、肝臓スフェロイド、ならびに腎臓上皮障壁組織モデルを含有するＭＰＳ（ｍｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ）マイクロ流体プラットフォームが開発され、基礎機能、遺伝子発現、および生存率が、２８日間にわたり維持された２１。これらの例は、薬物スクリーンおよび毒性スクリーンにおける、組織間の複雑な応答および相互作用を模倣しうるシステムへの、重要なステップを表す。
本研究では、本発明者らは、これらの技術をさらに進め、肝臓モデル、心臓モデル、血管モデル、肺モデル、精巣モデル、および結腸モデルを含む、６組織生体機能チップシステムの開発および試験について記載することを目的とする。各組織モデルは、天然ヒト組織内に存在する細胞型により、可能な場合は、同様の細胞型比率で創出した。特製の組織特異的「バイオインク」２７、２８によるバイオプリンティング２２〜２６技術、およびマイクロ流体技術を利用して、肝臓、心臓、および精巣の組織オルガノイドを、肺モジュールおよび血管障壁組織モジュール、ならびに平滑筋および上皮による結腸構築物に接続された、モジュラーで灌流可能なデバイスに、正確かつ再現可能な形で統合した。次いで、このシステムを利用して、薬物および毒性薬剤に対する生理学的応答について評価した。この６オルガノイド生体機能チップシステム上では、オルガノイドは、人体内で見出される臓器動態と同様に、様々な外部刺激に対して、独立に、または協調的に応答することが可能であり２９、このときに、試作品の統合型バイオセンサーシステムを、環境モニタリングおよび生物学的モニタリングに利用することができる。本発明者らは、生理学的特徴付け、機能的な試験、ならびに薬物スクリーニングおよび毒性スクリーニングを実証し、この新たなプラットフォームの有用性を開陳する。
［結果］
＜６組織生体機能チッププラットフォームのデザイン＞
本発明者らの研究の目標は、肝臓、心臓、血管、肺、精巣、および結腸の代替物を含有する、高度に機能的なマイクロ流体式灌流駆動型６組織生体機能チップシステムを開発することであった（図１、パネルＡ〜Ｂ）。重要なことは、これらの個々の組織型が、プラットフォームの初期設定のために、簡便な「プラグアンドプレイ」性能を可能とする、従来のポリジメチル−シロキサン（ＰＤＭＳ）ソフトリソグラフィーおよび成形１１、３０、３１により形成される、モジュラーマイクロ流体ハードウェアデバイス内またはマイクロリアクター内（図１、パネルＢ）に構築されることである。この戦略は、さらなる組織構築物またはオルガノイドを含有する、全プラットフォームの持続的な進化を可能とする。各種類の組織モデルの、個々の特定の要件のために、バイオファブリケーション法のツールボックスを利用して、各組織モデルを創出した（図１、パネルＣ〜Ｅ）。略述すると、懸滴法を使用して、主要なヒト肝細胞である、星細胞およびクッパー細胞により、球形の肝臓オルガノイドを形成し、球形の心臓オルガノイドおよび精巣オルガノイドを、ヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を使用して形成した。次いで、オルガノイドを、灌流システム内の、大型のハイドロゲル−オルガノイド構築物として固定化するのに、ハイドロゲルバイオインクによる架橋を利用する、肝臓ＥＣＭ由来のバイオインク、フィブリンおよびゼラチンによるバイオインク、ならびにヒアルロン酸（ＨＡ）およびゼラチンによるバイオインクを使用して、これらの球形のオルガノイドを、マイクロリアクターにバイオプリンティングした（図７）。血管モジュールおよび肺モジュールも、マイクロリアクター内で、同様の形態因子により作製したが、デバイス内に、ヒト臍帯静脈内皮細胞（血管）または肺線維芽細胞および肺上皮細胞が播種される、半多孔性膜の固定化を伴った。内皮モジュールデバイス自体へと統合される、特製の経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）センサーを利用した。このセンサーは、単層の両側に、２つの金電極を使用して、内皮を隔てた実効抵抗を測定することにより、内皮または上皮の完全性のモニタリングを可能とする。最後に、Ｉ型コラーゲンゲルを、結腸の平滑筋細胞および上皮細胞と共に成形した結果として、上皮腺房構造を含有する、アライメントされたコラーゲン粘膜下組織をもたらすことにより、結腸オルガノイドを形成した（図１、パネルＥ）。バイオファブリケーションの後、デバイスをシーリングし、マイクロペリスタルティックポンプにより駆動される、中央流体ルーティングブレッドボードを通した循環灌流システムに接続した。組織学、免疫染色、代謝アッセイ、基本薬物毒性試験、および各組織モデル型の生理学的関連性を裏付ける、さらなる機能試験を含む、個々の組織モデルについての広範な特徴付けデータを、図８〜１７に記載する。
＜６組織のベースラインにおける特徴付け＞
最終的に、生体機能チップデバイスは、毒性をほとんど伴わずに、ベースライン条件下の、一般的な培地条件下で、多種多様な組織型を支援するものとする。上記のプラットフォームを組み立て、マイクロペリスタルティックポンプにより、５ｍＬのリザーバーから、培地を汲み出す、１０μＬ／分の循環灌流下で始動した。一般的な培地は、無血清内皮細胞用培地と精巣細胞用培地との１：１の混合物を含有した。生存率は、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色およびマクロ共焦点顕微鏡法によるイメージングを介して視覚化される通り、７および１４日目のいずれにおいても、比較的大きいことが示された（図２、パネルＡ〜Ｂ）。興味深いことに、分泌されたバイオマーカーについてのパネル（図２、パネルＣ〜Ｈ）は、炎症性マーカーが、当初増大してから減弱したものの、他の毒性マーカーは、研究を通して、低量を維持し、一部の機能的なマーカーが存在し、一定であることを指し示す。とりわけ、肝臓のベースライン機能（アルブミンおよび尿素）は、研究期間にわたり、比較的一貫し、培地対照より有意に高いレベルを維持したことから、良好な生存率および機能が指し示される（図２、パネルＣ〜Ｄ）。同様に、細胞から、培地に放出される場合に、様々な組織型についての毒性の一般的マーカーであるＬＤＨ、および心筋細胞内の毒性のマーカーであるＣＫも、培地対照と同様のレベルである、比較的低値を維持したことから、低毒性が指し示される（図２、パネルＥ〜Ｆ）。興味深いことに、それぞれ、肺上皮および血管内皮から放出されるタンパク質である、ＩＬ−８およびプロスタサイクリンが、当初スパイクするが、経時的に、ベースラインレベルに減少することから、肺構築物および血管構築物が、システム始動時には、ストレスを受けたが、経時的に、改善されたことが示唆される（図２、パネルＧ〜Ｈ）。これらのデータは、マルチオルガノイドシステムが、おそらく、人体が機能する方式と同様に、自らを自己調節し、経時的に、培地を馴化し、各組織型を良好に支援することを示唆する。
＜動的に応答する血管モジュール＞
血管内皮モジュール（図１、パネルＤ）は、ＣＤ３１、フォンウィレブランド因子（ｖＷＦ）、およびＶＥ−カドヘリン（図３、パネルａ〜ｃ）を含む、古典的な内皮マーカーを発現させた。加えて、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色により裏付けられる通り、内皮の生存率が高かった（図３、パネルｄ）。機能的な応答について評価するため、内皮モジュールデバイス自体へと統合される、特製の経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）センサーを利用した（図３、パネルｅ〜ｆ）。略述すると、このセンサーは、単層の両側に、２つの金電極を使用して、内皮を隔てた実効抵抗を測定する。インタクトな単層が、抵抗の増大を結果としてもたらすのに対し、破壊された単層は、抵抗の減少を結果としてもたらす（図３、パネルｆ）。まず、単層が、経時的に、コンフルエントとなるときの、内皮を隔てた抵抗について評価することにより、ＴＥＥＲセンサーの妥当性を検証した。図３、パネルｇは、内皮細胞が、増殖し、膜に蝟集するときの抵抗が、一定を維持する無細胞の培地対照と対比して、増大することを示す。
次に、ＴＥＥＲセンサーを使用して、ヒスタミンの、内皮完全性に対する影響について評価した。体内で、血小板からのヒスタミンの放出は、内皮の破壊を結果としてもたらす。通常の培地条件下で、内皮層を隔てた抵抗は、一貫して、約０．５４ｋΩであった。１００μＭのヒスタミンを添加したところ、抵抗は、約０．４ｋΩに、有意に（ｐ＜０．０５）降下し、１０分間にわたり、一定を維持した。未使用の培地を添加して、ヒスタミンを洗浄したところ、抵抗は、有意に（ｐ＜０．０５）増大し、元のベースラインレベルに戻った（図３、パネルｈ）。
血管内皮の、１つの重要な機能は、血流および組織へと移動する、細胞および分子のいずれに対しても、選択的障壁として用いられることであり、逆もまた同様である。よって、本発明者らは、血管モジュールの応答性を、隣接するオルガノイド含有腔からの、可溶性の分子の流過をモジュレートする能力と併せて、さらに裏付けようとした。新たな血管モジュールを、完全にコンフルエントまたはコンフルエントではない内皮層により調製した。この実験のために、肝臓オルガノイドを、記載される通り、モジュールの下方チャンバー内の、肝臓特異的バイオインク中に固定化した（図３、パネルｆ）。これらを、マクロ共焦点顕微鏡法により、物質移動実験と並行してイメージングしたところ、半多孔性膜（目視不可能な膜）上の内皮、および下方の３Ｄ肝臓オルガノイド（図３、パネルｇ）が示された。重要なことは、物質移動実験のために、バイオインクがまた、培地中に、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４マレイミドタグとコンジュゲートさせた、１５ｋＤａの可溶性ゼラチンからなる、可溶性の蛍光色素も含有したことである。デバイスの下方チャンバー内に、肝臓オルガノイド、バイオインク、および色素を添加したら、デバイスをシーリングし、実験を開始した。モジュールを、培地リザーバーから来る、通常の培地による、２５μＬ／分の流動下に維持し、このときに、流出ポートからのアリコートを、５分ごとに回収した。２０分後、リザーバーを、１００μＭのヒスタミンを含有するリザーバーで置きかえた（図３、パネルｈ）。実験後、アリコートを、蛍光強度について解析した。コンフルエントの単層を伴うデバイスからのアリコートは、ヒスタミンの導入前は、低レベルの蛍光（５０〜９０ＲＦＵ）を有したが、その後、蛍光強度は、徐々に増大し、４５分には、２００ＲＦＵ近くに達した（図３、パネルｉ）。特に、最後の３つの時点（３５、４０、および４５分）からのアリコートのＲＦＵレベルは、早期の時点（１０、１５、および２０分）からのＲＦＵレベルより、有意に（ｐ＜０．０５）高レベルであったことから、ヒスタミンによる内皮完全性の破壊が、染色された培地の、上方の循環への移動を可能としたことが裏付けられる。重要なことは、コンフルエントではない対照のデバイスが、実験の開始時から、色素の移動を押しとどめられなかったことである。結果として、最初の３つの時点において、ＲＦＵレベルの上昇が観察され、実験の経過にわたり、低下が観察された。
