JP2019521101A - 内耳感覚有毛細胞の再生／置換のための併用療法 - Google Patents

Abstract

本開示は、内耳の組織における遺伝子の発現を減少させる組成物または薬剤と、第２の薬剤とを利用して有毛細胞を再生および／または回復させるための組成物および方法に関する。【選択図】図１-Ａ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０１６年６月３日に出願された米国特許出願第６２／３４５，７４０号に対する優先権を主張し、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。

難聴および平衡機能障害は一般的なヒトの障害である。多くの場合、これらの障害は、（１）蝸牛におけるコルチ器（ＯＣ）、（２）稜（ｃｒｉｓｔａｅ）における前庭上皮、または（３）前庭器官の球形嚢もしくは卵形嚢における感覚有毛細胞の喪失に起因する。現在、これらの組織での感覚有毛細胞の修復によってこれらの障害を治療することができるＦＤＡにより認可された治療は存在しない。

この問題に対する現在のアプローチは、前庭器官への損傷に順応させるための前庭リハビリテーションを含む。リハビリテーションは時間がかかり、失われた機能を回復しない。感音難聴では、リハビリテーションは、補聴器または人工内耳によって実現され得る。しかしながら、これらの装置は高価であり、正常以下の音質をもたらし、部分的な機能の回復しかもたらさず、人工内耳の症例において広範囲の手術を必要とし得る。

聴覚障害の治療における別のアプローチは、ペプチドまたは他の低分子の投与である。蝸牛で比較的高い濃度（マイクロモル濃度またはミリモル濃度）を達成されなければならないため、このような薬剤の使用では治療結果はしばしば限定される。さらに、タンパク質またはペプチド阻害剤は、血液迷路関門および血流でのタンパク質クリアランスならびに潜在的な抗原性のため、耳を治療するために全身送達することが困難である。分子が大きいため、局所送達を使用する場合は特に、適切な濃度のペプチドおよびタンパク質を蝸牛に直接送達することに関しても困難が存在する。

これらの従来のアプローチに対する１つの可能性がある代替方法は、内耳有毛細胞の再生および置換を引き起こす標的化遺伝子療法の使用である。例えば、有毛細胞の再生または置換は、げっ歯類において、内耳感覚上皮内にＡｔｏｈ１遺伝子を導入するウイルスベクターの使用によって実現されている。しかしながら、このアプローチは、感染症、炎症性免疫反応、遺伝子の突然変異、新生物の発生などの誘発を含むウイルスベクター療法につきものの危険性を伴う。ｋｉｐ１ｐ２７ ＲＮＡのサイレンシングは、有毛細胞の再生を引き起こすことが示されているが、機能の回復を伴わない異所性のものである。網膜芽腫遺伝子の調節も、さらに有毛細胞を生じ得るが、がん遺伝子または発がん遺伝子の操作につきものの危険があり得る。したがって、内耳有毛細胞の再生または置換を目的とする現在の遺伝子療法は、安全かつ効果的な分子標的および送達法を特定できていない。

１つの可能性がある遺伝子療法アプローチは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の使用による。細胞内に一旦導入されると、ｓｉＲＮＡ分子は、標的遺伝子によって発現されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）上の相補配列と複合体を形成する。このｓｉＲＮＡ／ｍＲＮＡ複合体の形成は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られている天然の細胞内過程を介してｍＲＮＡの分解を引き起こす。ＲＮＡｉは、特定の細胞過程における遺伝子の機能を同定するため、および疾患モデルにおいて可能性がある治療標的を同定するための、十分に確立された手段である。ＲＮＡｉは従来、細胞培養およびｉｎ ｖｉｔｒｏでの適用に使用されてきたが、遺伝子療法に基づく治療法が、この過程を利用して現在研究されている。

上述のように、内耳の有毛細胞の再生に関して、いくつかの遺伝子標的が研究されているがあまり成功していない。塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックス（ｂＨＬＨ）遺伝子Ｈｅｓ１およびＨｅｓ５は、耳の蝸牛および前庭構造における感覚有毛細胞の発生に関与していることが同定されている。加えて、有毛細胞の喪失を防ぐための可能性がある遺伝子標的は、プログラム細胞死またはアポトーシスに関与する分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ１（ＭＡＰＫ１）である。

グリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ−３）は、セリンおよびトレオニンアミノ酸残基へのリン酸塩分子の付加を媒介するセリン／トレオニンプロテインキナーゼである。これは、種々の異なる経路における４０を超える異なるタンパク質に対するキナーゼであり、種々の疾患に関与している。したがって、ＧＳＫ−３阻害剤（ＧＳＫ３Ｉ）は動物モデルにおいて安全性および有効性について試験されてきたが、ＧＳＫ−３の阻害が様々なシグナル伝達カスケードにわたって果たし得る役割はまだ十分に理解されていない。

本開示は、内耳の組織における遺伝子の発現を減少させる組成物または薬剤と、第２の薬剤とを利用して有毛細胞を再生および／または修復するための組成物および方法に関する。

いくつかの実施形態では、遺伝子は、Ｈｅｓ１、Ｈｅｓ５またはＭＡＰＫ１である。

いくつかの実施形態では、内耳の組織における遺伝子の発現を減少させる組成物または薬剤は、ｓｉＲＮＡ分子を含んでもよい。いくつかの実施形態では、内耳の組織における遺伝子の発現を減少させる組成物または薬剤は、遺伝子が調節される経路の阻害剤、例えば、ガンマセクレターゼ阻害剤などのＮｏｔｃｈシグナル伝達経路阻害剤を含んでもよい（例えば、Ｈｅｓ１の転写がＮｏｔｃｈシグナル伝達によって媒介されるからである）。

いくつかの実施形態では、第２の薬剤はプライミング組成物である。いくつかの実施形態では、プライミング組成物は、βカテニンを安定化させること、内耳における多能性細胞の数を増加させること、内耳における既存の多能性細胞の可塑性を増加させること、または内耳の細胞における分化のためのシグナルを送ることからなる群から選択される１つまたは複数の機能を示す。いくつかの実施形態では、この第２の薬剤はＧＳＫ−３阻害剤である。さらなる実施形態では、ＧＳＫ−３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１、６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）、またはチデグルシブ（ＴＩＤＥ）のいずれか１つまたは複数である。

いくつかの実施形態では、内耳の組織における遺伝子の発現を減少させる組成物は、ナノ粒子を含んでもよく、次にナノ粒子は内耳の組織における遺伝子の発現を減少させる薬剤を含んでもよい。

いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、内耳の組織における遺伝子の発現を減少させる薬剤を封入する。

いくつかの実施形態では、ナノ粒子は生分解性ポリマーを含む。さらなる実施形態では、生分解性ポリマーは、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）またはペグ化ＰＬＧＡ（ＰＥＧ−ＰＬＧＡ）である。

いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、磁気応答性であるか、または磁気応答性粒子を含む。いくつかの実施形態では、磁気応答性粒子は超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯＮ）である。

いくつかの実施形態では、第２の薬剤は、内耳の組織における遺伝子の発現を減少させる薬剤と同じまたは異なるナノ粒子に含まれてもよい。

本開示の態様は、内耳の組織における遺伝子の発現を減少させる組成物または薬剤と、難聴を治療し、ならびに／または有毛細胞を修復および／または再生するのに十分な治療有効量の第２の薬剤とを適用する方法に関する。いくつかの実施形態では、適用するステップは同時に実施される。代替の実施形態では、適用するステップは逐次的に実施される。さらなる実施形態では、第２の薬剤は、内耳の組織における遺伝子の発現を減少させる組成物または薬剤が適用される前または後に適用される。

