JP2019531762A - Vegfに対する合成の抗体およびそれらの使用 - Google Patents
Vegfに対する合成の抗体およびそれらの使用 Download PDFInfo
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Abstract
Description
別段に定義のない限り、本明細書に使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明の関連する実施形態が属する技術分野の当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。
この発明は、新規の抗VEGF抗体;およびそのような新規の抗VEGF抗体をコードする配列を含むポリヌクレオチド、およびそれらを含む医薬組成物を含めた組成物を包含する。用語「医薬製剤」、「医薬組成物」、および「剤形」とは、本明細書では互換的に使用され、対象への投与に適した形態で本発明の活性成分(複数可)を含有する組成物を指す。
a)抗体分子の抗原結合部分をコードする正しい遺伝子セグメントを特定しクローニングすること;この遺伝子セグメント(重鎖のVDJ、すなわち可変性多様性接合領域、または軽鎖のVJ、すなわち可変性接合領域、または単純にVもしくは可変領域として知られる)は、cDNAとゲノムのどちらの形態でもよい;
b)定常領域またはその所望の一部の遺伝子セグメントをクローニングすること;
c)転写および翻訳の可能な形態で完全なキメラ抗体がコードされるように、可変領域を定常領域にライゲーションすること;
d)選択マーカーとプロモーター、エンハンサー、およびポリ(A)付加配列などの遺伝子制御領域とを含有するベクター内にこの構築物をライゲーションすること;
e)この構築物を細菌中で増幅すること;
f)このDNAを真核細胞内に、最も多くは哺乳類リンパ球内に導入すること(トランスフェクション);
g)選択マーカーを発現している細胞を選択すること;
h)所望のキメラ抗体を発現している細胞をスクリーニングすること;および
k)適切な結合特異性およびエフェクター機能について抗体を試験すること。
本願発明は抗体断片を包含する。全抗体に比べてサイズの小さな抗体断片は、いくらかの利点を有する。例えば、断片によって、さらに速やかなクリアランスが可能になることがあり、全抗体に比べた際に目的の部位へのアクセスの改善に繋がることがある。
本発明は、VEGFに結合する抗体(例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、合成抗体、およびヒト化抗体)をさらに提供する。最も好適な抗体は、VEGFに選択的に結合するものとなり、VEGFではないタンパク質には結合しない(または弱く結合する)ものとなる。最も好適な抗体は、VEGFに特異的に結合するものとなる。用語「特異的に結合する」とは、その抗体が大部分でVEGFに結合することを意味することが意図されている。具体的に想定される抗VEGF抗体としては、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、ならびにこれらの抗体の抗原結合ドメインおよび/または1つまたは複数の相補性決定領域を含有するそれらの断片(例えば組換えタンパク質)が挙げられる。これらの抗体は、任意の供給源から得ることができ、そのようなものとしては、例えばラット、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、マウス、またはヒトがある。
本願発明は、新規のヒト化抗VEGF抗体を包含する。ヒト化抗体とは、非ヒト免疫グロブリンに由来する配列を含有するキメラ抗体である。例えば、ヒト化抗体とは、ヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)であり、そのグロブリンでは、レシピエントの超可変領域に由来する残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有する非ヒト霊長類、マウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種(ドナー抗体)の超可変領域に由来する残基に置き換えられている。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(FR)の残基が、対応の非ヒト残基に置き換えられていることがある。さらに、抗体の性能をいっそう磨き上げるために、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体に見出されない残基を含むことがある。このヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含むことがある。キメラ抗体は、特定の種に由来するかまたは特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応の配列に、一致するかまたは相同である、重鎖および/または軽鎖の一部分を含むことがあるが、その一方で、鎖(複数可)の残りは、別の種に由来するかまたは別の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体ならびにそのような抗体の断片が所望の生物活性を示す限り、それらの対応の配列に一致するかまたは相同である。
二重特異性抗体とは、抗VEGFのモノクローナルの、好ましくは本発明のヒト抗体またはヒト化抗体であり、少なくとも2つの異なる抗原に対する結合特異性を有する。この場合では、結合特異性のうち一方はVEGFに対するものであり、他方は任意の他の抗原に対するものである。例示的な二重特異性抗体は、VEGFタンパク質の2つの異なるエピトープに結合するものと思われる。
実施形態によっては、本明細書に記載される抗VEGF抗体のアミノ酸配列の改変(複数可)が想定される。本抗体のアミノ酸配列のバリアントは、例えば、適切なヌクレオチド変換を本抗体の核酸内に導入することによって、またはペプチド合成によって、調製されてもよい。そのような改変としては、例えば、抗体のアミノ酸配列からの欠失、および/またはその中への挿入、および/またはその中の残基の置換が挙げられる。どの組合せの欠失、挿入、および置換も、最終的な構築物が所望の特性を有するという条件で、その最終的な構築物に到達するように作製される。
本発明の別の態様は、抗VEGF抗体およびその断片をコードする様々な核酸分子を、好ましくは単離された形態で提供し、そのような分子としては、DNA、RNA、DNA/RNAハイブリッド、および関連分子、本抗VEGF抗体をコードする配列に相補的な核酸分子またはその一部、および本抗VEGF抗体をコードする核酸にハイブリダイズするものが挙げられる。特に好適な核酸分子は、本明細書に開示されるヒトまたはマウスのDNA配列に実質的に一致するか相補的であるヌクレオチド配列を有するものとなる。特に想定されるのは、天然の供給源由来か合成であるかを問わず、ゲノムDNA、cDNA、リボザイム、およびアンチセンス分子、ならびに代替の骨格をベースとするかまたは代替の塩基を含む核酸である。
本発明は、抗VEGF抗体またはその断片をコードする核酸分子を用いて形質転換された宿主細胞をさらに提供する。宿主細胞は、原核性と真核性のどちらかにすることができる。抗VEGF抗体の発現に有用な真核細胞は、その細胞株が細胞培養方法に適合し、かつ発現ベクターの伝搬および抗VEGF抗体遺伝子の発現に適合する限り、限定されない。好適な真核宿主細胞としては、以下に限定されないが、酵母、昆虫、および哺乳動物の細胞、好ましくは脊椎動物細胞、例えばマウス、ラット、サル、またはヒトの細胞株に由来するものなどが挙げられる。好適な脊椎動物細胞株としては、以下に限定されないが、CHOおよびHEK293が挙げられる。最も好適な脊椎動物細胞株は、生物製剤の製造または生産用に認可されたものである。好適な原核宿主は、大腸菌と枯草菌のどちらかである。
抗体の調製のための様々な方法が、当技術分野に周知である。例えば、宿主細胞を、上記の発現ベクターを用いて形質転換して、プロモーターを誘導するか形質転換体を選択するかまたは所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切に改変された在来の栄養培地で培養することがある。
当技術分野に公知の標準的なタンパク質精製法を採用することができる。以下の手順は、適した精製手順の例である:イムノアフィニティカラムまたはイオン交換カラムでの分画、SDS−PAGE、硫酸アンモニウム沈殿、逆相HPLC、シリカまたはDEAEなどの陽イオン交換樹脂でのクロマトグラフィー、およびゲル濾過例えばSephadex G−75。
本発明はまた、イムノコンジュゲート(互換的に「抗体−薬剤コンジュゲート」または「ADC」と称される)を提供し、このコンジュゲートは、化学療法剤、薬剤、成長阻害剤、毒素(例えば細菌、真菌、植物、または動物を起源とする酵素活性を持つ毒素もしくはその断片)、または放射活性剤(すなわち放射性コンジュゲート)などの細胞毒性剤または治療剤にコンジュゲーションされた任意の本発明の抗VEGF(例えば、本明細書に記載されるその一部分もしくはバリアントを含む)を含む。例えば、治療剤としては、以下に限定されないが、抗腫瘍薬、サイトカイン、第2の抗体、または抗体の一部分(例えばFc)が挙げられる。さらに、本発明は、プロドラッグを細胞毒性薬に変換する酵素に本発明の抗体が連結されている、実施形態を提供する。本発明の実践に従えば、本抗体の一部分は、scFv断片、Fv断片、Fab断片、Fab’断片、およびF(ab’)2断片からなる群から選択されてもよい。
本明細書に記載される抗VEGF抗体コード核酸分子によって、抗VEGF抗体のホモログ、代替的に薄切されたアイソフォーム、対立遺伝子のバリアント、および本発明の抗VEGF抗体の変異体、ならびにコード配列および遺伝子配列の単離が可能になる。
本発明の別の態様は、本発明の抗体が認識し結合するVEGFと同じかまたは重複するエピトープに結合する追加の抗VEGF抗体を、検出し特定するために使用することができる、アッセイおよび方法に関連する。具体的には、抗VEGF抗体のVEGFに結合する能力および/またはVEGF活性を阻害/刺激する能力によって、VEGFに結合する抗VEGF抗体および他の剤および細胞成分を特定することができる。VEGF結合活性についてのアッセイは、VEGFタンパク質を必要とすることがあるか、または、その断片もしくはそのペプチドが、ハイスループットスクリーニング法での使用に適する。
多種多様な本発明の診断使用がある。例えば、本発明は、対象、例えば動物またはヒト対象で、黄斑変性症、または眼でのVEGFの過剰生産に関連する(実際のまたは潜在的な)視覚の機能障害もしくは喪失、またはVEGFタンパク質の存在に関連するがんを診断するための方法を提供する。一実施形態では、本方法は、本発明の抗体のうちいずれか1つまたは組合せを用いて、試料(例えば細胞または生体液の試料)中のVEGFタンパク質の数を定量的に決定することを含む。次いで、そうして決定された数を、正常な対象由来の試料中の量と比較することができる。測定できる程度に異なる量が試料中に存在していること(すなわち、被験試料中のVEGFの数が正常な試料由来の数を超える)は、黄斑変性症または視覚の機能障害もしくは喪失のリスクの存在または増加、またはがんの存在を標示する。被験試料中のVEGFの数が正常な試料由来の数を超える際に、VEGFを細胞によって過剰発現する。
さらに、本発明は、対象由来の試料中のVEGFの量を様々な時点で測定することによって、対象での黄斑変性症、または視覚の機能障害、またはがん(例えば、前立腺がん、膀胱、膵臓がんの前立腺転移、骨転移)、またはVEGFに関連する障害の経過をモニタリングするための方法を提供する。これは、試料中のVEGFの量の変化を決定する目的で、例えばその変化が小さな量変化であるか、または大きな変化、すなわちVEGFの過剰発現であるかを決定するために行う。一実施形態では、この方法は、対象由来の初発の試料中でVEGFタンパク質の存在を定量的に決定すること、およびそうして決定された量を対象由来の第2の試料中に存在する量と比較することを含み、そのような試料は、異なる時点で採取され、決定された量の差異は、黄斑変性症または視覚機能障害またはがんの経過を標示するものである。
本発明は、VEGFに関連する疾患、例えば滲出型加齢性黄斑変性症、糖尿病性黄斑症、増殖性糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症(RVO)における黄斑浮腫、虹彩新血管新生、病理学的近視に起因する脈絡膜の新血管新生、成熟児網膜症、血管新生緑内障、および/またはがんなどを治療するために、例えば全身的に使用されることがある、本発明の抗VEGF抗体を提供する。
本願発明は、任意の新規の本発明の抗VEGF抗体を含む組成物を提供する。「医薬的に許容可能な担体」という言い回しは、その特定の投与経路に適したものとなる当業者に公知の任意の担体を指す。さらに、新規の本発明の抗VEGF抗体は、組成物中に唯一の医薬的に活性な成分として製剤化されてもよいし、他の活性成分と組み合わされてもよい。
本発明の別の態様によれば、キットが提供される。本発明によるキットとしては、本発明の組成物を含むパッケージ(複数可)が挙げられる。
VEGFに対する新規の合成抗体の同定および分子特性解析
全体のプロセスには、ファージディスプレイ技術を用いたFabの選択、すなわちクローンの選択とそれに続いて最も結合親和性の高いクローンを選択するための複数回の親和性成熟が含まれる。得られた配列を、PhoAベースのベクターにクローニングした後、大腸菌での発現、タンパク質の精製、および親和性の決定を行う。詳細なプロトコールを下記に示す。
合成ファージライブラリーの構築は、天然に発生した抗体の構造的および機能的な特性、バクテリオファージ被覆タンパク質の構造とアセンブリ、バクテリオファージの生物学、および宿主細胞の生物学に基づく。そのような知識に基づき、合成のFab抗体断片をファージ表面に提示する感染性バクテリオファージを生産する。どの単一Fabファージディスプレイライブラリーでも、Fab−ファージ被覆タンパク質キメラ融合タンパク質の合成Fab抗体断片部分は、様々な配列またはランダム配列を有する相補性決定領域(CDR)ループが接合され得る特異的なヒトフレームワーク領域(FR)またはヒトコンセンサス配列FRを有することがある。CDRが抗原との結合に関与することから、ファージをVEGFなどの抗原に対してスクリーニングして、VEGFに結合する合成Fabファージを特定し、ゆえにVEGFとの結合に関与するCDRを有するファージを選出する。選択されたFabファージによるVEGF結合の向上には、選択されたCDRの定方向の変異を生成すること、およびさらに何巡かファージ選択を行うことが必要であることがある。あるいは、FR配列の定方向の変異生成を、特に、ストランド間のジスルフィド形成に関与するシステインを除くCDR配列に隣接するアミノ酸残基、および高度に保存されたアミノ酸、例えばヒトIgG1の重鎖FRH4の不変のトリプトファンなどについて、実施することがある。
DNA構築物2140bpを遺伝子合成し、この構築物は、phoAプロモーター、クローン#121(Fab−A5)のFabコード配列、およびrrnBターミネーターの配列を含んでいた。構築物を、改変型pBR322ベクター内にEcoRI/NotI部位でクローニングして、クローン#121を生成した。続いて、クローン#121を、1454bpサイズのtetR耐性遺伝子を欠失させることによって改変して、クローン#131を生成した。
組換えFabの形質転換を大腸菌Dh5αおよびBL21で行った。
−80℃から出したグリセロールバイアルを、氷上に10分間解凍する。50μLの100mg/mLからのカルベニシリンまたは100mg/mLアンピシリン、50mLのルリアブロス(LB)に添加する。7μLの解凍したグリセロールストック培養物を取り、抗生物質を含む50mLのLBブロスに接種した。インキュベーターシェーカー中で37℃、210rpmで一晩、培養物を成長させた。