＜３Ｄオルガノイドと対比した、２Ｄ細胞培養物における、薬物毒性の比較＞
残念ながら、多くの薬物は、前臨床研究および臨床試験を通過した後、場合によって、何年もの間、市場にとどまった後、ヒトにおいて、毒性の影響を有するために、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によりリコールされる。注目すべきことは、市場から撤退した薬物のうちの９０％が、肝臓および心臓に対する影響に起因して撤退したことである。本発明者らのプラットフォームの有用性を裏付けるために、本発明者らは、表１にまとめられた、これらの薬物のうちのいくつかについてスクリーニングした。これらは、肝毒素である、トログリタゾン、ミベフラジル、ブロムフェナク、およびチエニル酸のほか、心毒素である、アステミゾール、ペルゴグリド、テロジリン、ロフェコキシブ、およびバルデコキシブを含む。
図４は、薬物濃度の関数として細胞生存率の変化を示す。とりわけ、肝臓オルガノイドは、トログリタゾンの濃度が、０から、１、２、および３μＭに増大し、ミベフラジルの濃度が、０から、１、１０、および１００μＭに増大するときに、細胞死の増大を経る（図４、パネルａ）。同様に、心臓オルガノイドは、アステミゾールの濃度が、０から、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭに増大し、ペルゴグリドの濃度が、０から、１、１０、および１００μＭに増大し、テロジリンの濃度が、０から、１００μＭに増大するときに、細胞死の増大を経る（図４、パネルｂ）。
３Ｄオルガノイドシステムと比較して、本発明者らはまた、これらの薬物を、２Ｄの初代肝細胞およびｉＰＳ心筋細胞の培養物、および２Ｄのｈｅｐｇ２肝がん細胞およびＣ２Ｃ１２筋芽細胞の培養物も使用してスクリーニングした。図５は、これらの薬物スクリーンの、ＡＴＰ活性に対する影響を、各組織モデル型についてまとめる。異なる数の細胞を利用する（肝臓オルガノイドは、１５００であり；心臓オルガノイドは、２５００であり；２Ｄ肝細胞は、２００００であり；２Ｄ心筋細胞は、１２５００であり；ＨｅｐＧ２およびＣ２Ｃ１２の培養物は、２００００であった）、異なる細胞モデルの形態因子間の比較を可能とするために、ＡＴＰレベルを、薬物のベースラインレベルに対して正規化した。
これらのデータは、２Ｄと比較された、３Ｄの鍵となる特徴を裏付け、すなわち、これらのモデルの、薬物処理に対する感受性は、異なることが多く、傾向は、必ずしも、一貫していない。とりわけ、肝臓薬物スクリーンに関しては、３Ｄオルガノイドは、いずれの２Ｄシステムに対しても、有意に高感受性であった（図５、パネルａ）。一方、３Ｄオルガノイドおよび２Ｄ肝細胞培養物のいずれも、ミベフラジルに対して、２ＤのＨｅｐＧ２培養物と比較して、高感受性であった（図５、パネルｂ）。逆に、３Ｄオルガノイドおよび２Ｄ肝細胞培養物のいずれも、ブロムフェナクに対して、２ＤのＨｅｐＧ２培養物と比較して、わずかに耐性が大きかった（図５、パネルｃ）。最後に、チエニル酸に応答して、異なる形態因子は、有意に異なる応答を経なかった（図５、パネルｄ）。
心臓の薬物処理に関しても、応答の、同様の変動が観察された。３Ｄ心臓オルガノイドは、低〜中程度の濃度で、アステミゾールおよびペルゴグリドの両方に対して、２Ｄシステムと比較して、有意により高感受性であった（図５、パネルｅ〜ｆ）。３Ｄオルガノイドは、また、テロジリンに対しても、２Ｄシステムより、わずかに高感受性であったが、これは、１００μＭの最高濃度に限られた（図５、パネルｇ）。他方、２Ｄ心筋細胞培養物は、ロフェコキシブおよびバルデコキシブのいずれに対しても、３Ｄオルガノイドおよび２Ｄ Ｃ２Ｃ１２培養物と比較して、感受性の増大を示したが、これは、低〜中程度の薬物濃度に限られた（図５、パネルｈ〜ｉ）。これらの結果は、細胞が、３Ｄオルガノイドアーキテクチャーにあるのか、２Ｄ単層にあるのか、または細胞が、典型的に、機能的ではない、確立された不死化細胞株と対比して、高機能初代細胞もしくは分化させたｉＰＳ由来細胞であるのかに応じて、ある種の薬物に対する細胞応答に、明確な差違が見られることを裏付ける。
心臓の薬物スクリーンに関して、図５の結果は、確かに、ある程度の有意差を示す。しかし、特に、テロジリン、ロフェコキシブ、およびバルデコキシブについて、全般的な応答傾向は、顕著に類似している。心臓毒性を引き起こすためにリコールされた、大半の薬物は、実際は、心臓細胞死に起因してリコールされたのではなく、拍動動態など、心機能の変化を引き起こすためにリコールされたことに注目されたい。２Ｄ心筋細胞培養物は、拍動活性を維持しうるが、一貫性および再現性は、維持するのが困難でありうる。さらに、Ｃ２Ｃ１２細胞は、筋芽細胞であり、拍動しない。これらの事実は、拍動動態を、これらの細胞モデル型の間で比較することを困難とする。しかし、図１５で裏付けられる通り、３Ｄ心臓オルガノイドは、薬物投与に対して、一貫して応答し、事実、図１９に示される通り、また、記載されている通り、患者において、心拍動態の変化を引き起こすために、取り下げられた、アステミゾール、ペルゴグリド、およびテロジリンに対する応答として、拍動動態の有害な変化も示す（表１）。
＜薬物試験における、マルチオルガノイド相互作用性の重要性＞
人体では、臓器は、互いに複雑に相互作用する。オルガノイドプラットフォームがまた、マルチオルガノイド相互作用も支援しうることを裏付けるために、下流の心臓構築物の機能性が、上流の肝臓構築物による代謝に依存する実験を実施した。流体システムのモジュラーな性質を利用して、このようなプラットフォームを構築した。心臓構築物マイクロリアクター筐体と統合されるようにカスタマイズされた、内蔵型のＬＥＤおよびカメラシステムを使用して、心臓オルガノイドに対する、リアルタイムの視覚的モニタリングを達成した（図６、パネルａ）３２。このシステムは、リアルタイムのビデオ捕捉を可能とした（図６、パネルｂ）。一連のＭａｔＬａｂ関数により、カスタムで書かれたＭａｔＬａｂコードを使用して、各フレーム内のピクセルの動きを、時間に対して決定することから、拍動伝搬の二元表示（図６、パネルｃ）を生成し、拍動数を視覚化するプロットを作成した。
エピネフリンおよびプロプラノロールの影響を、両方のシステム内で併用して試験する前に、心臓だけのシステムまたはタンデムシステムにより、独立に試験した。プロプラノロールだけ（０．１μＭ）による処理は、心臓だけのシステムにおいて、拍動数のわずか（約１０％）ではあるが、有意な（ｐ＜０．０５）低下を結果としてもたらした。しかし、肝臓構築物の存在下では、拍動数の低下が見られないことから、薬物の代謝が指し示される（図６ｄ）。同様に、エピネフリンだけ（０．５μＭ）による処理は、心臓だけのシステム内で、拍動数の著明な（約４０％）増大を結果としてもたらした。肝臓構成要素の付加は、エピネフリンにより誘導された拍動数の増大を、無効化はしなかったが、増大を、約４０％から、３０％に低減した（ｐ＜０．０５、図６、パネルｄ）ことから、統合型オルガノイドシステムの応答が、さらに裏付けられる。
次に、心臓だけのシステムおよびタンデムシステムにおける、両方の薬物の間の相互作用について評価した。図１４に記載した結果に基づき、０．１μＭプロプラノロール、および０．５μＭエピネフリンの薬物濃度を選択した。まず、プロプラノロールを投与し、その後、エピネフリンを追加したところ、どのオルガノイドが存在するのかに応じて、エピネフリンの影響は変動した（図６、パネルｅ）。各状態についての拍動プロットを、図６、パネルｆ〜ｉに描示する。肝臓オルガノイドを有さない群１では、０．１μＭプロプラノロールは、活性を維持し、０．５μＭエピネフリンによる、ベータアドレナリン作動性の影響を遮断することに成功した。遮断剤を代謝する肝臓構成要素が存在しなかったので、これは予測されたことだった。肝臓オルガノイドが存在する群２では、エピネフリンを投与した後で、ＢＰＭの、１．２５倍の増大が観察された。これを、プロプラノロールを、エピネフリンによる処置の前に投与しなかった、実験対照における、心臓ＢＰＭの、１．５倍の増大と比較した。これは、３Ｄ肝臓オルガノイドが、エピネフリンが、心臓オルガノイドの、著明な比率のベータアドレナリン作動性受容体を活性化させることから、対照の、エピネフリンだけによる応答の約５０％に相当する応答を誘導することを可能とするのに十分な量のプロプラノロールを代謝したことを示唆する。これは、複数のオルガノイドシステムが、単一のオルガノイドシステムと比較して有する利点を強調する。興味深いことに、群２における条件は、マイクロリアクター内で３Ｄオルガノイドを作り出すときに使用される細胞５０，０００個と対比した、組織培養用プラスチック上の細胞１〜２００万個から構成される、２Ｄ肝細胞培養物を使用して再現された。２Ｄ培養物が、エピネフリンにより誘導された拍動数の増大の回復を達成できなかったことから（図６、パネルｅ）、３Ｄシステムと比較した、２Ｄ培養物中の、十分な代謝活性の欠如が、さらに裏付けられる。
［考察］