内耳の名称を記した図である。 内耳の名称を記した図である。 内耳の名称を記した図である。 内耳の名称を記した図である。 Ｈｅｓ１ ｓｉＲＮＡ担持ＰＬＧＡナノ粒子（ＮＰ）処理が耳毒性傷害後に有毛細胞（ＨＣ）を再生することを実証するために使用した実験における、マウスのコルチ器（ＯＣ）の中回転からの代表的な画像を示す図である。新生児（Ｐ３）マウスＯＣを、オトトキシン（ｏｔｏｔｏｘｉｎ）、４−ヒドロキシル−２−ノネナール（４−ＨＮＥ、４５０μＭ）に２４時間曝露し、次いで未処理のままにするか、または非ターゲティングスクランブルＲＮＡ ＮＰ（ｓｃＲＮＡＮＰ）もしくはＨｅｓ１ ｓｉＲＮＡ担持ＮＰ（Ｈｅｓ１ ｓｉＲＮＡＮＰ）のいずれかにより処理し、７日後、組織を固定し、フルオロフォアがコンジュゲートしたファロイジンにより標識した。３列の外有毛細胞（ＯＨＣ）および１列の内有毛細胞（ＩＨＣ）が、未処理の培養物からのＯＣにおいて観察され（左上パネル）、１列のＩＨＣおよび少数の分散したＯＨＣ（白抜き矢じり）が４−ＨＮＥ処理（右上パネル）および４−ＨＮＥ＋ｓｃＲＮＡＮＰ処理したＯＣ（左下パネル）において観察された。余分なＯＨＣ（矢印、右下パネル）およびＩＨＣ（矢じり、右下パネル）が、Ｈｅｓ１ ｓｉＲＮＡＮＰ（８００μｇ／ｍＬ）により処理したＯＣにおいて観察された。 Ｈｅｓ１ ｓｉＲＮＡ ＮＰ処理に反応して、オトトキシン、４−ＨＮＥに曝露された新生児マウスＯＣにおいて回復されたＨＣの数の観察された用量依存反応を実証する図である。高用量のＮＰ（＞４００μｇ／ｍＬ）による処理の結果、同様に基底回転におけるＯＨＣ数の有意な増加がもたらされた。^＊＊＊および^＊は、未処理の培養物と比較して、それぞれ、ｐ＜０．００１および０．０５を示す。＃＃＃、＃＃および＃は、４−ＨＮＥのみに曝露された群と比較して、それぞれ、ｐ＜０．００１、０．０１および０．０５を示す。括弧内の数字は、ＨＣを計数したＯＣの数を示す。 以下の実験におけるＯＣの中回転からの代表的な画像を示す図である。新生児（Ｐ３）マウスＯＣを、耳毒性アミノグリコシド、ネオマイシン（ＮＥＯ、０．７５ｍＭ）に２４時間曝露し、次いで未処理のままにするか、または漸増用量のＨｅｓ１ ｓｉＲＮＡ担持ＮＰにより処理した。７日後、組織を固定し、Ｍｙｏ７ａ抗体（緑色、上パネル）およびフルオロフォアがコンジュゲートしたファロイジン（下パネル）により標識した。３列のＯＨＣおよび１列のＩＨＣが、未処理の培養物からのＯＣにおいて観察された（左上パネル）。少数の分散したＯＨＣ（白抜き矢じり）が、未処理のＮＥＯに曝露したＯＣ（ＮＥＯのみ）において観察された。用量依存的なＨＣ数の増加が、漸増用量のｓｉＨｅｓ１を封入したＰＬＧＡ ＮＰにより処理したＯＣにおいて観察された。示されたＮＰの用量当量は溶液中の全ｓｉＲＮＡ濃度に対応し、それぞれ、１４５、２３０、および３８５μｇ／ｍＬのｓｉＨｅｓ１を封入したＰＬＧＡ ＮＰを表す。 用量依存反応が、耳毒性アミノグリコシド、ネオマイシン（ＮＥＯ）に曝露し、その後、漸増用量のＨｅｓ１ ｓｉＲＮＡ ＮＰにより処理した新生児マウスＯＣにおいて回復したＨＣ（Ｍｙｏ７Ａ陽性細胞）の数においても観察されたことを実証する図である。ＨＣの計数は、ＯＣの中−頂（ｍｉｄ−ａｐｉｃａｌ）、中（ｍｉｄｄｌｅ）および中−基底（ｍｉｄ−ｂａｓａｌ）回転にわたって実施した。示した用量当量は溶液中の全ｓｉＲＮＡ濃度を表し、７８、１４５、２３０、および３８５μｇ／ｍＬのＰＬＧＡ ＮＰに対応する。ＨＣ数の有意な増加が観察された。^＊＊＊は、未処理の培養物と比較してｐ＜０．００１を示す。＃＃＃および＃＃は、ＮＥＯのみに曝露した群と比較して、それぞれ、ｐ＜０．００１および０．０１を示す。 ２、４、８および１６ｋＨｚの試験周波数での偽処置または治療用ｓｉＨＥＳ１ ＮＰで処置した耳からの生きているモルモットの騒音により損傷した蝸牛における聴性脳幹反応（ＡＢＲ）閾値回復（損傷後）の時間経過を示す図である。音響外傷を、４ｋＨｚを中心とする１３０ｄＢ ＳＰＬの音響過剰曝露によって２時間誘発した。疑非ターゲティングスクランブルＲＮＡ（ｓｃＲＮＡ）担持ＮＰ（８００μｇ／ｍＬ）または治療用ｓｉＨＥＳ１ ＮＰ（８００μｇ／ｍＬ）のいずれかによる遅延（損傷後７２時間）治療介入を、ミニ浸透圧ポンプを使用して、蝸牛の基底回転への直接的な片側注入（蝸牛開窓術（ｃｏｃｈｌｅｏｓｔｏｍｙ））によって行い、ミニ浸透圧ポンプを７日後に外科的に除去した。次いでＡＢＲ測定を、損傷後２、４、８および１０週において両方の実験コホートからの動物の間で行った。偽処置した対照と比較して、騒音に曝露された動物におけるｓｉＨＥＳ１ ＮＰにより処置した耳は、この実験の時間経過にわたって、より大きな程度の漸進的な聴覚機能回復（すなわち、試験した周波数範囲にわたるＡＢＲ閾値の低下）を示した。 図６に示されたＡＢＲ閾値回復の単純化された時間経過を示す図であり、急性音響外傷に曝露された、生きているモルモットにおけるｓｉＨＥＳ１ ＮＰによる遅延（傷害後７２時間）治療介入後に達成された聴力回復のレベルが、非ターゲティングｓｃＲＮＡ ＮＰにより達成されたものよりも大きかったことを実証する。 ２、４、８および１６ｋＨｚの試験周波数での音響過剰曝露の１日後と比較した、処置後１０週での外科的に注入した耳におけるｓｃＲＮＡ ＮＰまたはｓｉＨＥＳ１ ＮＰのいずれかによるｉｎ ｖｉｖｏでの遅延（損傷後７２時間）治療介入後のＡＡＴ後の生きているモルモットにおけるＡＢＲ閾値回復の差を示す図である。ここで観察されたＡＡＴ後の閾値回復に対するｓｉＨＥＳ１ ＮＰ処置による特異的改善は、臨床的に有意であると予想される。 処置した耳からの蝸牛の基底回転から収集した画像を示す図であり、ｓｉＨＥＳ１ ＮＰ注入が、成熟色素沈着モルモットの騒音により損傷された蝸牛においてＨＣ数の増加をもたらしたことを実証する。偽（ｓｃＲＮＡ）および治療的（ｓｉＨＥＳ１）処置した耳におけるＭｙｏ７ａおよびファロイジンによる標識化により、ｓｃＲＮＡ ＮＰを注入した耳におけるＯＨＣの顕著な喪失およびｓｉＨＥＳ１ ＮＰ処置した耳におけるＯＨＣ数の著しい回復が明らかにされた。矢印は、ｓｉＨＥＳ１処置した耳における不動毛束（矢じり）を有する過剰のＭｙｏ７ａ陽性ＩＨＣの発生を示す。 ｓｉＨＥＳ１ ＮＰ処置が、損傷を与える音響過剰曝露の後、ｉｎ ｖｉｖｏでＨＣ数を回復することを示す図である。Ｍｙｏ７ａにより免疫標識したＩＨＣおよびＯＨＣの数を定量し、傷害後１０週でのｓｃＲＮＡ ＮＰおよびｓｉＨＥＳ１ ＮＰにより処置した耳におけるＯＣ頂からの距離のパーセント（キロヘルツでの周波数位置）の関数としてＩＨＣおよびＯＨＣの喪失のパーセントを示すサイトコクレオグラム（ｃｙｔｏｃｏｃｈｌｅｏｇｒａｍ）としてグラフ化した。データは平均±ＳＥＭとしてプロットする。３つの蝸牛を各データ点について分析した。ＯＨＣおよびＩＨＣの喪失の顕著な基底から頂への勾配が、ｓｃＲＮＡ ＮＰにより処置した耳において観察され、これは、ＯＣの基底回転に沿った高周波数の周波数特定性領域を含む、ｓｉＨＥＳ１ ＮＰにより処置した耳における蝸牛螺旋の全長にわたって劇的に減少した。 蝸牛の基底回転から収集した画像を示す図であり、ｓｉＨＥＳ１ ＮＰ注入が、有毛細胞を死滅させる大きな損傷を与える騒音に曝露した成熟マウスにおいてｉｎ ｖｉｖｏでＨＣ数を回復することを実証する。４週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを、１１６ｄＢ ＳＰＬにて８〜１６ｋＨｚのオクターブ帯域ノイズの音響過剰曝露に２時間曝露した。音響外傷の７２時間後、ｓｉＨＥＳ１ ＮＰ（８００μｇ／ｍＬ）を、ミニ浸透圧ポンプを使用して、７日間、後半規管に片側から注入した。騒音損傷の８週間後、組織を固定し、ＨＣのＭｙｏ７ａによる免疫標識のために採取した。ｓｉＨｅｓ１ ＮＰ注入の結果、ｉｎ ｖｉｖｏで騒音により損傷したマウスの蝸牛の構造的に正確な位置におけるＨＣ数が増加した。 外リンパ模擬培地中のＰＬＧＡナノ粒子からのＨＥＳ１ ｓｉＲＮＡの累積放出プロファイルのグラフである。 コルチ器の損傷していない出生後（Ｐ３）の器官型培養物における内および外ＨＣ（それぞれＩＨＣおよびＯＨＣ）の数の増加に対する、単独での、またはＧＳＫ−３阻害剤であるＢＩＯの段階的（Ｓ）または同時（一緒、Ｔ）適用と組み合わせたｓｉＨＥＳ１の効果を示す図である。２または１０マイクロモル濃度（段階的適用、Ｓについて）にて、ビヒクルのみ（ジメチルスルホキシド、ＤＭＳＯ）またはＧＳＫ−３阻害剤であるＢＩＯのいずれかを含有する培地を添加する前に、コルチ器（ＯＣ）を培地のみで２４時間培養した。さらに７２時間培養した後、培地を交換し、２０ｎＭのｓｉＨＥＳ１トランスフェクション複合体（ＪｅＳＩ １０ｍＭ、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、Ｉｌｌｋｉｒｃｈ、フランス）の存在下または非存在下で、２または１０マイクロモル濃度（同時適用、Ｔについて）にて、ＤＭＳＯ（正常対照、ＮＣ、または段階的、Ｓ、適用実験について）またはＢＩＯのいずれかを含有する培養培地と置き換えた。さらに４８時間後、全ての培地を基礎培地と置き換え、ＨＣの固定および抗Ｍｙｏ７Ａによる免疫標識の前にさらに４８時間培養した。１０マイクロモル濃度のＢＩＯを順次適用し、続いてｓｉＨＥＳ１のトランスフェクションの結果、損傷していないＯＣにおいてＩＨＣおよびＯＨＣの両方の数が最大に増加し（すなわち、より多くのｄｅ ｎｏｖｏ有毛細胞産生）、典型的には出生後の蝸牛における新たなＨＣ産生に対して抵抗性である領域であるＯＣの中−基底回転において最も大きな差異が観察された。 ＢＩＯおよびｓｉＨｅｓ１による併用処置の結果を示す図であり、いずれかの単一の治療剤単独による処置と比較して、オトトキシンにより除去された卵形嚢の平衡斑状外（ｅｘｔｒａｓｔｒｉｏｌａｒ）領域におけるＨＣの数の相乗的増加を実証する。ＢＩＯが、有害な損傷後のＨＣを再生する際にＨｅｓ１ ｓｉＲＮＡの治療効果を増強することができるかどうかを評価するために、新生児のマウスの卵形嚢組織をネオマイシン（ＮＥＯ）に曝露し、次いで未処理のままにするか、または治療剤の一方もしくは両方により処理した。ｉｎ ｖｉｔｒｏで合計８日後、組織を固定し、ＨＣマーカーであるＭｙｏ７ａにより標識した。＃＃＃、未処理の対照と比較したＭｙｏ７ａ陽性細胞の差、ｐ＜０．００１。^＊、^＊＊および^＊＊＊、処理群の間のＭｙｏ７ａ陽性細胞の数の有意差に対してそれぞれ、ｐ＜０．０５、０．０１および０．００１。 図１４の異なる実験群からの代表的な画像を示す図である。ＮＥＯ処理後、ＨＣ数が大幅に減少する（パネル２）。Ｈｅｓ１ ｓｉＲＮＡ処理のみの結果、主に平衡斑状（ｓｔｒｉｏｌａｒ）領域内でＨＣ数は増加したが（パネル４）、ｓｉＨＥＳ１およびＢＩＯによる併用処理の結果、平衡斑状外領域にも及ぶ再生反応の増強がもたらされた（パネル５）。 ＢＩＯおよびｓｉＨｅｓ１による段階的処理の結果、ＢＩＯもしくはｓｉＨＥＳ１のみのいずれかについて、またはＢＩＯ＋ガンマセクレターゼ阻害剤（ＧＳＩ）、デスヒドロキシＬＹ４１１５７５（ジベンズアゼピン、５μＭ）による段階的処置について観察されたものよりも、ＮＥＯにより除去した卵形嚢の平衡斑状外領域において、より頑強な分化転換（ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｖｅ）反応が生じたことを実証する図であり、併用処理効果は卵形嚢外植片の平衡斑状領域に大部分限定された。 図１６の異なる実験群からの代表的な画像を示す図である。ＮＥＯ処理後、ＨＣ数が大幅に減少する（パネル２）。個々に、ＢＩＯ、Ｈｅｓ１ ｓｉＲＮＡおよびＧＳＩ処理のみの結果、平衡斑状領域内のＨＣ数の増加が生じたが（パネル４および６）、ＢＩＯおよびｓｉＨＥＳ１による併用処理の結果、平衡斑状外領域にも及ぶ再生反応の増強が特有に生じた（パネル５）。 成熟マウスＯＣの全蝸牛培養モデルからの代表的な画像を示す図であり、２０倍および４０倍の倍率でここに示される異なる実験群の中回転を示す。ＨＣ再生を研究するためにこの全蝸牛培養モデルを使用して、成熟マウス蝸牛（Ｐ１６）を採取し、培地のみで２４時間インキュベートすると、この期間にわたって既存のＩＨＣおよびＯＨＣが急速に変性し、死滅した。培養の２４時間後、これらの培養物を５μＭのＢＩＯにより７２時間処理し、続いてｓｉＨＥＳ１（２０ｎＭ）をトランスフェクションし、その後、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合計９日間培養し、その時点で組織を固定し、ファロイジン（赤色）またはＨＣマーカーであるＭｙｏ７ａ（緑色）により標識した。ＢＩＯおよびＨｅｓ１ ｓｉＲＮＡによる併用処理の結果、これらの条件下で感覚上皮領域内のＨＣ数の顕著な増加が生じた（右パネル）。 血清飢餓ＭＤＣＫ細胞におけるＧＳＫ３Ｉ媒介性増殖の代表的な画像を示す図である。細胞を最初に１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）の存在下で培養し、次いで２４時間、無血清培地に切り替え、その後、１０μＭのＥｄＵの存在下で示した濃度にてＧＳＫ３Ｉを含む０．２％血清含有培地を添加した。細胞をさらに４８時間培養し、その後、固定し、銅触媒による付加環化（「クリック」反応、Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ Ｅｄｕ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）におけるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８アジドのコンジュゲーションによりＥｄｕ陽性核（緑色）を可視化した。全核をＤＡＰＩ（青色）により染色した。ＮＣ、正常対照または未処理の細胞を、実験時間の過程全体にわたって１０％ＦＢＳの存在下で培養した。ＧＳＫ３Ｉ、チデグルシブは試験した用量範囲にわたる持続性増殖反応を支持したが、ＳＢ−２１６７６３などの他のＧＳＫ３Ｉによって誘導された増殖反応は漸増用量に伴って漸進的に減衰した。 血清飢餓（すなわち、有糸分裂で抑制された）ＭＤＣＫ細胞において増殖反応を誘導するためのＧＳＫ３阻害剤の比較結果を示す図である。図１３に記載されるように培養したＭＤＣＫ細胞の画像化領域からのＥｄＵ陽性核を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を使用して定量し、各領域におけるＤＡＰＩ染色核の総数に対するＥｄＵ陽性細胞数の平均パーセンタイルとしてグラフ化した。各実験条件について最低４つの細胞領域をこの分析に含めた。（^＊および^＊＊＊、未処理の血清飢餓対照と比較してＥｄＵ陽性核の統計的に有意な増加について、それぞれｐ＜０．０５および０．００１）。この標的化分析において調べたＧＳＫ３Ｉの中で、チデグルシブは、これらの血清制限条件下で試験したＧＳＫ３Ｉ濃度範囲にて最も頑強な有糸分裂反応を支持した。 チデグルシブ処理に反応する出生後のコルチ器における有糸分裂活性細胞のＥｄＵ標識化を示す図である。出生後３日目のＯＣを採取し、２４時間、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養し、その後、０．５または２．０μＭの最終濃度にてビヒクルのみ（ＤＭＳＯ）またはチデグルシブ（ＴＩＤＥ）のいずれかの存在下で１０μＭのＥｄＵを含有する培養培地を添加した。器官型培養物をこれらの薬剤の存在下で７２時間連続的に培養し、その後、上記のように固定し、ＥｄＵ陽性核を可視化した。各群からのＯＣの中回転の画像を示す。括弧は、各画像における感覚上皮領域を示す。ビヒクルにより処理した対照と比較して、チデグルシブは、培養したコルチ器の感覚上皮領域において顕著に大きな有糸分裂反応を誘導した。 ネオマイシン（０．７ｍＭ）に２４時間曝露し、続いてＧＳＫ３阻害剤チデグルシブ（ＴＩＤＥ）および／またはｓｉＨＥＳ１（２０ｎＭ）リポフェクション複合体（ＪｅｔＳＩ、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ）の存在下または非存在下で回収した後のマウスＯＣの器官型培養物の中−頂および中領域から定量した有毛細胞（Ｍｙｏ７ａ＋細胞）を示す図である。より多くのＨＣ数が、ＴＩＤＥおよびｓｉＨＥＳ１の組合せにより処理した培養物においてＯＣの中−頂および中回転の両方において観察され、ＴＩＤＥ、次いでｓｉＨＥＳ１の段階的適用により、ＨＣ数の最も有意な増加が生じた。^＊＊および^＊＊＊、ＮＥＯ処理のみと比較してｐ＜０．０１および０．００１。＃＃、ＮＥＯ＋ｓｉＨＥＳ１処理と比較してｐ＜０．０１。 ネオマイシン（０．７ｍＭ）に２４時間曝露し、続いてＧＳＫ３阻害剤チデグルシブ（ＴＩＤＥ）および／またはｓｉＨＥＳ１（２０ｎＭ）リポフェクション複合体（ＪｅｔＳＩ、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ）の存在下または非存在下で回収した後のマウスＯＣの器官型培養物の中−頂および中領域から定量した有毛細胞（Ｍｙｏ７ａ＋細胞）を示す図である。より多くのＨＣ数が、ネオマイシンの７２時間後にｓｉＨＥＳ１により処理した培養物においてＯＣの中−頂および中回転の両方において観察されたが、ＴＩＤＥ、次いでｓｉＨＥＳ１処理の段階的組合せは、ＯＣの中および中−頂回転の両方においてＨＣ数の相乗的増加を生じた。^＊および^＊＊＊、ＮＥＯ処理のみと比較してｐ＜０．０５および０．００１。＃＃＃、ＮＥＯ＋ｓｉＨＥＳ１処理と比較してｐ＜０．０１。 図２３に記載される実験からのＮＥＯにより損傷した器官型培養物の中で、対照および処置群からのＯＣの中回転のＭｙｏ７ａ免疫標識を示す図である。 ネオマイシン（０．７ｍＭ）に２４時間曝露し、続いてＧＳＫ３阻害剤チデグルシブ（ＴＩＤＥ）および／またはｓｉＨＥＳ１（２０ｎＭ）リポフェクション複合体（ＪｅｔＳＩ、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ）の存在下または非存在下で回収した後のマウスＯＣの器官型培養物の中−頂、中、および中−基底領域から定量した有毛細胞（Ｍｙｏ７ａ＋細胞）を示す図である。１組のＮＥＯにより除去したＯＣを、チデグルシブの効果を潜在的に増強する目的の培地補足物として２ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−２の存在下でＴＩＤＥ、次いでｓｉＨｅｓ１により処理した。より多くのＨＣ数が、ＴＩＤＥおよびｓｉＨＥＳ１の段階的組合せにより処理した培養物においてＯＣの中−頂および中回転の両方において観察されたが、増殖培地へのＦＧＦ−２の添加は、典型的にはＨＣ再生に対してより抵抗性である領域である、ＯＣの中−基底回転を通して効果を増強した。^＊および^＊＊＊、ＮＥＯ処理のみと比較してｐ＜０．０５および０．００１。＃＃＃、ＮＥＯ＋ｓｉＨＥＳ１処理と比較して、または注記したように処理群の中でｐ＜０．０１。 図２５に記載される実験からのＮＥＯにより損傷した器官型培養物の中で、対照および処理群からのＯＣの中回転のＭｙｏ７ａ免疫標識を示す図である。 哺乳動物Ｈｅｓ１転写産物の間で保存された標的部位を有する２つの異なるｓｉＨＥＳ１分子を使用して、マウス内耳細胞株（ＩＭＯ−２Ｂ１）における偽処理した対照と比較したＨｅｓ１ノックダウン効率の比較用量曲線分析からの逆転写−定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ｑＰＣＲ）結果を示す図である。ＳｉＲＮＡ分子を、市販のトランスフェクション剤（ＲＮＡｉＭＡＸ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ．）を使用して、ＩＭＯ−２Ｂ１のサブコンフルエントウェルにトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、全ＲＮＡを単離し、Ｈｅｓ１およびハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対するプライマーを使用して、ＲＴ−ｑＰＣＲ分析に供した。相対Ｈｅｓ１レベルを２^{−ΔΔＣＴ}法により決定した（その全体が参照により組み込まれる、ＬｉｖａｋおよびＳｃｈｍｉｔｔｇｅｎ（２００１年）Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５（４）：４０２〜４０８頁を参照のこと）。分子＃７を使用した最適なノックダウンがわずかな程度の２ｎＭのｓｉＲＮＡ（分子＃１に必要な約２０ｎＭと比較して）を使用して観察されたので、Ｈｅｓ１転写レベルを枯渇させるための分子＃７の見かけの効力は分子＃１のものよりもかなり大きかった。 ２０，０００（左パネル）および４０，０００（右パネル）倍の倍率での、ｓｉＨｅｓ１ ＰＥＧ−ＰＬＧＡ ＮＰの代表的な走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を示す図である。 ＩＭＯ−２ｂ１内耳細胞におけるフルオロフォアがコンジュゲートしたｓｉＲＮＡ担持ＰＥＧ−ＰＬＧＡ ＮＰの用量依存的取り込みを実証するグラフを示す図である。 ＦＡＭ ｓｃＲＮＡ（緑色、左上パネル）およびＡＦ５５５−ＰＬＧＡ（赤色、右上パネル）の洗浄、固定および共焦点顕微鏡画像化の前の漸増用量（２００、４００、または８００μｇ／ｍＬ）のＮＰとの２４時間インキュベーション後のＩＭＯ−２ｂ１におけるＤｕａｌ Ｆｌｕｏｒ ＰＬＧＡ ＮＰの内在化および局在化を示す図である。青色標識化（左下パネル）は細胞核のＤＡＰＩ染色を表す。融合画像（右下パネル）は、内在化ＮＰからのｓｃＲＮＡとＰＬＧＡとの間のシグナル（黄色）の重複を示す。スケールバーは１０μｍであり、全ての画像に適用される。 図３０からの８００μｇ／ｍＬの共焦点画像セットの拡大を示す図である。 ＦＡＭ ｓｃＲＮＡ（緑色、左上パネル）およびＡＦ５５５−ＰＬＧＡ（赤色、右上パネル）の洗浄、固定および共焦点顕微鏡画像化の前の漸増用量（２００、４００、または８００μｇ／ｍＬ）のＮＰとの２４時間インキュベーション後のＩＭＯ−２ｂ１細胞におけるＤｕａｌ Ｆｌｕｏｒ ＰＥＧ−ＰＬＧＡ ＮＰの内在化および局在化を示す図である。青色標識（左下パネル）は細胞核のＤＡＰＩ染色を表す。融合画像（右下パネル）は、内在化ＮＰからのｓｃＲＮＡとＰＥＧ−ＰＬＧＡとの間のシグナル（黄色）の重複を示す。スケールバーは１０μｍであり、全ての画像に適用される。 図３２からの８００μｇ／ｍＬの共焦点画像セットの拡大を示す図である。 内耳細胞生存率に対する新たなｓｉＨｅｓ１担持ＰＥＧ−ＰＬＧＡ ＮＰ製剤の用量漸増からの潜在的な細胞毒性効果の評価からの結果を示す図である。 ｓｉＨｅｓ１担持ＰＬＧＡ ＮＰと比較した、新たなｓｉＨｅｓ１担持ＰＥＧ−ＰＬＧＡ ＮＰ製剤の用量漸増によって達成された内耳細胞における相対Ｈｅｓ１サイレンシング効率のペアワイズ比較評価からの結果を示す図である。 並行して合成したｓｉＨｅｓ１担持ＰＬＧＡ ＮＰと比較した、新たなｓｉＨｅｓ１担持ＰＥＧ−ＰＬＧＡ ＮＰ製剤の用量漸増によって達成された、内耳細胞のタンパク質レベルにおける相対的Ｈｅｓ１サイレンシング効率の比較評価からの結果を示す図である。 ＧＳＫ３阻害が、オトトキシンにより除去したＯＣにおけるＨＣ数を回復するようにｓｉＨｅｓ１ ＮＰと相乗作用することを示す図である。出生後（Ｐ３）マウス（ＣＤ１）ＯＣ外植片を、耳毒性アミノグリコシド、ネオマイシンに２４時間曝露し、次いで６０ｎＭのｓｉＨｅｓ１ ＮＰのみ；ＧＳＫ３阻害剤、チデグルシブ（ＴＩＤＥ）のみ（２μＭ）；または６０ｎＭのｓｉＨｅｓ１ ＮＰと漸増用量のチデグルシブ（０．５、２、または１０μＭ）との組合せにより６日間処理し、その後、ＨＣ特異的マーカーであるＭｙｏ７ａに対して固定し、免疫標識した。示した画像間の固定基準として中回転。 ＴＩＤＥが、オトトキシンにより除去したＯＣにおけるＨＣ数を回復するようにｓｉＨｅｓ１ ＮＰと相乗作用することを示す図である。ＮＥＯにより除去したＯＣを、単独で、または漸増用量のＴＩＤＥと組み合わせて、準最適な（６０ｎＭ）用量のｓｉＨｅｓ１ ＮＰにより処理した。ＨＣ定量により、チデグルシブおよび低用量のｓｉＨｅｓ１ ＮＰ処理を組み合わせた場合、ＯＣの中および中−基底回転におけるＨＣ数の相乗的増加が明らかになった。ｓｉＨｅｓ１ ＮＰの持続放出プロファイルは２つの療法の段階的適用を模倣する。有毛細胞密度の用量依存的増加が、ＴＩＤＥおよびｓｉＨｅｓ１ ＮＰによる共処理の際にＯＣ全体を通して観察された。^＊および^＊＊＊、ＮＥＯ処理のみと比較してｐ＜０．０５および０．００１。＃および＃＃＃、ＮＥＯ＋ｓｉＨｅｓ１ ＮＰ処理と比較してｐ＜０．０５および０．００１。ｎ＝５ＯＣ／条件。 騒音により聴力を失ったモルモットにおける聴覚機能の回復に対するｓｉＨＥＳ１ナノ粒子の１日の注入の結果を示す図である。モルモットを、聴力を失う騒音レベル（４ｋＨｚを中心とする１２５ｄＢ ＳＰＬオクターブ帯域ノイズ）に３時間曝露した。音響外傷の７２時間後、偽（すなわち、非ターゲティングスクランブルＲＮＡ、ｓｃＲＮＡ）または治療用Ｈｅｓ１ ｓｉＲＮＡ（ｓｉＨｅｓ１）のいずれかを担持したＰＬＧＡ ＮＰ（８００μｇ／ｍＬ）を、２４時間（１日注入）にわたって１時間当たり１．０μＬの速度にてミニ浸透圧ポンプによって蝸牛に送達した（蝸牛開窓術）。聴性脳幹反応（ＡＢＲ）測定値を処置後３週間にて記録し、平均ＡＢＲ閾値回復（すなわち、音響過剰曝露の１日後と比較した聴力回復）を、各群について２〜１６ｋＨｚの試験周波数にわたってプロットした。損傷を与える騒音曝露は、全ての試験周波数にわたって顕著な難聴（すなわち、高ＡＢＲ閾値シフト）を誘発したが、ｓｉＨｅｓ１ ＮＰにより処置した耳は、ｓｃＲＮＡ ＮＰにより処置した耳と比較して、２〜１６ｋＨｚ範囲全体にわたって閾値回復の有意な改善を示した（^＊および^＊＊＊、ｐ＜０．０５および０．００１；各群についてｎ＝６）。 ２、４、８および１６ｋＨｚの試験周波数での音響過剰曝露の１日後と比較した、処置後９週間の外科的に注入した（１日投与）耳における、ｉｎ ｖｉｖｏでのｓｃＲＮＡ ＮＰまたはｓｉＨＥＳ１ ＮＰのいずれかによる遅延（損傷後７２時間）治療介入後の聴力を失った後の生きているモルモットにおけるＡＢＲ閾値回復の差を示す図である。ここで観察された閾値回復に対するｓｉＨＥＳ１ ＮＰ処置に特異的な改善の程度は、臨床的に有意であると予測される（^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１）。 ｓｉＨＥＳ１ ＮＰ処置が、騒音に曝露された成熟色素沈着モルモットにおいて、処置された耳からの蝸牛の基底回転におけるＨＣ数を回復することを実証する図である。偽（ｓｃＲＮＡ）および（ｓｉＨｅｓ１）ＮＰにより処置した耳におけるＭｙｏ７ａおよびファロイジンによる標識化により、ｓｃＲＮＡ ＮＰを注入した耳におけるＯＨＣの明白な喪失、および騒音により除去したモルモット蝸牛の中および基底回転の両方におけるｓｉＨｅｓ１ ＮＰにより処置した耳におけるＯＨＣ数の顕著な回復が明らかにされた。矢印は、形態学的に成熟したＨＣのｄｅ ｎｏｖｏ産生と一致する、ｓｉＨｅｓ１ ＮＰにより処置した耳のＩＨＣ領域において独自に観察される不動毛束（矢じり）を有する異所性Ｍｙｏ７ａ陽性ＨＣの発生を示す。

