JP2019518473A - Il−17a、il−17f、および他の炎症誘発性分子に対する三重特異的抗体 - Google Patents
Il−17a、il−17f、および他の炎症誘発性分子に対する三重特異的抗体 Download PDFInfo
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Abstract
Description
・配列番号10〜12のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号13〜15のアミノ酸配列を含む軽鎖;
・配列番号8のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、および配列番号9のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン;または
・配列番号5のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号6のアミノ酸配列を含む軽鎖。
一部の実施形態において、第2の結合ドメインは、配列番号12のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号15のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。一部の実施形態において、第2の結合ドメインは、配列番号10〜12のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号13〜15のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。一部の実施形態において、第2の結合ドメインは、配列番号8のアミノ酸配列と、配列が少なくとも90%同一の重鎖可変ドメイン、配列番号9のアミノ酸配列と少なくとも90%同一の可変ドメイン、またはそれらの双方を含む。一部の実施形態において、第2の結合ドメインは、配列番号8のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、配列番号9のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、またはそれらの双方を含む。特定の実施形態において、第2の結合ドメインは、配列番号8のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメイン、および配列番号9のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメインを含む。
・IL−17AのKDが10−11M以下;
・IL−17FのKDが10−7M以下;
・TNFαのKDが10−11M以下;
・HT1080細胞におけるIL−6アッセイにおいて、200ng/mL未満の濃度にて少なくとも50%(例えば、60%、70%、80%、または90%)IL−17Aおよび/またはIL−17A/TNFαの活性を阻害する;
・HT080細胞によるIL−17A依存性IL−6放出を阻害する;
・HT1080細胞におけるIL−6の産生を阻害する;
・WEHI−13VAR細胞において100ng/mL未満の濃度にて少なくとも50%(例えば、60%、70%、80%、または90%)TNFα依存性細胞毒性を阻害する;
・ウサギ、マウス、またはモルモットのTNFαには結合しない;
・IL−17AおよびTNFαに同時に結合する;
・カニクイザルIL−17AおよびTNFαに結合する。
・ヒト血清における37℃での少なくとも3、4、5、6、または7日のインキュベーション後(例えば、7日のインキュベーション後)、安定したままである;
・半減期が、in vivoで、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15日を超える(例えば12日);
・in vivo関節炎モデルにおいて抗炎症効果を有する;そして
・IL−17およびTNFαの活性をin vivo阻害する。
・本明細書中に記載される三重特異的結合分子のいずれかの第1の結合ドメインをコードするヌクレオチド配列;
・本明細書中に記載される三重特異的結合分子のいずれかの第2の結合ドメインの重鎖をコードするヌクレオチド配列;
・本明細書中に記載される三重特異的結合分子のいずれかの第1の結合ドメインをコードするヌクレオチド配列;または
・上記のあらゆる組合せ。
一部の実施形態において、単離された核酸分子は、本明細書中に記載される三重特異的結合分子のいずれかの、第1の結合ドメインをコードするヌクレオチド配列、および第2の結合ドメインの軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含み、場合によっては、ペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。単離された核酸分子は、例えば、配列番号4をコードするヌクレオチド配列、および配列番号6をコードするヌクレオチド配列を含んでよく、場合によっては、ペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。一実施形態において、ペプチドリンカーのアミノ酸配列は、配列番号16である。一実施形態において、単離された核酸分子は、配列番号7をコードする。
・本明細書中に記載される三重特異的結合分子のいずれかの第1の結合ドメインをコードするヌクレオチド配列;
・本明細書中に記載される三重特異的結合分子のいずれかの第2の結合ドメインの重鎖をコードするヌクレオチド配列;および
・本明細書中に記載される三重特異的結合分子のいずれかの第1の結合ドメインをコードするヌクレオチド配列。
特定の実施形態において、宿主細胞は、配列番号5をコードするヌクレオチド配列、および配列番号7をコードするヌクレオチド配列を含む。
本明細書中で別段の定義がない限り、本発明に関連して用いられる科学技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。例示的な方法および材料が以下に記載されるが、本明細書中に記載される方法および材料と類似の、または同等の方法および材料もまた、本発明の実行または試験に用いられ得る。本明細書中で言及される全ての刊行物および他の参考文献は、それらの全体が参照によって組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配することとなる。いくつかの文献が本明細書中に引用されているが、この引用は、これらの文献のいずれかが、当該技術における共通の一般的知識の一部を形成することの容認にはならない。