新たな薬物候補物質の開発は、インビトロでは、ヒト組織を正確にモデル化することができないために、限定的かつ法外に高価なものとなる一方で、動物モデルが可能とするのは、限定された操作だけであり、必ずしもヒトにおける結果を予測しない。従来、インビトロにおける薬物試験および毒性試験は、２Ｄ培養物中の細胞株を使用して実施されてきた。数え切れないほど多くの医学的発見を生み出してきたにもかかわらず、２Ｄ培養物は、インビボ組織の３Ｄ微小環境を再現することができない４、６、７。組織オルガノイドなどの３Ｄシステムへと移行することにより、これらの短所の多くを克服することができる。オルガノイドは、多くの場合、薬物および毒素に対して、実際のヒト臓器と同じ形で応答する能力を有し、それ自体、薬物スクリーニングへの適用のための、改善されたプラットフォームを提供しうる。さらに、異なる組織型の複数のモデルを統合するプラットフォームの近年の進歩２０、２１は、体内の、異なる組織および臓器の間で生じうる、複雑な相互作用を考慮する、さらなる性能をもたらそうとしている。
ここで提示される研究において、本発明者らは、生存率が高く毒性をほとんど指し示さない一般的な培地下にある単一の再循環型灌流システム内で、肝臓、心臓、血管、肺、精巣および結腸の、最大で６つの顕著に異なる生体工学処理された組織モデルを支援するプラットフォーム（図２）について記載する。次いで、本発明者らは、プラットフォームの構成要素および構成要素の組合せの適用について記載して、このような生体機能チッププラットフォームが有しうる潜在的可能性を開示する。これらの例は、応答性で、モジュラーな、血管内皮モジュール（図３）、ＦＤＡによりリコールされた薬物を使用する、一連の薬物スクリーン（図４、５、および１９）、２つのオルガノイドによる、相互依存性の二重薬物応答（図６）、および個々の様々なオルガノイド／組織モデルの特徴付け（図７〜１７）であって、実質的な組織学的アッセイおよび機能的なアッセイのほか、アセトアミノフェン毒性およびＮ−アセチル−Ｌ−システインによる拮抗作用の実証（図１３）を含む特徴付けを含む。
重要なことは、６つの組織型構築物を、単一の灌流プラットフォーム内に統合したところ、本発明者らは、６つのモジュール全てにおいて、比較的高生存率を２週間にわたり維持することが可能であったことである。他の研究グループも、現在までのところ、多組織モデルシステムの生存率を、最大４週間という、より長期にわたり維持する能力を裏付けているが、これらの例は、最大で４つの組織型に限定されている２０、２１。さらに、これらのシステムにおける、オルガノイドまたは組織モデルの大部分は、２Ｄ培養物または３Ｄ細胞株の形態であった。本発明者らは、当初、十分なレベルの細胞生存率を維持するために、生体機能チッププラットフォームに添加される各組織型に応じて、それだけ、培地を複雑としなければならないと仮定していた。驚くべきことに、本発明者らは、これが当てはまらないと考えられることを見出した。本発明者らの６組織プラットフォームを実証するに当たり、本発明者らは、一般的な培地に、より感受性の大きな細胞集団になると本発明者らが考えたもの、とりわけ、平面状に構成される内皮細胞オルガノイドおよび精巣オルガノイドに向けてバイアスをかけた。注目すべきことに、本発明者らは、システム内の、他の４つの組織型の性能も良好であることを観察した。生存率アッセイは、少数の死細胞を示した。可溶性バイオマーカー解析は、当初、ＩＬ−８、プロスタサイクリン、および、一部のシステムにおける、それぞれ、肺、血管、および心臓構築物が受けたストレスを表す、ＣＫのスパイクを明らかにした。しかし、システム作動の時間経過にわたり、これらのバイオマーカーは、無細胞の培地対照に近いレベルに戻った。この興味深い結果は、おそらく、多数の組織型が存在する結果として、培地を、天然由来のユニバーサルな支持培地のようなものへと馴化することを示唆する。加えて、本発明者らは、細胞は、生理学的に関連性がある３Ｄアーキテクチャー内に置かれると、より頑健となり、したがって、培地処方の変化の影響を受けにくくなりうると考える。これらの理論は、３Ｄ組織モデルから構成されたマルチオルガノイドプラットフォームは、現在市販されている、より高価で、組織特異的な培地処方から離れ、より廉価かつ単純な、一般的培地に向かうことが可能でありうることを示唆するために、注目に値する。
重要なことは、本発明者らが、単純な細胞凝集物と考えられるものと、３Ｄオルガノイドとの差違について論じようと望むことである。本発明者らが、その後、チップ上の組織構築物にバイオプリンティングする肝臓オルガノイドおよび心臓オルガノイドは、記載されている通り、懸滴法により形成する。しかし、これらのオルガノイドは、単純な細胞凝集物と関連する機能性を、はるかに凌駕する。「細胞凝集物」という用語は、細胞の物理的クラスターを表す。凝集物は、多年にわたり利用されているが、従来、必ずしも、高組織機能性を有さないのに対し、本発明者らのオルガノイドは、これを有する。さらに、より支持的な微小環境をもたらすのに本発明者らが実施するカスタマイゼーションは、システムに、有益な生物学的影響を及ぼす、さらなる特徴ももたらす２８、３３。
インビトロにおけるオルガノイドモデルの大部分は、薬物および毒素をスクリーニングするのに開発されている９、１０。重要なことは、これらのシステムが、臨床試験へと進み、患者に投与される前に、開発中の薬物候補物質の毒性の影響を同定する潜在的な可能性を有することである。残念ながら、有害な副作用を有する多くの薬物が臨床試験に合格し、市場に達し、ＦＤＡによりリコールされる前に患者に使用される。生体機能チッププラットフォームなどの技術が、開発時に、より多く利用可能であり、重要なことだが、より広く受容されれば、研究者らがこれらの問題を早期に同定し、実際の人命と、訴訟の数十億ドルを失わずに済んだ可能性がある。この文脈で、本発明者らは、毒性の影響のためにＦＤＡによりリコールされた薬物についてのパネルをスクリーニングすることにより、本発明者らのプラットフォーム有用性を裏付けることを選択した。本発明者らは、トログリタゾンおよびミベフラジルによる肝毒性、ならびにアステミゾール、ペルゴジド、およびテロジリンによる、心毒性および拍動数の低下を捕捉することに成功した。肝臓および心臓に関する合併症が、全ての薬物の不合格およびリコールのうちの約９０％を占め、これらの転帰を捕捉する能力を裏付けることが可能であることは、それ自体、極めて重要である。２Ｄ対照培養物を使用する、本発明者らの並列研究は、本発明者らのプラットフォームの潜在的な価値を、さらに裏付ける。例えば、肝臓の場合、初代肝細胞および長年使用されているＨｅｐＧ２肝がん細胞株の２Ｄ培養物は、オルガノイドと比較して異なる結果をもたらした。場合によって、オルガノイドは、感受性が大きく、場合によって、オルガノイドは、薬物に対する耐性が大きかった。同様に、ある薬物に対する感受性の増大、および他の薬物に対する耐性の増大といったこれらの種類の異なる結果は、心臓オルガノイドによる薬物スクリーンでも観察された。これらの結果は、体内の薬物毒性対３Ｄオルガノイド対２Ｄ培養物の間の関係が、複雑であることを指し示す。単純に、３Ｄシステムが、２Ｄ培養物より感受性が大きいとは言えない。特定の感受性およびアッセイの適切性は、問題となる特定の薬物に、極めて大きく依存する。本発明者らは、これは、３Ｄ培養物と２Ｄ培養物との体積比の差違と対比した、実質的な表面積；３Ｄのオルガノイドおよび構築物の内部で生じうる緩衝；ならびに各個別の薬物が、細胞内でターゲティングする、特異的な生物学的機構という、いくつかの因子に起因すると考える。よって、本発明者らは、目下のところ、関与する、これらの因子および特異的機構自体について調査している。
薬物に対する、個々のオルガノイドの応答より重要なのは、実際のヒト生理学と同様に、１つのオルガノイドの応答が、他のオルガノイドの応答に関与する、マルチオルガノイドシステムの応答である。この概念について深めるために、個々の肝臓オルガノイドおよび心臓オルガノイドを、二重臓器システムへと組み立てた。健常な肝臓は、プロプラノロールを効率的に代謝し、プロプラノロールを、心臓のベータ受容体の遮断において失効化しうるので、プロプラノロールによる遮断およびエピネフリンベースのベータ受容体活性化の影響を、肝臓オルガノイドを用いて、および、用いずに評価した。肝臓オルガノイドを伴わないシステムでは、プロプラノロールは、その活性形態にとどまり、エピネフリンが心拍数の増大を誘導することを遮断することに成功した。しかし、３Ｄ肝臓オルガノイドをシステムに導入すると、それらがプロプラノロールを代謝し、エピネフリンの投与により拍動数が増大した。このことは、肝臓構築物による薬物の顕著な不活化を示す。これは、１つのシステム内の、複数のインビトロオルガノイドの統合された応答について、初めて記載された実例のうちの１つでありうる。注目すべきことは、３Ｄ肝臓オルガノイドを２Ｄにおける肝細胞培養物で代替したところ、２Ｄにおける細胞数の４０倍の増大にもかかわらず、プロプラノロールは、肝細胞が全く存在しなかった場合と同様に、エピネフリンの影響を遮断したことである。
ここで記載した研究は、天然ヒト臓器と同様の機能性を示す、オルガノイドおよび組織構築物の創出を裏付ける。また、肝臓、心臓、血管、肺、精巣、および結腸から構成される、６つの顕著に異なる生体工学処理された組織モデルの、単一の再循環型灌流システムへの統合も裏付けられる。重要なことは、プラットフォームの個々の構成要素が、ヒトにおける毒性のためにＦＤＡにより市場から回収された様々な薬物を含む薬物のパネルに、適切に応答することである。なおより重要なことは、オルガノイドの組合せを単一のプラットフォームへと組み合わせる場合、より複雑な、統合された応答であって、１つのオルガノイドの機能性が、薬物に対する、別のオルガノイドの応答に影響を与える応答を観察しうることである。微妙かつ複雑な応答性能を伴う３Ｄヒトベースの組織モデルに基づく本システム、およびこれと同様の他のシステムは、将来、インビトロにおける薬物スクリーニングおよび毒性スクリーニングならびに疾患のモデル化を、どのように実施するのかに影響を与える、大きな潜在的可能性を有する。
＜参考文献＞
［実施例２］
環境重金属研究が提起され、提起された環境重金属研究のための組織オルガノイド型が、魚類および哺乳動物の組織における、公知の生体内蓄積、生体内分布、および毒性に基づき選択されている。これは、単独およびＭＰＳから回収されたデータについて評価するための、何らかのベースラインを提示する。
＜組織オルガノイドの作製＞