１．定義
本明細書に使用される場合、「に十分な量」という用語は、意図した効果の達成を可能にする、例えば、内耳の組織における遺伝子の発現を減少させる量を指す。このような量は、意図した効果に基づいて、当技術分野において公知の種々のアッセイによって決定することができる。

本明細書に使用される場合、「適用すること」または「投与すること」という用語は、指定された薬剤、組成物、または力を、指定された領域または対象に導入する全ての手段を指す。「投与」または「適用」は、治療の過程を通して１回の用量で、連続的または断続的に行うことができる。最も効果的な投与手段および投与量を決定する方法は、当業者に公知であり、療法に使用される組成物、療法の目的、治療される標的細胞、および治療される対象によって異なる。単回または複数回の投与は、治療する医師によって選択される用量レベルおよびパターンにより実施され得る。適切な投薬製剤および薬剤を投与する方法は当技術分野において公知である。投与経路も決定することができ、最も効果的な投与経路を決定する方法は当業者に公知であり、治療に使用される組成物、治療の目的、治療される対象の健康状態または病期、および標的細胞または組織によって異なる。投与経路の非限定的な例には、経口投与、経鼻投与、吸入、注射、および局所適用が含まれる。投与は工業的および治療的適用における使用のためであってもよい。

本明細書に使用される場合、「生分解性」という用語は、使用中に分解することを意図される、ポリマー、組成物、および製剤などの物質を記載するために本明細書に使用される。生分解性物質はまた、「生体適合性」でもあり得、すなわち、生体組織に有害ではない。非限定的な例示的な生分解性物質には、任意選択でペグ化されている、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）およびポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）が含まれる。

本明細書に使用される場合、「ＢＩＯ」または「６−ブロモインジルビン−３’−オキシム」という用語は、以下に示される構造を有する化合物および薬学的に許容されるその塩を指す：

本明細書に使用される場合、「細胞」という用語は、真核細胞を指す。「有毛細胞」という用語は、顕微鏡下で微細な毛のように見える長い繊毛（例えば、不動毛および／または動毛）を有することを特徴とする感覚上皮細胞を指し；本明細書に使用される場合、有毛細胞（ＨＣ）は、それらの位置、例えば、内耳有毛細胞（ＩＨＣ）または外耳有毛細胞（ＯＨＣ）によって識別され得る。このような有毛細胞は、少なくとも耳のコルチ、斑、および稜の蝸牛器官に存在することが知られている。

本明細書に使用される場合、「分化」という用語は、特定の成熟／特殊化した細胞型の形質と一致する、および／またはそれらを促進／維持する特定の遺伝子産物を産生する、成熟／特殊化した細胞型の細胞（例えば、有毛細胞）に細胞を発達させる特定の状態を指す。

本明細書に使用される場合、「発現」という用語は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡが続いてペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。遺伝子の発現レベルは細胞または組織試料中のｍＲＮＡまたはタンパク質の量を測定することによって決定することができ、さらに、複数の遺伝子の発現レベルは特定の試料についての発現プロファイルを確立するために決定することができる。発現の文脈に使用される場合、「増加する」という用語は、転写および／または翻訳の量を増加させるのに役立つ１つまたは複数の作用を指す。同様に、「減少する」という用語は、転写および／または翻訳の量を減少させるのに役立つ１つまたは複数の作用を指す。

本明細書に使用される場合、「遺伝子」という用語は、ＲＮＡがコーディング（例えば、ｍＲＮＡ）であるか、または非コーディング（例えば、ｎｃＲＮＡ）であるかに関わらず、ＲＮＡ分子に転写される任意の核酸配列を広範に含むことを意味する。

本明細書に使用される場合、「ＧＳＫ−３」という用語は、この名称に関連するタンパク質、すなわち、セリンおよびトレオニンアミノ酸残基上へのリン酸塩分子の付加を媒介するセリン／トレオニンプロテインキナーゼを指す。

本明細書に使用される場合、「Ｈｅｓ１」（ＨｅｓファミリーＢＨＬＨ転写因子１、クラスＢ塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックスタンパク質３９、ヘアリー様タンパク質、ヘアリーホモログ、ＢＨＬＨｂ３９、ＨＨＬ、ＨＲＹ、ヘアリーアンドエンハンサーオブスプリット１（Ｈａｉｒｙ Ａｎｄ Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｏｆ Ｓｐｌｉｔ １）、（ショウジョウバエ）、ヘアリーアンドエンハンサーオブスプリット１、ヘアリーホモログ（ショウジョウバエ）、ＨＥＳ−１、またはＨＬとしても知られている）という用語は、この名称および／またはＧＣＩＤ：ＧＣ０３Ｐ１９４１３６、ＨＧＮＣ：５１９２、Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子：３２８０、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１１４３１５、ＯＭＩＭ：１３９６０５、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１４４６９（これらの各々はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に関連する遺伝子および結果として生じるタンパク質産物、ならびに限定されないが、ヒト、マウス、ラット、モルモット、およびチンチラを含む、特定の種におけるそれらのホモログまたはオルソログを指す。ヒトＨｅｓ１の非限定的な例示的なアミノ酸配列は本明細書以下に提供される（配列番号１３）：
MPADIMEKNSSSPVAATPASVNTTPDKPKTASEHRKSSKPIMEKRRRARINESLSQLKTLILDALKKDSSRHSKLEKADILEMTVKHLRNLQRAQMTAALSTDPSVLGKYRAGFSECMNEVTRFLSTCEGVNTEVRTRLLGHLANCMTQINAMTYPGQPHPALQAPPPPPPGPGGPQHAPFAPPPPLVPIPGGAAPPPGGAPCKLGSQAGEAAKVFGGFQVVPAPDGQFAFLIPNGAFAHSGPVIPVYTSNSGTSVGPNAVSPSSGPSLTADSMWRPWRN