特記されない限り、本明細書中で用いられる「IL−17A」、「IL−17F」、および「TNFα」は、それぞれヒトIL−17A、IL−17F、およびTNFαを指す。
本発明は、IL−17A、IL−17F、およびIL−17AでもIL−17Fでもない炎症誘発性分子(例えばTNFα)に対する三重特異的結合分子を提供する。特定の実施形態において、三重特異的結合分子は、三重特異的抗体またはその抗原結合部分である。結合分子は、IL−17A、IL−17F、および炎症誘発性分子(例えばTNFα)に結合するドメインを含む。一部の実施形態において、結合分子は、IL−17AおよびIL−17Fに結合する第1の結合ドメイン、ならびにTNFαに結合する第2の結合ドメインを含む。一部の実施形態において、IL−17AおよびIL−17Fについての結合ドメインは、別個であってよい。
・配列番号1〜3;または
・配列番号4。
・配列番号10〜15;
・配列番号8および9;または
・配列番号5および6。
・配列番号1〜3;または
・配列番号4;
かつ、ヒトTNFαへの結合について、以下を含む抗体と競合するか、前記抗原の、当該抗体と同じエピトープに結合する:
・配列番号10〜15;
・配列番号8および9;または
・配列番号5および6。
本発明はまた、本明細書中に記載される本発明の三重特異的結合分子をコードする核酸分子および核酸配列を提供する。一部の実施形態において、異なる核酸分子が、三重特異的結合分子の第1のドメインおよび第2のドメインのアミノ酸配列をコードする。第1のドメインおよび/または第2のドメインが重鎖および軽鎖を含む場合、一部の実施形態において、異なる核酸が、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列をコードする。他の実施形態において、同じ核酸分子が、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列をコードする。特定の実施形態において、一核酸分子が、第1のドメインおよび第2のドメインのアミノ酸配列(例えば、重鎖および軽鎖の配列)のあらゆる組合せをコードしてよい。特定の実施形態において、一核酸分子が、第1の結合ドメインのアミノ酸配列および第2の結合ドメインの軽鎖アミノ酸配列をコードしてよく、場合によってはこの2つを連結するあらゆるペプチドリンカー配列を含んでもよい。
本発明の更なる態様が、本発明の三重特異的結合分子を生産する方法に関する。本発明のこの態様の一実施形態が、本明細書中で定義される三重特異的結合分子を生産する方法であって、三重特異的結合分子を発現することができる組換え宿主細胞を提供することと、前記宿主細胞を、三重特異的結合分子の発現に適した条件下で培養することと、生じた三重特異的結合分子を単離することとを含む方法に関する。そのような組換え宿主細胞におけるそのような発現によって産生される三重特異的結合分子は、本明細書中で、「組換え三重特異的結合分子」と呼ぶ。三重特異的結合分子が抗体である場合、「組換え抗体」と呼ぶ。本発明はまた、そのような宿主細胞の子孫細胞、およびこれによって産生される三重特異的結合分子を提供する。
本発明の別の態様は、活性成分として(または唯一の活性成分として)本発明の三重特異的結合分子を含む医薬組成物である。医薬組成物は、本明細書中に記載されるあらゆる三重特異的結合分子を含み得る。一部の実施形態において、当該組成物は、IL−17A、IL−17F、TNFαの活性によって影響され得る障害、および/または自己免疫疾患もしくは炎症性疾患の改善、予防、および/または処置が意図される。
一態様において、本発明の三重特異的結合分子は、IL−17A、IL−17F、および/またはTNFαの活性によって影響を受け得る障害の処置に用いられる。例えば、医師は、本発明の三重特異的結合分子を単独で、または他の治療剤と組み合わせて(連続的に、または同時に)投与することによって、自己免疫疾患または炎症性疾患を処置することができる。三重特異的結合分子は、IL−17A、IL−17F、および/またはTNFαの活性を調節して、自己免疫応答または炎症応答の低下をもたらす。本発明の三重特異的結合分子および方法によって処置され得る疾患として、以下のいずれかが挙げられ得る:関節リウマチ、変形性関節症、若年性慢性関節炎、敗血症性関節炎、ライム変形性関節症、乾癬性関節炎、反応性関節炎、脊椎関節症、全身性エリテマトーデス、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、インスリン依存性真性糖尿病、甲状腺炎、喘息、アレルギー性疾患、乾癬、プラーク乾癬、アトピー性皮膚炎、強皮症、「移植片対宿主」臓器移植拒絶反応、臓器移植に伴う急性または慢性免疫疾患、サルコイドーシス、川崎病、グレーブス病、ネフローゼ症候群、慢性疲労症候群、ヴェゲナー肉芽腫症、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、顕微鏡的腎血管炎、慢性活動性肝炎、尿毒症、敗血性ショック、毒素ショック症候群、敗血症症候群、悪液質、後天性免疫不全症候群、急性横脊髄炎、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、原発性胆汁性肝硬変、溶血性貧血、成人(急性)呼吸窮迫症候群、脱毛症、円形脱毛症、血清反応陰性関節症、関節症、ライター病、潰瘍性大腸炎の関節症に関連する乾癬性関節症、アトピー性アレルギー、自己免疫性水疱性疾患、尋常性天疱瘡、シート様天疱瘡、類天疱瘡、線状IgA、自己免疫性溶血性貧血、クームス陽性溶血性貧血、後天性悪性貧血、若年性悪性貧血、関節炎、原発性硬化性A型肝炎、潜在性自己免疫性肝炎、線維症肺疾患、原発性線維症肺胞炎、炎症後間質性肺疾患、間質性肺炎、慢性好酸球性肺炎、感染後間質性肺疾患、痛風性関節炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性I型肝炎(古典的自己免疫性肝炎またはルポイド)、自己免疫性II型肝炎変形性関節症、原発性硬化性胆管炎、I型乾癬、II型乾癬、特発性白血球減少症、自己免疫性好中球減少症、腎NOS疾患、