オルガノイドは、全体的に、初代ヒト細胞またはヒトｉＰＳ由来細胞から構成され、高度に機能的かつ応答性の組織モデルを作出するように、生理学的に正確な比で組み合わされる。オルガノイドは、組織型特異的な、天然のマトリックスと、調節可能な力学的特性との組合せを含有し、生存率および機能の両方を支援する。各オルガノイド型の細胞組成を、以下に記載する。
肝臓：肝臓オルガノイドは、非接着性丸底ウェル内に凝集させた、初代ヒト肝細胞（Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ）、星細胞（ＳｃｉｅｎｃｅＣｅｌｌ）、およびクッパー細胞（Ｇｉｂｃｏ）により形成する。
心臓：心臓オルガノイドは、上記の通りに凝集させた、ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞および初代線維芽細胞（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して形成する。これらのオルガノイドは、心房、心室、および房室結節の心筋細胞亜型に分化する。
脳：ヒトｉＰＳ細胞を、胚様体形成を介する段階的な神経分化プロトコールにより分化させる。胚様体は、神経前駆細胞（ｈＮＰＣ）培地中の懸濁液中で保つ。２週間後、胚様体を、単一細胞の接着培養物としてプレートに配置する。神経への分化のために、早期継代神経前駆体の単一細胞懸濁液を、一定の旋回振とう下で培養する。４日後、培地を交換し、凝集物を、分化培地中で、最長４週間にわたり保って、ＮＰＣの、グルタミン酸作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロンのほか、星状細胞および希突起膠細胞への同時的な分化を誘導する。
血管：血管モジュールは、半多孔性シリコン膜の片側において、内皮細胞を培養することにより形成する。平面状構築物を、並列循環システムを伴うマイクロリアクターデバイスにはめ込む。
肺：気道内に存在する構造および細胞構成によりモデル化された、３Ｄ気道オルガノイドもまた、半多孔性膜上に、三層で作製する。オルガノイドは、下層：肺微小血管内皮細胞（Ｌｏｎｚａ）、中層：気道間質間葉性細胞（ドナーに由来する）、および上層：間質層上で、直接培養された気管支上皮細胞（Ｌｏｎｚａ）を含有する。
精巣：精巣オルガノイドは、上記の通りに凝集させた、精原細胞、ライディッヒ細胞、セルトリ細胞、および尿細管周囲筋様細胞の初代細胞培養物を使用して形成する。
卵巣：卵巣卵胞オルガノイドを、ヒト組織から単離され、培養物中で拡大された、ヒト顆粒膜細胞および卵胞膜細胞により作製する。次いで、これらの細胞を凝集させ（顆粒膜細胞を卵胞膜細胞で取り囲んだ、層状化構築物）て、操作卵胞を形成する。これらの構造は、予測されるホルモンを産生し、ホルモンの分泌レベルは、培地からのフィードバックにより自己調節される。これらの構造は、特異的な培養条件下で、卵巣組織から単離された卵母細胞を成熟させることが可能である。
＜デバイスの作製＞
これらの研究では、折りたたみによる自己アライメントが可能であり、層状化されて、マイクロ流体構造を形成しうる、薄型シリコーンテープを使用する（図２０Ａ）。この手法は、無菌室プロセスまたは層ごとの正確なアライメントの必要性をなくし、パターン形成技術であって、コンピュータ制御型レザープロッターの使用を含む、大量生産に適する、様々な、広く利用可能で、廉価なパターン形成技術を通して達成することができる。これらの構造では、デバイスの方位分解能（lateral device resolution）は、意図される目的に十分であるが、深さは、使用される接着性フィルム層の厚さにより規定される。これらの寸法は、マイクロリットル未満の流体の操作を支援するために十分であるほか、記載された組織オルガノイド内に含有される細胞などの細胞の集団を含有する、細胞培養構築物の支持にも十分である。このデザイン戦略は、バルブ、ミキサー、およびマイクロ流体回路を駆動するのに使用される、他の機能システムと適合性である。加えて、多くの組織チッププラットフォームと関連する、１つの一般的な欠陥は、非生理学的な、流体−組織体積比である。本発明者らの作製システムは、平均容量を７μＬとする、マイクロリアクターチャンバーの創出を可能とする。６つのチャンバーと、関連する接続チャネルとが存在する、この６組織プラットフォームの場合、各デバイスは、１００μＬ未満の細胞培養培地を使用する。
＜オルガノイドのデバイスの組込み＞
３Ｄ組織オルガノイドを、マイクロ流体システム内に組み込む難題に取り組むため、本発明者らは、ヒアルロン酸（ＨＡ）と、ゼラチンベースのハイドロゲルであるＨｙＳｔｅｍ（ＥＳＩ−ＢＩＯ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）とを活用する、インサイチュー作製法を開発した。この材料は、組織エンジニアリングにおいて広範にわたり利用されており、コラーゲン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、およびアルギン酸など、従来の材料と異なり、多種多様なバイオファブリケーション法により、容易に組み込まれる。さらに、ＨＡおよびゼラチンは、天然ＥＣＭの天然成分であるので、架橋されたＨＡ多糖鎖、および加水分解された細胞接着性コラーゲンゲルの形態で、真の生体模倣基材をもたらす。
細胞培養構築物の作製のための一般的な手法では、ＨＡ成分およびゼラチン成分を、組織オルガノイド、ならびに架橋剤および光開始剤と混合して、チオール−アクリレート光重合化を支援する。各オルガノイド型を、最終的な統合型構築物中のオルガノイド体積比が、人体内の臓器の体積比と合致する（例えば、肝臓オルガノイドの重量が、心臓オルガノイドの重量の５倍となる）ような密度で、非ゲル化基材に添加する。各オルガノイドを付着させた基材を、マイクロ流体チャンバーに、逐次的に導入し、各構築物の形および位置を規定するのに、ポジティブトーンのフォトマスクを使用して、パターン形成を達する（図２０Ｂ）。架橋されたハイドロゲルは、チャンバーの頂面および底面に対して接着性であり、ハイドロゲルを、流体の流動条件下で保持することを可能とする。この光パターン形成は、任意の数の、独立のマイクロ流体チャンバー内で実施することができる。結果として得られる３Ｄ構築物は、その後、循環流動下で、長期にわたり生存させながら保つことができ、システムの全体は、チップ上の生化学アッセイおよび直接的イメージングの両方を含む、解析的な調査に適する。
さらなるパターン形成（例えば、さらなる細胞またはオルガノイド型を伴う）もまた、システムの著明な複雑性を可能とする、多元構造を作製するのに使用することができる。注目すべきことは、ＨｙＳｔｅｍプラットフォームがまた、上記の通りの各組織オルガノイドに特異的な、さらなる生体分子因子を供給する、可溶性細胞外マトリックスの組込みも支援することである。このようなインビトロ構築物は、インビボにおいて観察される、広範な生理活性および生理反応を再現し、システムの生体模倣的な性質を強調することが示されている。総じて、この作製手法は、迅速、廉価かつモジュール式であり、多数の並列実験のために、大量生産が容易な潜在的可能性を伴う。図２０Ｃは、ＭＰＳプラットフォームの雄性バージョンおよび雌性バージョン（このシステムは、消化管ではなく、血管を含むが）のいずれのためにも提起される、６つの構築物を含有する、顕微鏡スライドの全取付け面積を伴う、完全なデバイスを示す。図２０Ｄは、培養の１週間目に、この方法を介して調製された、各オルガノイドの生存を示す。
＜単一オルガノイドシステムについての評価＞
実験は、５つの一般的な組織オルガノイド型の各々のほか、卵巣オルガノイドおよび精巣オルガノイドの両方を含有する独立のシステムに対して実施する。６つのオルガノイド構築物を、システムの安定化のための時間を許容するように、５日間にわたり維持する。各重金属を、以下に記載される化学的形態および濃度で、５日目に、システム培地に導入する。
カドミウム：ＣｄＣｌ２；０．１、１、１０、１００μＭの濃度
クロム（ＶＩ）：ＣｒＯ３；０．１、１、１０μＭの濃度
クロム（ＩＩＩ）：Ｃｒ；１、１０、１００、および１００μＭの濃度
鉛：ＰｂＣｌ２；５、５０、および５００μＭ、ならびに５ｍＭの濃度
水銀：ＨｇＣｌ２；０．２、２、２０μＭの濃度
ヒ素（ＩＩＩ）：Ａｓ２Ｏ３；０．０５、０．５、５、５０μＭの濃度
プロジェクトの経過中、これらの用量は、必要に応じて、シフトまたは拡大することができる。
＜基本的な評価＞
２５パーセントの部分的な培地交換を５日ごとに実施し、添加される培地には、重金属を適切な濃度で含めておく。重金属への曝露後の多様な時点において、オルガノイドを採取する。培地アリコートを、オフラインの代謝アッセイおよびバイオマーカーアッセイのために、保存し、凍結させる。オルガノイドを、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色およびＡＴＰ活性により、生存率について評価する。タリウム、鉛、水銀、およびグリホサート（Ｒｏｕｎｄｕｐ中の活性薬剤）を使用して、肝臓、心臓、および精巣についての予備的データを、図２１および２２に示すが、これらは、これらのオルガノイドが、急性の重金属（および他の環境の毒素）曝露に、実際に応答することを裏付ける。一般に、従来の可溶性バイオマーカー（表２）については、抗体またはアプタマーによる内蔵型電気化学バイオセンシングを介して評価する。対照としての、各時点で回収された培地に対して、ＥＬＩＳＡまたは比色アッセイを実施して、電気化学的モニターの精度を確認する。
＜各オルガノイド型における、環境金属の生物濃縮＞
表示の時点において、組織オルガノイドを、マイクロリアクターから採取する。オルガノイドを洗浄し、緩衝液中でホモジナイズする。オルガノイド溶解物中の重金属含量を、誘導結合プラズマ分光法（Ｉｎｔｅｒｔｅｋ Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ、ＰＡ）により測定する。この技法は、複数の金属について、定量的であり、同時に、各組織型について、オルガノイドの体積比により正規化することができる。重金属は、酵素中および他のタンパク質中で、これらの生理学的に必要な金属を置換し、おそらく、毒性に寄与するので、プラズマ分光法を使用することの、さらなる利点は、鉄、銅、および亜鉛を測定する能力である。
＜組織学的評価＞