本明細書に使用される場合、「Ｈｅｓ５」（ＨｅｓファミリーＢＨＬＨ転写因子５、クラスＢ塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックスタンパク質３８、ヘアリーアンドエンハンサーオブスプリット５、ＢＨＬＨｂ３８、ヘアリーアンドエンハンサーオブスプリット５（ショウジョウバエ）としても知られている）という用語は、この名称および／またはＧＣＩＤ：ＧＣ０１Ｍ００２５２８、ＨＧＮＣ：１９７６４、Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子：３８８５８５、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１９７９２１、ＯＭＩＭ：６０７３４８、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ５ＴＡ８９（これらの各々はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に関連する遺伝子および結果として生じるタンパク質産物、ならびに限定されないが、ヒト、マウス、ラット、モルモット、およびチンチラを含む、特定の種におけるそれらのホモログまたはオルソログを指す。ヒトＨｅｓ５の非限定的な例示的なアミノ酸配列は本明細書以下に提供される（配列番号１４）：
MAPSTVAVELLSPKEKNRLRKPVVEKMRRDRINSSIEQLKLLLEQEFARHQPNSKLEKADILEMAVSYLKHSKAFVAAAGPKSLHQDYSEGYSWCLQEAVQFLTLHAASDTQMKLLYHFQRPPAAPAAPAKEPKAPGAAPPPALSAKATAAAAAAHQPACGLWRPW

本明細書に使用される場合、「阻害剤」という用語は、分子（例えば、タンパク質、核酸、または他の生物学的分子）が特定の反応に関与することを抑制または阻止する組成物または薬剤を指す。例えば、ＧＳＫ−３阻害剤は、ＧＳＫ−３がその生物学的機能の１つまたは複数に関与するのを阻止する組成物または薬剤を指すために使用され得る。非限定的な例示的なＧＳＫ−３阻害剤には、ＢＩＯ、ＴＩＤＥ、カイロン（Ｃｈｉｒｏｎ）化合物、塩化リチウム、およびＳＢ−２１６７６３が含まれる。

本明細書に使用される場合、「ＭＡＰＫ１」（分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ１、細胞外シグナル制御キナーゼ２、分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ２、ＭＡＰキナーゼアイソフォームＰ４２、ＭＡＰキナーゼ１、ＭＡＰキナーゼ２、ＥＣ２．７．１１．２４、Ｐ４２−ＭＡＰＫ、ＭＡＰＫ２、ＰＲＫＭ１、ＰＲＫＭ２、ＥＲＫ−２、ＥＲＫ２、ＥＲＴ１、プロテインチロシンキナーゼＥＲＫ２、ＥＣ２．７．１１、Ｐ４２ＭＡＰＫ、Ｐ４１ｍａｐｋ、ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫ２、Ｐ４０、Ｐ３８、ＥＲＫ、Ｐ４１としても知られている）という用語は、この名称および／またはＧＣＩＤ：ＧＣ２２Ｍ０２１７５４、ＨＧＮＣ：６８７１、Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子：５５９４、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１０００３０、ＯＭＩＭ：１７６９４８、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ２８４８２（これらの各々はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に関連する遺伝子および結果として生じるタンパク質産物、ならびに限定されないが、ヒト、マウス、ラット、モルモット、およびチンチラを含む、特定の種におけるそれらのホモログまたはオルソログを指す。ヒトＭＡＰＫ１（アイソフォーム１）の非限定的な例示的なアミノ酸配列は本明細書以下に提供される（配列番号１５）：
MAAAAAAGAGPEMVRGQVFDVGPRYTNLSYIGEGAYGMVCSAYDNVNKVRVAIKKISPFEHQTYCQRTLREIKILLRFRHENIIGINDIIRAPTIEQMKDVYIVQDLMETDLYKLLKTQHLSNDHICYFLYQILRGLKYIHSANVLHRDLKPSNLLLNTTCDLKICDFGLARVADPDHDHTGFLTEYVATRWYRAPEIMLNSKGYTKSIDIWSVGCILAEMLSNRPIFPGKHYLDQLNHILGILGSPSQEDLNCIINLKARNYLLSLPHKNKVPWNRLFPNADSKALDLLDKMLTFNPHKRIEVEQALAHPYLEQYYDPSDEPIAEAPFKFDMELDDLPKEKLKELIFEETARFQPGYRS

本明細書に使用される場合、「磁気応答性」という用語は、磁気として知られる物理現象から生じる引力または反発力に応答する粒子または作用物質の能力を指す。いくつかの実施形態では、磁気応答性であることにより、磁気勾配の適用による粒子または作用物質の制御された移動または輸送が可能となる。「磁気応答性」作用物質の非限定的な例は酸化鉄であり、ある特定の酸化鉄粒子は超常磁性であってもよい。このような超常磁性酸化鉄粒子は、マクロスケール、マイクロスケール、またはナノスケールであってもよい。ナノスケールの超常磁性酸化鉄粒子はＳＰＩＯＮという省略表現で称される。

本明細書に使用される場合、「ミクロスフェア」という用語は、約１〜約１０００ミクロンの範囲のサイズを有する、例えば、対象組成物などの生体適合性ポリマーから形成される、実質的に球形のコロイド構造を含む。マイクロカプセルは一般にポリマー製剤などの、ある種の物質によって覆われているので、一般に「マイクロカプセル」はミクロスフェアと区別することができる。「微粒子」という用語は、ミクロスフェアおよびマイクロカプセル、ならびに上記の２つのカテゴリーのいずれかに容易に分類できない構造であり、全て平均約１０００ミクロン未満の寸法を有する。構造が直径約１ミクロン未満である場合、対応する技術分野で認識されている用語である「ナノスフェア」、「ナノカプセル」、および「ナノ粒子」を利用することができる。

「薬学的に許容される担体」（または「薬学的に許容される賦形剤」）という用語は、本明細書に開示される組成物に使用され得る任意の希釈剤、賦形剤、または担体を指す。薬学的に許容される担体には、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えば、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール、ミクロスフェア、微粒子、またはナノ粒子（例えば、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）などの生分解性ポリマーを含む）、および羊毛脂が含まれる。適切な医薬担体は、この分野の標準参照テキストである、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙに記載されている。それらは、意図される投与形態、すなわち、経口錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、シロップ剤などに関して選択され得、従来の薬務と両立し得る。

本明細書に使用される場合、「可塑性」という用語は、ある細胞（例えば、幹細胞）が別の細胞の特徴を呈する能力を指し、一般に分化の文脈に使用される。「多能性」という用語は、いくつかの異なる細胞型を生じる細胞の能力を指す。

本明細書に使用される場合、「ポリマー」という用語は、反復サブユニットから構成される分子を指す。一般に、ポリマーは、「低分子化合物」として分類されているそれらの分子に比べて、より大きな分子量を有する傾向がある。

本明細書に使用される場合、「置換すること」または「再生すること」という用語は、有毛細胞の再生、再成長、または回復を指す。「保護する」という用語は、有毛細胞喪失の阻止または軽減を意図する。

本明細書に使用される場合、診断または治療の「対象」という用語は、細胞または哺乳動物などの動物もしくはヒトである。診断または治療の対象となる非ヒト動物は、命名された疾患または状態（例えば、難聴）を患うものまたはその動物モデル、例えば、サル、マウス、例えば、ラット、マウス、チンチラ、イヌ科、例えば、イヌ、ウサギ科、例えば、ウサギ、家畜、スポーツ動物、およびペットである。

本明細書に使用される場合、「ｓｉＲＮＡ」という用語は、特定の遺伝子または転写後の遺伝子の発現を干渉する二本鎖ＲＮＡ分子を意図する。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉経路を使用して遺伝子発現を干渉または阻害するように機能する。同様の干渉または阻害効果が、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍＲＮＡ）および／または１つもしくは複数の修飾核酸残基を含む核酸（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡなど）、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、アンロックド核酸（ＵＮＡ）、またはトリアゾール連結ＤＮＡのうちの１つまたは複数によって達成され得る。

本明細書に使用される場合、「ＴＩＤＥ」または「チデグルシブ」という用語は、以下に示される構造を有する化合物、ならびに薬学的に許容されるその塩および誘導体を指す：

意図される誘導体の非限定的な例には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１４／００５１９５号に開示されているものが含まれる。そのようなＴＩＤＥ誘導体はＴＩＤＥと同じ機能を有し得るが、改善された安定性、溶解性、または薬物動態のために修飾されてもよい。本明細書において意図される誘導体のさらなる非限定的な例には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｏｒａｌｅｓ−Ｇａｒｃｉａら、（２０１２年）ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｎｕｅｒｏｓｃｉ．３：９６３〜９１７頁に開示されているものが含まれる。ＴＩＤＥに関連するＧＳＫ３阻害剤およびその誘導体には、ＧＳＫ３阻害剤類似体のＴＤＺＤファミリーが含まれる。

本明細書に使用される場合、「組織」という用語は、生きているもしくは死んだ生物の組織、あるいは生きているもしくは死んだ生物に由来するか、またはそれらを模倣するように設計された任意の組織を指す。

本明細書に使用される場合、「治療有効量」という用語は、所望の効果を達成するのに十分な量を指す。治療的適用の文脈において、有効量は、問題となる状態の種類および重症度、ならびに全身の健康状態、年齢、性別、体重、および医薬組成物に対する耐性などの個々の対象の特徴に依存する。免疫原性組成物の文脈において、いくつかの実施形態では、有効量はバイオフィルムの分解を生じるのに十分な量である。他の実施形態では、免疫原性組成物の有効量は、抗原に対する抗体生成をもたらすのに十分な量である。いくつかの実施形態では、有効量は、それを必要とする対象に対して受動免疫を与えるのに必要な量である。免疫原性組成物に関して、いくつかの実施形態では、有効量は、上記の要因に加えて、意図される使用、特定の抗原化合物の免疫原性の程度、および対象の免疫系の健康／応答性に依存する。当業者は、これらおよび他の要因に応じて適切な量を決定することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの適用の場合、いくつかの実施形態では、有効量は、問題になっている適用の大きさおよび性質に依存する。それはまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの標的の性質および感受性、ならびに使用方法に依存する。当業者は、これらおよび他の考慮に基づいて有効量を決定することができる。有効量は、実施形態に応じて、組成物の１回または複数回の投与を含んでもよい。

本明細書に使用される場合、「治療すること」または「治療」という用語は、疾患、障害または状態が、疾患、障害および／もしくは状態にかかりやすいか、またはそれらを有する対象において発生することを阻止すること；疾患、障害または状態を阻害すること、例えば、その進行を妨げること；ならびに疾患、障害または状態を軽減または好転させること、例えば、疾患、障害および／または状態の退縮を引き起こすことを含む。疾患または状態を治療することはまた、特定の疾患または状態の少なくとも１つの症状を改善することを含んでもよい。「難聴」という用語は、音を感知する能力の機能障害を指し、したがって、その治療は、音を感知する能力に対する上記に列挙した効果のいずれか１つを意味する。「感音難聴」という用語は、内耳または内耳から脳への神経経路に損傷がある特定の種類の難聴を指す。

２．本開示を実施する方法
本開示の態様は、１つまたは複数の薬剤または組成物を耳の特定の組織または領域に適用することによって、難聴、任意選択で感音難聴を治療する方法、および／または有毛細胞を置換、再生、もしくは保護する方法に関する。

本明細書に開示される方法に基づいて治療され得る耳の領域は、図１に名称を記している、その外耳、中耳、または内耳領域を含むが、これらに限定されない。

組成物
本開示の態様は、内耳の組織における遺伝子の発現を減少させる組成物または薬剤と、第２の薬剤とに関する。

いくつかの実施形態では、内耳の組織における遺伝子の発現を減少させる組成物または薬剤は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）などの干渉核酸、および／または１つもしくは複数の修飾核酸残基を含む核酸である。いくつかの実施形態では、干渉核酸は、目的の組織への送達の前および／または送達の際に分解を最小化するように、（配列に基づいて）最適化されるか、または化学的に修飾される。これらの干渉核酸についての商業的に入手可能な供給源には、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ａｍｂｉｏｎ、Ｏｒｉｇｅｎｅ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、およびＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、このような最適化および／または修飾は、干渉核酸の十分なペイロードが目的の組織に送達されることを確実にするために行われ得る。他の実施形態は、発現を制限するために遺伝子のＤＮＡに結合することによって遺伝子の発現を減少させるように設計された低分子、アプタマー、もしくはオリゴヌクレオチド、例えばアンチジーンオリゴヌクレオチドの使用、あるいは限定されないが、前記遺伝子の発現が低減されるように標的化転写産物もしくは遺伝子産物または１つもしくは複数の他のタンパク質に直接的に結合することを含む機構を介して転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）を課すように設計された低分子、アプタマー、もしくはオリゴヌクレオチドの使用、あるいは特定の遺伝子の発現を低減させる他の低分子デコイの使用を含む。いくつかの実施形態では、内耳の組織における遺伝子の発現を減少させる組成物または薬剤は、遺伝子が調節される経路の阻害剤、例えば、ガンマセクレターゼ阻害剤などのＮｏｔｃｈシグナル伝達経路阻害剤を含んでもよい（例えば、Ｈｅｓ１の転写がＮｏｔｃｈシグナル伝達によって媒介されるからである）。

いくつかの実施形態では、遺伝子は、Ｈｅｓ１、Ｈｅｓ５、またはＭＡＰＫ１である。非限定的な例示的なこれらの遺伝子の配列およびそれらに対するｓｉＲＮＡ配列は、例えば、米国特許第９，１０１，６４７号に提供されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。さらなる非限定的な例示的なｓｉＲＮＡ配列は、配列番号１〜２４（これらの配列における小文字は任意選択であり、配列番号１〜１４はＨｅｓ１を対象とし、配列番号１５〜２０はＨｅｓ５を対象とし、配列番号２１〜２４はＭＡＰＫ１を対象とする）として本明細書以下に提供される。さらなる配列は、当技術分野において公知の方法、例えば、Ｆａｋｈｒら、（２０１６年）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２３（４）：７３〜８２頁に従って決定することができる。

いくつかの実施形態では、第２の薬剤はプライミング組成物である。いくつかの実施形態では、プライミング組成物は、βカテニンを安定化させること、内耳における多能性細胞の数を増加させること、内耳における既存の多能性細胞の可塑性を増加させること、または内耳の細胞における分化のためのシグナルを送ることからなる群から選択される１つまたは複数の機能を示す。いくつかの実施形態では、この第２の薬剤はＧＳＫ−３阻害剤である。さらなる実施形態では、ＧＳＫ−３阻害剤は、６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）またはチデグルシブ（ＴＩＤＥ）のいずれかである。いくつかの実施形態では、第２の薬剤は、限定されないが、ＧＳＫ−３阻害剤および／または発生シグナル伝達に関与する１つもしくは複数の因子（例えば、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ２および／またはＦＧＦ模倣物）などの１つまたは複数の成分を含んでもよく、このファミリーの非限定的な例は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＫａｔｏｈおよびＫａｔｏｈ（２００６年）Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ ５（９）：１０５９〜１０６４頁に提供されている。

製剤
いくつかの実施形態では、内耳の組織における遺伝子の発現を減少させる組成物は、製剤および／または粒子を含んでもよく、その製剤および／または粒子は、内耳の組織における遺伝子の発現を減少させる薬剤を含んでもよい。