一晩成長させた5mLの培養物を取り、Qiagen QIAprep Spin Miniprep Kit(カタログ番号:27104)を用いてプラスミドを単離する。
凍結ストックから出した細菌を、適切な抗生物質(カルベンシリン/アンピシリン)と共にプレートに広げる。単一コロニーを拾い、抗生物質を含むLB中で、600nmでのODが0.4〜0.6に到達するまで細胞を成長させる。培養物を4000g、4℃で10分間スピンダウンさせる。ペレットを4℃でTSBの1/20体積に再懸濁する。細胞を氷上で10分間インキュベーションし、10%滅菌グリセロールの最終濃度となるよう添加する。細胞を個別のチューブに分注し(100uLの細胞)、液体窒素またはドライアイス中で凍結する。チューブを−80℃で貯蔵する。
希釈したDNAを1.5mLチューブ中で10μLの1×KCMと混合した。チューブを氷上で2〜5分間冷却した後、同じ体積のコンピテント細胞(10uL)を添加した。チューブをさらに氷上で20分間インキュベーションし、次いで、室温で10分間インキュベーションした。200uLのSuper Optimal Broth with Catabolite Repression(SOC)またはLB培地(ThermoFisher)を添加し、細胞を37℃で1時間撹拌することによって回復させた。100−200uLの上記培養物を取り、適切な抗生物質(カルベニシリン/アンピシリン)を含むLBアガロースプレート上で、37℃で一晩成長させた。
前接種物を調製する(10mLのLB培地pH7.0+10μLの100mg/mlストックからのカルベンシリン)。培養物を37℃/210rpmで一晩成長させる。1mLの一晩成長させた培養物を100mLの新鮮LB培地(100mLのLB培地pH7.0+100μLの100mg/mlストックからのカルベンシリン)中で継代培養する。培養物を、37℃/210rpmで、OD600が0.4から0.6の間に到達するまで成長させる。培養物を滅菌条件下、4000rpmでスピンする。ペレットを滅菌条件下、6mLの滅菌LB培地pH7.0+4mLの50%滅菌グリセロール中、60:40(成長させた培養物:グリセロール)の比で再懸濁する。多数のグリセロールストックを調製し、最初に−20℃で貯蔵し、次いで後に−80℃に移す。グリセロールストックを定期的に復活させる。
大腸菌で新たに形質転換された201の単一コロニーを、LBアガロースプレートから拾った。大腸菌BL21−201を、カルベニシリン抗生物質(10μl)を含有するLBブロス(10mL)中に接種した。培養物を、オービタルシェーカー中で37℃、210rpmで16時間保った。培養物の600nmでのODを16時間後に確認した。
500mLの成長培地および生産培地を調製した。培地のpHを7.0に調整した。摂取前に、500μLのカルベニシリン(100mg/mLストックより)、500μLのチアミンHCL(1M滅菌ストックより)、2.5mLの滅菌グルコース(40%滅菌ストックより)、および320μLのリン酸カリウム(1M KH2PO4より)を添加した。成長培地に8%の一晩成長培養物(前培養物)を接種した。成長培地中の培養物の初発のOD(600nm)、グルコース濃度、およびリン酸濃度を、同時に確認した。培養フラスコをオービタルシェーカー中、37℃、210rpmで、ODが2〜2.5の間に到達するまで保った。OD(600nm)を確認して、成長培地中の培養物のグルコース濃度およびリン酸濃度を見積もった。培養物を4000rpm、+25℃で15分間スピンした。細胞ペレットを滅菌条件で洗浄し、4000rpmで15分間スピンした。細胞ペレットを低リン酸濃度(0.064mM作業用濃度).の500mLの生産培地に再懸濁した。生産培養フラスコを30℃、210rpmで20時間保った。同時に、生産培地中の培養物のOD(600nm)、WCW、DCW、グルコースおよびリン酸の濃度を分析した。発現した培養物を4300g、+4℃で30分間スピンした。
100mLの培養物からタンパク質を抽出した後のプロセス
140mM塩化ナトリウムおよび1mMフェニルメタンスルホニルフルオリド(PMSF)を含有する20mMリン酸緩衝液を用いて、細菌ペレットの溶解を行った。100mLの培養物から得た20gのペレットに対し、4Lの溶解緩衝液を使用した。ペレットの洗浄は、2Lの溶解緩衝液を用いて行い、その際に、ペレットを再懸濁して、4℃、4,300gで15分間遠心分離した。次いで、ペレットを2Lの溶解緩衝液に4℃で再懸濁し、65℃の水浴で5分間、予加熱した。短時間の混合ステップの後、TritonX100を0.1%の比率で添加して、5分間混合した。次いで、懸濁液を水浴に移して65℃で40分間維持した後、溶解物を氷上で冷却した。
攪拌フラスコ中の発現クローンからのおよび精製後のFabの産生量の定量に用いるために。ルセンティスの標準曲線を作製し、細胞溶解物中およびカラムクロマトグラフィー(タンパク質精製)後の溶離物中のFabの濃度の決定に用いた。
緩衝液を調製した[洗浄緩衝液(PT)、希釈緩衝液(PBT)、およびブロッキング緩衝液]。VEGF−121(ヒトVEGF−A121)を使用して、Nunc96ウェルMaxiSorpプレートをPBS中ウェル当たり終濃度50ng/100uLで2時間、緩やかに攪拌しながら被覆した。hVEGFを被覆プレートから除去した。200uLのブロッキング緩衝液を添加して、プレートを緩やかに攪拌しながらRTで1時間、インキュベーションした。ブロッキング緩衝液をフィルターペーパー上に放り付けることによって除去した。プレートを200ulの洗浄緩衝液で3回洗浄した。20ug/mLのストック溶液から、ルセンティス(登録商標)(ラニビズマブ;NovartisおよびRoche)を希釈緩衝液中500ng/mLに希釈した。500ng/mLの希釈ルセンティス(登録商標)を用いて、ルセンティス(登録商標)の一通りの逐次希釈を実施して、200ng/mL、100ng/mL、…、0.39ng/mLの希釈ルセンティス(登録商標)を得た。100uLの逐次希釈ルセンティス(登録商標)をウェルに3連で添加し、プレートを緩やかに攪拌しながらRTで1時間、インキュベーションした。プレートのウェル中の溶液を叩き捨て、プレートを200uLの洗浄緩衝液で3×洗浄した。100uLの抗カッパ軽鎖抗体−HRPコンジュゲート(希釈緩衝液中1:5000)を添加して、RTで1時間インキュベーションした。プレートを洗浄緩衝液で3×、PBSで2×洗浄し、フィルターペーパー上に放り付けて緩衝液を完全に除去した。100uLのTMB基質を各ウェルに添加し、比色反応を5分間展開させた。100uLの1N硫酸を添加して反応を停止した。プレートをマルチモードプレートリーダーにて450nmで読んだ。未知の試料については、いくつかの希釈物を作製し、標準曲線(図2および表2)を用いて値を外挿する。
親和性アッセイのステップは以下の通りである。緩衝液を調製した[洗浄緩衝液(PBST)、希釈緩衝液(PBT)、ブロッキング緩衝液、および停止緩衝液]。Nunc384ウェルプレートのウェルを、PBS中ウェル当たり終濃度50ng/25uLでhVEGFを用いて、150rpm、RTで2時間被覆した。2時間後、hVEGFを被覆プレートから除去した。75uLのブロッキング緩衝液を添加して、200rpm、RTで緩やかに撹拌しながら1時間インキュベーションした。ブロッキング緩衝液を除去して、プレートを75uLのPBSTで6×洗浄し、ティッシュタオル上に叩き付けて乾燥した。その間に、付着防止加工プレート/Eppendorf中で、hVEGFの開始濃度2×(100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM…)をPBT中に調製し、その結果、VEGFの終濃度の×を50nM、25nM、12.5nM、6.25nM…)とした。200pMルセンティス(2×)のFabをPBT中に調整し、結果として終濃度Xを100pMとした。50uLの100pM hVEGF(2×)(100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM…)を50uLの200pMルセンティス(2×)に混合して、結果として終濃度Xを(50nM、25nM、12.5nM、6.25…)とし、200rpm、RTで緩やかに撹拌しながら1時間インキュベーションした。同様のステップをFab分子についても続けて行った。25uLのこの逐次希釈hVEGF/Fab混合物をプレートに添加し、200rpm、RTで緩やかに撹拌しながら30分間インキュベーションした。プレートに固定化されていない一次抗体を除去し、プレートを75uLのPBSTで6×洗浄し、ティッシュタオル上に叩き付けて乾燥した。25uLの抗カッパ軽鎖HRP(PBT中1:5000)を添加して、200rpm、RTで緩やかに撹拌しながら45分間インキュベーションした。プレートに固定化されていない二次抗体を除去し、プレートを各ウェル中75uLのPBSTで6×、PBSで2×洗浄し、ティッシュタオル上に叩き付けて乾燥した。25uLのTMB基質を添加し、200rpm、RTで緩やかに撹拌しながら5分間インキュベーションした。25uLの1N硫酸をプレートに添加して、反応を停止した。プレートをマルチモードプレートリーダーにて450nmで読んだ(図3および表3を参照)。
簡潔に述べれば、10pMのhVEGF−165を、図の凡例に記載されるような抗VEGF抗体の逐次希釈物と共にインキュベーションした。結合溶液中にいくらかの非結合のhVEGF−165が共存する予め形成させたhVEGF−165/抗VEGF抗体複合体を、Quantikine(登録商標)ELISAヒトVEGFイムノアッセイ(R&DSystems,Inc.;カタログ番号:SVE00)に提供されるようなヒトVEGFに特異的なモノクローナル抗体を被覆した96ウェルポリスチレンマイクロプレートに移す。プレートに結合しているhVEGF−165を、セイヨウワサビペルオキシダーゼにコンジュゲーションされたポリクローナル抗hVEGF抗体と、色素源としてテトラメチルベンジジンとを用いて検出して、Quantikine(登録商標)アッセイキットに提供されるようなプレートに結合しているhVEGF−165を定量する。データから算出されたKdを、Prismソフトウェアを用いて5パラメーターの非対称モデルにフィッティングした。
GACCAACAGCGGTTGATTGATCAGGTAGAGGGGGCGCTGTACGAGGTAAAGCCCGATGCCAGCATTCCTGACGACGATACGGAGCTGCTGCGCGATTACGTAAAGAAGTTATTGAAGCATCCTCGTCAGTAAAAAGTTAATCTTTTCAACAGCTGTCATAAAGTTGTCACGGCCGAGACTTATAGTCGCTTTGTTTTTATTTTTTAATGTATTTGTAACTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTATGTAGAGGTTGAGGTGATTTT(配列番号15)
ATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGCCGCCTACGGCCGCGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACAAAGCATCCGAACTCTACGCCGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCCGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACGTGGCTGGTATCTGTTCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATTCACAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAAAAACATAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAATACTCGAGGCTGAGCAAAGCAGACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCCTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTAACTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAACGCGTACGCTGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCGATTTATTTCATTATTCTATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCATACATTTACCCGTCTTATGGCTATACTTATTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCCATGCGTGGTATTATGGGTGGGGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCCACCAAGGGTCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTCGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATAA(配列番号16)
CGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACATCCATGCGTTAACGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGGAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCGGGAGCGGATTTGAACGTTGTGAAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACGCCCGCCATAAACTGCCAGGCATCAAACTAAGCAGAAGGCCATCCTGACGGATGGCCTTTTT(配列番号19)
GAATGCGCAAACCAACCCTTGGCAGAACATATCCATCGCGTCCGCCATCTCCAGCAGCCGCACGCGGCGCATCTCGGGCAGCGTTGGGTCCTGGCCACGGGTGCGCATGATCGTGCTCCTGTCGTTGAGGACCCGGCTAGGCTGGCGGGGTTGCCTTACTGGTTAGCAGAATGAATCACCGATACGCGAGCGAACGTGAAGCGACTGCTGCTGCAAAACGTCTGCGACCTGAGCAACAACATGAATGGTCTTCGGTTTCCGTGTTTCGTAAAGTCTGGAAACGCGGAAGTCAGCGCCCTGCACCATTATGTTCCGGATCTGCATCGCAGGATGCTGCTGGCTACCCTGTGGAACACCTACATCTGTATTAACGAAGCGCTGGCATTGACCCTGAGTGATTTTTCTCTGGTCCCGCCGCATCCATACCGCCAGTTGTTTACCCTCACAACGTTCCAGTAACCGGGCATGTTCATCATCAGTAACCCGTATCGTGAGCATCCTCTCTCGTTTCATCGGTATCATTACCCCCATGAACAGAAATCCCCCTTACACGGAGGCATCAGTGACCAAACAGGAAAAAACCGCCCTTAACATGGCCCGCTTTATCAGAAGCCAGACATTAACGCTTCTGGAGAAACTCAACGAGCTGGACGCGGATGAACAGGCAGACATCTGTGAATCGCTTCACGACCACGCTGATGAGCTTTACCGCAGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTGCAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAACACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCAAGAATTC
第1世代の抗VEGF Fabの選択−ナイーブ抗体ライブラリーの選択と種間交差反応性と選択されたFabの特異性
抗体断片(Fab)ファージライブラリーF(H. Persson, Et. al., J Mol Biol, vol. 425, no. 4, pp. 803–811, 2013.)を、Preprotech(カタログ番号100−20A)から得た組換えヒト血管内皮成長因子(hVEGF)121に対して選択した。Preprotech(カタログ番号450−32)から得たマウスVEGF(mVEGF)とhVEGFに対する結合について、および抗体の結晶化可能断片(Fc)とウシ血清アルブミン(BSA)に対する結合のないことについて、Fabをスクリーニングした。総計7種のFabを選択し、そのうち6種(FF0124−1、FF0124−3、FF0124−4、FF0124−5、FF0124−6、およびFF0124−7)は、hVEGFとmVEGFの両方に結合するが、FcおよびBSAには結合しない。これらのFabのhVEGFに対する親和性を、Fab−ELISAによって見積もった(図4)。
FLTは、天然のVEGF受容体の1つである。FLTと予めインキュベーションした際に、6種のFabが小さくhVEGFと結合するが(図5)、このことは、6種のFabとFLTとが、hVEGF上に重複した結合部位を有し、それらがhVEGFに対するFLTの結合を阻害する可能性を有することを示唆する。5種のFabを鋳型として使用して、FF0124−1配列、FF0124−3配列、FF0124−4配列、FF0124−6配列、およびFF0124−7配列をベースにしたライブラリーを作製した。これらのライブラリーを、hVEGFに対する親和性の高さについて選択した。
次世代のライブラリーは、Fab FF0124−1、FF0124−3、FF0124−4、FF0124−6、およびFF0124−7をベースにした。各ライブラリーの多様性は、1×109から4×109に及んだ。5つのライブラリーを、既に記載されたようにプールし(多様性の総計1010)生産した。次いで、プールしたFab−ファージライブラリーを選択し、見積もった親和性によって順位付けした選択クローンの配列を図6に報告する。10nMの一点での競合ELISAに基づくと、Fab FF0158−C4、FF0158−F11、およびFF0158−C11は、hVEGFに最も低い親和性で結合する。これらは、既に記載されたように、細菌中で可溶性タンパク質として生産されたものである。溶液中のhVEGFに対する親和性を、競合的Fab−ELISAによって測定した(図7)。
CDR−H1またはCDR−H2の変異は、FF0158−C4の生産収量を向上できることから、出願人らは、CDR−H1およびCDR−H2に焦点を合わせた多様性を有する2種の異なるライブラリーを作出した。pTacプロモーターと、重鎖とpIIIコード配列の間のアンバー終止とを有する抗−MBPFabファージミドを用いて、ライブラリーを造成した。このフォーマットでは、Fabは、アンバーサプレッサー細菌株で発現された際にはファージ上に提示され、非アンバーサプレッサー細菌株で発現された際には可溶性形態で分泌される。ファージにより提示されたFabを親和性について選択したのに対し、分泌されたFabをタンパク質収量についてスクリーニングした。
収量の向上した抗VEGF Fab FF0188−H5の親和性を向上させるために、出願人らは、FF0188−H5配列を鋳型として有する新しいライブラリーを設計した。多様化させたCDRの終止コドンを鋳型に追加して、2つのライブラリーの親配列の数を限定した。
抗VEGF FabFF0117−A5の親和性をさらに向上させるために、出願人らは、FF0117−A5配列を有する新しいライブラリーを鋳型として設計した。すなわち、FF0117−A5を変異させて、CDR−L1およびCDR−L2に終止コドンを導入し、FabのHCのC末端終端をコードする配列を改変し、二価の提示に代えて一価の提示を可能にした。ライブラリーの多様性は、6×109である。1010個のファージ粒子を使用して、500mLのアンバーサプレッサー株Omnimax(登録)の培養物を感染させ、Fab提示ファージ粒子を作製した。
次いで、出願人らは、FF03046−2のscFvまたはFabのバージョンをヒトFcのC末端に融合している。この融合タンパク質は、FcのC末端に融合されたFab/scFvの1つ1つに単一のVEGF分子をしっかりと留める能力に起因してさらに低いクリアランスとさらに高い親和性とを有するものと、出願人らは予想している。FcのN−末端をscFvまたはFabに融合して、他の目的のタンパク質に結合させることができることがそうであるように、これによって、多特異性を持つ実体の生成が容易なものとなる。
Yバリアントの配列
バリアント201
ATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGCCGCCTACGGCCGCGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACAAAGCATCCGAACTCTACGCCGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCCGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACGTGGCTGGTATCTGTTCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATTCACAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAAAAACATAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAATACTCGAGGCTGAGCAAAGCAGACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCCTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTAACTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAACGCGTACGCTGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCGATTTATTTCATTATTCTATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCATACATTTACCCGTCTTATGGCTATACTTATTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCCATGCGTGGTATTATGGGTGGGGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCCACCAAGGGTCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTCGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATAA(配列番号21)
ATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGCCGCCTACGGCCGCGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACAAAGCATCCGAACTCGACGCCGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCCGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACGTGGCTGGTATCTGTTCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATTCACAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAAAAACATAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAATACTCGAGGCTGAGCAAAGCAGACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCCTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTAACTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAACGCGTACGCTGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCGATTTATTTCATTATTCTATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCATACATTTACCCGTCTTATGGCTATACTTATTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCCATGCGTGGTATTATGGGTGGGGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCCACCAAGGGTCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTCGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATAA(配列番号22)
ATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGCCGCCTACGGCCGCGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACAAAGCATCCGATCTCTACGCCGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCCGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACGTGGCTGGTATCTGTTCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATTCACAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAAAAACATAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAATACTCGAGGCTGAGCAAAGCAGACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCCTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTAACTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAACGCGTACGCTGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCGATTTATTTCATTATTCTATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCATACATTTACCCGTCTTATGGCTATACTTATTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCCATGCGTGGTATTATGGGTGGGGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCCACCAAGGGTCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTCGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATAA(配列番号23)
ATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGCCGCCTACGGCCGCGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACAAAGCAGACGAACTCTACGCCGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCCGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACGTGGCTGGTATCTGTTCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATTCACAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAAAAACATAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAATACTCGAGGCTGAGCAAAGCAGACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCCTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTAACTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAACGCGTACGCTGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCGATTTATTTCATTATTCTATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCATACATTTACCCGTCTTATGGCTATACTTATTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCCATGCGTGGTATTATGGGTGGGGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCCACCAAGGGTCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTCGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATAA(配列番号24)
ATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGCCGCCTACGGCCGCGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACAAAGATTCCGAACTCTACGCCGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCCGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACGTGGCTGGTATCTGTTCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATTCACAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAAAAACATAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAATACTCGAGGCTGAGCAAAGCAGACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCCTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTAACTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAACGCGTACGCTGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCGATTTATTTCATTATTCTATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCATACATTTACCCGTCTTATGGCTATACTTATTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCCATGCGTGGTATTATGGGTGGGGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCCACCAAGGGTCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTCGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATAA(配列番号25)
ATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGCCGCCTACGGCCGCGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACGATGCATCCGAACTCTACGCCGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCCGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACGTGGCTGGTATCTGTTCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATTCACAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAAAAACATAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAATACTCGAGGCTGAGCAAAGCAGACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCCTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTAACTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAACGCGTACGCTGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCGATTTATTTCATTATTCTATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCATACATTTACCCGTCTTATGGCTATACTTATTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCCATGCGTGGTATTATGGGTGGGGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCCACCAAGGGTCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTCGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATAA(配列番号26)
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ATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGACGCCTACGGCCGCGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACAAAGCATCCGAACTCTACGCCGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCCGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACGTGGCTGGTATCTGTTCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATTCACAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAAAAACATAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAATACTCGAGGCTGAGCAAAGCAGACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCCTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTAACTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAACGCGTACGCTGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCGATTTATTTCATTATTCTATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCATACATTTACCCGTCTTATGGCTATACTTATTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCCATGCGTGGTATTATGGGTGGGGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCCACCAAGGGTCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTCGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATAA(配列番号35)
ATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGCCGCCGACGGCCGCGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACAAAGCATCCGAACTCTACGCCGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCCGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACGTGGCTGGTATCTGTTCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATTCACAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAAAAACATAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAATACTCGAGGCTGAGCAAAGCAGACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCCTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTAACTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAACGCGTACGCTGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCGATTTATTTCATTATTCTATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCATACATTTACCCGTCTTATGGCTATACTTATTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCCATGCGTGGTATTATGGGTGGGGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCCACCAAGGGTCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTCGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATAA(配列番号36)
ATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGCCGCCTACGACCGCGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACAAAGCATCCGAACTCTACGCCGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCCGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACGTGGCTGGTATCTGTTCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATTCACAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAAAAACATAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAATACTCGAGGCTGAGCAAAGCAGACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCCTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTAACTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAACGCGTACGCTGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCGATTTATTTCATTATTCTATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCATACATTTACCCGTCTTATGGCTATACTTATTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCCATGCGTGGTATTATGGGTGGGGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCCACCAAGGGTCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTCGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATAA(配列番号37)
ATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGCCGCCTACGGCGACGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACAAAGCATCCGAACTCTACGCCGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCCGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACGTGGCTGGTATCTGTTCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATTCACAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAAAAACATAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAATACTCGAGGCTGAGCAAAGCAGACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCCTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTAACTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAACGCGTACGCTGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCGATTTATTTCATTATTCTATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCATACATTTACCCGTCTTATGGCTATACTTATTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCCATGCGTGGTATTATGGGTGGGGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCCACCAAGGGTCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTCGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATAA(配列番号38)
右側の段に標示されるバリアント201〜220の軽鎖の多重配列アラインメント[IMGT(登録商標)に従って画定されるCDR配列を下線表示する]
右側の段に標示されるバリアント201〜220の重鎖の多重配列アラインメント[IMGT(登録商標)に従って画定されるCDR配列を下線表示する]
右側の段に標示されるバリアント201〜220の軽鎖の多重配列アラインメント[Kabatに従って画定されるCDR配列を下線表示する]
製剤1は以下の賦形剤を含む。0.03%のポリソルベート20、5%のスクロース、40mMの塩化ナトリウム、10mMのリン酸緩衝液、および5.8のpH。代替的な実施形態では、ポリソルベート20を約0.1%から0.04%の範囲で使用することがある。さらに、スクロースを約1%から約20%の範囲で使用することがある。塩化ナトリウムを約10から約80mMの範囲で使用することがある。リン酸緩衝液を約10から約100mMの範囲で使用することがある。また、pHを約5から6の範囲とすることがある。
バリアント201の生化学的な説明
バリアント201は、図23および図24に示されたヒト抗VEGF可変ドメインを含むFab抗体であり、最初に融合タンパク質(配列番号16)として生産された後、プロセッシングされて23アミノ末端分泌シグナルを除去され、成熟Fab201抗体断片を生じ、この断片は、図23に示された重鎖の可変領域−CH1ドメインおよびヒンジ領域の部分と、図24に示されたカッパ軽鎖可変領域−カッパ軽鎖定常領域とを有する。ルセンティスのような他の既知の抗VEGF抗体に比べると、バリアント201の可変ドメインは、特にKabat体系またはIMGT(登録商標)体系のどちらかによって画定されるようなCDRに多重変異を含有する(図23および図24)。これらの変異は、バリアント201のVEGFとのさらに強い結合を付与する(図3)。
VEGFに対する合成抗体についての上流のプロセスの情報
KCM法による大腸菌BL21における抗VEGF Fab−201構築物の形質転換
抗VEGF FabのDNA構築物を10μLの1×KCMと混合し、氷上で2〜5分間予冷した後、同じ体積のコンピテント細胞(10uL)を添加した。チューブを氷上で20分間、さらにインキュベーションし、次いで、室温で10分間インキュベーションした。200uLのSuper Optimal Broth with Catabolite Repression(SOC)を添加して、細胞をオービタルシェーカー中、37℃で1時間インキュベーションした。100µLの上記培養物を、適切な抗生物質(カルベニシリン)と共にLBアガープレート上に広げ、プレートを37℃で14時間インキュベーションした。