個々の細胞型の免疫組織化学的な同定と共に、蛍光細胞死アッセイを実施する。これらのデータを使用して、各細胞型について、細胞生存率の分布をもたらす。加えて、各オルガノイド型についての組織病理学的評価を使用して、金属に曝露されたオルガノイド内の、細胞変化および微小解剖学的変化を同定する。
＜遺伝子の誘導＞
オルガノイドを、標準法によるＲＮＡ抽出のために加工する。トランスクリプトーム解析は、ストレス応答アレイを使用して実施する。酸化ストレスおよび他のストレスを含む毒性学的有害転帰に関与する、３７０の鍵となる遺伝子のｍＲＮＡレベルは、Ｑｉａｇｅｎ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ＰａｔｈｗａｙＦｉｎｄｅｒ ＲＴ２ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（商標）を伴うｑＰＣＲにより測定する。結果は、アレイ上で、推奨される対照遺伝子を使用するときの倍数変化として計算する。データは、遺伝子オントロジーデータベースおよびパスウェイエンリッチメントにおける、ＡｍｉＧＯ ２およびＰＡＮＴＨＥＲのｏｖｅｒｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ検定により解析する。結果は、ＧＯＲＩＬＬＡにより、検証および補正する。
加えて、重金属曝露に応答して上方調節されうる、他のストレス応答遺伝子セットを同定するのに、鍵となる実験のために、全トランスクリプトームシーケンシングを行う。オルガノイドを、標準法によるＲＮＡ抽出のために加工する。トランスクリプトームは、Ａｇｉｌｅｎｔ ＲＮＡマイクロアレイ解析（ＷＦＵＨＳ Ｇｅｎｏｍｉｃｓコア施設により実施される）を使用して測定する。次いで、ＫＥＧＧ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇｅｎｅｓｐｒｉｎｇ、およびＷＧＣＮＡなど、標準的なソフトウェアパッケージを使用して、重み付けされた遺伝子相関ネットワーク解析により、全ゲノム転写データを、生体機能パスウェイ、毒性学パスウェイ、およびカノニカルパスウェイを含む分子ネットワーク相互作用について、統合および解析する。
＜フリーラジカルの産生＞
提起された研究において使用される重金属の全ては、組織オルガノイド内およびこの周囲の酸化還元化学反応を根本的に変更する電位を有する。マイクロ流体回路内の培地の酸化還元電位は、本発明者らのチームにより開発された、インラインの酸化還元センサーによりモニタリングする。培地中のスーパーオキシドアニオンは、チトクロームｃで固定化したナノ多孔質金に基づく、高感度の電気化学的センサーにより検出する。培地中のフリーラジカルによる、この基材の酸化は、測定される電流レベルの変化を結果としてもたらし、これを使用して、培地中のフリーラジカルの量を計算することができる。
＜脂質分配＞
採取されたオルガノイドの一部は、超音波処理により溶解する。超遠心分離を使用して、オルガノイドミクロソームを単離する。ミクロソーム画分内の重金属濃度を、誘導結合プラズマ分光法により同定および定量化された、水性の細胞構成要素中の重金属含量と比較し、これを使用して、各組織オルガノイド型内の脂質分配を決定する。
＜統計学的解析＞
実験は、例数ｎ＝３またはこれを超える試料により、初期の実験で同定された分散に基づき実施する。データは、平均値±標準偏差として提示する。２つの主要な統計学的手法：１）尺度が、経時的に、変化しているのかどうかを検出する一元ＡＮＯＶＡモデル；および２）転帰を、２つの群または特定の時点の間で比較する、対応のあるｔ検定を、必要に応じて使用する。本発明者らのチームは、Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｅｓｉｇｎ Ｃｏｒｅを含む、いくつかの統計学的コア施設、およびＷａｋｅ Ｆｏｒｅｓｔ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅにおける、生物統計解析コンサルタントにアクセスを有する。
＜データの解釈＞
各重金属についての、重金属の蓄積、ストレス遺伝子の誘導、および毒性を、これらの実験のリードアウトの各々について、公表されたデータと比較する。
＜統合型ＭＰＳプラットフォームについての評価＞
６オルガノイド間統合型ＭＰＳを、マイクロ流体チップ内に組み立てる。現在報告されているマイクロ流体チップは、消化管（内臓）循環系が、末梢循環から、部分的に独立していることを考慮に入れていない。バイオリアクターチップ上の、マイクロ流体回路のパターン形成は、肝臓バイオリアクターを通して、培地を再循環させるので、この循環のうちの小部分は、大循環へとフィードされる。マイクロ流体回路は、第１のマイクロ流体回路のうちの９０％を、肝臓構築物を通して還流させるように作製される。これは、導入された化合物が、大循環に流入する前に、肝臓モジュールを何度か流過することを確保する。これらの微小回路から回収されるデータを、標準的な、流体分布が一様な微小回路と比較して、オルガノイド循環間の動態が、重金属毒性のモデル化に影響を及ぼすのかどうかを決定する。システムは、卵巣オルガノイドまたは精巣オルガノイドを加えた、５つの一般的なオルガノイド型を、直列に含有する。オルガノイドにおける、金属の急性毒性、重金属の生体内蓄積、生体内分布、および組織学的／分子的応答の特徴付けは、既に記載されている通りに実施する。
＜金属キレート化療法についての評価＞
この実験の目標は、キレーターの使用と関連する毒性を同定し、この可能な毒性が、多様な濃度の重金属に曝露されたＭＰＳに対する、キレート化の有益な効果に凌駕されるのかどうかを決定することである。注目すべきことは、キレーターは、鉛、水銀、およびヒ素による中毒の場合における、有益な効果について調査されているが、３Ｄオルガノイドモデルを使用する、これらの重金属についての研究は、実施されていないことである。さらに、現在、クロム毒性またはカドミウム毒性に特異的な、公知の解毒剤は存在しない。
＜キレート剤、濃度、および関連する標的＞
キレーター単独の効果は、キレート化療法の否定的な結果についての対照として用いられる。加えて、これらの薬剤は、クロム中毒およびカドミウム中毒の処置において有効であることが示されていないが、将来のコンビナトリアル療法について試験するためのベースラインをもたらすために、本発明者らは、クロムおよびカドミウムへの曝露後に、これらの薬剤をスクリーニングする。試験されるキレート剤を、表３に提示する。
＜副作用の評価＞
肝臓酵素、肝臓代謝、神経毒性、炎症、心臓不整脈、神経化学的シグナル伝達の変更、および肺の障壁機能は、化合物スクリーン時、および、この後にモニタリングされる、キレート剤の潜在的な効果である。
＜重金属の毒性＞
オルガノイドにおける、金属の毒性、重金属の生体内蓄積、生体内分布、および組織学的／分子的応答の特徴付けは、既に記載されている通りに実施する。
＜データの解釈＞
結果を、キレーター単独、重金属と同時に投与されるキレーター、および金属への曝露後に投与されるキレーターにより処置されるシステム間で比較する。これらの比較を使用して、それぞれ、否定的な副作用、循環金属の予防的封鎖、および組織オルガノイドからの金属の除去を識別する。
＜補助剤の評価＞
６オルガノイドＭＰＳを使用して、重金属曝露のための、補助剤療法の効果を決定する。一般に、これらの補助剤は、組織中および血清中の、フリーラジカルスカベンジング能力を増大させる。加えて、組織から重金属を除去すると主張する、いくつか市販の処置についても評価する。これらの化合物はインターネットまたはドラッグストアにより入手可能であるが、重金属の処置について、ＦＤＡには承認されていない。これらのうちのいくつかは、低用量の公知のキレーターを含むが、一部は、含まない。試験される薬剤を、表４に提示する。
＜キレート剤の補助剤＞
スルフヒドリル含有化合物は、金属キレート化の一助となることが以前から公知である。これらの化合物は、それ自体、個別に、および既往の目的で記載されたキレート剤と組み合わされて、スクリーニングされる。濃度は、ヒト用量と同等である。
＜店頭販売（over the counter）のキレート化療法（ＯＴＣ）＞
ＯＴＣ重金属キレーターは、一般的な成分の群分けと、主張される作用機構とに基づき選択する。製造元により推奨される用量に基づき、いくつかの濃度を選択する。例は、ＫｅｌａｍｉｎＨＭ（商標）（ＥＤＴＡベース）、Ｐｕｒｅ Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎｓ Ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ（登録商標）−ＨＭ Ｃｏｍｐｌｅｘ（ペクチンベース）、Ｍｅｒｃｕｒｙ Ｄｅｔｏｘ ６０（商標）（アミノ酸および他の天然高分子）を含む。
＜データの解釈＞
結果を、補助剤単独またはＯＴＣキレーター単独で処置されるシステム間で比較する。これらのデータは、薬剤の潜在的な毒性作用を指し示すであろう。重金属の投与と同時に投与されるＯＴＣキレーター、または重金属の投与後に投与されるＯＴＣキレート剤を使用して、それぞれ、循環金属の予防的封鎖、および組織オルガノイドからの金属の除去を決定する。キレート化／補助剤の組合せで処置されたシステムを、キレート化療法単独と比較して、これらの補助剤が、毒性を低減するのか、金属のキレート化に影響を及ぼすのかを決定する。まとめると、これらの実験は、統合型ヒトＭＰＳにおける重金属中毒を処置するための、抗酸化補助剤およびＯＴＣキレート化療法の安全性および有効性について試験する。
［実施例３］
これらの実験の意図は、重金属毒性が、５オルガノイドＭＰＳ内のオルガノイドの各々に、どのようにして影響を及ぼすのかについて、従来の細胞培養物および動物の参照基準と比較して評価することである。５オルガノイドＭＰＳは、肝臓、心臓、肺／血管、脳、および精巣の、５つのオルガノイド型を、直列に含有する。この比較は、重金属毒性をモデル化するために、ＭＰＳの忠実度について記載する。全ての実験は、５つの組織オルガノイド型の各々を含有する統合型システムに対して実施する。
＜ＭＰＳ戦略＞