糸球体腎炎、顕微鏡的腎血管炎、円板状エリテマトーデス、特発性またはNOS−男性不妊症、精子に対する自己免疫、多発性硬化症(全てのサブタイプ)、交感神経性眼炎、結合組織疾患に続発する肺高血圧症、グッドパスチャー症候群、結節性多発動脈炎の肺症状、急性リウマチ熱、リウマチ性脊椎炎、強直性脊椎炎、スティル病、全身性硬化症、Shengrena症候群、シェーグレン症候群、高安動脈炎、自己免疫性血小板減少症、特発性血小板減少症、自己免疫性甲状腺疾患、甲状腺機能亢進症、甲状腺腫自己免疫性甲状腺機能低下症(橋本病)、自己免疫性萎縮性甲状腺機能低下症、原発性粘液浮腫、白内障ぶどう膜炎、原発性血管炎、白斑、急性肝疾患、慢性肝疾患、アレルギー、喘息、精神障害(うつ病および統合失調症が挙げられる)、仲介型のTh2型およびTh1型疾患、結膜炎、アレルギー性接触性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、アルファ−1−抗トリプシン欠損症、筋萎縮性側索硬化症、貧血、サイトカイン療法障害に関連する嚢胞性線維症、脱髄疾患、皮膚炎、虹彩網膜炎/ぶどう膜炎/視神経炎、虚血再灌流障害における損傷、虚血性脳卒中、若年性リウマチ様関節炎、自己免疫性腸障害、自己免疫性難聴、自己免疫性リンパ増殖性症候群、自己免疫性心筋炎、自己免疫早期卵巣不全、および眼瞼炎。三重特異的結合分子はまた、先の障害のあらゆる組合せを処置し得る。
・本発明の三重特異的結合分子、および治療剤のそのような組合せの、処置を必要とする患者への同時投与(そのような成分が、前記成分を実質的に同時に前記患者に放出する単一剤形に一緒に製剤化される場合)、
・本発明の三重特異的結合分子、および治療剤のそのような組合せの、処置を必要とする患者への実質的に同時の投与(そのような成分が、前記患者によって実質的に同時に摂取されると直ぐに、前記成分が、前記患者に実質的に同時に放出される別個の剤形に、互いに別々に製剤化される場合)、
・本発明の三重特異的結合分子、および治療剤のそのような組合せの、処置を必要とする患者への逐次投与(そのような成分が、前記患者によって、それぞれの投与間の時間間隔を長くして連続して摂取されると直ぐに、前記成分が、前記患者に実質的に異なる時点にて放出される別個の剤形に、互いに別々に製剤化される場合)、
・本発明の三重特異的結合分子、および治療剤のそのような組合せの、処置を必要とする患者への逐次投与(そのような成分が、前記成分を制御放出すると直ぐに、同じ時点および/または異なる時点にて、同時に、連続的に、かつ/または重複して前記患者に放出される単一剤形に一緒に製剤化される場合)(各部分が、同じ経路または異なる経路によって投与され得る)。
本発明の三重特異的結合分子は、問題の症状の処置に有効な量で、すなわち、所望される結果を達成するのに必須の投与量で、かつそうするのに必須の期間、投与されることとなる。治療的に有効な量は、処置されることとなる特定の症状、患者の年齢、性別、および体重、そして三重特異的結合分子が、スタンドアロン処置として施されることとなるのか、1つまたは複数の追加の抗自己免疫処置または抗炎症処置と組み合わせて施されることとなるのか等の要因に従って、変動し得る。
本発明の三重特異的結合分子は、診断プロセス(例えば、in vitro、ex vivo)にも有用である。例えば、三重特異的結合分子は、患者由来のサンプル(例えば、組織サンプル、または体液サンプル、例えば、炎症性滲出液、血液、血清、腸液、唾液、もしくは尿)中のIL−17A、IL−17F、および/またはTNFαのレベルを検出かつ/または測定するのに用いられ得る。適切な検出方法および測定方法として、免疫学的方法、例えば、フローサイトメトリ、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、化学発光アッセイ、ラジオイムノアッセイ、および免疫組織学が挙げられる。本発明はさらに、本明細書中に記載される三重特異的結合分子を含むキット(例えば診断キット)を包含する。
例1:三重特異的抗IL−17A/抗IL−17F/抗TNFα抗体の作出および最適化
図1に示すように、三重特異的抗IL−17A/抗IL−17F/抗TNFα抗体を作出し、かつ最適化した。
公開されているプロトコール(Longo et al.,Methods Enzymol 529:227−240(2013))に従って、EBNA1(エプスタイン・バール・ウイルス核抗原1)を構成的に発現するCHO−K1細胞において、抗体および抗原を産生させた。Life Technologies Corporationによって生産されている無血清培地を用いて、製造者の指示に従って、細胞を、オービタルシェーカ上で懸濁培養した。一過性発現のために、細胞を、2×10E6/mlの濃度にて、線状ポリエチレンイミン(PEI MAX,Polysciences)により形質移入した。DNA/PEI比は1:3であった。形質移入の5〜7日後に、培地を2000gにて20分間遠心分離して、0.22μmフィルタで濾過した。アフィニティクロマトグラフィによって、標的タンパク質を培養液から抽出した。
ラマ(Lama Glama)を、等容量の完全フロイントアジュバント(1回目の注射中)または不完全フロイントアジュバント(残りの注射用)と混合した抗原物質の皮下注射によって、連続して5回免疫化した。組換えタンパク質の混合物を、抗原(1回の注射につき各タンパク質0.2mg)として用い、そのうちの1つが、ヒトIL−17A−H6F(例2)であった。1回目から3週間後に2回目の注射(免疫化工程)を実行してから、2週間おきにさらに3回免疫化を実行した。血液サンプル(50ml)を、3回目からはじめて、各注射の5日後に採取した。