前接種物の調製:
大腸菌BL21−201の凍結した作業用細胞バンクから得た10μLを、カルベニシリン抗生物質(100mg/mlストックより10μL)を含有する10mLの滅菌LBブロスに接種した。培養物をオービタルシェーカー中、37℃、210rpmで16時間(一晩)インキュベーションした。
表5に記されるような成長および生産用の最小塩培地を調製する。培地のpHを7.0±0.3に調整する。成長および生産培地を121℃、15psiで15分間、オートクレーブにかける。
2.5L発酵槽での発現:
抗VEGF抗体を、3.7L発酵槽で発酵プロセスを用いて大スケールで生産した。
各2.5Lの発酵にすいて、大腸菌BL21−201の20μLの凍結された作業用細胞バンクを、カルベニシリン抗生物質(100mg/mlLストックからの250μL)を含有する250mLの滅菌LBブロスに接種した。培養フラスコをオービタルシェーカー中、37℃、210rpmで16時間(一晩)インキュベーションした。
2.5Lの発酵培養用に最小塩培地を調製した。培地のpHを水酸化アンモニウム(25%)によって7.0±0.3に調整した。最小塩培地を3.7L発酵槽中、121℃、15psiで20分間、滅菌した。
発酵データおよび発現収量を図21に示す。
VEGFに対する合成抗体のための下流のプロセスの情報
細胞ペレットの懸濁液および溶解:
大腸菌細胞ペレットの溶解は、溶解緩衝液[溶解緩衝液−200mMリン酸緩衝液、pH7.4、400mM塩化ナトリウム、10mMフッ化フェニルメタンスルホニル(PMSF)、2mMEDTA、5%スクロース、1%TritonX−100を用いて実施した。約446グラムの湿重量の細胞ペレットを、室温で4.0Lの溶解緩衝液(およそ1:10の比率)に懸濁し、均一な細胞懸濁液を得るまで細胞ペレットを勢いよく混合した。ペレットを−80℃から取り出して室温で溶解を実施したことから、極端な温度差があったために、高い緩衝液強度が塩濃度と相まった結果、細菌の細胞壁上に浸透圧ショックを生じ、それを高度に多孔質化してペリプラズム領域から分子を自由に流出させる。この方法は、タンパク質を遊離するには充分ではなく、高圧ホモジナイザーを用いたさらに別の処理を必要とする。
ホモジネート溶解物を、水浴中65℃で1時間加熱し、次いで、氷上で20分間冷却した。冷却した溶解物を、4℃、17,000gで30分間遠心分離することによって清澄化した。さらに、清澄化した溶解物を、Tangential Flow Filtrationにより10KDaを用いて、初発の溶解物の体積の6倍に濃縮した。
体積20mLのGE Capto LをXK16/20カラムに詰め、0.4M塩化ナトリウムを含む0.2Mリン酸ナトリウム、pH7.4を用いて平衡化した。濃縮した溶解物を流速4mL/分でロードし、平衡化緩衝液で洗浄した。0.2Mグリシン−Cl/2%スクロース、pH2.0を含有する緩衝液を用いてSaksin Fab−201を溶離し、採集した溶離物を1.5M Tris−Cl、pH8.8により直ちに中和した。
capto−Lクロマトグラフィーから得た最初の溶離物を、20mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.3に対し透析し、エンドトキシンおよびHCDNAを除去するために10mLのアニオン交換樹脂GE Qセファロースを用いて仕上げた。精製したfabをフロースルーとして採集した。
Q−セファロースから得たフロースルーを、XK26/20に詰めた15mLのカチオン交換GE SPセファロース樹脂の上にロードした。僅かに伝導度を増加させて樹脂を洗浄し、結合していたFabを含むタンパク質の溶離を、導電率14〜16mS/cmでの勾配溶出によって行った。強固に結合していたタンパク質を、緩衝液を含む1M塩化ナトリウムにより溶出した。原薬を20mM PB、pH5.6に対して透析し、最後に滅菌濾過した(0.22µm)。
製剤化したFAB 201の薬剤としての安定性
原薬Fab201を、滲出型AMDに対する硝子体内注射が容易となるように安定性特性を上げるための製剤化(薬剤製品)に供した。薬剤製品DP_201を、5から10mg/mLの間の濃度域で製剤化した。APIに加えて、製剤は、10mMリン酸緩衝液/40mM NaCl/0.03%ポリソルベート20/5%スクロース溶液をpH5.8で含有する。製剤のモル浸透圧濃度は、およそ276mOsmであり、ヒト硝子体内液と同等である。
ウサギの眼における抗血管形成の長期試験
試験を実施し、Saksin LifesciencesPvt.Ltd.、TICEL Bio−Park Facility、タラマーニー、チェンナイ、インドによって発見された抗VEGF(血管内皮成長因子)Fab(抗原結合断片)タンパク質(被験分子#201)の効能および持続可能性を、VEGF誘導性網膜漏出モデルウサギ(ダッチベルト、3〜4か月齢の雄、体重–1.0〜1.3kg)にて、商業的に入手可能なルセンティスと比較して評価した。試験は、PharmOptima,LLC、ポーテージ、ミシガン州、米国で実施した。何群かのウサギを、0日目に硝子体内投与(IVT)によって、被験分子#201(50μLの製剤緩衝液中に150μg)、ルセンティス(50μLの製剤緩衝液中に150μg)、またはビヒクル(50μL製剤緩衝液)で処置した。次いで、各群由来の動物に、VEGFへの曝露をIVTによって7日目、21日目、または37日目に与え、効能が長期にわたり持続するか否かを決定した。
本研究から、被験分子#201の効能の持続可能性は、VEGF誘導性の網膜漏出モデルウサギにおいて、被験分子#201の投与の3週間後のVEGF曝露の後では、ルセンティスよりも非常に大きかったことを結論とすることができよう。この効能の分子基盤は、図23および図24に示されるように、ルセンティスに比べた際のFab201のCDRの違いに起因するものと考えられる。
Claims (143)
- 以下の超可変領域または相補性決定領域(CDR)アミノ酸配列:アミノ酸31位のヒスチジンからアミノ酸35位のヒスチジン(配列番号1)を含むCDRH1、アミノ酸50位のチロシンからアミノ酸66位のグリシン(配列番号1)を含むCDRH2、およびアミノ酸99位のヒスチジンからアミノ酸109位のチロシン(配列番号1)を含むCDRH3
を含む重鎖可変ドメインを含む、VEGFに特異的に認識し結合する単離された抗VEGF抗体またはその一部分もしくはバリアント。 - 以下の超可変領域または相補性決定領域(CDR)アミノ酸配列:アミノ酸24位のアルギニンからアミノ酸34位のアラニン(配列番号3)を含むCDRL1、アミノ酸50位のリジンからアミノ酸56位のアラニン(配列番号3)を含むCDRL2、およびアミノ酸89位のグルタミンからアミノ酸97位のスレオニン(配列番号3)を含むCDRL3
を含む軽鎖可変ドメインを含む、VEGFに特異的に認識し結合する単離された抗VEGF抗体またはその一部分もしくはバリアント。 - a.以下の図9Cに示されるようなまたは配列番号3に記載されるような超可変領域または相補性決定領域(CDR)アミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および
b.以下の図9Cに示されるようなまたは配列番号1に記載されるような超可変領域または相補性決定領域(CDR)アミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン
を含む、VEGFに特異的に認識し結合する単離されたヒト抗VEGF抗体またはその一部分もしくはバリアント。 - a.図16に示されるような超可変領域または相補性決定領域(CDR)アミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および
b.図16に示されるような超可変領域または相補性決定領域(CDR)アミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン
を含む、VEGFに特異的に認識し結合する単離されたヒト抗VEGF抗体またはその一部分もしくはバリアント。 - 以下のCDRアミノ酸配列:アミノ酸24位のアルギニンからアミノ酸34位のアラニン(配列番号3)を含むCDRL1、アミノ酸50位のリジンからアミノ酸56位のアラニン(配列番号3)を含むCDRL2、およびアミノ酸89位のグルタミンからアミノ酸97位のスレオニン(配列番号3)を含むCDRL3
を含む軽鎖可変ドメインをさらに含む、請求項1に記載の抗VEGF抗体またはその一部分。 - a.図16に太字で示されるIMGTナンバリングに従って画定される以下のCDRアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン:アミノ酸配列GFDLDHYSを含むCDRH1、アミノ酸配列IYPSYGYTを含むCDRH2、およびアミノ酸配列ARHAWYYGWGLDYを含むCDRH3と;
b.図16に太字で示されるIMGTナンバリングに従って画定される以下のCDRアミノ酸配列:アミノ酸配列QAAYGRを含むCDRL1、アミノ酸配列KASを含むCDRL2、およびアミノ酸配列QQRGWYLFTを含むCDRL3を含む軽鎖可変ドメインと
を含む、VEGFに特異的に認識し結合する単離されたヒト抗VEGF抗体またはその一部分もしくはバリアント。 - a)以下の超可変領域または相補性決定領域(CDR)アミノ酸配列:アミノ酸24位のアルギニンからアミノ酸34位のアラニン(配列番号3)を含むCDRL1またはその一部分、アミノ酸50位のリジンからアミノ酸56位のアラニン(配列番号3)を含むCDRL2またはその一部分、およびアミノ酸89位のグルタミンからアミノ酸97位のスレオニン(配列番号3)を含むCDRL3またはその一部分
を有する軽鎖可変ドメインと;
b)以下の超可変領域または相補性決定領域(CDR)アミノ酸配列:アミノ酸31位のヒスチジンからアミノ酸35位のヒスチジン(配列番号1)を含むCDRH1またはその一部分、アミノ酸50位のチロシンからアミノ酸66位のグリシン(配列番号1)を含むCDRH2またはその一部分、およびアミノ酸99位のヒスチジンからアミノ酸109位のチロシン(配列番号1)を含むCDRH3またはその一部分
を有する重鎖可変ドメインと
を含む、VEGFに特異的に認識し結合する合成のヒト抗VEGF抗体またはその一部分もしくはバリアント。 - c)以下のフレームワーク領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン:FRL1またはその一部分、FRL2またはその一部分、FRL3またはその一部分、およびFRL4またはその一部分と;
d)以下のフレームワーク領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン:FRH1またはその一部分、FRH2またはその一部分、FRH3またはその一部分、およびFRH4またはその一部分と
をさらに含む、請求項6に記載の抗VEGF抗体またはその一部分もしくはバリアント。 - アミノ酸1位のグルタミン酸からアミノ酸30位のフェニルアラニン(配列番号1)を含む重鎖フレームワーク領域(FR)1であるFRH1のアミノ配列をさらに含む、請求項1または7に記載の抗VEGF抗体。
- アミノ酸36位のトリプトファンからアミノ酸49位のアラニン(配列番号1)を含む重鎖フレームワーク領域(FR)2であるFRH2のアミノ配列をさらに含む、請求項1または7に記載の抗VEGF抗体。
- アミノ酸67位のアルギニンからアミノ酸98位のアルギニン(配列番号1)を含む重鎖フレームワーク領域(FR)3であるFRH3のアミノ配列をさらに含む、請求項1または7に記載の抗VEGF抗体。
- アミノ酸110位のトリプトファンからアミノ酸120位のセリン(配列番号1)を含む重鎖フレームワーク領域(FR)4であるFRH4のアミノ配列をさらに含む、請求項1または7に記載の抗VEGF抗体。
- 以下の重鎖フレームワーク領域(FR)のアミノ酸配列:アミノ酸1位のグルタミン酸からアミノ酸30位のフェニルアラニン(配列番号1)を含むFRH1、アミノ酸36位のトリプトファンからアミノ酸49位のアラニン(配列番号1)を含むFRH2、アミノ酸67位のアルギニンからアミノ酸98位のアルギニン(配列番号1)を含むFRH3、およびアミノ酸110位のトリプトファンからアミノ酸120位のセリン(配列番号1)を含むFRH4
をさらに含む、請求項1または7に記載の抗VEGF抗体。 - アミノ酸1位のアスパラギン酸toアミノ酸23位のシステイン(配列番号3)を含む軽鎖フレームワーク領域(FR)1であるFRL1のアミノ配列をさらに含む、請求項2または7に記載の抗VEGF抗体。
- アミノ酸35位のトリプトファンからアミノ酸49位のチロシン(配列番号3)を含む軽鎖フレームワーク領域(FR)2であるFRL2のアミノ配列をさらに含む、請求項2または7に記載の抗VEGF抗体。
- アミノ酸57位のグリシンからアミノ酸88位のシステイン(配列番号3)を含む軽鎖フレームワーク領域(FR)3であるFRL3のアミノ配列をさらに含む、請求項2または7に記載の抗VEGF抗体。
- アミノ酸98位のフェニルアラニンからアミノ酸107位のリジン(配列番号3)を含む軽鎖フレームワーク領域(FR)4であるFRL4のアミノ配列をさらに含む、請求項2または7に記載の抗VEGF抗体。
- 以下の軽鎖フレームワーク領域(FR)アミノ酸配列:アミノ酸1位のアスパラギン酸からアミノ酸23位のシステイン(配列番号3)を含むFRL1、アミノ酸35位のトリプトファンからアミノ酸49位のチロシン(配列番号3)を含むFRL2、アミノ酸57位のグリシンからアミノ酸88位のシステイン(配列番号3)を含むFRL3、およびアミノ酸98位のフェニルアラニンからアミノ酸107位のリジン(配列番号3)を含むFRL4
をさらに含む、請求項2または7に記載の抗VEGF抗体。 - c)以下のフレームワーク領域のアミノ酸配列:アミノ酸1位のアスパラギン酸からアミノ酸23位のシステイン(配列番号3)を含むFRL1またはその一部分、アミノ酸35位のトリプトファンからアミノ酸49位のチロシン(配列番号3)を含むFRL2またはその一部分、アミノ酸57位のグリシンからアミノ酸88位のシステイン(配列番号3)を含むFRL3またはその一部分、およびアミノ酸98位のフェニルアラニンからアミノ酸107位のリジン(配列番号3)を含むFRL4またはその一部分
を有する軽鎖可変ドメインと;
d)以下のフレームワーク領域のアミノ酸配列:アミノ酸1位のグルタミン酸からアミノ酸30位のフェニルアラニン(配列番号1)を含むFRH1またはその一部分、アミノ酸36位のトリプトファンからアミノ酸49位のアラニン(配列番号1)を含むFRH2またはその一部分、アミノ酸67位のアルギニンからアミノ酸98位のアルギニン(配列番号1)を含むFRH3またはその一部分、およびアミノ酸110位のトリプトファンからアミノ酸120位のセリン(配列番号1)を含むFRH4またはその一部分
を有する重鎖可変ドメインと
をさらに含む、請求項7に記載の抗VEGF抗体またはその一部分もしくはバリアント。 - 完全長抗体である、請求項1、2、3、4、5、6、または7に記載の抗VEGF抗体。
- 前記完全長抗体が、配列番号3に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖と配列番号1に示される重鎖、アミノ酸24位のアスパラギン酸からアミノ酸237位のシステイン(配列番号17)を含む軽鎖とアミノ酸24位のグルタミン酸からアミノ酸251位のスレオニン(配列番号18)を含む重鎖、またはアミノ酸24位のアスパラギン酸からアミノ酸237位のシステイン(配列番号76)を含む軽鎖とアミノ酸24位のグルタミン酸からアミノ酸251位のスレオニン(配列番号78)を含む重鎖を含む、請求項20に記載の抗VEGF抗体。