５オルガノイド間統合型ＭＰＳを、上記の実施例２で記載したマイクロ流体チップ内に組み立てる。バイオリアクターチップ上におけるマイクロ流体回路のパターン形成は、肝臓バイオリアクターを通して培地を再循環させ、この循環のうちの小部分は、大循環へとフィードされる。マイクロ流体回路は、第１のマイクロ流体回路のうちの９０％を、肝臓構築物を通して還流させる。これは、導入された化合物が、大循環に流入する前に肝臓モジュールを何度か流過することを確保する。これらの微小回路から回収されるデータを、標準的な、流体分布が一様な微小回路と比較することにより、オルガノイド循環間の動態が、重金属毒性のモデル化に影響を及ぼすのかどうかを決定する。システムは、肝臓、心臓、肺／血管、脳、および精巣の、５つのオルガノイド型を、直列に含有する。
＜重金属の投与＞
５オルガノイドＭＰＳデバイスを、システムの安定化のための時間を許容するように、５日間にわたり維持する。各重金属を、以下に記載される化学的形態および濃度で、５日目に、導入する。化合物は当初、文献および予備的急性毒性研究に記載されている値に基づく以下の濃度で、ＭＰＳプラットフォームに投与する。プロジェクトの経過中、これらの用量は、必要に応じて、シフトまたは拡大することができる。
カドミウム：ＣｄＣｌ２；０．１、１、１０、１００μＭの濃度
クロム（ＶＩ）：ＣｒＯ３；０．１、１、１０μＭの濃度
クロム（ＩＩＩ）：Ｃｒ；１、１０、１００、および１００μＭの濃度
鉛：ＰｂＣｌ２；５、５０、および５００μＭ、ならびに５ｍＭの濃度
水銀：ＨｇＣｌ２；０．２、２、２０μＭの濃度
ヒ素（ＩＩＩ）：Ａｓ２Ｏ３；０．０５、０．５、５、５０μＭの濃度
＜基本的な評価＞
４分の１の部分的な培地の交換を、５日ごとに実施し、添加される培地中には、重金属を、適切な濃度で含める。重金属への曝露後の多様な時点において、オルガノイドを採取する。培地アリコートを、オフラインのバイオマーカーアッセイのために、保存し、凍結させる（表２）。オルガノイドを、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色およびＡＴＰ活性により、生存率について評価する。タリウム、鉛、水銀、およびグリホサート（Ｒｏｕｎｄｕｐ中の活性薬剤）を使用して、肝臓、心臓、および精巣についての予備的データを、図２３に示すが、これらは、これらのオルガノイドが、急性の重金属（および他の環境の毒素）曝露に、実際に応答することを裏付ける。
＜各オルガノイド型における、環境金属の生物濃縮＞
研究の終了時に、オルガノイドを、ＭＰＳから採取し、このとき、オルガノイド溶解物中の重金属含量を、誘導結合プラズマ分光法（Ｉｎｔｅｒｔｅｋ Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ、ＰＡ）により測定する。この技法は、複数の金属について定量的であり、同時に、各組織型について、オルガノイドの体積比により正規化することができる。重金属は、酵素中および他のタンパク質中で、これらの生理学的に必要な金属を置換し、おそらく、毒性に寄与するので、プラズマ分光法を使用することの、さらなる利点は、鉄、銅、および亜鉛を測定する能力である。
＜組織学的評価＞
個々の細胞型の免疫組織化学的同定と共に、蛍光細胞死アッセイ（アネキシンＶ［アポトーシス］対Ｋｉ６７［増殖］）を実施する。これらのデータを使用して、各細胞型について、細胞生存率の分布をもたらす。加えて、各オルガノイド型についての組織病理学的評価を使用して、金属に曝露されたオルガノイド内の、細胞変化および微小解剖学的変化を同定する。
＜成果、起こりうる難題、および提起される解決策（ＳＡ１）＞
本発明者らのチームが、６オルガノイドプラットフォームの維持に成功した、上記の、本発明者らの研究に基づき、この３Ｄオルガノイドプラットフォームが、経時的に、一般的な培地を馴化することから、含めたオルガノイド内の、特異的細胞型の全てに適した環境を創出することが期待される。使用されるシステム容量が極めて少ない（＜５０ｕｌ）場合、流体対組織体積比は、高度に生理学的である。公表されている、重金属の生体内分布は、臓器が、生物内のこれらの金属に曝露される順序に基づく可能性がある。これは、なぜ、消化管および肝臓の問題に、筋肉の問題よりも高頻度で遭遇するのかを説明しうる。ＭＰＳ内の流体対組織体積比が大きいために、この考えについて試験することは困難でありうる。オルガノイドの順序を切り替えて、この順序が生体内分布に影響を及ぼすのかどうかを決定することはできる。加えて、単一のオルガノイドシステムに由来するデータを作成して、臓器の順序が、重金属の生体内蓄積に影響を及ぼすのかどうかを決定することができる。
単一のオルガノイドＭＰＳを使用して、キレーター単独の影響のほか、環境内の重金属毒素と組み合わされたキレーターの影響もモデル化できる。本研究の主な目標は、キレーターの使用と関連する毒性を同定することであり、かつ、この想定される毒性が、多様な濃度の重金属に曝露されたＭＰＳに対する、キレート化の有益な効果を凌駕するのかどうかを決定することである。注目すべきことは、キレーターは、鉛、水銀、およびヒ素による中毒の場合における有益な効果については調査されているものの、これらの重金属とともに３Ｄオルガノイドモデルを使用した研究はこれまでに実施されていないことである。さらに、現時点では、クロム毒性またはカドミウム毒性に特異的な公知の解毒剤は存在しない。よって、本研究は、これらの毒素への曝露のための潜在的な治療を調査する、統合型ＭＰＳプラットフォームを展開するための、著明な機会を創出する。５オルガノイドＭＰＳを使用して、重金属曝露のための、補助剤療法の効果を決定する。一般に、これらの補助剤は、組織中および血清中の、フリーラジカルスカベンジング能力を増大させる。
＜キレート剤＞
キレーター単独（表３）の効果は、キレート化療法の否定的な結果についての対照として用いられる。加えて、これらの薬剤は、クロム中毒およびカドミウム中毒の処置において有効であることが示されていないが、将来のコンビナトリアル療法について試験するためのベースラインをもたらすために、本発明者らは、クロムおよびカドミウムへの曝露後に、これらの薬剤をスクリーニングする。
＜キレート剤の補助剤＞
スルフヒドリル含有および抗酸化化合物は、以前から、金属キレート化の一助となることが公知である３１。これらの化合物（表４）は、それ自体、個別に、および上記のキレート剤と組み合わせて、スクリーニングされる。
＜副作用の評価＞
肝臓酵素、肝臓代謝、神経毒性、炎症、心臓不整脈、神経化学的シグナル伝達の変更、および肺の障壁機能は、化合物スクリーン時、および、この後にモニタリングされる、キレート剤の潜在的な効果である。
＜重金属の毒性＞
オルガノイドにおける、金属の毒性、重金属の生体内蓄積、生体内分布、および組織学的／分子的応答の特徴付けは、既に記載されている通りに実施する。
＜成果、起こりうる難題、および提起される解決策（ＳＡ２）＞
抗酸化剤として作用する補助剤は、ＭＰＳ内の、高度に生理学的な流体対組織比に起因して、ＭＰＳ内では、ヒトと比較して異なる形で挙動する。組織オルガノイドを取り囲む、大きな体積の抗酸化剤を含有する培地は、実のところ、フリーラジカルをスカベンジングするのにより有効である。ヒトにおける流体：組織、および、ＭＰＳ内の流体：組織（約１／１００）の関係に基づき、スケールダウンした用量である用量範囲を使用する。本研究は、抗酸化性補助剤およびＯＴＣキレーターに焦点を当てる。しかし、他のいくつかの薬剤も、重金属曝露のための、可能な処置として示唆されている。重金属クリアランスの一助となりうるか、またはキレート化療法と関連する副作用を緩和しうる、さらなる薬剤については、リソースが許す範囲で試験することができる。例えば、一部のキレーターは、肝臓損傷、神経機能、炎症、心臓不整脈、および組織障壁機能の喪失などの副作用と関連している。これらの副作用のために、潜在的に可能な処置は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｄｒｕｇ Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎ Ｐｏｒｔａｌデータベースを使用して同定されるであろう。
＜データの解釈および統計学的解析＞
金属に曝露された統合型ＭＰＳから回収されたデータは、従来の二次元培養物、実験の動物、およびヒトにおける、急性毒性および生体内蓄積についての公表値と比較する。初期研究は、６オルガノイドＭＰＳが、高生存率および安定的な組織機能を維持することを検証する。後続の毒性スクリーンは、１）個々のオルガノイド金属の生体内蓄積および毒性が、統合型システム内で測定された応答と相関するのかどうか、ならびに２）統合型システムにおける重金属への曝露から生じる、予測外の組織オルガノイド応答について評価する。
［実施例４］
＜５オルガノイド統合型薬物スクリーニング＞
実験の目的は、マルチオルガノイド毒性の、肝臓オルガノイドの代謝機能への依存について評価することである。例として、肝臓の代謝活性は、一部の薬物の転帰および有効性に、大きな影響を与えうる。例えば、一般的な、第一選択の抗がん薬である５ＦＵは、腫瘍だけでなく、体内の多くの細胞に対して細胞傷害性である。それゆえ、５ＦＵは、通常はプロドラッグであるカペシタビンの形態で与えられ、それが肝臓を通過してその活性形態へと代謝されるまで本質的に不活性である。
＜実験のデザインおよび結果＞
肝臓、心臓、肺、精巣、および脳のオルガノイドを含有する、５組織プラットフォームを始動し、薬物研究を開始する前に、７日間にわたり維持した。この時点で、肝臓モジュールを、プラットフォームの半分から取り外した。カペシタビン（２０ｕＭ）を、全てのプラットフォームに投与し、その後、７日間にわたる曝露の後（研究全体の１４日目）に、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色または心拍挙動を介して、生存率について評価した。
結果は、肝臓が存在すると、カペシタビンは、毒性薬物である５−ＦＵへと代謝され、心毒性および肺毒性を引き起こすことを裏付けた（図２４）。肝臓を伴わなければ、この代謝は生じず、心臓オルガノイドおよび肺オルガノイドの生存率は低下しない。驚くべきことに、いずれの群においても、脳オルガノイドは損傷を受けた（図２４）。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤの結果は、カペシタビンを、心臓オルガノイドおよび肺オルガノイドにおける細胞死の増大を誘導する５−ＦＵ活性薬物形態へと代謝するために、肝臓オルガノイドが必要とされること示す。