特異的抗IL−17AファージFabを、先で記載した一連の選択サイクルを実行することによって、組換えヒトIL−17A(R&D Systems)でFabディスプレイライブラリから単離した(Marks et al.,J Mol Biol 222(3):581−597(1991);de Haard et al.,J Biol Chem 274(26):18218−30(1999))。パニングによる選択を実行するために、50mM炭酸バッファ(pH9.5)中のヒトIL−17Aを、吸着管High Sorb(Nunc)の表面上に、4℃にて一晩吸着させた。管を、PBS(pH7.4)で洗浄してから、PBS溶液(pH7.4)−スキムミルク(0.5%wt./Vol.)で1時間ブロックした。次に、PBS(pH7.4)−スキムミルク(0.5%wt./Vol.)中のファージ溶液2.4ml(1ml中1012ファージ粒子の濃度)を、抗原を入れた試験管に加えて、撹拌しながら1時間インキュベートした。非結合ファージを、PBS溶液(pH7.4)−Tween 20(0.1%vol./vol)を用いて、一連の洗浄サイクルの間に除去した。洗浄回数は、第1ラウンドから第3ラウンドまで、それぞれ20−30−40回まで増大させた。残りの結合ファージ粒子を、100mlのGly−HCl(pH2.5)溶液で15分間、撹拌しながら溶出してから、1M Tris−HCl(pH7.6)で中和した。細菌株、大腸菌(E.coli)TG1に、得られたファージを感染させてから、ファージを単離して、次の選択サイクルに用いた。
EIA(ELISA)を用いて、選択されたFabフラグメントの、ヒトIL−17Aとの結合を測定した。陽性対照として、公開されている配列(Novartis)を有するFab抗体AIN457を用いた。特異的結合アッセイのために、ELISAプレート(Nunc Immuno Maxisorp)上のウェルを、50μlのIL−17A(1Xコーティング炭酸バッファ中0.5μg/ml)でコーティングしてからシールして、4℃にて一晩インキュベートした。その後のステップは全て、GenetixQ−pix2xt(Molecular Device)ロボットシステムおよびTecan Freedom EVO 200(Tecan)に基づく自動化高性能プラットフォームを用いる標準的なEIAプロトコールによって実行した。非特異的結合を阻害するために、ブロッキングバッファ(BB)を加えた(PBS中0.5%スキムミルク200μl)。プレートを、シェーカ上で室温にて1時間インキュベートした。PBS−Tweenによる洗浄後、分析されるFabを含有する試験細胞上清を、ウェルあたり50μl加えて、等容量のブロッキングバッファと混合した。プレートを再び室温にて1時間、振盪しながらインキュベートしてから、プレートの各ウェルを、PBS−Tweenバッファで5回洗浄した。洗浄後、50μl/ウェルのヒト抗Fab HRP結合二次抗体(Pierce−Thermo Scientific)を、PBS−Tween中に、1:5000の比率で加えた。プレートを、ロータリーシェーカ(50分、室温)上で振盪して、先に記載したようにPBS−Tweenバッファで5回洗浄した。TMB(100μl/ウェル)を、飽和するまで(平均3〜5分)加えることによって比色シグナルを発色させてから、更なる発色を、停止溶液(100μl/ウェル、10%硫酸)を加えることによって停止させた。色シグナルを、450nmの波長にて、適したプレートリーダ(Tecan−Sunrise;Tecan)を用いて測定した。抗体結合の程度は、色シグナル生成と比例した。シグナルがバックグラウンドカラーを5倍超上回ったクローンを、競合的EIA分析で試験して、IL−17Aリガンドと受容体との相互作用を阻害するアンタゴニストFabを検出した。
競合ELISAを用いて、以前に選択された抗ヒトIL−17A Fabのアンタゴニスト能力を分析した。陽性対照として、アンタゴニストFab抗体AIN457(Novartis)を用いた。ELISAプレート(Nunc Immuno Maxisorp)のウェルに、50μlの受容体IL−17ARA−Fc(R&D Systems)を、1Xコーティング炭酸バッファ中1mg/mlの濃度にて固定して、4℃にて一晩インキュベートした。その後のステップは全て、GenetixQ−pix2xt(Molecular Device)ロボットシステムおよびTecan Freedom EVO 200(Tecan)に基づく自動化高性能プラットフォームを用いる標準的なEIAプロトコールによって実行した。非特異的結合を阻害するために、ブロッキングバッファ(BB)を加えた(PBS中0.5%スキムミルク200μl)。プレートを、シェーカ上で室温にて1時間インキュベートした。
抗IL−17A Fab候補についてのkoffの比較スクリーニングを、装置Octet Red 96(Pall−ForteBio)を用いて実行した。抗FABCH1バイオセンサを、10mM PBS、pH7.2〜7.4、0.1%Tween−20、および0.1%BSAを含有するランニングバッファ中で30分間再水和させた。大腸菌(E.coli)10x作業バッファを試験サンプルに加えて、最終濃度を1xにした。次に、抗FABCH1バイオセンサを、候補Fabフラグメントのサンプルおよび大腸菌(E.coli)中に、12℃にて4時間浸漬した。Fabフラグメントが表面上に固定されたセンサを、ランニングバッファでウェル中に移して、ベースラインを特定した(60秒)。次に、センサを、検体(IL−17A、30μg/ml)の溶液が入ったウェル中に、抗原−抗体複合体の会合(association)のために移した(300秒)。次に、センサを、ランニングバッファを含有するウェルに、次の解離工程のために戻した(300秒)。各実験の後、用いたセンサを、次の実験に用いるために、再生用の3倍バッファ(Gly−HCl、pH1.7)に入れることによって、再生した。Octet Data Analysisソフトウェア(バージョン7.0)を用いて、相互作用モデル1:1を用いる標準的な手順に従って、曲線の解析を実行した。
表1.ヒトIL−17Aに対するVHHFab親和性およびヒトIL−17Fに対する特異性。
ゆえに、解析データに基づいて、3VHHVK4B11のVHHモノドメインは、他の2つの候補と比較して、最大の結合親和性を示した。
ELISAアッセイを、ヒトIL−17F(R&D Systems)についてではあるが、例5に記載した標準的なELISAプロトコールに従って、3つの前述のVHHFabに実行した。Fab抗体AIN457(公開されている配列;Novartis)を、陽性対照として用いた。3つのVHHFab候補の相互作用の定性分析の結果を、表1に示す。以下に記載する突然変異を有する、以後VHH17(配列番号1;図9)と称するVHHモノドメインを、3VHHVK4B11 Fabに対する親和性試験および交差反応性試験に基づいて、更なる研究のために選択した。