- ヒトIgGまたはヒト化IgGである、請求項1、2、3、4、5、6、または7に記載の抗VEGF抗体。
- 前記抗体の一部分が抗体断片である、請求項1、2、3、4、5、6、または7に記載の抗VEGF抗体。
- 前記抗体断片がFabである、請求項23に記載の抗VEGF抗体。
- 前記Fabが、配列番号3の1位のアスパラギン酸で始まり107位のリジンで終わるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインと、配列番号1の1位のグルタミン酸で始まり120位のセリンで終わるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインとを含む、請求項24に記載の抗VEGF抗体。
- 前記FabがFc領域に接合されている、請求項25に記載の抗VEGF抗体。
- Fc領域に接合されている前記Fabが、配列番号5に示されるアミノ酸またはその一部分を含む、請求項26に記載の抗VEGF抗体。
- 前記抗体断片がF(ab’)2である、請求項23に記載の抗VEGF抗体。
- 前記バリアントがscFvである、請求項1、2、3、4、6、または7に記載の抗VEGF抗体。
- 前記scFvが、配列番号9の241位のアスパラギン酸で始まり483位のセリンで終わるアミノ酸配列を含む、請求項29に記載の抗VEGF抗体。
- 前記scFvがFc領域に接合されている、請求項30に記載の抗VEGF抗体。
- Fc領域に接合されている前記scFvが、配列番号9に示されるアミノ酸またはその一部分を含む、請求項31に記載の抗VEGF抗体。
- 前記抗体断片がFvである、請求項23に記載の抗VEGF抗体。
- 前記抗体のバリアントが、請求項1、2、3、4、6、または7に記載の抗体の抗原結合領域を含む、VEGFを認識し結合する組換えタンパク質である、請求項1、2、3、4、6、または7に記載の抗VEGF抗体。
- 前記組換えタンパク質が、CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2、またはCDRL3のアミノ酸配列に対する変更を含む、請求項1、2、3、4、6、または7に記載の抗VEGF抗体。
- 前記変更が、アミノ酸(複数可)の挿入または欠失である、請求項35に記載の抗VEGF抗体。
- 前記挿入または欠失が、10アミノ酸以下である、請求項36に記載の抗VEGF抗体。
- 前記変更がアミノ酸置換である、請求項35に記載の抗VEGF抗体。
- 前記アミノ酸置換が、3アミノ酸以下に影響を及ぼす、請求項38に記載の抗VEGF抗体。
- 前記アミノ酸置換が、保存されたアミノ酸置換である、請求項38に記載の抗VEGF抗体。
- 前記変更が、VEGFまたはその一部分への前記抗体の結合を阻害しない、請求項35に記載の抗VEGF抗体。
- 前記抗体のバリアントが、FRH1、FRH2、FRH3、FRH4、FRL1、FRL2、FRL3、またはFRL4のアミノ酸配列に対する変更を有する抗体である、請求項9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、または19に記載の抗VEGF抗体。
- 前記変更が、アミノ酸(複数可)の挿入または欠失である、請求項42に記載の抗VEGF抗体。
- 前記変更がアミノ酸置換である、請求項42に記載の抗VEGF抗体。
- 前記アミノ酸置換が、保存されたアミノ酸置換である、請求項44に記載の抗VEGF抗体。
- 前記変更が、VEGFまたはその一部分への前記抗体の結合を阻害しない、請求項42に記載の抗VEGF抗体。
- 請求項1、2、3、4、6、または7に記載の抗体のFab断片、Fab’断片、F(ab’)2断片、scFv断片、またはFv断片。
- 前記抗体またはその一部分もしくはバリアントが、約50nMを超えないK(d)値でヒトVEGFに結合する、請求項1、2、3、4、6、または7に記載の抗VEGF抗体。
- 前記抗体またはその一部分もしくはバリアントが、in vitroで内皮細胞のVEGF誘導性増殖を阻害するための約200pMを超えないEC50値を有する、請求項1、2、3、4、5、6、または7に記載の抗VEGF抗体。
- 2つの異なる抗原への結合特異性を有し、前記抗原のうち1つは、請求項1、2、3、4、5、6、または7に記載の抗体が結合または競合するものである、二重特異性抗体。
- 前記抗体が、請求項1のCDRH1もしくはその一部分、請求項1のCDRH2もしくはその一部分、請求項1のCDRH3もしくはその一部分、請求項2のCDRL1もしくはその一部分、請求項2のCDRL2もしくはその一部分、または請求項2のCDRL3もしくはその一部分、またはそれらの組合せのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を含む、請求項50に記載の二重特異性抗体。
- 前記抗体が、Fc領域をさらに含む、請求項51に記載の二重特異性抗体。
- モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、合成抗体、単鎖抗体、またはそれらの抗原結合断片である、請求項1、2、3、4、5、6、または7に記載の抗VEGF抗体。
- 前記一部分が、Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv、およびF(v)からなる群から選択される請求項1、2、または7に記載の抗体の抗原結合断片である、請求項1、2、3、4、6、または7に記載の抗VEGF抗体。
- Kabat法によって画定される各CDRおよび/または各FRのアミノ酸配列が、IMGT法によって画定されるCDRまたはFRの対応のアミノ酸配列に置換され、前記置換が、以下:
a)アミノ酸31位のヒスチジンからアミノ酸35位のヒスチジン(配列番号1)を含むKabat定義によるCDRH1が、アミノ酸26位のグリシン(配列番号1)からアミノ酸33位のセリン(配列番号1)を含むIMGT定義によるCDRH1に置き換えられている;
b)アミノ酸50位のチロシンからアミノ酸66位のグリシン(配列番号1)を含むKabat定義によるCDRH2が、アミノ酸51位のイソロイシン(配列番号1)からアミノ酸58位のスレオニン(配列番号1)を含むIMGT定義によるCDRH2に置き換えられている;
c)アミノ酸99位のヒスチジンからアミノ酸109位のチロシン(配列番号1)を含むKabat定義によるCDRH3が、アミノ酸97位のアラニンからアミノ酸109位のチロシン(配列番号1)を含むIMGT定義によるCDRH3に置き換えられている;
d)アミノ酸24位のアルギニンからアミノ酸34位のアラニン(配列番号3)を含むKabat定義によるCDRL1が、アミノ酸27位のグルタミンからアミノ酸32位のアルギニン(配列番号3)を含むIMGT定義によるCDRL1に置き換えられている;
e)アミノ酸50位のリジンからアミノ酸56位のアラニン(配列番号3)を含むKabat定義によるCDRL2が、アミノ酸50位のリジンからアミノ酸52位のセリン(配列番号3)を含むIMGT定義によるCDRL2に置き換えられている;
f)アミノ酸89位のグルタミンからアミノ酸97位のスレオニン(配列番号3)を含むKabat定義によるCDRL3が、アミノ酸89位のグルタミンからアミノ酸97位のスレオニン(配列番号3)を含むIMGT定義によるCDRL3に置き換えられている;
g)アミノ酸1位のグルタミン酸からアミノ酸30位のフェニルアラニン(配列番号1)を含むKabat定義によるFRH1が、アミノ酸1位のグルタミン酸からアミノ酸25位のセリン(配列番号1)を含むIMGT定義によるFRH1に置き換えられている;
h)アミノ酸36位のトリプトファンからアミノ酸49位のアラニン(配列番号1)を含むKabat定義によるFRH2が、アミノ酸34位のイソロイシンからアミノ酸50位のチロシン(配列番号1)を含むIMGT定義によるFRH2に置き換えられている;
i)アミノ酸67位のアルギニンからアミノ酸98位のアルギニン(配列番号1)を含むKabat定義によるFRH3が、アミノ酸59位のチロシンからアミノ酸96位のシステイン(配列番号1)を含むIMGT定義によるFRH3に置き換えられている;
j)アミノ酸110位のトリプトファンからアミノ酸120位のセリン(配列番号1)を含むKabat定義によるFRH4が、アミノ酸110位のトリプトファンからアミノ酸120位のセリン(配列番号1)を含むIMGT定義によるFRH4に置き換えられている;
k)アミノ酸1位のアスパラギン酸からアミノ酸23位のシステイン(配列番号3)を含むKabat定義によるFRL1が、アミノ酸1位のアスパラギン酸からアミノ酸26位のセリン(配列番号3)を含むIMGT定義によるFRL1に置き換えられている;
l)アミノ酸35位のトリプトファンからアミノ酸49位のチロシン(配列番号3)を含むKabat定義によるFRL2が、アミノ酸33位のバリンからアミノ酸49位のチロシン(配列番号3)を含むIMGT定義によるFRL2置き換えられている;
m)アミノ酸57位のグリシンからアミノ酸88位のシステイン(配列番号3)を含むKabat定義によるFRL3が、アミノ酸53位のグルタミン酸からアミノ酸88位のシステイン(配列番号3)を含むIMGT定義によるFRL3に置き換えられている;および
n)アミノ酸98位のフェニルアラニンからアミノ酸107位のリジン(配列番号3)を含むKabat定義によるFRL4が、アミノ酸98位のフェニルアラニンからアミノ酸107位のリジン(配列番号3)を含むIMGT定義によるFRL4に置き換えられている
のうちのいずれかである、請求項1、2、3、4、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、または19に記載の抗体。 - Kabat法によって画定される各CDRおよび/または各FRのアミノ酸配列が、IMGT法によって画定されるCDRまたはFRの対応のアミノ酸配列に置換され、前記置換が、以下:
a)アミノ酸31位のヒスチジンからアミノ酸35位のヒスチジン(配列番号78)を含むKabat定義によるCDRH1が、アミノ酸26位のグリシン(配列番号78)からアミノ酸33位のセリン(配列番号78)を含むIMGT定義によるCDRH1に置き換えられている;
b)アミノ酸50位のチロシンからアミノ酸66位のグリシン(配列番号78)を含むKabat定義によるCDRH2が、アミノ酸51位のイソロイシン(配列番号78)からアミノ酸58位のスレオニン(配列番号78)を含むIMGT定義によるCDRH2に置き換えられている;
c)アミノ酸99位のヒスチジンからアミノ酸109位のチロシン(配列番号78)を含むKabat定義によるCDRH3が、Kabat定義によるアミノ酸97位のアラニンからアミノ酸109位のチロシン(配列番号78)を含むKabat定義によるCDRH3に置き換えられている;
d)アミノ酸24位のアルギニンからアミノ酸34位のアラニン(配列番号76)を含むKabat定義によるCDRL1が、アミノ酸27位のグルタミンからアミノ酸32位のアルギニン(配列番号76)を含むIMGT定義によるCDRL1に置き換えられている;
e)アミノ酸50位のリジンからアミノ酸56位のアラニンを含むKabat定義によるCDRL2(配列番号76)が、アミノ酸50位のリジンからアミノ酸52位のセリン(配列番号76)を含むIMGT定義によるCDRL2に置き換えられている;
f)アミノ酸89位のグルタミンからアミノ酸97位のスレオニンを含むKabat定義によるCDRL3(配列番号76)が、アミノ酸89位のグルタミンからアミノ酸97位のスレオニン(配列番号76)を含むIMGT定義によるCDRL3に置き換えられている;
g)アミノ酸1位のグルタミン酸からアミノ酸30位のフェニルアラニン(配列番号78)を含むKabat定義によるFRH1が、アミノ酸1位のグルタミン酸からアミノ酸25位のセリン(配列番号78)を含むIMGT定義によるFRH1に置き換えられている;
h)アミノ酸36位のトリプトファンからアミノ酸49位のアラニン(配列番号78)を含むKabat定義によるFRH2が、アミノ酸34位のイソロイシンからアミノ酸50位のチロシン(配列番号78)を含むIMGT定義によるFRH2に置き換えられている;
i)アミノ酸67位のアルギニンからアミノ酸98位のアルギニン(配列番号78)を含むKabat定義によるFRH3が、アミノ酸59位のチロシンからアミノ酸96位のシステイン(配列番号78)を含むIMGT定義によるFRH3に置き換えられている;
j)アミノ酸110位のトリプトファンからアミノ酸120位のセリン(配列番号78)を含むKabat定義によるFRH4が、アミノ酸110位のトリプトファンからアミノ酸120位のセリン(配列番号78)を含むIMGT定義によるFRH4に置き換えられている;
k)アミノ酸1位のアスパラギン酸からアミノ酸23位のシステイン(配列番号76)を含むKabat定義によるFRL1が、アミノ酸1位のアスパラギン酸からアミノ酸26位のセリン(配列番号76)を含むIMGT定義によるFRL1に置き換えられている;
l)アミノ酸35位のトリプトファンからアミノ酸49位のチロシン(配列番号76)を含むKabat定義によるFRL2が、アミノ酸33位のバリンからアミノ酸49位のチロシン(配列番号76)を含むIMGT定義によるFRL2に置き換えられている;
m)アミノ酸57位のグリシンからアミノ酸88位のシステイン(配列番号76)を含むKabat定義によるFRL3が、アミノ酸53位のグルタミン酸からアミノ酸88位のシステイン(配列番号76)を含むIMGT定義によるFRL3に置き換えられている;および
n)アミノ酸98位のフェニルアラニンからアミノ酸107位のリジン(配列番号76)を含むKabat定義によるFRL4が、アミノ酸98位のフェニルアラニンからアミノ酸107位のリジン(配列番号76)を含むIMGT定義によるFRL4に置き換えられている
のうちのいずれかである、請求項1、2、3、4、6、7、8、9、100、11、12、13、14、15、16、17、18、または19に記載の抗体。 - 治療剤に接合されている請求項1、2、3、4、6、または7に記載の抗VEGF抗体またはその一部分もしくはバリアントを含む、イムノコンジュゲート。
- 前記治療剤は、リシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、エチジウム、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラキノン、アクチノマイシンD、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素(PE)A、PE40、リシン、アブリン、グルココルチコイド、および放射性同位体からなる群から選択される細胞毒性剤である、請求項57に記載のイムノコンジュゲート。
- 前記抗体の一部分が、scFv断片、Fv断片、Fab断片、Fab’断片、およびF(ab’)2断片からなる群から選択される、請求項56に記載のイムノコンジュゲート。
- 請求項1、2、3、4、6、または7に記載の抗VEGF抗体および医薬的に許容可能な担体を含む組成物。
- 請求項60に記載のイムノコンジュゲートおよび医薬的に許容可能な担体を含む組成物。
- 請求項1、2、3、4、6、または7に記載の抗体をコードする単離された核酸。
- 請求項62に記載の核酸を含むベクター。
- 請求項63に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項64に記載の宿主細胞を培養し、その結果前記核酸が発現して抗体を生産することを含む、抗VEGF抗体を生産するプロセス。
- 前記宿主細胞の培養物から前記抗VEGF抗体を回収することをさらに含む、請求項65に記載のプロセス。
- ヒトVEGFに結合する特異的な結合部の免疫グロブリン重鎖またはその一部分、免疫グロブリン軽鎖またはその一部分、または両方をコードする、単離された核酸であって、前記特異的な結合部が、抗体の抗原結合部分を含み、