１、３、５、７、９、１１、１３、および１５日目に、尿素、アルブミン、α−ＧＳＴ、ＩＬ−８、およびＩＬ−１βを含む可溶性バイオマーカーを、培地アリコートから定量化した（図２６）。培地アリコートを、質量分析による解析に出して、カペシタビンの、５−ＦＵへの代謝について検証した。
［実施例５］
＜小型マイクロ流体プラットフォームにおける、５オルガノイド統合型薬物スクリーニング＞
取付け面積および流体容量が小さなマイクロ流体プラットフォームを調製し、同じ複雑な薬物研究が、このプラットフォーム上で可能であるのかどうかについて評価した。流体容量の最小化は、システム循環内の、該当するバイオマーカーの、シグナル対ノイズ比の増大を結果としてもたらしうる。
＜実験のデザインおよび結果＞
接着性フィルムベースのマイクロ流体プラットフォームは、以下で記載される通りに作製した。実施例４で記載した、フルスケールプラットフォームと同様に、肝臓、心臓、肺、精巣、および脳のオルガノイドを含有する５組織構築物を始動し、薬物研究を開始する前に、７日間にわたり維持した。この時点で、肝臓モジュールを、プラットフォームの半分から取り外した。カペシタビン（２０ｕＭ）を、全てのプラットフォームに投与し、その後、７日間の曝露の後（研究全体の１４日目）に、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色または心拍挙動を介して、生存率ついて評価した。
小型システムでは、肝臓が存在すると、カペシタビンは、毒性の薬物である５−ＦＵへと代謝され、心毒性および肺毒性を引き起こす（図２５）。肝臓を伴わなければ、この代謝は生じず、心臓オルガノイドおよび肺オルガノイドの生存率は低下しない。重要なことは、このプラットフォームでは、脳オルガノイドの生存率が高いことである（図５）。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤの結果は、カペシタビンを、心臓オルガノイドおよび肺オルガノイドにおける細胞死の増大を誘導する５−ＦＵ活性薬物形態へと代謝するために、肝臓オルガノイドが必要とされること示す。さらに、特定の理論に束縛されることを望まないが、脳オルガノイドが生存可能であることから、おそらく、システム内の容量のスケールダウンが、脳オルガノイドの生存を支援する良好に馴化された培地を結果としてもたらすことが示唆される。これは、このシステム内で、脳オルガノイドを、他のオルガノイド型と併せて維持しうることを裏付ける。
７および１５日目に、尿素、アルブミン、α−ＧＳＴ、ＩＬ−８、およびＩＬ−１βを含む可溶性バイオマーカーを、培地アリコートから定量化した（図２６）。培地アリコートを、質量分析による解析に出して、カペシタビンの、５−ＦＵへの代謝について検証した。
＜小型システムのデザイン＞
本システムは、培地に曝露されたＰＤＭＳの表面積を、標準サイズのシステムなどの他のシステムと比較して低減するか、またはなくすことにより、薬物化合物、毒素、可溶性タンパク質、および分泌された化合物の、デバイス壁上またはデバイス壁内への、吸着または吸収の可能性を低減する。デバイスの製造戦略は、テープマイクロフルイディクス、レーザー加工式ＰＭＭＡ、および一部のＰＤＭＳ成形に基づき、これにより、デバイスの培地と接触するＰＤＭＳの表面積量を、著明に最小化する。図２７は、この作製法についての概観を提示する。
［実施例６］
＜環境毒素のスクリーニング＞
肝臓および心臓オルガノイドを、それぞれ、肝細胞培養培地（Ｌｏｎｚａ）中または心臓維持培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ）中に溶解させた、硝酸タリウム（１μＭ、１０μＭ、１００μＭ）、塩化鉛（１００μＭ、１ｍＭ、および１０ｍＭ）、ＲｏｕｎｄＵｐ中の活性薬剤であるグリホサート（５００μＭ、５ｍＭ、５０ｍＭ）、または塩化水銀（２μＭ、２０ｍＭ、２００ｍＭ）との、４８時間のインキュベーションにかけた。化合物の曝露後、オルガノイドを、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色による生存率またはＡＴＰ活性について評価した。オルガノイドは、３つの化合物全てに応答して、用量依存的な生存率およびＡＴＰ活性の低下を表した。加えて、心臓オルガノイドを、拍動数動態への影響について評価した。
図２８は、肝臓オルガノイドによる環境毒素スクリーンからの結果を示し、パネルＡ〜Ｄは、正規化されたＡＴＰ活性およびＩＣ５０値の推定を示し、パネルＥは、グリホサート、鉛、タリウム、および水銀で処理された肝臓オルガノイドについての、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色およびマクロ共焦点イメージングを示す。＊：各毒素スクリーンについて、薬物を伴わない状態と比較したｐ＜０．０５である。図２９は、心臓オルガノイドによる環境毒素スクリーンからの結果を示し、パネルＡ〜Ｄは、正規化されたＡＴＰ活性およびＩＣ５０値の推定を示し、パネルＥは、グリホサート、鉛、タリウム、および水銀で処理された肝臓オルガノイドについての、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色およびマクロ共焦点イメージングを示す。＊：各毒素スクリーンについて、薬物を伴わない状態と比較したｐ＜０．０５である。図３０は、環境毒素への曝露の影響としての、心臓オルガノイド拍動数の変化を示す。
前述は、本発明を例示するものであり、これを限定するものとしては見なされないものとする。本発明は、以下の特許請求の範囲により規定され、特許請求の範囲の均等物も、この中に含まれるものとする。本明細書で引用される、全ての刊行物、特許出願、特許、特許公開、およびほかの参考文献は、参考文献が提示される文および／または段落と関連性がある教示について、それらの全体が参照により組み込まれる。

Claims (44)

  1. 互いに流体連絡した、少なくとも第１、第２、および第３のチャンバー；
    前記第１のチャンバー内の肝臓組織；
    前記第２のチャンバー内の心筋組織；
    前記第３のチャンバー内の肺組織；ならびに
    前記第１、第２、および第３のチャンバー内の、一般的な水性増殖培地
    を含む、多組織生体機能チップ装置。
  2. 前記第１、第２、および第３のチャンバーと流体連絡した第４のチャンバー；
    前記第４のチャンバー内の精巣組織または卵巣組織；ならびに
    前記第１、第２、第３、および第４のチャンバー内の、前記一般的な水性増殖培地
    をさらに含む、請求項１に記載の装置。
  3. 前記第１、第２、および第３のチャンバー、ならびに、存在する場合前記第４のチャンバー、ならびにこれらの各々の中の前記一般的な水性増殖培地の全てと互いに流体連絡する、第５のチャンバー、および、任意選択的に第６のチャンバー；
    ここで、前記第５、および、第６のチャンバーが存在する場合、各々互いに異なるさらなる組織を含有し、各前記異なるさらなる組織が、血管内皮組織、骨格筋組織、腎臓組織、神経組織、脳組織、および腸組織（例えば、小腸組織および／または結腸組織）からなる群から選択される、
    をさらに含む、請求項１または２に記載の装置。
  4. 前記組織のうちの少なくとも１つが、転移性細胞および／または悪性細胞を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の装置。
  5. 前記チャンバー（存在する場合）の全てと作動的に関連し、前記一般的な水性増殖培地を、前記チャンバーの全てを通して循環させるために構成されたポンプをさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の装置。
  6. 前記チャンバー（存在する場合）の全てと作動的に関連し、流体連絡した、酸素化チャンバー（例えば、培地リザーバー）をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の装置。
  7. 前記チャンバーのうちの、少なくとも１つ、少なくとも２つ、一部、または全ての間に配置され、前記組織のうちの１つまたは組合せを、互いから隔絶させるように構成された、（手動で操作されるか、または自動的に制御される）流体バルブをさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の装置。
  8. 前記一般的な水性増殖培地が、少なくとも精巣細胞用培地を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の装置。
  9. 前記一般的な水性増殖培地が、任意選択的に、約０．１ｍＭ〜約５ｍＭの範囲の濃度でグルタミンを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の装置。
  10. 前記一般的な水性増殖培地が、任意選択的に、約５ｍＭ〜約６０ｍＭの範囲の濃度でグルコースを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の装置。
  11. 前記一般的な水性増殖培地が、任意選択的に、約０．１ｎｇ／ｍＬ〜約２０ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度で（哺乳動物、特に、ヒトの）上皮増殖因子を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の装置。
  12. 前記一般的な水性増殖培地が、任意選択的に、約０．１μｇ／ｍＬ〜約２μｇ／ｍＬの範囲の濃度でヒドロコルチゾンを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の装置。
  13. 前記一般的な水性増殖培地が、任意選択的に、約０．１μｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬの範囲の濃度でアスコルビン酸を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の装置。