VHH17ドメインCDRの個々の位置への突然変異を、Q5(登録商標)Site−Directed Mutagenesis Kit(NEB)を用いたNNKランダム化技術によって、製造者のプロトコールに従って挿入した。プラスミドpET22b−VHH17を、マトリックスとして用いた。PCR産物を、低融点アガロースゲル上で分画して、適切なカラム上で精製した。ライゲーション後、DNAを、大腸菌(E.coli)発現株BL21(DE3)中に形質転換した。先に記載したように、個々のクローンを、96ウェルプレート中での発現によって得た。突然変異体VHH17を含有する上清を、先に記載した条件下で、そして高性能Genetix Q−pix2xtシステムおよびTecan Freedom EVO200システムを用いて、ELISAによって分析した。固定化されたIL−17Aの濃度は、0.2μg/mlであった。結合したVHH17モノドメインを、1:5000希釈マウス抗mycタグ9E10、抗マウスIgG(HRP)結合体(Pierce)、およびTMB+H2O2/H2SO4色素で染色した。450nmの波長での吸収を測定した。
表2.VHH17走査突然変異誘発
ヒトTNFα(RU2303604号明細書)に対する抗体の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの遺伝子を、元のコドン組成内で合成して、重鎖および軽鎖についてそれぞれpEE−Hc(IgG1)プラスミドおよびpEE−Lcプラスミド中にクローニングした。これにより、CHO−EBNA細胞における共同の(joint)一過性発現が、IgG1アイソタイプモノクローナル抗体を産生し得る。これらの構築体を、配列決定によって検証し、重鎖についてはpEE−aTNF−IgG1Hcと命名し、そして軽鎖についてはpEE−aTNFLcと命名した(図9は、可変ドメインのアミノ酸配列を示す)。
抗体の試験溶液を、96ウェルプレート中で、500ng/mlの濃度から、1ウェルあたり溶液2,100μlきざみで滴定した。500pg/mlの濃度に組換えヒトTNFαの溶液を調製してから、50μlを、試験サンプル入りの各ウェルに加えた。プレートを、CO2インキュベータ内で37℃にて1時間インキュベートした。
ヒト組換えIL−17AおよびTNFαの存在下で、ヒトHT1080細胞株(ATCC:CCL−121)によって、IL−6の産生を誘導するIL−17Aの能力を用いて、三重特異的候補BCD−121(例10参照)の中和活性を分析した。10%不活化胎児血清、グルタミン、およびゲンタマイシンを補充したDMEM培地中で、細胞を増殖させた。細胞を、96ウェル平底細胞培養プレートに、ウェルあたり5×104個加えて、5時間放置して付着させた。40ng/mlの組換えIL−17Aの混合物を、抗体希釈液と共に、37℃にて1時間インキュベートした。次に、サイトカイン/抗体混合物を、細胞に加えて、一晩放置した。HT1080細胞培養体におけるIL−6の産生は、加えたIL−17Aの量に比例した。細胞上清中に放出されたIL−6の量を、ELISAによって、「DuoSet ELISA Development System Human IL6」(R&D System,Cat.No.DY206)を用いて判定した。結果を図15に示す。再生した抗TNFα単一特異的抗体アダリムマブを、陰性対照として用いて、抗IL−17A単一特異的抗体BCD−085を、陽性対照(BIOCAD)として用いた。グラフから分かるように、アダリムマブはIL−6の産生を阻害せず、BCD−085は、IL−6の産生を約9.2ng/mLのIC50で阻害し、BCD−121抗体は、IL−6の産生を3.5ng/mLのIC50で有利に阻害した。ゆえに、候補抗体BCD−121は、このアッセイにおいて、IL−6産生の最も強力なアンタゴニストである。
ヒト組換えIL−17AおよびTNFαの存在下で、ヒトHT1080細胞株(ATCC:CCL−121)によってIL−6の産生を誘導するIL−17Aまたは二重IL−17A/TNFαの能力を用いて、三重特異的結合分子候補BCD−121(例10参照)の中和活性を分析した。10%不活化胎児血清、グルタミン、およびゲンタマイシンを補充したDMEM培地中で、細胞を増殖させた。1ウェルあたり5×104個の細胞を、96ウェル平底細胞培養プレートに加えた。細胞を、5時間放置して付着させた。40ng/mlの組換えIL−17Aおよび20ng/mlのTNFαの混合物を、抗体の希釈液と共に、37℃にて1時間インキュベートした。次に、サイトカインおよび抗体の混合物を、細胞に加えて、一晩放置した。HT1080細胞培養体におけるIL−6の産生は、加えたIL−17Aの量に比例した。細胞上清中に放出されたIL−6の量を、ELISAによって、「DuoSet ELISA development system human IL6」(R&D System,Cat.No.DY206)を用いて判定した。結果を図16に示す。再生した抗TNFα単一特異的抗体アダリムマブおよび抗IL−17A単一特異的抗体BCD−085(BIOCAD)を、対照として用いた。グラフから分かるように、BCD−121三重特異的抗体は、単一特異的抗体と比較して、有利な効果を示し、約25pMのIC50値を、そしてより下部のプラトーでは、ほとんど検出不可能な量のIL−6を示した。対照的に、対照抗体アダリムマブは、IC50値が約100pMであった。BCD−085は、約25pMの同様のIC50値を示したが、閾値プラトー(threshold plateau)がBCD−121よりも20倍超低かった。ゆえに、BCD−121は、用いたアッセイにおいて、IL−6産生の最も強力なアンタゴニストである。
以下の定量アッセイに用いるために、Jurkat−tmTNFα cl.8細胞培養体をフラスコから回収して、200gにて5分間遠心分離した。定量のために、上清をデカントして、培地中でもう一回洗浄した。
抗体の試験溶液を、96ウェルプレート中で、15μg/mlの濃度から、1ウェルあたり250μlきざみで滴定した。ヒト補体を、分析用の冷却培地(1%BSA入りRPMI)中に1:3で溶解させて、50μlを、試験サンプル入りのウェル中に加えた。50μlのJurkat−tmTNFα細胞懸濁液を各ウェルに加えて、サンプルを、1×106細胞/mlの濃度(1ウェルあたり5×104細胞)とした。プレートを、オービタルシェーカ上で室温にて3分間振盪して、37℃のCO2インキュベータ内に2〜3時間置いた。生存細胞数を、生存染色Alamar Blueを用いて測定した。インキュベーションの完了後、Alamar Blue試薬15μlを、検体プレートの各ウェルに加えてから、プレートを、オービタルシェーカ上で室温にて5分間振盪した。プレートを、37℃にて18〜24時間インキュベートした。蛍光読取りを、Fluoroskan Ascent FL装置を用いて、544/590nmの励起/発光波長にて、相対的蛍光単位で評価した。