このような製剤および／または粒子の非限定的な例には、ナノ粒子、リポフェクション、ゲルまたはヒドロゲル（例えば、Ｋｅｃｈａｉら、（２０１６年）Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．２２６：２４８〜５７頁）、ナノエマルション（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２８８２９２号）、微粒子（例えば、Ｙａｎｇら、（２０１２年）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．３３（２１）：３１７３〜８０頁）、コロイド懸濁液（例えば、Ａｒｉａｎａら、（２０１６年）Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ Ｓｕｒｇ．１５４（５）：９１７〜９頁）、滅菌懸濁液（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｉｐｒｏｄｅｘ．ｃｏｍ／におけるＣｉｐｒｏｄｅｘ）、溶液（例えば、Ｐａｒｒａら、（２００２年）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４６（３）：８５９〜６２頁）、エアロゾル（例えば、Ｌｉら、（２０１３年）ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．６０（９）：２４５０〜２４６０頁）、粉剤（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｆａｕｑｕｉｅｒｅｎｔ．ｂｌｏｇｓｐｏｔ．ｃｏｍ／２００９／１０／ｔｒｅａｔｍｅｎｔ−ｏｆ−ｃｈｒｏｎｉｃ−ｄｒａｉｎｉｎｇ−ｅａｒ．ｈｔｍｌ＃ｉｘｚｚ４５９ｗｃＲＫＯｒ）、点耳剤（例えば、Ｗｉｎｔｅｒｓｔｅｉｎら、（２０１３年）Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ Ｓｕｒｇ．１４８（２）：２７７〜８３頁）、ナノファイバー（例えば、Ａｋｉｙａｍａら、（２０１３年）Ｉｎｔ Ｊ Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ．８：２６２９〜２６４０頁）、またはクリーム（例えば、Ｑｕａｄｉｄｅｒｍ（登録商標）クリーム）が含まれる。本明細書上記に引用した全ての参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。

いくつかの実施形態では、製剤および／または粒子は、特に内耳への送達のために適合される。例えば、熱可逆性ヒドロゲル（例えば、プルロニックＦ−１２７）などのゲル製剤は、薬物が内耳に拡散または輸送され得るように、薬物が中耳に維持され、正円窓膜と接触することを可能にする。同様にコロイド懸濁液は、特に、内耳に直接的に注射するために製剤化されてもよいか、または正円窓膜を通る拡散もしくは他の輸送手段のために鼓膜を横切ってもよい。同様に、複数のナノ粒子を含むナノ粒子または製剤は、例えば、磁力による、制御された送達のために製剤化されてもよい。このような方法は、微粒子および／または別のナノスケール構造に一般化することができる。

いくつかの実施形態では、第２の薬剤は、内耳の組織における遺伝子の発現を減少させる薬剤と同一または異なる製剤および／または粒子に含まれてもよい。いくつかの実施形態では、第２の薬剤は、同じもしくは異なる製剤にあり、および／または標的組織へのその適用のタイミングを容易にするためであり、つまり、内耳の組織における遺伝子の発現を減少させる薬剤である粒子に対して同時または逐次的である。例えば、同時送達ではあるが、逐次放出の場合、第２の薬剤は、内耳の組織における遺伝子の発現を減少させる薬剤を含む持続放出製剤および／または粒子と共に投与される溶液に含まれてもよい。同様の効果は、異なる薬剤についての異なる放出プロファイルのために製剤化された両方の薬剤を含む単一の製剤および／または粒子の使用によって達成され得る。

いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、内耳の組織における遺伝子の発現を減少させる薬剤を含むか、または封入する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は生分解性ポリマーを含む。さらなる実施形態では、生分解性ポリマーは、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）またはペグ化ＰＬＧＡ（ＰＥＧ−ＰＬＧＡ）である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、限定されないが、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）または他の公知のナノ粒子安定剤を含む、さらなる添加剤を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、磁気応答性であるか、または磁気応答性粒子を含む。いくつかの実施形態では、磁気応答性粒子は、酸化鉄、任意選択で超常磁性（ｓｕｐｅｒｐａｒａｒｍａｇｎｅｔｉｃ）酸化鉄（ＳＰＩＯＮ）である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、溶液、懸濁液、ゲル、またはその送達に適した他の製剤にさらに含まれてもよい。

さらなる実施形態では、同じまたは異なるナノ粒子は、第２の薬剤を含んでもよいか、または封入してもよい。本明細書上記に開示されるナノ粒子は、油中水型エマルションまたは当技術分野において公知の任意の他の技術によって形成することができる。したがって、限定されないが、デュアルコア／シェル担持（例えば、Ｎａｒａｙａｎら、（２０１４年）Ａｃｔａ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ．２１１２〜２１２４頁）、共封入（例えば、Ｓｏｎｇら、（２００８年）Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍ．６９（２）：４４５〜５３頁）、および層ごとの堆積（例えば、Ｄｅｎｇら、（２０１３年）ＡＣＳ Ｎａｎｏ．７（１１）：９５７１〜９５８４頁）などの、１種より多い薬剤を含むナノ粒子を生成するための様々な選択肢が利用可能である。本明細書上記に引用した全ての参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。

ナノ粒子は、放出のタイミングを容易にするように製剤化されてもよく、例えば、難水溶性の第２の薬剤（例えば、ＴＩＤＥ）が、内耳の組織における遺伝子の発現を減少させる親水性薬剤（例えば、ｓｉＨｅｓ１）を担持したナノ粒子の有機シェルに封入されてもよい。第２の薬剤は、水により接近しやすいので、最初に放出され、続いて内耳の組織における遺伝子の発現を減少させる薬剤が持続放出される。

投与様式
上記に開示された薬剤、組成物、製剤および／または粒子は、内耳の組織における遺伝子の発現を減少させる薬剤の前または後に投与される第２の薬剤と同時にまたは逐次的に投与されてもよい。

投与量は、当技術分野において公知の方法によって容易に決定することができる。例えば、有効なｉｎ ｖｉｔｒｏ用量、例えば、約０．５から１０μＭの間の第２の薬剤（例えば、ＴＩＤＥ）および約２０から３２０ｎＭの間の内耳の組織における遺伝子の発現を減少させる薬剤（例えば、ｓｉＨｅｓ１）は、適切なｉｎ ｖｉｖｏ用量にスケールアップされてもよい。内耳の組織における遺伝子の発現を減少させる薬剤の非限定的な例示的なｉｎ ｖｉｖｏ用量は、約１００から３００ｎＭの間のｓｉＨｅｓ１である。いくつかの実施形態では、適切なｉｎ ｖｉｖｏ用量は、約５ｎＭから５ｍＭの第２の薬剤（例えば、ＴＩＤＥ）および約１ｎＭから５ｍＭの間の内耳の組織における遺伝子の発現を減少させる薬剤（例えば、ｓｉＨｅｓ１）の量であってもよい。適切な投与レジメン（ｒｅｇｉｍｅｎｔ）は、各薬剤について適切な間隔で１つまたは複数の用量を必要とし得ることが意図され、これらの間隔は薬剤または適応症によって変化させてもよい。適切な投与間隔は、約１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、１カ月、２カ月、３カ月またはそれ以上であってもよい。

いくつかの実施形態では、適用および／または投与は、例えば、指定された薬剤または組成物の直接適用、注射、または注入であってもよい。いくつかの実施形態では、指定された薬剤または組成物は、正円窓膜（ＲＷＭ）を通した直接注射によって、またはＲＷＭを通して配置された一時的もしくは永久的なカニューレを介した注入によって投与されてもよい。いくつかの実施形態では、注入または注射は、取り付けられた微量注入ポンプ、透析装置、または流体交換システムによって補助されてもよい。同様の実施形態では、注射または注入技術はまた、卵円窓、および／または卵円窓の靭帯もしくは輪に適用されてもよい。注射または注入はさらに、蝸牛開窓術または半規管の１つなどの骨迷路内への他の開口部を介して達成されてもよい。あるいは、皮質骨は迷路上で除去されてもよく、指定された薬剤または組成物は、骨内送達のために皮質除去された骨上に適用されてもよい。いくつかの実施形態では、組成物または薬剤は、静脈内または動脈内投与によって全身に送達される。

上記に列挙した投与経路は決して網羅的ではない。一般に、内耳への送達には様々な手段があるが、これらは、２つの一般的なカテゴリー、つまり、内耳への造瘻術（必要な場合、ドリル、ナイフ、またはレーザーで開口される）を介するものと、およびＲＷＭ、アブミ骨底板の靱帯を通る、または蝸牛の領域もしくは前庭構造を通る拡散を介するもの（典型的には、骨の領域は、内耳骨内膜裏層および流体から中耳空間を分離する非常に薄い骨だけが残るような厚さまで薄くされる）とに分類される。

いくつかの実施形態では、造瘻術が使用される場合、造瘻術は機械または手動で行われる。いくつかの実施形態では、造瘻術は、アブミ骨底板を介し、蝸牛へのドリルで開けられた開口部を介し、半規管へのドリルで開けられた開口部を介し、前庭水管を介し、蝸牛開窓術を介し、ＲＷＭへの直接的な開口部を介する。いくつかの実施形態では、造瘻術は、埋め込み電極を差し込むように行われ、したがって開示される製剤および／または粒子の１つまたは複数は、１つまたは複数の薬剤または組成物を環境に溶出するように電極表面に結合され得る。いくつかの実施形態では、造瘻術を受ける１つまたは複数の開口部は、約１日から約１週間、２週間、３週間、４週間、または１カ月の間、例えば約１から３０日の間、アクセス可能である。いくつかの実施形態では、造瘻術は、開口部がアクセス可能である期間にわたる単回注射または連続注入に適している。

いくつかの実施形態では、拡散が利用される場合、薬剤、組成物、製剤および／または粒子は、内耳液への特定の膜構造を横切る拡散を可能にする。非限定的な例示的な製剤には、溶液、ゲル、エマルション、または懸濁液が含まれる。例えば、ゲルまたはペレットは、本明細書上記に開示される１つまたは複数の薬剤、組成物、および／または粒子の送達に適し得る。例えば、ゲルは、送達のための表面積を増加させることによって送達を向上させるためにアブミ骨上およびＲＷＭ上および薄くなった骨の領域上に経鼓膜的に（ｔｒａｎｓｔｙｍｐａｎｉｃａｌｌｙ）配置されてもよい。同様に、固体または半固体のペレットが、前記膜との薬物接触を向上させ、薬物が中耳腔から除去されないようにする手段として、アブミ骨底板、ＲＷＭまたは薄くなった骨の領域に配置されてもよい。

理論に束縛されるものではないが、内耳液に薬物を送達するための低侵襲性の拡散アプローチの課題の１つは、ＲＷＭの表面積が小さいこと、およびアブミ骨底板の靭帯の表面積がさらに小さいことであり得る。いくつかの実施形態では、「ブルーライニング（ｂｌｕｅ−ｌｉｎｉｎｇ）」として当技術分野において公知の手順がこの問題を解決することができる。「ブルーライニング」により、穿孔領域は極めて薄くなり、内耳の内面上の骨内膜をぎりぎり覆う。これは、吸収のための表面積を大幅に増加させることができ、蝸牛または内耳の他の領域に実際の開口部を作製するよりも侵襲性が低くなり得る。熟練した耳の外科医は、この手順を安全に実施することができるはずである。

いくつかの実施形態では、送達は、鼓膜を横切る単回または複数回の注射で達成され得る。いくつかの実施形態では、送達は、鼓膜に挿入されたプラスチックチューブを介した単回または複数回の注射によって達成され得る。いくつかの実施形態では、送達は、カテーテルを介した連続注入によって達成され得、その先端は拡散が起こる領域に直接配置される。

キット
本明細書に記載されるｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ法を実施するのに必要な薬剤および指示書を含むキットも特許請求される。したがって、本開示は、本明細書に開示される１つまたは複数の薬剤、組成物、製剤および／または粒子を含み得る、これらの方法を実施するためのキット、ならびに、組織を採取することおよび／またはスクリーニングを実施すること、および／または結果を分析すること、および／または本明細書に定義される有効量の干渉剤の投与などの、本明細書に開示される方法を実施するための指示書を提供する。これらは、単独で、または他の適切な治療剤と組み合わせて使用することができる。

適応症
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される製剤、組成物、方法、投与様式、およびキットは、１つまたは複数の適応症の治療において使用され得る。本明細書に意図される非限定的な例示的な適応症には、大きな音、音響外傷、発破、毒素、ウイルスまたは細菌感染、加齢、感覚有毛細胞の喪失を伴う遺伝的難聴、および糖尿病または甲状腺機能低下症などの代謝状態に起因する蝸牛感覚有毛細胞の喪失をもたらす感音難聴が含まれる。さらなる非限定的な例示的な適応症には、毒素、外傷、ウイルスまたは細菌感染、加齢、遺伝的に誘導される平衡感覚有毛細胞の喪失または糖尿病もしくは甲状腺機能低下症などの代謝状態に起因する末梢前庭器官（稜または黄斑）における感覚有毛細胞の喪失または損傷に起因する平衡障害が含まれる。

３．実施例
以下の実施例は非限定的であり、本開示を実施する際の様々な場合において使用され得る手順を例示する。さらに、本明細書の以下に開示される全ての参考文献は、それらの全体が参照として組み込まれる。

ｓｉＨｅｓ１ナノ粒子の生成およびその評価
担持ナノ粒子の生成
この研究のために調製されるｓｉＲＮＡ担持ＰＬＧＡナノ粒子は、以前に報告されているように水中油中水型（ｗ１／ｏ／ｗ２）二重エマルション溶媒蒸発法によって製剤化した（Ｃｕｎら、（２０１０年）Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ３９０：７０〜７５頁；Ｄｕら、（２０１３年）Ｈｅａｒ．Ｒｅｓ．３０４Ｃ：９１〜１１０頁）。簡潔に述べると、ｓｉＲＮＡを５０μＬのＴＥ緩衝液（ＭｉｌｌｉＱ水中の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよび１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）に溶解し、１００ｍｇのＰＬＧＡを含有する１００ｍＬのジクロロメタン（ＤＣＭ）と混合し、混合物を超音波処理により一次ｗ１／ｏエマルションに乳化した。ＭｉｌｌｉＱ水中の５％（ｗ／ｖ）ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）４ミリリットルを一次エマルションに直接注ぎ、その後、３０秒×３の超音波処理によってさらに乳化して、ｗ１／ｏ／ｗ２二重エマルションを形成した。得られたエマルションをＭｉｌｌｉＱ水中の０．３％（ｗ／ｖ）ＰＶＡ５０ｍＬで希釈し、室温にて２時間磁気により撹拌してＤＣＭを蒸発させた。ＰＬＧＡナノ粒子を、４℃にて２０分間、１３，０００×ｇでの超遠心分離によって回収し、ＭｉｌｌｉＱ水で３回洗浄し、５ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水に再懸濁し、凍結乾燥した（−１００℃および４０ｍＴｏｒｒ以下）。ｓｉＲＮＡ担持ＮＰの最適な製剤を、１５ｎｍｏｌのｓｉＲＮＡ、１００ｍｇのＰＬＧＡ、および５％のＰＶＡから作製した。得られたＮＰを、動的光散乱（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ、Ｍａｌｖｅｒｎ、Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、ＵＫ）、ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計（ｎａｎｏＤｒｏｐ ２０００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、および走査型電子顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ｓｕｐｒａ ５５、ＶＰ、ＦＥ−ＳＥＭ、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、ドイツ）をそれぞれ使用して、平均粒径（ＰＭＤ）、多分散指数（ＰＤＩ）、薬物封入効率パーセント（ＥＥ％）、および形態について特性付けした。合成したＮＰは、通常、使用時まで−８０℃にて保存する。

