JP2019528782A - 細胞の長期モニタリングの為の非破壊ナノストロー細胞内試料採取の方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本特許出願は、2016年9月13日に出願された米国特許仮出願第62/394,089号、件名「細胞の長期モニタリングの為の非破壊ナノストロー細胞内試料採取の方法(METHODS OF NON−DESTRUCTIVE NANOSTRAW INTRACELLULAR SAMPLING FOR LONGITUDINAL CELL MONITORING)」の優先権を主張するものである。本特許出願は、参照によってその全内容が本明細書に組み込まれている。
本明細書中において言及される全ての刊行物及び特許出願は、それぞれ個々の刊行物又は特許出願が参照により具体的且つ個別に示されて組み込まれる場合と同程度に、参照により全内容が本明細書に組み込まれる。
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された契約HL133272の下に、且つ、米国標準技術局によって授与された契約70NANB15H268の下に、米国政府支援を受けてなされたものである。米国政府は本発明における一定の権利を有する。
Claims (33)
- 細胞内から細胞内試料物質を非破壊試料採取する方法であって、
ナノストローを通して上部電極と下部電極との間に電圧を印加して、細胞膜のうちの、前記ナノストローの開口部を覆って延びている部分に1つ以上の細孔を開けるステップと、
前記細胞内から放出されて前記ナノストローに入った試料物質を、前記ナノストローの下の試料収集器内に捕捉するステップと、
前記細胞内の前記試料物質の15%超が放出される前に、前記上部電極と前記下部電極との間の前記電圧印加を停止して、前記細胞膜が回復することを可能にするステップと、
を含む方法。 - 印加する前記ステップは、1〜100Vのパルス電圧を、ナノストローを通して前記上部電極と前記下部電極との間に印加するステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記試料を捕捉する前記ステップは、前記試料物質を捕捉基板上に固定化するステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記印加を停止する前記ステップは、パルス幅が約10マイクロ秒から約50ミリ秒である1〜100Vのパルス列の印加を1〜300秒後に停止するステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記電圧を印加する前記ステップは、試料領域内で前記ナノストローと複数の追加ナノストローとを通して上部電極と下部電極との間に前記電圧を印加するステップを含み、更に、前記試料を捕捉する前記ステップは、前記ナノストロー及び前記複数の追加ナノストローの中に放出された前記試料物質を前記試料収集器内に捕捉するステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ナノストローを通して前記上部電極と前記下部電極との間に前記電圧を再印加するステップと、試料物質を捕捉するステップと、前記電圧印加を停止するステップと、を最短回復時間後に繰り返すステップを更に含み、前記最短回復時間は1時間より長い、請求項1に記載の方法。
- 前記最短回復時間は6時間より長い、請求項6に記載の方法。
- 前記捕捉された試料物質の中の第1の時点の試料を保存するステップと、前記ナノストローを通して前記上部電極と前記下部電極との間に前記電圧を再印加する前記ステップと、試料物質を捕捉する前記ステップと、前記電圧印加を停止する前記ステップとを、各繰り返しの間の最短回復時間後に、更なる複数の繰返し回数にわたって繰り返すステップと、を更に含み、前記捕捉された試料物質の中の更なる時点の試料が各繰り返しの為に保存される、請求項1に記載の方法。
- 前記試料収集器内に捕捉されている前記捕捉された試料物質を検出するステップを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記試料収集器内に捕捉されている前記捕捉された試料物質を定量化するステップを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記捕捉された試料物質の中の異なる複数のバイオマーカを識別するステップを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記捕捉された試料物質の中の異なる複数のバイオマーカを定量化するステップを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記電圧を印加する前に、前記細胞を取り巻く培地を緩衝溶液とともに交換し、前記高電圧印加の停止後に、前記細胞を取り巻く培地を交換するステップを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 複数の時点において細胞内から細胞内試料物質を非破壊試料採取する方法であって、
ナノストローを通して上部電極と下部電極との間に1〜100Vの電圧を印加して、細胞膜のうちの、前記ナノストローの開口部を覆って延びている部分に1つ以上の細孔を開けるステップと、
前記細胞内から放出されて前記ナノストローに入った試料物質を、前記ナノストローの下の試料収集器内に捕捉するステップであって、前記試料物質を捕捉基板上に固定化するステップを含む前記捕捉するステップと、
前記細胞内の前記試料物質の15%超が放出される前に、前記上部電極と前記下部電極との間の前記電圧印加を停止して、前記細胞膜が回復することを可能にするステップと、