ヒトIL−17AおよびヒトTNFαへのBCD−121の同時結合の分析を、Octet Red96装置(Pall−ForteBio)による古典的な「サンドイッチ」分析法を用いて実行した(図19)。ランニングバッファとして0.1%Tween−20および0.1%BSAを含有するPBSを用いて、30℃にて分析を実行した。実験中、第1の抗原(IL−17A−ビオチン)を、ストレプトアビジンでコーティングしたセンサ上に、20μg/mlの濃度および200μl/ウェルの容量にて固定化した。さらにセンサを、20μg/mlの濃度の抗体の200μl/ウェルの抗体溶液中に浸漬した。その後、センサを、1mg/mlの濃度の200μl/ウェルのTNFα溶液中に、そしてタンパク質を含有しない生理食塩水中に浸漬した。
分析を、サンドイッチアプローチを用いて、Sino Biologicsによって製造されているIL−17A調製物およびTNFα調製物を用いて行った。チップの活性化後、個々のリガンドを、非特異的に(NH2基によって)、バイオセンサ表面上に20μg/mlの濃度にて固定化した。次に、抗体の負荷(Loading)を、1〜25μg/mlの濃度にて実行した。その後、複合体解離工程用のランニングバッファ中にセンサを浸漬した。流量は10μl/分であった。
表3.IL−17A、IL−17F、およびTNFαに対するBCD−121の親和性
ELISAを用いて、ヒトIL17ファミリ抗原に対するBCD−121の比較結合を測定した。結合分析のために、ELISAプレート(Greiner bio one由来の結合培地)のウェルを、50μlのヒトIL−17A、IL−17B、IL−17C、IL−17D、IL−17E、IL−17F、またはIL−17A/F(R&D Systems)で、(1×コーティング炭酸バッファ中)1μg/mlの濃度にて個々にコーティングして、密封して、4℃にて一晩インキュベートした。その後の全ての工程を、標準的なEIAプロトコールによって実行した。非特異的結合を阻害するために、ブロッキングバッファBBを加えた(PBS中0.5%スキムミルク200μl)。プレートを、シェーカ上で室温にて1時間インキュベートした。PBS−Tweenで洗浄した後、50μlの試験抗体を、PBS−Tween中5μg/mlの濃度にて、各ウェルに加えた。プレートを再び室温にて1時間、振盪しながらインキュベートしてから、プレートの各ウェルを、PBS−Tweenバッファで3回洗浄した。洗浄後、ヒト抗Fab HRP結合二次抗体(Pierce−Thermo Scientific由来)を、PBS−Tween中に、1:5000の比率にて加えた(50μl/ウェル)。プレートを、ロータリーシェーカ(50分、室温)上で振盪して、先に記載したようにPBS−Tweenバッファで3回洗浄した。TMB(50μl/ウェル)を、飽和するまで(平均3〜5分)加えることによって比色シグナルを発色させてから、更なる発色を、停止溶液(30μl/ウェル、10%硫酸)を加えることによって停止させた。色シグナルを、450nmにて、適したプレートリーダ(Tecan−Sunrise;Tecan)を用いて測定した。抗体結合の程度は、色シグナル生成と比例した。
ELISAアッセイを、例16に記載したのと同様のプロトコールを用いて実施した。ヒト、モルモット、ウサギ、およびマウスのTNFα抗原は、R&D Systemsに由来する。
Zetasizer Nano ZSP装置で、サンプル(1mg/ml)の凝集点(aggregation point)の判定を実行した。0.5mlの溶液を、ダストフリーの石英キュベット内に入れ、これを装置内で1.5℃ずつ50〜85℃まで徐々に加熱した。各温度を30秒間維持して、散乱光の強度を定数測定(constant measuring)した。散乱光の強度を、角度θ=173°にて検出した。
表4.動的光散乱によって測定したBCD−121凝集点
約5mg/mlの濃度のタンパク質サンプルを、それぞれ200μlの3つの部に分けて、別々のチューブ内に入れた:各組成物について1本のチューブを、+4℃の冷蔵庫内で保存した。他の2本を試験管ヒータ内に入れて、50℃にてそれぞれ6時間および24時間インキュベートした。加温後、チューブをヒータから取り出して、室温にて15分間静置して、8000rpmにて5分間遠心分離して、上清を、UV検出器によるゲル濾過用に移した。
抗体の軽鎖および重鎖を最適な比率で含有するNeon Transfection System(Life Technologies)スラリー親細胞株CHO−Sベクター構築体を用いたエレクトロポレーションによる形質移入によって、BCD−121の安定したプロデューサ細胞株を得た。ClonePixロボットプラットフォーム(Molecular Devices)を用いて、生産性が高い(1000mg/L)クローン株を得た。ミニプール選択の準備段階を、抗生物質を用いて、種々の培養形式で実行した。生産性分析を、分析システムOctet RED96(Pall Life Sciences)を用いて実行した。基本培地および培養スキームの選択に、自動化システムBiomek FXロボット(Beckman Coulter)を用いて、DOEを実行した。プロデューサ細胞を培養するために、動物性タンパク質を含有しない無血清培地およびフィッティング(fitting)を用いた。前臨床研究用のBCD−121の蓄積を、使用容量が50lのHyClone単回使用バイオリアクタ(Thermo Fisher Scientific)内で実行した。
BCD−121を含有する培養液の清澄化を、深層フィルタMillistak C0HC(Merck−Millipore)上で実行した。一次抗体の精製を、プロテインAによる親和性樹脂上で、特異的標的タンパク質を用いて実行して、抗体を、pH3.3〜3.8のグリシンバッファで溶出した。ウイルス不活化のために、溶出液を、酸性pHにて30〜60分間インキュベートしてから、1M Tris−OH溶液で中和した。残留DNA、タンパク質産生細胞、切断リガンド親和性吸着剤凝集体、および抗体フラグメントを除去するために、吸着剤CHT(商標)Ceramic Hydroxyapatite(Bio−Rad)上で最終のクロマトグラフィ精製を実行した。この方法について、タンパク質溶液を、pH7.5にて調製した吸着剤に、続いて塩化ナトリウムによる特定の溶出勾配にアプライした。精製したタンパク質を、Viresolve PROフィルタ(Merck Millipore)のセットを用いて、ウイルスについて濾過した。タンパク質を、カットオフ限界が50kDaであるテープ上での接線流中で濃縮し、続いて酢酸バッファ(pH5.0)、ソルビトール、およびポリソルベート−80を含有する最終バッファに対して透析濾過した。最終溶液中のタンパク質濃度は、少なくとも70mg/mlであった。