ｉｎ ｖｉｔｒｏでのナノ粒子研究
新生児（Ｐ３）マウスのコルチ器（ＯＣ）を、オトトキシン、４−ヒドロキシル−２−ノネナール（４−ＨＮＥ、４５０μＭ）に２４時間曝露し、次いで未処理のままにするか、または非ターゲティングスクランブルＲＮＡ ＮＰ（ｓｃＲＮＡＮＰ）もしくはＨｅｓ１ ｓｉＲＮＡ担持ＰＬＧＡ ＮＰ（Ｈｅｓ１ ｓｉＲＮＡＮＰ）のいずれかで処理し、７日後、組織を固定し、フルオロフォアがコンジュゲートしたファロイジンにより標識した（図２）。あるいは、耳毒性アミノグリコシド、ネオマイシン（ＮＥＯ、０．７５ｍＭ）を使用し、その後、Ｈｅｓ１ ｓｉＲＮＡ担持ＰＬＧＡ ＮＰの治療適用、組織固定、ならびに有毛細胞マーカーであるミオシンＶＩＩａ（Ｍｙｏ７ａ）に対する抗体および蝸牛螺旋の長さに沿ったＨＣの免疫蛍光により媒介される定量を容易にするためにフルオロフォアがコンジュゲートしたファロイジンの両方により標識した親和性を用いて、上記と同じように実験を行った（図４）。用量依存反応を、Ｈｅｓ１ ｓｉＲＮＡ ＮＰ処理に反応するオトトキシン（４−ＨＮＥまたはＮＥＯ）のいずれかに曝露した新生児マウスＯＣの回復したＨＣの数において観察した（図３および５）。

ｉｎ ｖｉｖｏでのナノ粒子研究
成体色素沈着モルモット（２５０ｇ、４週齢）を、１３０ｄＢ ＳＰＬにて２時間、４ｋＨｚを中心とする音響過剰曝露に曝露した。損傷の７２時間後（すなわち、遅延処置）、８００μｇ／ｍＬの非ターゲティングスクランブルＲＮＡ ＮＰまたはｓｉＨＥＳ１ ＮＰのいずれかを充填したミニ浸透圧ポンプを、蝸牛の基底回転に外科的に移植し（蝸牛開窓術）、擬または治療的処置を、７日間にわたって蝸牛に片側注入し、その後、ポンプを外科的に除去した。２、４、８、および１６ｋＨｚでの聴性脳幹反応（ＡＢＲ）測定を、音響損傷の前、ならびに損傷後２４時間、２週間、４週間、８週間、および１０週間にて行った。最後の１０週のＡＢＲ記録期間の後、動物を安楽死させ、蝸牛組織を固定し、顕微解剖し、ＨＣの可視化および定量のためのマーカーにより免疫標識した。ｓｉＨＥＳ１ ＮＰにより処置し、騒音に曝露したモルモット由来の蝸牛は、非ターゲティングｓｃＲＮＡ ＮＰにより処置した騒音に曝露したモルモット由来の蝸牛と比較して、内側および外側のＨＣ数の両方の顕著な回復を示した（図９〜１０）。

成熟Ｃ５７ＢＬ／６マウス（４週齢）を音響過剰曝露（８〜１６ｋＨｚオクターブバンドノイズ、１１６ｄＢ ＳＰＬ）に２時間曝露した。損傷の７２時間後、８００μｇ／ｍＬのｓｉＨＥＳ１ ＮＰを充填したミニ浸透圧ポンプを後半規管に外科的に移植し、治療的処置を７日間にわたって片側注入し、その後、ポンプを外科的に除去した。処置の８週間後、動物を安楽死させ、蝸牛組織を固定し、顕微解剖し、ＨＣの可視化および定量のための抗Ｍｙｏ７ａにより免疫標識した。ｓｉＨＥＳ１ ＮＰにより処置し、騒音に曝露したマウス由来の蝸牛は、騒音に曝露した対照由来の蝸牛と比較して、内側および外側のＨＣ数（構造的に正確な位置における）の両方の顕著な回復を示した（図１１）。

ｉｎ ｖｉｔｒｏでの薬物放出研究
Ｈｅｓ１ ｓｉＲＮＡ担持ＰＬＧＡ ＮＰからのｉｎ ｖｉｔｒｏでの薬物放出研究を、Ｗａｎｇｅｍａｎｎ Ｐ、Ｓｃｈａｃｈｔ Ｊ、Ｄａｌｌｏｓ Ｐ、Ｐｏｐｐｅｒ ＡＮ、Ｆａｙ ＲＲ（Ｅｄｓ．）、Ｔｈｅ Ｃｏｃｈｌｅａ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９６年、１３０〜１８５頁から適合した透析法を使用して３連で実施した。具体的には、Ｈｅｓ１ ｓｉＲＮＡまたは封入した（遊離）Ｈｅｓ１ ｓｉＲＮＡを含有する１ｍｇの粉末ＰＬＧＡ ＮＰを、タンパク質を含まない１ｍＬの模倣外リンパ培地（ＳＰＭ）を含有する内側透析バッグ（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ Ｇ２、ＭＷＣＯ ２０ｋＤａ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｒａｎｃｈｏ Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ、ＣＡ）に懸濁した。コロイド懸濁液を含有するバッグを３ｍｌの模倣内リンパ培地（ＳＥＭ）に入れた。この系を３７℃にて水平水浴（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｗａｔｅｒ Ｂａｔｈ Ｍｏｄｅｌ １２１１、Ｓｈｅｌｄｏｎ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｉｎｇ Ｉｎｃ．、Ｃｏｒｎｅｌｉｕｓ、ＯＲ）に入れた。ＳＥＭの３つの１０μＬアリコートを特定の時間間隔で取り出し、３０μＬの新鮮なＳＥＭと置き換えて、シンク条件を維持した。平均薬物放出パーセント（％±標準偏差）を、各時点の間隔（１〜１０日）にて計算した。

ＰＧＬＡナノ粒子からのｓｉＲＮＡの放出動態は、当技術分野において公知の以下の式を使用して決定することができる：
ゼロ次：
Ｑ_ｔ＝Ｑ_０＋Ｋ_０ｔ
（薬物放出速度は、溶解した物質のその濃度とは無関係である。）
１次：
Ｌｏｇ Ｑ_ｔ＝Ｌｏｇ Ｑ_０＋Ｋｔ／２．３０３
（薬物放出速度は、その濃度に依存する）
ヒクソン−クロウェル：

（薬物は溶解によって放出される）
ヒグチ：
Ｑ_ｔ＝Ｋ_Ｈｔ^１／２
（薬物は拡散によって放出される）
Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ−Ｐｅｐｐａｓ：
Ｆ＝（Ｍ_ｔ／Ｍ）＝Ｋ_ｍｔ^ｎ
（ｎ＝０．５０は、フィックの拡散を示し、
０．５＜ｎ＜０．８９は、異常拡散または非フィックの拡散を示す：拡散および浸食の両方の制御された放出速度の組合せ。
ｎ≧０．８９の場合、事例−２の緩和または優れた事例の輸送−２を示す：ポリマー鎖の浸食。）

遊離Ｈｅｓ１ ｓｉＲＮＡの放出プロファイルはゼロ次モデル（Ｒ^２＝０．９７）と十分に適合する（図１２）。これは、薬物放出速度が外部模倣内リンパ培地（ＳＥＭ）中の可溶性ｓｉＲＮＡの量に依存しないことを示した。したがって、模倣外リンパ培地（ＳＰＭ）中の可溶性ｓｉＲＮＡの濃度に関わらず、遊離Ｈｅｓ１ ｓｉＲＮＡは半透膜を通って常に拡散した（放出速度パーセント６．６％／日）。最も早いサンプリング間隔での半透膜を横切る外部ＳＥＭへのＨｅｓ１ ｓｉＲＮＡの有意な初期移動（２０％、１日）は遊離溶質の受動拡散と矛盾しない。

遊離Ｈｅｓ１ ｓｉＲＮＡと対照的に、ＰＬＧＡ ＮＰ内に封入したＨｅｓ１ ｓｉＲＮＡの放出プロファイルは、１次（Ｒ^２＝０．９７）、ヒクソン−クロウェル（Ｒ^２＝０．９５）およびＫｏｒｓｍｅｙｅｒ−Ｐｅｐｐａｓ（Ｒ^２＝０．９６、ｎ＝０．９４）の式との持続放出プロファイル適合を示した（図面を参照のこと）。この拡散パターンは、放出が、ＮＰのポリマーシェル（ＰＬＧＡ）の遅延した加水分解によるＨｅｓ１ ｓｉＲＮＡの溶解によって主に制御されることを示した。さらに、Ｈｅｓ１ ｓｉＲＮＡの溶解はＰＬＧＡのポリマー鎖の浸食を伴った。

ＮＰ懸濁液１（ＮＰ１）およびＮＰ懸濁液２（ＮＰ２）からのｓｉＲＮＡの放出プロファイルのペアワイズ比較は、放出速度がＮＰ中のｓｉＲＮＡ担持量の増加と共に増加したことを示した（放出速度パーセント：それぞれ、５．９対６．３％／日）。これは、薬物放出速度が外部ＳＥＭ中の可溶性ｓｉＲＮＡの量に依存することを示した。両方のＮＰ製剤についてのＨｅｓ１ ｓｉＲＮＡの低い初期バースト放出（約５％、１日）は、ＮＰの表面に吸着されたｓｉＲＮＡの存在に起因すると解釈される。

遊離ｓｉＲＮＡについて、この薬物放出モデル系において初期担持量の５０％を放出するのに４．２日を必要とした。ＮＰ１について、初期担持量の５０％を放出するのに７．８日を必要とした。ＮＰ２について、初期担持量の５０％を放出するのに６．２日を必要とした。

ＢＩＯおよびＨｅｓ１ ｓｉＲＮＡ
非損傷ＯＣ
マウス蝸牛由来の器官型培養物を培養し、次いでＣＤ１マウスから出生後３日目（Ｐ３）に採取した。次いで、これらの外植片を適切な培地中で２４時間培養した。Ｐ４相当時に（すなわち、ｅｘ ｖｉｖｏで２４時間）、培養したコルチ器（ＯＣ、すなわち、蝸牛感覚上皮）を、ＤＭＳＯ（ビヒクル）またはＧＳＫ３阻害剤、６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）のいずれかを含有する新鮮な培養培地に浸し、それに応じてＯＣを７２時間培養した。Ｐ７相当時に（すなわち、ｅｘ ｖｉｖｏで９６時間）、両方の処理群からの培養物のサブセットを、２０ｎＭのＨｅｓ１ ｓｉＲＮＡを２４時間トランスフェクトする（ｊｅｔＳＩ １０ｍＭ、ＰｏｌｙＰｌｕｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、Ｉｌｌｋｉｒｃｈ、フランス）。逐次適用の効果を調べるために、ｓｉＨｅｓ１を、ＢＩＯを含まない培地中でトランスフェクトした。同時適用の効果を調べるために、ｓｉＨｅｓ１を、ＢＩＯを含有する培地中でトランスフェクトした。２４時間のトランスフェクションインキュベーション時間の後、２つの薬剤の逐次処理の試験のために指定した培養物を、ＢＩＯを含まない培地中で培養し、一方、同時適用のために指定した培養物を、ＢＩＯの存在下でさらに４８時間培養した。全ての培養物を、最後の２４時間、いずれの試験薬剤も含まない培地中に維持し、その後、組織を４％パラホルムアルデヒド溶液中に固定し、有毛細胞マーカーに対する抗体、ミオシンＶＩＩａ（Ｍｙｏ７ａ）、および蝸牛螺旋の長さに沿ったＨＣのその後の免疫蛍光により媒介される定量のための適切な二次抗体による免疫標識に供した（図１３）。

ＮＥＯ損傷卵形嚢
マウスの卵形嚢斑（平衡器官感覚上皮）由来の器官型培養物を培養し、次いでＣＤ１マウスから出生後３日目（Ｐ３）に採取した。次いでこれらの外植片を適切な培地中で２４時間培養した。Ｐ４相当時に（すなわち、ｅｘ ｖｉｖｏで２４時間）、培養した卵形嚢を、耳毒性アミノグリコシドネオマイシン（ＮＥＯ）を含有する新鮮な培養培地に２４時間浸してＨＣ喪失を誘導し、次いでＤＭＳＯ（ビヒクル）またはＧＳＫ３阻害剤、６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ、２．５μＭ）のいずれかをＰ５に投与した。それに応じて卵形嚢を７２時間培養した。Ｐ８相当時に（すなわち、ｅｘ ｖｉｖｏで１２０時間）、培養物を、治療剤を含まない新鮮な培地と置き換え、両方の処理群からの培養物のサブセットを、２０ｎＭのＨｅｓ１ ｓｉＲＮＡをトランスフェクトし（ｊｅｔＳＩ １０ｍＭ、ＰｏｌｙＰｌｕｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、Ｉｌｌｋｉｒｃｈ、フランス）、または５μＭのＮｏｔｃｈ経路阻害剤、ＬＹ４１１５７５の存在下でインキュベートし、さらに７２時間培養した。次いで全ての培養物を、最後の２４時間、いずれの試験薬剤も含まない培地中に維持し、その後、組織を４％パラホルムアルデヒド溶液中で固定し、有毛細胞マーカーに対する抗体、ミオシンＶＩＩａ（Ｍｙｏ７ａ）、および蝸牛螺旋の長さに沿ったＨＣのその後の免疫蛍光により媒介される定量のための適切な二次抗体による免疫標識に供した（図１４〜１７）。

全ての事例において、ＢＩＯ／ｓｉＨｅｓ１は、いずれかの薬剤単独よりも多くの数のｄｅ ｎｏｖｏ ＨＣを生成し、逐次処理は同時処理よりも頑強な反応を誘導する。これらの結果は、特に、ＯＣの中−基底回転および卵形嚢（ｕｔｒｉｃｕｌｅ）の平衡斑状外領域、典型的には出生後の蝸牛および卵形嚢斑における新たなＨＣ産生に対して抵抗性である領域において、逐次適用がより大きな分化転換反応（すなわち、より多くのｄｅ ｎｏｖｏ有毛細胞）を生じることと一致する（図１３〜１８）。

ＴＩＤＥおよびＨｅｓ１ ｓｉＲＮＡ
チデグルシブの分析
チデグルシブは、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙから入手し、一連の市販のＧＳＫ３阻害剤と並行してＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ Ｃａｎｉｎｅ Ｋｉｄｎｅｙ（ＭＤＣＫ）細胞を用いて血清飢餓条件下で用量曲線分析を実施して、この十分に確立された哺乳動物上皮細胞株における有糸分裂抑制条件下で、その相対増殖能を確認した。これらの実験において、ＭＤＣＫ細胞を血清飢餓条件下で２４時間培養し、その後、細胞を、ＧＳＫ３阻害剤および１０μＭのＥｄＵ（５−エチニル−２’−デオキシウリジン）、ＤＮＡ複製を受けた細胞を永久的に標識するヌクレオシド類似体の存在下で４８時間培養した。