前記電圧を再印加し、追加試料物質を捕捉するステップの前の少なくとも1時間の最短回復時間の間に前記細胞が回復することを可能にするステップと、
を含む方法。 - 複数の時点において細胞内から細胞内試料物質を非破壊試料採取する方法であって、
ナノストロー基板の複数の試料領域のそれぞれにおいて、少なくとも1つのナノストローを通して上部電極と下部電極との間に電圧を印加して、各ナノストローの開口部を覆って延びている細胞膜を貫通する1つ以上の細孔を開けるステップと、
前記複数の試料領域のそれぞれにおいて試料物質を捕捉するステップであって、前記試料物質は、前記ナノストローに入って前記複数の試料領域のそれぞれに対応する前記少なくとも1つのナノストローの下の複数の試料収集器に放出される、前記捕捉するステップと、
前記上部電極と前記下部電極との間の前記電圧印加を停止するステップと、
前記複数の試料領域のそれぞれにおいて、前記電圧を再印加し、追加試料物質を捕捉するステップの前の少なくとも1時間の最短回復時間の間に前記細胞が回復することを可能にするステップと、
様々な時点において、前記複数の試料領域のそれぞれに対応する別々のバイオマーカを前記捕捉された試料物質の中から識別するステップと、
を含む方法。 - 細胞内物質を非破壊試料採取するシステムであって、
上部領域及び下部領域を有する細胞培養チャンバと、
前記下部領域の上に位置するナノストロー基板であって、複数の試料領域を含む前記基板と、
各試料領域において前記ナノストロー基板を貫通して延びる複数のナノストローであって、各ナノストローは、外径が、細胞の細胞膜に貫入することなく前記細胞を支持するように構成されている、前記複数のナノストローと、
複数の試料物質収集器であって、各試料物質収集器は、前記複数の試料領域のうちの1つの試料領域に対応する、前記複数の試料物質収集器と、
前記上部領域にある第1の電極と、
前記下部領域にある第2の電極と、
前記第1の電極及び前記第2の電極と結合されて、パルス幅が約10マイクロ秒から約50ミリ秒である約1〜100Vのパルス電圧を前記複数のナノストローを通して1〜300秒の継続時間にわたって印加するように構成された制御装置と、
を含むシステム。 - 前記ナノストロー基板は、凹んだ試料領域のパターンを含む、請求項16に記載のシステム。
- 前記ナノストロー基板は、前記細胞培養チャンバ内に取り外し可能に配置されるように構成された取り外し可能な捕捉基板を含む、請求項16に記載のシステム。
- 前記ナノストロー基板は、1つしかない向きで前記細胞培養チャンバに嵌め込まれるようにキー留めされる、請求項16に記載のシステム。
- 前記ナノストロー基板はポリカーボネート膜を含む、請求項16に記載のシステム。
- 前記ナノストロー基板は、前記試料領域間の前記ナノストロー基板の表面を覆うブロックコーティングを含む、請求項15に記載のシステム。
- 前記ナノストロー基板の試料領域の厚さが10nm〜5ミクロンである、請求項16に記載のシステム。
- 前記細胞培養チャンバの前記下部領域は複数の試料ポートを含み、各試料物質収集器は一意の試料ポートに関連付けられている、請求項16に記載のシステム。
- 各ナノストローの外径は約20nmから約1500nmである、請求項16に記載のシステム。
- 各ナノストローの外径は100nmを超えている、請求項16に記載のシステム。
- 前記複数のナノストローはアルミナナノストローである、請求項16に記載のシステム。
- 前記複数の試料物質収集器のそれぞれは、前記試料物質と結合するように構成された試料物質捕捉基板を含む、請求項16に記載のシステム。
- 前記複数の試料物質収集器は取り外し可能である、請求項16に記載のシステム。
- 前記第2の電極は、前記ナノストロー基板と前記複数の試料物質収集器との間に位置する、請求項16に記載のシステム。
- 前記複数の試料物質収集器は、前記ナノストロー基板と前記第2の電極との間に位置する、請求項16に記載のシステム。
- 前記複数の試料採取領域は、それぞれの最大径が5〜200μmであるように構成されている、請求項16に記載のシステム。
- 細胞用培地と無培地緩衝液とを自動的に切り替えるように構成された前記細胞培養チャンバに入る1つ以上のポートを更に含み、更に、前記制御装置は、前記パルス電圧を印加する前に細胞用培地と無培地緩衝液とを切り替えるように、且つ、前記パルス電圧を印加した後に無培地緩衝液と細胞用培地とを切り替えるように構成されている、請求項16に記載のシステム。
- 細胞内物質を非破壊試料採取するシステムであって、
上部領域及び下部領域を有する細胞培養チャンバと、
前記下部領域の上に位置するナノストロー基板であって、凹んだ試料領域のパターンを含む前記基板と、
各試料領域において前記ナノストロー基板を貫通して延びる複数のナノストローであって、各ナノストローは、外径が、細胞の細胞膜に貫入することなく前記細胞を支持するように構成されており、前記外径は約20nmから約1500nmである、前記複数のナノストローと、
試料物質捕捉基板を含む、複数の取り外し可能な試料物質収集器であって、各試料物質収集器は、前記複数の試料領域のうちの1つの試料領域に対応する、前記複数の取り外し可能な試料物質収集器と、
前記上部領域にある第1の電極と、
前記下部領域にある第2の電極と、
前記第1の電極及び前記第2の電極と結合されて、パルス幅が約10マイクロ秒から約50ミリ秒である1〜100Vのパルス電圧を前記複数のナノストローを通して1〜300秒の継続時間にわたって印加するように構成された制御装置と、
を含むシステム。
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