  14. 前記一般的な水性増殖培地が、任意選択的に、約０．１ｎｇ／ｍＬ〜約１０ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度で（哺乳動物、特に、ヒトの）血管内皮増殖因子を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の装置。
  15. 前記一般的な水性増殖培地が、任意選択的に、約０．１〜約１０ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度で（哺乳動物、特に、ヒトの）線維芽細胞増殖因子ベータを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の装置。
  16. 前記一般的な水性増殖培地が、任意選択的に、約０．１ｎｇ／ｍＬ〜約１５ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度でインスリン様増殖因子１を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の装置。
  17. 前記一般的な水性増殖培地が、任意選択的に、１ｍＬ当たり約０．１単位〜１ｍＬ当たり約５単位の範囲の濃度でヘパリンを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の装置。
  18. 前記一般的な水性増殖培地が、任意選択的に、約０．１体積％〜約１体積％の範囲の濃度で抗菌剤または抗微生物剤（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、アンフォテリシンＢ）を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の装置。
  19. 前記一般的な水性増殖培地が、任意選択的に、約０．１体積％〜約１０体積％の範囲の濃度で血清（例えば、ウシ胎仔血清、ウシ血清など）を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の装置。
  20. 前記一般的な水性増殖培地が、無血清内皮細胞用培地と精巣細胞用培地との１：１の混合物を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の装置。
  21. 前記一般的な水性増殖培地と作動的に関連したセンサー（例えば、（ｉ）ＩＬ−８；（ｉｉ）プロスタサイクリン；（ｉｉｉ）アルブミンの低減；（ｉｖ）尿素の低減；（ｖ）ＬＤＨ；（ｖｉ）クレアチンキナーゼ；（ｖｉｉ）アルファ−グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ；（ｖｉｉｉ）カルセインＡＭで染色された生細胞；（ｉｘ）ヨウ化プロピジウムもしくはエチジウムホモ二量体で染色された死細胞；（ｘ）ＡＴＰ活性の低減；および／または（ｘｉ）ミトコンドリア代謝の低減のうちの１または複数を報告することにより、応答することなどにより、薬物、薬物候補物質、化合物、生物学的薬剤、化学的薬剤などに対する毒性応答を感知するように構成された）をさらに含む、請求項１に記載の装置。
  22. 前記センサーが、ＥＬＩＳＡセンサー；比色アッセイセンサー、リアルタイムの抗体センサーもしくはアプタマーセンサー、ウェスタンブロットセンサー、経内皮電気抵抗センサー、経上皮電気抵抗センサー、組織の形状を示すように構成された光学ビデオ捕捉装置、および／または心臓組織内の拍動の動態もしくは拍動挙動の変化を示すように構成された光学ビデオ捕捉装置を含む、請求項２１に記載の装置。
  23. 前記組織の全てが、一般的な細胞試料（例えば、対象から回収された皮膚試料などの試料）からの分化により作出される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の装置。
  24. 前記第４のチャンバー内の精巣組織、前記第５のチャンバー内の脳組織、および前記第６のチャンバー内の腸組織（例えば、結腸組織）を含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の装置。
  25. 前記第４のチャンバー内の卵巣組織、前記第５のチャンバー内の脳組織、および前記第６のチャンバー内の腸組織（例えば、結腸組織）を含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の装置。
  26. 前記第５のチャンバー内の脳組織、および前記第６のチャンバー内の血管組織を含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の装置。
  27. 前記組織のうちの、少なくとも１つ、少なくとも２つ、一部、または全てが、ヒト細胞、任意選択的に、組織試料に由来するｉＰＳ細胞および／または細胞から調製される、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の装置。
  28. 前記組織のうちの、少なくとも１つ、少なくとも２つ、一部、または全てが、約２００μｍ〜約３５０μｍの直径である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の装置。
  29. 前記組織のうちの、少なくとも１つ、少なくとも２つ、一部、または全てが、組織特異的細胞外マトリックス（例えば、前記肝臓組織は、肝臓の細胞外マトリックスを含む）を含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の装置。
  30. 前記チャンバーのうちの、少なくとも１つ、少なくとも２つ、一部、または全てを、併せて、並列または直列に連結する、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の装置。
  31. 少なくとも１０または１５の異なる細胞型を含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の装置。
  32. 前記組織のうちの、少なくとも１つ、少なくとも２つ、一部、または全てが、合計約１，５００または２，０００〜約３，０００または３，５００個の細胞を含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の装置。
  33. 前記チャンバーのうちの１つまたは複数を接続する、１つまたは複数の流体回路をさらに含む、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の装置。
  34. 前記１つまたは複数の流体回路のうちの少なくとも１つが、前記一般的な水性増殖培地のうちの少なくとも一部を、前記第１のチャンバーを通して再循環させるように構成された、請求項３３に記載の装置。
  35. 前記一般的な水性増殖培地が、任意選択的に、約０．１μＭ〜約１００μＭの範囲の濃度で存在するカドミウムを含み、かつ／または前記一般的な水性増殖培地が、任意選択的に、約０．１μＭ〜約１０μＭの範囲の濃度で存在するクロム（例えば、クロム（ＶＩ）および／またはクロム（ＩＩＩ））を含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の装置。
  36. 前記一般的な水性増殖培地が、任意選択的に、約５μＭ〜約５ｍＭの範囲の濃度で存在する鉛を含む、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の装置。
  37. 前記一般的な水性増殖培地が、任意選択的に、約０．２μＭ〜約２０μＭの範囲の濃度で存在する水銀を含む、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の装置。
  38. 前記一般的な水性増殖培地が、任意選択的に、約０．０５μＭ〜約５０μＭの範囲の濃度で存在するヒ素（例えば、ヒ素（ＩＩＩ））を含む、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の装置。
  39. （ａ）請求項１〜３８のいずれか一項に記載の装置を用意するステップと；
    （ｂ）前記一般的な水性増殖培地を、少なくとも１、４、８、または１１日間にわたり、前記チャンバーの全てを通して循環させるステップと
    を含む方法。
  40. 前記循環させるステップを、
    （ｉ）前記一般的な水性増殖培地中の、ＩＬ−８および／もしくはプロスタサイクリンの炎症性マーカー濃度が低下するのに十分な時間；
    （ｉｉ）前記培地中のアルブミンおよび／もしくは尿素の濃度が、実質的に安定を維持する時間；
    （ｉｉｉ）前記培地中のＬＤＨおよび／もしくはクレアチンキナーゼのレベルが、対照条件下の同じ培地と、実質的に同じレベルを維持する時間；ならびに／または
    （ｉｖ）前記培地中のアルファ−グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼレベルが、対照条件下の同じ培地と、実質的に同じレベルを維持する時間
    にわたり実行する、請求項３９に記載の方法。
  41. 試験化合物を、前記一般的な水性増殖培地に添加するステップと；次いで、
    少なくとも１つの前記組織、または複数の前記組織における、前記試験化合物に対する薬理学的応答および／または毒性学的応答を検出するステップと
    をさらに含む、請求項３９または４０に記載の方法。
  42. 前記試験化合物が、金属（例えば、重金属（例えば、ヒ素、カドミウム、クロム、鉛、および／または水銀））である、請求項４１に記載の方法。
  43. キレート剤を、前記一般的な増殖培地に添加するステップをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記キレート剤を、前記試験化合物を添加する前、これと同時、および／またはこの後に、前記一般的な増殖培地に添加する、請求項４３に記載の方法。
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