純粋なヒト血清中でのBCD−121の安定性を評価するために、三重特異的抗体を、2、10、および50μg/mlの濃度にて、7人の健康なドナーから得た純粋なヒト血清混合物に加えて、0.01%チメロサールで保存処理して、37℃にて7日間保存した。7日後、BCD−121の濃度を、ELISAによって、2つのアッセイ形式で測定した:固定化したTNFαおよびビオチン化したIL17(ストレプトアビジン−HRP結合体の検出による)、ならびに固定化したTNFα(ヤギ抗ヒトIgG Fc−HRP結合体の検出による)。2、10、および50μg/mlの濃度になるように、BCD−121をELISA測定の直前に加えた血清サンプルを、対照として用いた。測定を、以下のように実行した:対照、および、2、10、または50μg/mlのBCD−121を含む、保存した血清サンプルを、100ng/mlに希釈し(それぞれ20倍、100倍、および500倍)、そして実際の濃度を、PBS−Tween中に溶解した標準較正曲線(6.25〜200ng/ml)に対して測定した。全てのELISA工程は、標準的なEIAプロトコールによって実行した。100μlの希釈サンプルまたは較正標準を、TNFαによってプレコーティングしたマイクロウェルに加えた。コーティングしたTNFαの濃度は、pH9.5の20mM炭酸バッファ中2μg/mlであった。次に、ブロッキングバッファ(BB:PBS中0.5%スキムミルク200μl)をプレートに加えた。プレートをシェーカ上で室温にて1時間インキュベートした。PBS−Tweenで洗浄した後、100μlのビオチン化IL17(3μg/ml)またはヤギ抗ヒトIgG Fc−HRP(Sigma、1:20000の比率)を、ウェル単位で加えた(PBS−Tween中の濃度)。プレートを再び室温にて1時間、振盪しながらインキュベートしてから、プレートの各ウェルを、PBS−Tweenバッファで3回洗浄した。100μlのストレプトアビジン−HRP結合体を、1:20000(Sigma)の比率で、ビオチン化したIL17を予め加えたウェル中に追加的に加えた。その後の1時間のインキュベーションおよび洗浄の後、TMB(100μl/ウェル)を、飽和するまで(平均10〜15分)加えることによって比色シグナルを発色させてから、更なる発色を、停止溶液(50μl/ウェル、10%硫酸)を加えることによって停止させた。色シグナルを、450nmにて、適したプレートリーダ(Tecan−Sunrise;Tecan)を用いて測定した。BCD−121結合の量は、色シグナル生成と比例した。較正曲線濃度を、これに希釈係数を掛けて、理論的に加えた血清BCD−121濃度%として表した。
以下の研究を、コラーゲン誘導性関節炎のモデルを用いて、雄のカニクイザル(Macaca fascicularis)に行った。実験における動物の総数は、それぞれ4頭のサルの5群で20頭であった。実験では、産物の4用量:0.2mg/kg;1.0mg/kg;5.0mg/kg;10.0mg/kgを用いた。対照群の動物にはプラセボを与えた。産物およびプラセボの投与を、コラーゲンによる予備感作の後に開始した。この研究の間、全群の動物を測定して、APWの関節面を算出した。研究の最後に、中手指節関節および中足指節関節をとって、破壊的変化の重篤度を評価した。実験群についての概略を、以下の表5に示す。
表5.
投与したコラーゲンの総量は、実験動物あたり2mgであった。この目的のために、2mgのコラーゲンを、0.7mlの0.1M酢酸中に溶解した。この溶液に、0.7mlの完全フロイントアジュバントを加えた。
投与したコラーゲンの総量は、実験動物あたり3mgであった。この目的のために、3mgのコラーゲンを、1mlの0.1M酢酸中に溶解した。この溶液に、1mlの完全フロイントアジュバントを加えた。
投与したコラーゲンの総量は、実験動物あたり3mgであった。この目的のために、3mgのコラーゲンを、1mlの0.1M酢酸中に溶解した。この溶液に、1mlの完全フロイントアジュバントを加えた。
・コラーゲンの第1の投与前;
・コラーゲンの第2の投与時;そして
・第2の投与(コラーゲンの投与直前)の後、7週間毎週。
JA=縦軸の値×横軸の値×3.14×0.25。
実験日のJA値×100
関節炎の誘発前のJAの平均値
毒物動態アッセイを、カニクイザル(cynomolgus)に実行した。この研究では、BCD−121産物の3つの用量レベルを用いた。実験群の概略を、以下の表6に示す。
表6.
−臨床検査の結果;
−動物の体重(投与前、ならびに実験の7、14、21、28、35、および42日目);
−体温(投与前、ならびに実験の7、14、21、28、35、および42日目の投与後1、2、4、6、および24時間);
−尿検査(投与前、ならびに実験の7、14、21、28、35、および42日目);
−パラメータ:赤血球数、白血球数、ヘモグロビン濃度の臨床血液分析(投与前、ならびに実験の7、14、21、28、35、および42日目);
−血清比率:LDH、総ビリルビン、総タンパク質、グルコース、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、およびアラニンアミノトランスフェラーゼの生化学的分析(投与前、ならびに実験の7、14、21、28、35、および42日目);そして
−霊長類の血清中の薬物濃度(投与後0.5、1、3、6、24、30、48、72、96、120、144、168、192、264、336、408、504、624、720、816、912、および1008時間)。
Х=АхF
式中、A−較正曲線を用いて判定した、試験サンプル中のBCD−121表の濃度(ng/ml);
F−初期血清の希釈倍数;
BCD−121の1ヶ月間の反復皮下投与に続く、1ヶ月の回復期間の毒性アッセイを、ジャワのカニクイザルに実行した。3つの用量レベルを実験に用いた。実験群の概略を、以下の表7に示す。
表7.