a)前記抗体の抗原結合部分の免疫グロブリン重鎖またはその一部分は、91位のシトシンで始まり105位のシトシンで終わる(配列番号1)核酸配列を含む免疫グロブリン重鎖CDRH1またはその一部分、148位のチミンで始まり198位のシトシンで終わる(配列番号1)核酸配列を含む重鎖CDRH2またはその一部分、および295位のシトシンで始まり327位のシトシンで終わる(配列番号1)核酸配列を含む重鎖CDRH3またはその一部分を含む;ならびに/または
b)前記抗体の抗原結合部分の免疫グロブリン軽鎖またはその一部分は、70位のシトシンで始まり102位のシトシンで終わる(配列番号3)核酸配列を含む軽鎖CDRL1またはその一部分、148位のアデニンで始まり168位のシトシンまでの(配列番号3)核酸配列を含む軽鎖CDRL2またはその一部分、および265位のシトシンで始まり291位のグアニンで終わる(配列番号3)核酸配列を含む軽鎖CDRL3またはその一部分を含む、
単離された核酸。 - 図16に示される軽鎖核酸配列および図16に示される重鎖核酸配列を含む、請求項4に記載のFab抗体をコードする単離された核酸。
- (a)または(b)に示されるような核酸配列のいずれかが、同じアミノ酸配列をコードする等価の核酸配列に置き換えられることがある、請求項67に記載の単離された核酸。
- 前記抗体が、ヒト定常領域またはヒト化定常領域をさらに含む、請求項69に記載の単離された核酸。
- 前記ヒト定常領域またはヒト化定常領域が、IgG1定常領域である、請求項70に記載の単離された核酸。
- 前記ヒト定常領域またはヒト化定常領域が、IgG4定常領域である、請求項70に記載の単離された核酸。
- 前記特異的な結合部が、配列番号9に示されるような721位のグアニンで始まり1449位のチミンまでの核酸配列を含む単鎖Fv分子またはその一部分である、請求項67に記載の単離された核酸。
- 前記特異的な結合部が、配列番号1および3に示されるような核酸配列を含むFabまたはその一部分(複数可)である、請求項67に記載の単離された核酸。
- 前記特異的な結合部が、配列番号16に示されるような70位のグアニンで始まり711位のチミンまでの核酸配列、および配列番号16の897位のグアニンで始まり1580位のアデニンまでの核酸配列を含む、Fabまたはその一部分(複数可)である、請求項67に記載の単離された核酸。
- 前記特異的な結合部が、配列番号16に示されるような1位のアデニンで始まり711位のチミンまでの核酸配列、および配列番号16の828位のアデニンで始まり1580位のアデニンまでの核酸配列を含む、Fabまたはその一部分(複数可)である、請求項67に記載の単離された核酸。
- 前記特異的な結合部が、配列番号16に示される核酸配列を含むFabまたはその一部分である、請求項67に記載の単離された核酸。
- 前記抗体の抗原結合部分の免疫グロブリン重鎖またはその一部分が、アミノ酸1位のグルタミン酸からアミノ酸30位のフェニルアラニン(配列番号1)のアミノ酸配列をコードする1位のグアニンで始まり90位のチミンで終わる(配列番号1)核酸配列を含む、免疫グロブリン重鎖フレームワーク領域(FR)1であるFRH1をさらに含む、請求項67に記載の単離された核酸。
- 前記抗体の抗原結合部分の免疫グロブリン重鎖またはその一部分が、アミノ酸36位のトリプトファンからアミノ酸49位のアラニン(配列番号1)のアミノ酸配列をコードする106位のチミンで始まり147位のアデニンで終わる(配列番号1)核酸配列を含む、免疫グロブリン重鎖フレームワーク領域(FR)2であるFRH2をさらに含む、請求項67に記載の単離された核酸。
- 前記抗体の抗原結合部分の免疫グロブリン重鎖またはその一部分が、アミノ酸67位のアルギニンからアミノ酸98位のアルギニン(配列番号1)のアミノ酸配列をコードする199位のシトシンで始まり294位のシトシンで終わる(配列番号1)核酸配列を含む、免疫グロブリン重鎖フレームワーク領域3であるFRH3をさらに含む、請求項67に記載の単離された核酸。
- 前記抗体の抗原結合部分の免疫グロブリン重鎖またはその一部分が、アミノ酸110位のトリプトファンからアミノ酸120位のセリン(配列番号1)のアミノ酸配列をコードする328位のチミンで始まり360位のグアニンで終わる(配列番号1)核酸配列を含む、免疫グロブリン重鎖フレームワーク領域4であるFRH4をさらに含む、請求項67に記載の単離された核酸。
- 前記抗体の抗原結合部分の免疫グロブリン重鎖またはその一部分が、アミノ酸1位のグルタミン酸からアミノ酸30位のフェニルアラニン(配列番号1)のアミノ酸配列をコードする1位のグアニンで始まり90位のチミンで終わる(配列番号1)核酸配列を含む重鎖フレームワーク領域FRH1、アミノ酸36位のトリプトファンからアミノ酸49位のアラニン(配列番号1)のアミノ酸配列をコードする106位のチミンで始まり147位のアデニンで終わる(配列番号1)核酸配列を含む重鎖フレームワーク領域FRH2、アミノ酸67位のアルギニンからアミノ酸98位のアルギニン(配列番号1)のアミノ酸配列をコードする199位のシトシンで始まり294位のシトシンで終わる(配列番号1)核酸配列を含む重鎖フレームワーク領域FRH3、およびアミノ酸110位のトリプトファンからアミノ酸120位のセリン(配列番号1)のアミノ酸配列をコードする328位のチミンで始まり360位のグアニンで終わる(配列番号1)核酸配列を含む重鎖フレームワーク領域FRH4をさらに含み、前記重鎖フレームワーク領域FRH1からFRH4および前記重鎖相補性決定領域CDRH1からCDRH3をコードする核酸配列が、FRH1−CDRH1−FRH2−CDRH2−FRH3−CDRH3−FRH4の順番で接合されている、請求項67に記載の単離された核酸。
- 前記抗体の重鎖が、アミノ酸1位のグルタミン酸からアミノ酸120位のセリン(配列番号1)のアミノ酸配列をコードする1位のグアニンで始まり360位のグアニンで終わる(配列番号1)重鎖可変領域の核酸配列を含む、請求項82に記載の単離された核酸。
- 前記抗体の抗原結合部分の免疫グロブリン軽鎖またはその一部分が、アミノ酸1位のアスパラギン酸からアミノ酸23位のシステイン(配列番号3)のアミノ酸配列をコードする1位のグアニンで始まり69位のシトシンで終わる(配列番号3)核酸配列を含む、免疫グロブリン軽鎖フレームワーク領域1であるFRL1をさらに含む、請求項67に記載の単離された核酸。
- 前記抗体の抗原結合部分の免疫グロブリン軽鎖またはその一部分が、アミノ酸35位のトリプトファンからアミノ酸49位のチロシン(配列番号3)のアミノ酸配列をコードする103位のチミンで始まり147位のシトシンで終わる(配列番号3)核酸配列を含む、免疫グロブリン軽鎖フレームワーク領域2であるFRL2をさらに含む、請求項67に記載の単離された核酸。
- 前記抗体の抗原結合部分の免疫グロブリン軽鎖またはその一部分が、アミノ酸57位のグリシンからアミノ酸88位のシステイン(配列番号3)のアミノ酸配列をコードする169位のグアニンで始まり264位のチミンで終わる(配列番号3)核酸配列を含む、免疫グロブリン軽鎖フレームワーク領域3であるFRL3をさらに含む、請求項67に記載の単離された核酸。
- 前記抗体の抗原結合部分の免疫グロブリン軽鎖またはその一部分が、アミノ酸98位のフェニルアラニンからアミノ酸107位のリジン(配列番号3)のアミノ酸配列をコードする292位のチミンで始まり321位のアデニンで終わる(配列番号3)核酸配列を含む、免疫グロブリン軽鎖フレームワーク領域4であるFRL4をさらに含む、請求項67に記載の単離された核酸。
- 前記抗体の抗原結合部分の免疫グロブリン軽鎖またはその一部分が、アミノ酸1位のアスパラギン酸からアミノ酸23位のシステイン(配列番号3)のアミノ酸配列をコードする1位のグアニンで始まり69位のシトシンで終わる(配列番号3)核酸配列を含む軽鎖フレームワーク領域FRL1、アミノ酸35位のトリプトファンからアミノ酸49位のチロシン(配列番号3)のアミノ酸配列をコードする103位のチミンで始まり147位のシトシンで終わる(配列番号3)核酸配列を含む軽鎖フレームワークFRL2、アミノ酸57位のグリシンからアミノ酸88位のシステイン(配列番号3)のアミノ酸配列をコードする169位のグアニンで始まり264位のチミンで終わる(配列番号3)核酸配列を含む軽鎖フレームワークFRL3、アミノ酸98位のフェニルアラニンからアミノ酸107位のリジン(配列番号3)のアミノ酸配列をコードする292位のチミンで始まり321位のアデニンで終わる(配列番号3)核酸配列を含む軽鎖フレームワークFRL4をさらに含み、前記軽鎖フレームワーク領域FRL1からFRL4および前記軽鎖相補性決定領域CDRL1からCDRL3をコードする核酸配列が、FRL1−CDRL1−FRL2−CDRL2−FRL3−CDRL3−FRL4の順番で接合されている、請求項67に記載の単離された核酸。
- 前記抗体の軽鎖が、アミノ酸1位のアスパラギン酸からアミノ酸107位のリジン(配列番号3)のアミノ酸配列をコード摺る1位のグアニンで始まり321位のアデニンで終わる(配列番号3)軽鎖可変領域の核酸配列を含む、請求項88に記載の単離された核酸。
- 前記単離された核酸が、1つまたは複数のサイレント変異を有する、請求項67、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、または89に記載の単離された核酸。
- 前記単離された核酸が、インフレームの欠失または挿入を有し、前記欠失または挿入が、3の倍数個の塩基または塩基対として起こる、請求項67、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、または89に記載の単離された核酸。
- 前記インフレームの欠失または挿入が、相補性決定領域(CDR)で起こり、30個以下の塩基または塩基対の長さである、請求項91に記載の単離された単離された核酸。
- 前記インフレームの欠失または挿入が、相補性決定領域(CDR)で起こり、15個以下の塩基または塩基対の長さである、請求項91に記載の単離された単離された核酸。
- 前記インフレームの欠失または挿入が、相補性決定領域(CDR)配列で起こり、6個の塩基または塩基対の長さである、請求項91に記載の単離された単離された核酸。
- 前記インフレームの欠失または挿入が、相補性決定領域(CDR)配列で起こり、3個の塩基または塩基対の長さ.である、請求項91に記載の単離された単離された核酸。
- 前記単離された核酸が、フレームワーク配列に3の倍数個の塩基のインフレームの欠失または挿入を有する、請求項67、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、または89に記載の単離された単離された核酸。
- 前記インフレームの欠失または挿入が、30個以下の塩基または塩基対の長さである、請求項96に記載の単離された核酸。
- 前記単離された核酸が、1つまたは複数のミスセンス変異を有する、請求項67、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、または891に記載の単離された核酸。
- 前記ミスセンス変異(複数可)が、CDR配列の最大3個のアミノ酸を変更している前記CDR配列で起こる、請求項98に記載の単離された核酸。
- 前記特異的な結合部が抗体であり、前記抗体の重鎖が、アミノ酸1位のグルタミン酸からアミノ酸120位のセリンまで(配列番号1)のFF03046−2のVHドメインと、アミノ酸121位のアラニンからアミノ酸218位のバリンまで(配列番号1)のヒトIgG1定常領域のCH1ドメインとを含み、前記抗体の軽鎖が、アミノ酸1位のアスパラギン酸からアミノ酸107位のリジンまで(配列番号3)のFF03046−2のVLドメインと、アミノ酸108位のアルギニンからアミノ酸214位のシステインまで(配列番号3)のヒトカッパ軽鎖定常領域を含む、請求項67に記載の単離された核酸。
- 前記特異的な結合部が抗体であり、前記抗体の重鎖が、アミノ酸1位のグルタミン酸からアミノ酸120位のセリン(配列番号1)までのFF03046−2のVHドメインと、アミノ酸121位のアラニンからアミノ酸218位のバリンまで(配列番号1)のヒトIgG1定常領域のCH1ドメインと、アミノ酸219位のグルタミン酸からアミノ酸228位のスレオニンまで(配列番号1)のヒトIgG1定常領域のヒンジ領域の一部分とを含み、前記抗体の軽鎖が、アミノ酸1位のアスパラギン酸からアミノ酸107位のリジンまで(配列番号3)のFF03046−2のVLドメインと、アミノ酸108位のアルギニンからアミノ酸214位のシステインまで(配列番号3)のヒトカッパ軽鎖定常領域とを含む、請求項67に記載の単離された核酸。
- 前記特異的な結合部が抗体であり、前記抗体の重鎖が、アミノ酸261位のグルタミン酸からアミノ酸380位のセリンまで(配列番号16)のFF03046−2のVHドメインと、アミノ酸381位のアラニンからアミノ酸478位のバリンまで(配列番号16)のヒトIgG1定常領域のCH1ドメインとを含み、抗体の軽鎖は、アミノ酸24位のアスパラギン酸からアミノ酸130位のリジンまで(配列番号16)のFF03046−2のVLドメインと、アミノ酸131位のアルギニンからアミノ酸237位のシステインまで(配列番号16)のヒトカッパ軽鎖定常領域とを含む、請求項67に記載の単離された核酸。
- 前記特異的な結合部が抗体であり、前記抗体の重鎖が、アミノ酸261位のグルタミン酸からアミノ酸380位のセリンまで(配列番号16)のFF03046−2のVHドメインと、アミノ酸381位のアラニンからアミノ酸478位のバリンまで(配列番号16)のヒトIgG1定常領域のCH1ドメインと、アミノ酸479位のグルタミン酸からアミノ酸488位のスレオニンまで(配列番号16)のヒトIgG1定常領域のヒンジ領域の一部分とを含み、前記抗体の軽鎖が、アミノ酸24位のアスパラギン酸からアミノ酸130位のリジンまで(配列番号16)のFF03046−2のVLドメインと、アミノ酸131位のアルギニンからアミノ酸237位のシステインまで(配列番号16)のヒトカッパ軽鎖定常領域とを含む、請求項67に記載の単離された核酸。
- 配列番号16に示されるような請求項102または103に記載の単離された核酸。
- 前記核酸が、恒常的プロモーターの制御下で発現される、請求項104に記載の単離された核酸。
- 前記核酸が、調節性プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下で発現される、請求項104に記載の単離された核酸。
- 調節性プロモーターまたは誘導性プロモーターが、phoAプロモーターである、請求項106に記載の単離された核酸。
- 前記phoAプロモーターが、配列番号15に記載の核酸配列またはその一部分を含む、請求項107に記載の単離された核酸。
- 前記核酸の転写の終結が、転写ターミネーターの制御下にある、請求項104に記載の単離された核酸。
- 前記転写ターミネーターが、リボソームRNA遺伝子ターミネーターである、請求項109に記載の単離された核酸。
- 前記リボソームRNA遺伝子ターミネーターが、配列番号19に示されるような核酸配列またはその一部分を含む、請求項110に記載の単離された核酸。
- 前記核酸がベクターである、請求項104に記載の単離された核酸。
- 前記ベクターが、colE1複製起点を含む、請求項112に記載の単離された核酸。
- 前記ベクターが、選択マーカーまたはスクリーニングマーカーを含む、請求項113に記載の単離された核酸。
- 前記選択マーカーまたはスクリーニングマーカーが、薬剤選択マーカー、蛍光タンパク質、細胞表面マーカー、酵素、発光タンパク質、代謝マーカー、成長因子、および耐性因子からなる群から選択される、請求項114に記載の単離された核酸。
- 前記ベクターが、配列番号20に示されるようなテトラサイクリン耐性遺伝子を欠失したpBR322である、請求項112に記載の単離された核酸。
- 前記抗体が、BSAまたはFcに結合しない、請求項67に記載の単離された核酸。