このタイプの分析の例を図１９に示す。試験したＧＳＫ３阻害剤の各々は、これらの条件下で試験した最低用量にて細胞増殖に対して明白な陽性効果を示し、用量漸増（１０μＭまで）は、観察したＥｄＵ陽性核の数の減少をもたらした。チデグルシブは、これらの条件下で、より高い用量にて細胞増殖に対してそのプラスの効果を持続し、おそらくＧＳＫ３に対するこの薬理学的阻害剤のより高い特異性（すなわち、ＡＴＰの非競合的阻害剤）を明確に示した。

このスクリーニングからの処理群の各々におけるＥｄＵ陽性核の正規の定量を図２０に示す。高用量にてＧＳＫ３阻害が十分に実証されている分子である、１０ｍＭのＬｉＣｌとのインキュベーションは、非阻害性塩である塩化ナトリウムの同一の用量と比較して、ＥｄＵ陽性細胞の数の増加をもたらした。この分析において評価した薬理学的ＧＳＫ３Ｉの中で、低用量（０．１μＭ）のＣＨＩＲ−９９０２１（ＣＡＳ ２５２９１７−０６−９）は、血清飢餓下で培養した有糸分裂活性細胞において頑強な統計的に有意な増加をもたらした。１０μＭへの用量漸増は、低用量で観察した増殖に対するプラスの効果を劇的に減少させ、その結果、ＥｄＵ陽性核の数は、未処理の血清飢餓細胞と比較して統計的に有意ではなくなった。他のＡＴＰ競合的ＧＳＫ３Ｉについても同様の用量依存的な増殖効率減少の傾向が観察され、６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ、ＣＡＳ ６６７４６３−６２−９）およびＳＢ−２１６７６３（ＣＡＳ ２８０７４４−０９−４）の漸増用量により、ＥｄＵ陽性核（ｎｕｃｌｉｅ）の数が減少するような具合になっており、高用量（１０μＭ）のＢＩＯが、これらの条件下でＭＤＣＫ細胞に対して毒性（すなわち、定量されていない）であることが証明された。ＥｄＵ陽性核の数は、試験した用量の各々にわたって未処理の血清飢餓ＭＤＣＫ細胞集団において定量したものよりも統計的に高いままであった。これらの結果は、ＧＳＫ３に対して予測される特異性がより大きいと、増殖のための濃度範囲がより広くなる可能性があることを示唆する。

出生後のＯＣを、ＥｄＵおよびチデグルシブまたはビヒクルのみのいずれかの存在下で７２時間連続的に培養して、ＧＳＫ３阻害剤が、ＯＣの感覚上皮領域において有糸分裂反応を誘導することができるかどうかを評価する、標的化パイロット実験を行った。図２１に示されるように、０．５および２．０マイクロモル濃度のチデグルシブの存在下で培養したＯＣは、ビヒクルのみの存在下で培養したＯＣにおいて観察したものよりも、聴覚感覚上皮の解剖学的位置におけるＥｄＵ陽性核のより高い発生率を示した。追跡分析は、ＯＣにおけるこのチデグルシブ誘導性増殖反応が、細胞型特異的マーカーを使用して、支持細胞、有毛細胞、または両方に関与するかどうかを示す。

非損傷およびＮＥＯ損傷ＯＣ
ＢＩＯについての上記のプロトコールを、ＢＩＯを１０．０μＭのチデグルシブ（ＴＩＤＥ）の添加に置き換えて使用する。他のプロトコールと並行して、チデグルシブがｓｉＨＥＳ１の後に培養培地中に含まれる第３の処理群を加える：Ｐ４またはＰ５（有毛細胞喪失を模倣する耳毒性損傷が存在するか否かに応じて）に、対照培地を１０．０μＭのＴＩＤＥを含めまたは含めずに添加し；Ｐ７に、ｓｉＨｅｓ１をＴＩＤＥの存在下または非存在下で添加し；Ｐ９に、１０．０μＭのチデグルシブを培養物のサブセットのための培地に含める。Ｐ１１に、全ての培地を、治療剤を全く含まない新鮮な培地と置き換える。Ｐ１２に、組織を免疫標識化のために固定する。耳毒性アミノグリコシドであるＮＥＯへの曝露後のこの処理パラダイムの比較分析の例を図２２に示す。より多くのＨＣ数を、ＴＩＤＥおよびｓｉＨＥＳ１の組合せにより処理した培養物中のオトトキシンに曝露したＯＣの中−頂回転において観察し、ＴＩＤＥおよびｓｉＨＥＳ１の段階的組合せが、これらの条件下でＨＣ数の最も有意な増加を生じた（図２２〜２４）。図２２のデータについてのＨＣ定量結果を以下の表に示す。

実験を、上記のＴＩＤＥおよびｓｉＨＥＳ１の段階的適用を使用して反復したが、その結果は、薬剤間の相乗作用を示す様式でＴＩＤＥの事前適用後のＨＣ数を回復させるためのｓｉＨＥＳ１の有効性の有意な向上を明確に示す（図２３〜２４）。

この実験パラダイムを再度反復し、ＦＧＦ−２を、培養物のサブセットについてＰ５、Ｐ７、およびＰ９にて２ｎｇ／ｍＬで培養培地に任意選択で含めた、さらなる処理群を加えた。より多くのＨＣ数を、ＴＩＤＥおよびｓｉＨＥＳ１の段階的組合せにより処理した培養物中のＯＣの中−頂および基底回転の両方において観察したが、増殖培地へのＦＧＦ−２（この濃度ではそれ自体で治療反応を誘発しなかった）の添加は、典型的には、出生後の哺乳動物の蝸牛におけるＨＣ再生に対してより抵抗性である領域である、ＯＣの中−基底回転を通して、ＴＩＤＥ／ｓｉＨＥＳ１処理の治療効果を増強した（図２５〜２６）。

さらなるナノ粒子実験
実験２および／または３のサブセットを、ｓｉＨｅｓ１担持ナノ粒子−持続放出製剤−および種々の用量のＴＩＤＥを使用し、ならびにｓｉＨｅｓ１およびＴＩＤＥの両方を含むナノ粒子を使用して反復する。

このプロトコールのいくつかの反復実験において、持続放出ｓｉＨｅｓ１ナノ粒子およびＴＩＤＥの同時適用を、ＴＩＤＥおよびｓｉＨｅｓ１リポフェクション複合体の段階的適用を模倣するように設計した様式で行う。模倣は、ＴＩＤＥ（０．５から２０μｍの間の漸増用量でのいくつかの反復実験において）を加え、持続放出ｓｉＨｅｓ１ナノ粒子を同時に適用して、実験２および３に記載されるネオマイシンプロトコールを使用して達成される。

さらに、上記に参照した全ての実験を、ｓｉＨｅｓ５およびｓｉＭＡＰＫ１を用いて反復する。

例示的なプロトコールは以下の通りである。

出願人らは、生体適合性ＰＬＧＡ ＮＰからのｓｉＨｅｓ１の、遅延したが、持続した放出が、２つの薬物が同時投与された場合、Ｈｅｓ１に対するＧＳＫ３阻害剤およびｓｉＲＮＡの段階的適用の治療属性を再現するという仮説を立てた。この仮説を試験するために、十分な実験マージンを有するために漸増用量（０．５、２、および１０μＭ）のＧＳＫ３Ｉ、チデグルシブと共にｓｉＨｅｓ１ ＮＰの最大以下の有効用量（６０ｎＭ）を使用して、ネオマイシン（ＮＥＯ）に曝露したコルチ器（ＯＣ）の器官型培養物における再生の用量反応プロファイルを評価した。このパラダイムを使用して、ＮＥＯにより除去したＯＣを、その後、固定および免疫組織学的分析の前に６日間にわたって、ｓｉＨｅｓ１ ＮＰ単独で、またはチデグルシブと組み合わせて培養した。

図３７および３８に示されるように、ｓｉＨｅｓ１ ＮＰにより誘導される有毛細胞（ＨＣ）再生の明確な濃度依存性の増強を、ＯＣを漸増用量のチデグルシブと組み合わせて処理した場合に観察した。しかしながら、チデグルシブ単独による処理は統計的に有意な再生反応を誘導しなかった。このことは、チデグルシブは、この状況において、ＨＣを再生するように独立して作用するのではなく、ｓｉＨｅｓ１により媒介される反応を本質的に増強するようにプライミング剤として作用する可能性があることを示唆している。

これらの処理群の間のＨＣ数の定量により、臨床的に関連するＧＳＫ３阻害剤であるチデグルシブが、ＯＣの中回転において１０μＭの濃度、ならびに基底回転において２および１０μＭの濃度にてｓｉＨｅｓ１ ＮＰ再生効力の統計的に有意な増加（ｓｉＨｅｓ１ ＮＰのみと比較して）を促進することが明らかになった。ｓｉＨｅｓ１ ＮＰの再生反応が一貫して最も高かった、中−頂領域において、処理群の間で統計的に有意な差を帰属することができなかった。チデグルシブのみによって誘導される再生反応の欠如のために、この組合せ処理ストラテジーによって誘導される増強された治療効果は、ＨＣ数の治療的増加に関して相乗的であると記載され得る。

さらなるナノ粒子実験
ｓｉＨｅｓ１（分子＃１）担持ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）またはポリエチレングリコール−ＰＬＧＡナノ粒子（ＰＥＧ−ＰＬＧＡ ＮＰ）を、以前に報告されているように、わずかな改変を加えた水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）二重エマルション溶媒蒸発法によって調製した。ＭｃＣａｌｌおよびＳｉｒｉａｎｎｉ（２０１３年）Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．８２：５１０１５頁；ｄｏｉ：１０．３７９１／５１０１５。

簡潔に述べると、ある体積のｓｉＨｅｓ１水溶液（１００μＬ）を、ＰＬＧＡ ＮＰについて１００ｍｇのＰＬＧＡ、またはＰＥＧ−ＰＬＧＡ ＮＰについて５０ｍｇのＰＬＧＡおよび５０ｍｇのＰＥＧ−ＰＬＧＡを含有する１，０００μＬのジクロロメタン（ＤＣＭ）に滴下した（表１）。

混合物を、超音波処理（１０秒、２５Ｗ）（Ｍｉｃｒｏｓｏｎ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｃｅｌｌ ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ ＸＬ Ｍｉｓｏｎｉｘ Ｉｎｃ．、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、ＮＹ）により一次ｗ_１／ｏエマルションに乳化した。ＰＬＧＡ ＮＰについて、一次エマルションを４ｍｌの５％ＰＶＡ水溶液中で希釈した。得られた二次エマルションを、ＭｉｌｌｉＱ水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏ．、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）中の５０ｍＬの０．３％（ｗ／ｖ）（ＰＬＧＡ ＮＰ）または０．１２５％ＰＶＡ（ｗ／ｖ）（ＰＥＧ−ＰＬＧＡ ＮＰ）中で希釈し、室温にて２時間磁気撹拌して（ＲＯ１０、ＩＫＡ−Ｗｅｒｋｅ Ｇｍｂｈ ＆ Ｃｏ、Ｓｔａｕｆｅｎ、ドイツ）、ＤＣＭを蒸発させた。ＰＥＧ−ＰＬＧＡ ＮＰを、１０℃にて２０分間、１３，０００ｇでの超遠心分離（ＴＯＭＹ ＭＸ−２０１ Ｈｉｇｈｓｐｅｅｄ Ｒｅｆｒｉｇｅｒａｔｅｄ Ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）によって回収し、ＭｉｌｌｉＱ水により３回洗浄して、余分な溶媒（ＤＣＭ）および残留ＰＶＡを除去し、次いで滅菌ガラス容器中の５ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水に再懸濁し、連続して３日間、４０ｍＴｏｒｒ（Ｖｉｒｔｉｓ Ｂｅｎｃｈｔｏｐ ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｅｒ、Ｇａｒｄｉｎｅｒ、ＮＹ）下で−１００℃にて凍結乾燥した。

得られた粉末ＮＰをＵＶ下で２０〜３０分間滅菌し、さらに使用するまで−８０℃にて保存した。

ｓｉＨｅｓ１担持ＰＥＧ化ＰＬＧＡ ＮＰ（表２）は、標準的なＰＬＧＡ製剤よりも小さく（すなわち、低い平均粒径［ＰＭＤ］）、標準的なＰＬＧＡ製剤ほど負に帯電していなかった（すなわち、高いゼータ電位［ＺＰ］）。ＰＥＧ−ＰＬＧＡナノ粒子製剤に担持されたｓｉＨｅｓ１（ｐｍｏｌ／ｍｇ）の量は、ＰＬＧＡ製剤と比較したナノ担体のサイズの減少に比例して減少した。

それらのサイズおよび物理化学的特性に基づいて、本発明者らは、ｓｉＲＮＡ担持ＰＥＧ−ＰＬＧＡ ＮＰが、内耳細胞によって容易に取り込まれるという仮説を立てた。この仮説を評価し、内耳細胞におけるＰＬＧＡ ＮＰに対するｓｉＲＮＡ担持ＰＥＧ−ＰＬＧＡ ＮＰの取り込みを比較するために、フルオレセイン（ＦＡＭ）がコンジュゲートした非ターゲティングｓｉＲＮＡ模倣物（スクランブルＲＮＡ、ｓｃＲＮＡ）二本鎖を、ｓｉＨｅｓ１ ＮＰを合成するために用いたものと同じ合成方法論を使用して、ＡｌｅｘＦｌｕｏｒ ５５５がコンジュゲートしたＰＥＧ−ＰＬＧＡおよびＰＬＧＡ ＮＰ製剤内に封入した。合成前に、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５（ＡＦ５５５、ＭＷ：１．２５ｋＤａ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）のＰＬＧＡ（ＭＷ：１５ｋＤａ）（Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｉｎｃ．、Ｍｏｎｔｒｅａｌ、カナダ）とのコンジュゲーションを、カルボジイミドカップリング反応（Ｃｈａｎら、（２０１０年）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．６２４：１６３〜７５頁）を使用して実施した。等モル量のＰＬＧＡおよびＡＦ５５５を混合し、室温にて一晩撹拌した。未反応の成分を、室温にて３時間、脱イオン水（Ｄｉｒｅｃｔ−Ｑ３ ＵＶシステム、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＳＡＳ、Ｍｏｌｓｈｅｉｍ、フランス）に対する透析（Ｓｐｅｃｔｒａ／ｐｏｒ Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ Ｇ２、ＭＷＣＯ ３．５〜５ｋＤａ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．Ｒａｎｃｈｏ Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ、ＣＡ）によって除去した。ＰＬＧＡがコンジュゲートしたＡＦ５５５を含有する精製した懸濁液を精製水中で回収し、８℃にて３０分間、１５，０００ｒｐｍで遠心分離した。