- Kabat法によって画定される際の各CDRおよび各FRのアミノ酸配列をコードする核酸が、IMGT法によって画定される際のCDRまたはFRの対応のアミノ酸配列をコードする核酸に置換され、前記核酸の置換が、以下:
a)91位のシトシンで始まり105位のシトシンで終わる(配列番号1)核酸配列を含むKabat定義によるCDRH1が、76位のグアニンで始まり99位のチミンで終わる(配列番号1)核酸配列を含むCDRH1のIMGT等価物に置き換えられている;
b)148位のチミンで始まり198位のシトシンで終わる(配列番号1)核酸配列を含むKabat定義によるCDRH2が、151位のアデニンで始まり174位のチミンで終わる(配列番号1)核酸配列を含むCDRH2のIMGT等価物に置き換えられている;
c)295位のシトシンで始まり327位のシトシンで終わる(配列番号1)核酸配列を含むKabat定義によるCDRH3が、289位のグアニンで始まり327位のシトシンで終わる(配列番号1)核酸配列を含むCDRH3のIMGT等価物に置き換えられている;
d)70位のシトシンで始まり102位のシトシンで終わる(配列番号3)を含むKabat定義によるCDRL1が、79位のシトシンで始まり96位のシトシンで終わる(配列番号3)核酸配列を含むCDRL1のIMGT等価物に置き換えられている;
e)148位のアデニンで始まり168位のシトシンまでの(配列番号3)核酸配列を含むKabat定義によるCDRL2が、148位のアデニンで始まり156位のシトシンで終わる(配列番号3)核酸配列を含むCDRL2のIMGT等価物に置き換えられている;
f)265位のシトシンで始まり291位のグアニンで終わる(配列番号3)核酸配列を含むKabat定義によるCDRL3が、265位のシトシンで始まり291位のグアニンで終わる(配列番号3)核酸配列を含むCDRL3のIMGT等価物に置き換えられている;
g)アミノ酸1位のグルタミン酸からアミノ酸30位のフェニルアラニン(配列番号1)のアミノ酸配列をコードする1位のグアニンで始まり90位のチミンで終わる(配列番号1)核酸配列を含むKabat定義によるFRH1が、アミノ酸1位のグルタミン酸からアミノ酸25位のセリン(配列番号1)のアミノ酸配列をコードする1位のグアニンで始まり75位のチミンで終わる(配列番号1)核酸配列を含むFRH1のIMGT等価物に置き換えられている;
h)アミノ酸36位のトリプトファンからアミノ酸49位のアラニン(配列番号1)のアミノ酸配列をコードする106位のチミンで始まり147位のアデニンで終わる(配列番号1)核酸配列を含むKabat定義によるFRH2が、アミノ酸34位のイソロイシンからアミノ酸50位のチロシン(配列番号1)のアミノ酸配列をコードする100位のアデニンで始まり150位のシトシンで終わる(配列番号1)核酸配列を含むFRH2のIMGT等価物に置き換えられている;
i)アミノ酸67位のアルギニンからアミノ酸98位のアルギニン(配列番号1)のアミノ酸配列をコードする199位のシトシンで始まり294位のシトシンで終わる(配列番号1)核酸配列を含むKabat定義によるFRH3が、アミノ酸59位のチロシンからアミノ酸96位のシステイン(配列番号1)のアミノ酸配列をコードする175位のチミンで始まり288位のチミンで終わる(配列番号1)核酸配列を含むFRH3のIMGT等価物に置き換えられている;
j)アミノ酸110位のトリプトファンからアミノ酸120位のセリン(配列番号1)のアミノ酸配列をコードする328位のチミンで始まり360位のグアニンで終わる(配列番号1)核酸配列を含むKabat定義によるFRH4が、アミノ酸110位のトリプトファンからアミノ酸120位のセリン(配列番号1)のアミノ酸配列をコードする328位のチミンで始まり360位のグアニンで終わる(配列番号1)核酸配列を含むFRH4のIMGT等価物に置き換えられている;
k)アミノ酸1位のアスパラギン酸からアミノ酸23位のシステイン(配列番号3)のアミノ酸配列をコードする1位のグアニンで始まり69位のシトシンで終わる(配列番号3)核酸配列を含むKabat定義によるFRL1が、アミノ酸1位のアスパラギン酸からアミノ酸26位のセリン(配列番号3)のアミノ酸配列をコードする1位のグアニンで始まり78位のチミンで終わる(配列番号3)核酸配列を含むFRL1のIMGT等価物に置き換えられている;
l)アミノ酸35位のトリプトファンからアミノ酸49位のチロシン(配列番号3)のアミノ酸配列をコードする103位のチミンで始まり147位のシトシンで終わる(配列番号3)核酸配列を含むKabat定義によるFRL2が、アミノ酸33位のバリンからアミノ酸49位のチロシン(配列番号3)のアミノ酸配列をコードする97位のグアニンで始まり147位のシトシンで終わる(配列番号3)核酸配列を含むFRL2のIMGT等価物に置き換えられている;
m)アミノ酸57位のグリシンからアミノ酸88位のシステイン(配列番号3)のアミノ酸配列をコードする169位のグアニンで始まり264位のチミンで終わる(配列番号3)核酸配列を含むKabat定義によるFRL3が、アミノ酸53位のグルタミン酸からアミノ酸88位のシステイン(配列番号3)のアミノ酸配列をコードする157位のグアニンで始まり264位のチミンで終わる(配列番号3)核酸配列を含むFRL3のIMGT等価物に置き換えられている;および
n)アミノ酸98位のフェニルアラニンからアミノ酸107位のリジン(配列番号3)のアミノ酸配列をコードする292位のチミンで始まり321位のアデニンで終わる(配列番号3)核酸配列を含むKabat定義によるFRL4が、アミノ酸98位のフェニルアラニンからアミノ酸107位のリジン(配列番号3)のアミノ酸配列をコードする292位のチミンで始まり321位のアデニンで終わる(配列番号3)核酸配列を含むFRL4のIMGT等価物に置き換えられている
である、請求項67、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、または89に記載の単離された核酸。 - 各CDRおよび各FRのアミノ酸配列をコードする核酸が、IMGT法によって画定され、以下:
a)76位のグアニンで始まり99位のチミンで終わる(配列番号79)核酸配列を含むIMGT定義によるCDRH1;
b)151位のアデニンで始まり174位のチミンで終わる(配列番号79)核酸配列を含むIMGT定義によるCDRH2;
c)289位のグアニンで始まり327位のシトシンで終わる(配列番号79)核酸配列を含むIMGT定義によるCDRH3;
d)79位のシトシンで始まり96位のシトシンで終わる(配列番号核酸配列を含むIMGT定義によるCDRL1 148位のアデニンで始まり156位のシトシンで終わる(配列番号77)核酸配列を含むIMGT定義によるCDRL2;
e)265位のシトシンで始まり291位のグアニンで終わる(配列番号77)核酸配列を含むIMGT定義によるCDRL3;
f)アミノ酸1位のグルタミン酸からアミノ酸25位のセリン(配列番号79)のアミノ酸配列をコードする1位のグアニンで始まり75位のチミンで終わる(配列番号79)核酸配列を含むIMGT定義によるFRH1;
g)アミノ酸34位のイソロイシンからアミノ酸50位のチロシン(配列番号79)のアミノ酸配列をコードする100位のアデニンで始まり150位のシトシンで終わる(配列番号79)核酸配列を含むIMGT定義によるFRH2;
h)アミノ酸59位のチロシンからアミノ酸96位のシステイン(配列番号79)のアミノ酸配列をコードする175位のチミンで始まり288位のチミンで終わる(配列番号79)核酸配列を含むIMGT定義によるFRH3;
i)アミノ酸110位のトリプトファンからアミノ酸120位のセリン(配列番号79)のアミノ酸配列をコードする328位のチミンで始まり360位のグアニンで終わる(配列番号79)核酸配列を含むIMGT定義によるFRH4;
j)アミノ酸1位のアスパラギン酸からアミノ酸26位のセリン(配列番号77)のアミノ酸配列をコードする1位のグアニンで始まり78位のチミンで終わる(配列番号77)核酸配列を含むIMGT定義によるFRL1;
k)アミノ酸33位のバリンからアミノ酸49位のチロシン(配列番号77)のアミノ酸配列をコードする97位のグアニンで始まり147位のシトシンで終わる(配列番号77)核酸配列を含むIMGT定義によるFRL2;
l)アミノ酸53位のグルタミン酸からアミノ酸88位のシステイン(配列番号77)のアミノ酸配列をコードする157位のグアニンで始まり264位のチミンで終わる(配列番号77)核酸配列を含むIMGT定義によるFRL3;および
m)アミノ酸98位のフェニルアラニンからアミノ酸107位のリジン(配列番号77)のアミノ酸配列をコードする292位のチミンで始まり321位のアデニンで終わる(配列番号77)核酸配列を含むIMGT定義によるFRL4
である、請求項4または68に記載の単離された核酸。 - 請求項67または68に記載の核酸を用いて形質転換された宿主細胞。
- 特異的な結合部の生産のための条件下で請求項120に記載の宿主細胞を培養すること、および前記特異的な結合部を単離および/または精製することを含む、VEGFを認識し結合する特異的な結合部を生産する方法であって、前記宿主細胞が、前記抗体の抗原結合部分の前記重鎖またはその一部分をコードするヌクレオチド配列と前記軽鎖またはその一部分をコードするヌクレオチド配列とを含む方法。
- VEGFを認識し結合する前記特異的な結合部が、scFv抗体分子またはFab抗体分子である、請求項121に記載の方法。
- VEGFを認識し結合する前記特異的な結合部が、完全長抗体である、請求項121に記載の方法。
- 治療有効量の請求項1、2、3、4、6、または7の抗VEGF抗体を哺乳動物に投与することを含む、前記哺乳動物においてVEGF誘導性の血管形成を阻害するための方法。
- 前記哺乳動物が、マウス、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、サル、およびヒト対象の群から選択される、請求項124に記載の方法。
- 前記哺乳動物が、網膜障害、滲出型加齢性黄斑変性症、糖尿病性黄斑症、増殖性糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症(RVO)における黄斑浮腫、虹彩新血管新生、病理学的近視に起因する脈絡膜の新血管新生、未熟児網膜症(ROP)、成熟児網膜症、血管新生緑内障、およびがんから選択される疾患を有する、請求項124に記載の方法。
- 前記網膜障害が、夜間の視力低下(夜盲症)、明るく照らされた範囲から薄暗い範囲への適応の問題、突然のまたは未解明の視力喪失、周辺視野の喪失、特定の視野での視力喪失、眼球の急速な不随意性の振動運動(眼振)、光に対する異常な感受性または不耐性(羞明)、またはそれらの組合せに関連する、請求項126に記載の方法。
- 治療有効量の請求項1、2、3、4、6、または7のヒト化抗VEGF抗体を哺乳動物に投与することを含む、前記哺乳動物において黄斑変性症を阻害するための方法。
- 黄斑変性症が滲出型黄斑変性症である、請求項128に記載の方法。
- 滲出型黄斑変性症が加齢性である、請求項129に記載の方法。
- 黄斑変性症が加齢性である、請求項128に記載の方法。
- 黄斑変性症が、新血管新生または血管新生と関連している、請求項128に記載の方法。
- 投与が硝子体内投与である、請求項128に記載の方法。
- 投与が、新血管新生または血管形成を阻害するか、防止するか、または後退させる、請求項133に記載の方法。
- 治療有効量の請求項1、2、3、4、6、または7の抗VEGF抗体を哺乳動物に投与することを含む、前記哺乳動物において細胞増殖性の障害を阻害するための方法。
- 前記哺乳動物が、マウス、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、サル、およびヒト対象の群から選択される、請求項128または135に記載の方法。
- 前記細胞増殖性の障害が、滲出型加齢性黄斑変性症、糖尿病性黄斑症、増殖性糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症(RVO)における黄斑浮腫、虹彩新血管新生、病理学的近視に起因する脈絡膜の新血管新生、成熟児網膜症、血管新生緑内障、糖尿病性網膜症、網膜新血管新生、経扁平部硝子体切除(PPV)、糖尿病性黄斑浮腫(DME)、およびがんからなる群から選択される、請求項135に記載の方法。
- 以下の表5aまたは表5cに示されるようなバリアント201、202、203、204、205、206、207、208、209、212、213、214、215、216、217、218、219、または220の超可変領域または相補性決定領域(CDR)のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、VEGFに特異的に認識し結合する単離されたヒト抗VEGF抗体またはその一部分もしくはバリアント。
- 以下の表5bまたは表5dに示されるようなバリアント201、202、203、204、205、206、207、208、209、212、213、214、215、216、217、218、219、または220の超可変領域または相補性決定領域(CDR)のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、VEGFに特異的に認識し結合する単離されたヒト抗VEGF抗体またはその一部分もしくはバリアント。
- 表5aまたは表5cに示されるようなアミノ酸配列を含むバリアント201、202、203、204、205、206、207、208、209、212、213、214、215、216、217、218、219、または220の軽鎖のいずれかを含む、VEGFに特異的に認識し結合する単離されたヒト抗VEGF抗体またはその一部分もしくはバリアント。
- 表5bまたは表5dに示されるようなアミノ酸配列を含むバリアント201、202、203、204、205、206、207、208、209、212、213、214、215、216、217、218、219、または220の重鎖のいずれかを含む、VEGFに特異的に認識し結合する単離されたヒト抗VEGF抗体またはその一部分もしくはバリアント。
- a.以下の表5aに示されるようなバリアント201、202、203、204、205、206、207、208、209、212、213、214、215、216、217、218、219、または220の超可変領域または相補性決定領域(CDR)のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および
b.以下の表5bに示されるようなバリアント201、202、203、204、205、206、207、208、209、212、213、214、215、216、217、218、219、または220の超可変領域または相補性決定領域(CDR)のアミノ酸配列を含む対応の重鎖可変ドメイン
を含む、VEGFに特異的に認識し結合する単離されたヒト抗VEGF抗体またはその一部分もしくはバリアント。 - a.以下の表5cに示されるようなバリアント201、202、203、204、205、206、207、208、209、212、213、214、215、216、217、218、219、または220の超可変領域または相補性決定領域(CDR)のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および
b.以下の表5dに示されるようなバリアント201、202、203、204、205、206、207、208、209、212、213、214、215、216、217、218、219、または220の超可変領域または相補性決定領域(CDR)のアミノ酸配列を含む対応の重鎖可変ドメイン
を含む、VEGFに特異的に認識し結合する単離されたヒト抗VEGF抗体またはその一部分もしくはバリアント。
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