合成後、得られたＦＡＭ−ｓｃＲＮＡ担持ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５ ＰＬＧＡまたはＰＥＧ−ＰＬＧＡ ＮＰ（本明細書以下において、Ｄｕａｌ Ｆｌｕｏｒ ＮＰＳと称する）は、ｓｉＨｅｓ１担持ＮＰとサイズ、電荷、および残留ＰＶＡ含有量が同等であり、それらが、ｓｉＨｅｓ１ナノ担体製剤の実行可能な代用物としての役割を果たす能力があることが示された（表３）。

Ｄｕａｌ Ｆｌｕｏｒ ＰＬＧＡおよびＰＥＧ−ＰＬＧＡ ＮＰの細胞取り込みを、３３℃、５％ＣＯ_２での２４時間のインキュベーション後、紫外分光測定−分光測定（ＵＶ−ｓｐｅｃ）および共焦点顕微鏡の組合せを使用してＩＭＯ−２ｂ１マウス内耳細胞において調べた。

ＵＶ−ｓｐｅｃについて、細胞を９６ウェルプレートに播種し、完全増殖培地中で７０％コンフルエンスに達するまで培養した。２４時間後、細胞を、３３℃、５％ＣＯ_２にて２４時間、２００、４００、８００μｇ／ｍＬでインキュベートした。ＰＢＳ溶液による３ステップの洗浄後、細胞外蛍光を、１〜５分間、０．２％のトリパンブルー５０μｌによりクエンチした（Ｇｉｂｃｏ、ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）（Ｈｅｄ Ｊ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｉｎｇ ｉｎｇｅｓｔｅｄ ｆｒｏｍ ａｄｈｅｒｉｎｇ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８６年；１３２：１９８〜２０４頁）。内在化蛍光強度を、ＦＡＭ ｓｃＲＮＡについては４８５±２０ｎｍの発光波長および５２５±２５ｎｍの励起にて、ならびにＡＦ５５５ ＰＬＧＡについては５５５±２０ｎｍの発光波長および５７２±２５ｎｍの励起にてマイクロプレートリーダー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＤＴＸ ８８０ Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ、Ｂｒｅａ、ＣＡ）を使用して決定した。培地排出前のインキュベートしたＮＰ懸濁液の未洗浄蛍光がある陽性対照（ＰＣ）ウェルを使用して各参照基準について１００％蛍光を確立した。Ｄｕａｌ Ｆｌｕｏｒ ＮＰ製剤とインキュベートしなかった細胞の正常対照（ＮＣ）ウェルをバックグラウンド対照として使用した。ＮＰ取り込みのマイクロプレートリーダー評価により、４００および８００μｇ／ｍＬの用量にて、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ ＮＰがＰＬＧＡ ＮＰと比較して優れた内在化を示すことが実証された（図２９、^＊＊、ｐ＜０．０１）。２００μｇ／ｍＬの濃度では、内在化ＮＰの全蛍光強度は２つの製剤の間で同様であった。

フルオロフォアにより標識したＮＰとの２４時間のインキュベーション後のＩＭＯ−２ｂ１固定細胞の共焦点顕微鏡により、両方の製剤が用量依存的に細胞内に内在化することが確認された（図３０）。ｓｉＲＮＡ担持ＰＬＧＡ ＮＰは、ＩＭＯ−２ｂ１細胞内でヘテロ分散（ｈｅｔｅｒｏｄｉｓｐｅｒｓｅ）局在化パターンを示したが、対応するＰＥＧ−ＰＬＧＡ ＮＰ製剤はＰＬＧＡ ＮＰよりも一貫した核周囲局在化を示した（図３０〜３３）。この観察は、ｓｉＲＮＡにより媒介される遺伝子サイレンシングに最適な細胞内領域におけるＰＥＧ−ＰＬＧＡ ＮＰによって送達されるｓｉＲＮＡ生体分子のより効率的な送達および蓄積を示唆する（Ｃｈｉｕら、（２００４年）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１１（８）：１１６５〜７５頁）。

ｓｉＨｅｓ１担持ＰＥＧ−ＰＬＧＡ ＮＰ製剤の潜在的な細胞障害効果を評価するために、ＩＭＯ−２ｂ１細胞を、ＰＬＧＡまたはＰＥＧ−ＰＬＧＡ製剤のいずれかと４８時間インキュベートした後、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイを行って、細胞生存率を評価した。ＭＴＴアッセイは、黄色テトラゾリウム色素であるＭＴＴの、その不溶性紫色生成物であるホルマザンへの還元を介してＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性細胞オキシドレダクターゼ活性を測定することによって細胞代謝能を客観的に定量するための比色法である。

このように、評価中の薬物の相対的な細胞障害効果は、試験ウェルにおいて形成されたホルマザン生成物の全量を、未処理細胞の対照ウェルにおいて形成された対応する量と比較することによって識別することができる。この方法を使用すると、ｓｉＨｅｓ１担持ＰＥＧ−ＰＬＧＡ ＮＰの８００μｇ／ｍＬ（約６６ｎＭのｓｉＲＮＡ当量）までの用量漸増は、４８時間曝露後のＩＭＯ−２ｂ１細胞によって十分に耐容された（図３４）。試験した最高濃度では、未処理対照（ＵＴＤ）と比較して、いずれのＮＰ製剤についてもＭＴＴアッセイを使用して、細胞生存率の統計的に有意な喪失は観察されなかった。対照的に、細胞障害レベル（２％）の非イオン性界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ＴＸ）により処理したウェルは、このアッセイにおいて細胞生存率の顕著な喪失を示した。

ＰＥＧ−ＰＬＧＡ ＮＰ内に封入したｓｉＨｅｓ１生体分子（分子＃１）の相対サイレンシング効率を試験するために、ｓｉＲＮＡ担持ＰＬＧＡおよびＰＥＧ−ＰＬＧＡ ＮＰのいずれかの用量漸増を、ＩＭＯ−２Ｂ１細胞のサブコンフルエントなウェルと培養し、それにより各ウェルにおける全ｓｉＲＮＡについてペアワイズ投与を制御した（２８．８、５７．６、１１５．２ｎＭ ｓｉＲＮＡ当量）。ＮＰ処理の開始から７２時間後、全ＲＮＡを単離し、Ｈｅｓ１およびハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対するプライマーを使用してＲＴ−ｑＰＣＲ分析に供した。相対Ｈｅｓ１レベルを２^{−ΔΔＣＴ}法によって決定した。ＬｉｖａｋおよびＳｃｈｍｉｔｔｇｅｎ（２００１年）Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５（４）：４０２〜８頁を参照のこと。

その見かけの向上した取り込み効率および機能的に最適な核周囲蓄積パターンと一致することには、ｓｉＨｅｓ１を担持したＰＥＧ−ＰＬＧＡ ＮＰ（分子＃１）は、ＰＬＧＡ ＮＰよりも低い用量当量にてＨｅｓ１発現に対してより顕著なサイレンシング効果を誘発した（図３５、＃＃＃、示した用量でのＰＬＧＡ ＮＰと比較してＰＥＧ−ＰＬＧＡ ＮＰによって誘導されるサイレンシングの程度に関してｐ＜０．００１）。

タンパク質レベル（曝露後９６時間）でのＩＭＯ−２ｂ１におけるｓｉＨｅｓ１ ＫＤ効率の標的とした比較は、転写レベル（曝露後７２時間）でのＨｅｓ１の測定から得られた結果を反映した（図３６）。ＮＰインキュベーション後、細胞抽出物を、Ｈｅｓ１に対する抗体による免疫ブロッティングに供し、免疫ブロットにおけるＨｅｓ１の相対レベルを、ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを使用するデンシトメトリー分析によって決定した。各レーンの下の数字は、各ブロットにおける未処理（偽）対照試料に対する各抽出物中で測定したＨｅｓ１タンパク質の量を表す。３５０μｇ／ｍＬおよびそれ以上の濃度にて、Ｈｅｓ１タンパク質の顕著な減少をＰＥＧ化ＰＬＧＡ ＮＰについて観察したのに対して、ＰＬＧＡ ＮＰについてＨｅｓ１レベルの明らかな減少を６００μｇ／ｍＬおよびそれ以上にて最初に観察した。

投与実験の期間
ｓｉＨｅｓ１ ＮＰの治療的投与期間を、投与を１日のみ（２４時間）に制限し、聴力を失ってから７２時間後に開始することによって追跡実験において試験した。図３９に見られるように、実質的な統計的に有意な聴力改善を、この代替投与パラダイムを使用して、注入後３週間の早さで複数の試験頻度にわたって観察した。図４０に示されるように、実質的な聴力改善もまた、延長された９週間の期間にわたって観察し、高周波数の基底領域において最大の漸進的改善を観察した。これらの結果により、１日のｓｉＨｅｓ１ ＮＰ注入が、騒音により聴力を失った動物における聴覚機能を回復させるための１０日の注入と、見かけ上、同じくらい有効であることが明らかになった。この結果はいくぶん驚くべきものであったが、ｓｉＨｅｓ１のＮＰにより媒介される送達が、この状況において内因性多タンパク質ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）へのｓｉＲＮＡの効率的な担持をもたらし、このことは、一旦担持されると、非分裂細胞における単回用量投与後の時に数週間、遺伝子サイレンシングを持続することができることを示唆する。Ｗｅｉら、（２０１１年）Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７９（６）：９５３．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２１４２７１６９；Ｂａｒｔｌｅｔｔら、（２００６年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３４（１）：３２２．Ｅｐｕｂ ２００６／０１／１８．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１６４１０６１２；ＰＭＣＩＤ：１３３１９９４；Ｂａｒｔｌｅｔｔら、（２００７年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．９７（４）：９０９．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１７１５４３０７を参照のこと。

同様の実験を本明細書に記載される併用療法を用いて反復する。

Claims (33)

1. 対象における難聴または平衡機能障害を治療する方法であって、
   治療有効量のＧＳＫ−３阻害剤を、それを必要とする対象の内耳に適用するステップと、
   内耳の組織におけるＨｅｓ１遺伝子の発現を減少させるのに十分な量の組成物を、前記対象の内耳に適用するステップと
   を含む方法。
2. ＧＳＫ−３阻害剤が、６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）およびチデグルシブ（ＴＩＤＥ）から選択される、請求項１に記載の方法。
3. 内耳の組織におけるＨｅｓ１遺伝子の発現を減少させるのに十分な組成物が、ｓｉＲＮＡ分子を含む、請求項１または２に記載の方法。
4. ｓｉＲＮＡ分子が、配列番号１〜１４のうちの１つまたは複数を含む、請求項３に記載の方法。
5. 内耳の組織におけるＨｅｓ１遺伝子の発現を減少させるのに十分な組成物が、内耳の組織におけるＨｅｓ１遺伝子の発現を減少させる薬剤を含むナノ粒子を含む、請求項１または２に記載の方法。
6. 内耳の組織におけるＨｅｓ１遺伝子の発現を減少させる薬剤が、ｓｉＲＮＡ分子である、請求項５に記載の方法。
7. ナノ粒子が、生分解性ポリマーをさらに含む、請求項５または６に記載の方法。
8. 生分解性ポリマーが、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）またはペグ化ＰＬＧＡ（ＰＥＧ−ＰＬＧＡ）である、請求項７に記載の方法。
9. ナノ粒子が、磁気応答性粒子をさらに含む、請求項４から８のいずれか一項に記載の方法。
10. 磁気応答性粒子が、超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯＮ）である、請求項９に記載の方法。
11. 正円窓膜または卵円窓膜を横切ってナノ粒子を輸送するために磁力を使用するステップをさらに含む、請求項９または１０に記載の方法。
12. 治療有効量のＦＧＦ２を、それを必要とする対象の内耳に適用するステップをさらに含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 適用するステップのうちの１つまたは複数が、経鼓膜投与、蝸牛内注射、蝸牛内注入、または点耳剤を使用することを含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
14. ＧＳＫ−３阻害剤が、内耳の組織におけるＨｅｓ１遺伝子の発現を減少させるのに十分な組成物を適用する前に適用される、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
15. ＧＳＫ−３阻害剤が、内耳の組織におけるＨｅｓ１遺伝子の発現を減少させるのに十分な組成物を適用した後に適用される、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
16. ＧＳＫ−３阻害剤、および内耳の組織におけるＨｅｓ１遺伝子の発現を減少させるのに十分な組成物の両方が同時に適用される、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
17. 対象の内耳における有毛細胞を置換、再生および／または保護する方法であって、
    治療有効量のプライミング組成物を、それを必要とする対象の内耳に適用するステップと、
    内耳の組織におけるＨｅｓ１遺伝子の発現を減少させるのに十分な量の組成物を、前記対象の内耳に適用するステップと
    を含み、
    プライミング組成物が、βカテニンを安定化させること、内耳における多能性細胞の数を増加させること、内耳における既存の多能性細胞の可塑性を増加させること、または内耳の細胞における分化のためのシグナルを送ることからなる群から選択される１つまたは複数の機能を示す、方法。
18. プライミング組成物が、ＧＳＫ−３阻害剤を含む、請求項１７に記載の方法。
19. ＧＳＫ−３阻害剤が、６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）およびチデグルシブ（ＴＩＤＥ）から選択される、請求項１８に記載の方法。
20. プライミング組成物がＦＧＦ２をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
21. 内耳の組織におけるＨｅｓ１遺伝子の発現を減少させるのに十分な組成物が、ｓｉＲＮＡ分子を含む、請求項１７に記載の方法。
22. ｓｉＲＮＡ分子が、配列番号１〜１４のうちの１つまたは複数を含む、請求項２１に記載の方法。
23. 内耳の組織におけるＨｅｓ１遺伝子の発現を減少させるのに十分な組成物が、内耳の組織におけるＨｅｓ１遺伝子の発現を減少させる薬剤を含むナノ粒子を含む、請求項１７に記載の方法。
24. 内耳の組織におけるＨｅｓ１遺伝子の発現を減少させる薬剤が、ｓｉＲＮＡ分子である、請求項２３に記載の方法。
25. ナノ粒子が、生分解性ポリマーをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
26. 生分解性ポリマーが、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）またはペグ化ＰＬＧＡ（ＰＥＧ−ＰＬＧＡ）である、請求項２５に記載の方法。
27. ナノ粒子が、磁気応答性粒子をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
28. 磁気応答性粒子が、超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯＮ）である、請求項２７に記載の方法。
29. 正円窓膜または卵円窓膜を横切ってナノ粒子を輸送するために磁力を使用するステップをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
30. 適用するステップの一方または両方が、経鼓膜投与、蝸牛内注射、蝸牛内注入、または点耳剤を使用することを含む、請求項１７に記載の方法。
31. ＧＳＫ−３阻害剤が、内耳の組織におけるＨｅｓ１遺伝子の発現を減少させるのに十分な組成物を適用する前に適用される、請求項１７に記載の方法。
32. ＧＳＫ−３阻害剤が、内耳の組織におけるＨｅｓ１遺伝子の発現を減少させるのに十分な組成物を適用した後に適用される、請求項１７に記載の方法。
33. ＧＳＫ−３阻害剤、および内耳の組織におけるＨｅｓ１遺伝子の発現を減少させるのに十分な組成物の両方が同時に適用される、請求項１７に記載の方法。