−臨床検査の結果;
−動物の体重(投与前、そしてその後毎週);
−体温(投与前、そしてその後、実験終了まで毎週);
−心血管系に及ぼす影響、これについて、心臓の生体電気活性を、Poly−Spectrumシステムを用いて評価した;投与前、そしてその後、実験の3、5、および7週目に評価した;
−尿検査(投与前、ならびに実験の3、5、および7週目);
−パラメータ:赤血球数、白血球数、ヘモグロビン濃度、リンパ球数、単球、好中球、好酸球、および好塩基球の数、ならびに血小板数の臨床血液分析(投与前、その後、実験の第1週から開始して、週に1回);
−以下に関して血液凝固系に及ぼす影響の評価:
活性化部分トロンボプラスチン時間、フィブリノーゲン濃度、およびプロトロンビン時間(投与前、その後、実験の3、5、および7週目);
−血清比率の生化学的分析:ナトリウム、カリウム、クレアチニン、尿素、アルカリホスファターゼ、LDH、総ビリルビン、総タンパク質、グルコース、トリグリセリド、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、総コレステロール(投与前、ならびに実験の3、5、および7週目);
−投与期間の終わりに、群3*のサテライト動物を、安楽死させてから病理学的に検査した;研究の終わりに、群3および対照群の動物に同じことをした;
−毒性研究の一部として、局所刺激性薬物の影響も評価し、これについて、注射部位の軟部組織を選択して、組織学的検査を実行した。
1ヶ月間の反復皮下投与に続く、1ヶ月の回復期間の免疫毒性の調査毒性アッセイを、ジャワのカニクイザルに実行した。3つの用量レベルを実験に用いた。実験群の概略を、以下の表8に示す。
表8.
−リンパ球の亜集団組成。これは、投与前、そしてその後、実験の2、4、および6週目に評価した;
−免疫グロブリンのクラス比率。これは、投与前、そして実験の2、4、および6週目に評価した;
−食作用に及ぼす影響を、投与前に、そしてその後、実験の2、4、および6週目に評価した。
1ヶ月間の反復皮下投与に続く、1ヶ月の回復期間の免疫毒性の調査毒性アッセイを、ジャワのカニクイザルに実行した。3つの用量レベルを実験に用いた。実験群の概略を、以下の表9に示す。
表9.
1ヶ月間の反復皮下投与に続く、1ヶ月の回復期間の薬物動態アッセイを、ジャワのカニクイザルに実行した。3つの用量レベルを用いた。実験群の概略を、以下の表10に示す。
表10.
表11:配列番号チャート
Claims (43)
- ヒトIL−17AおよびヒトIL−17−Fに結合する第1の結合ドメイン、ならびにヒト炎症誘発性分子に結合する第2の結合ドメインを含む三重特異的結合分子。
- 前記結合分子は、抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項1に記載の結合分子。
- 前記第1の結合ドメインは、配列番号3のアミノ酸配列を含む、請求項1または2に記載の結合分子。
- 前記第1の結合ドメインは、配列番号1〜3のアミノ酸配列を含む、請求項1または2に記載の結合分子。
- 前記第1の結合ドメインは、配列番号4のアミノ酸配列を含む結合ドメインと同じエピトープとの結合について競合し、または同エピトープに結合する、請求項1または2に記載の結合分子。
- 前記第1の結合ドメインは、配列番号4と少なくとも90%同一である、請求項1または2に記載の結合分子。
- 前記第1の結合ドメインは、配列番号4のアミノ酸配列を含む、請求項1または2に記載の結合分子。
- 前記第1の結合ドメインはヒト化されている、請求項1に記載の結合分子。
- 前記第2の結合ドメインは、ヒトTNFαに結合する、請求項1に記載の結合分子。
- 前記第2の結合ドメインは、
a)配列番号10〜12のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号13〜15のアミノ酸配列を含む軽鎖;
b)配列番号8のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、および配列番号9のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン;または
c)配列番号5のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号6のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む結合ドメインと同じエピトープとの結合について競合し、または同エピトープに結合する、請求項9に記載の結合分子。 - 前記第2の結合ドメインは、配列番号12のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号15のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項9に記載の結合分子。
- 前記第2の結合ドメインは、配列番号10〜12のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号13〜15のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項11に記載の結合分子。
- 前記第2の結合ドメインは、配列番号8と少なくとも90%同一である重鎖可変ドメイン、配列番号9と少なくとも90%同一である可変ドメイン、またはそれらの双方を含む、請求項9に記載の結合分子。
- 前記第2の結合ドメインは、配列番号8のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、配列番号9のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、またはそれらの双方を含む、請求項9に記載の結合分子。
- 前記第2の結合ドメインは、配列番号8のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメイン、および配列番号9のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメインを含む、請求項9に記載の結合分子。
- 前記第2の結合ドメインは、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体、Fv、Fab、F(ab’)2、Fd、一本鎖Fv分子(scFv)、ダイアボディ、または単一ドメイン抗体(dAb)である、請求項9に記載の結合分子。
- 前記第2の結合ドメインは、配列番号5と少なくとも90%同一である重鎖、配列番号6と少なくとも90%同一である軽鎖、またはそれらの双方を含む、請求項9に記載の結合分子。
- 前記第2の結合ドメインは、配列番号5のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号6のアミノ酸配列を含む軽鎖、またはそれらの双方を含む、請求項9に記載の結合分子。
- 前記第2の結合ドメインは、配列番号5のアミノ酸配列からなる重鎖、および配列番号6のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、請求項9に記載の結合分子。
- ヒトIL−17AおよびヒトIL−17Fに結合する第1の結合ドメイン、およびヒトTNFαに結合する第2の結合ドメインを含む三重特異的結合分子であって、前記第1の結合ドメインは、配列番号4のアミノ酸配列を含み、前記第2の結合ドメインは、配列番号5のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号6のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、三重特異的結合分子。
- ヒトIL−17A、ヒトIL−17F、およびヒトTNFαに結合する三重特異的結合分子であって、配列番号5および7のアミノ酸配列を含む三重特異的結合分子。
- 前記第1の結合ドメインおよび前記第2の結合ドメインは、5個を超えるアミノ酸のペプチドリンカーによって連結されている、請求項1、20、および21のいずれか一項に記載の結合分子。
- 前記ペプチドリンカーのアミノ酸残基が、G、A、S、P、E、T、D、およびKから選択される、請求項22に記載の結合分子。
- 前記ペプチドリンカーは、配列番号16のアミノ酸配列を含む、請求項22に記載の結合分子。
- 前記結合分子は、アイソタイプIgGの抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項1、20、および21のいずれか一項に記載の結合分子。
- 前記抗体は、アイソタイプサブタイプIgG1のものである、請求項25に記載の結合分子。
- 前記結合分子は、突然変異のない同結合分子と比較して、前記抗体依存性細胞媒介性細胞毒性(ADCC)および/または前記補体依存性細胞毒性(CDC)を軽減する少なくとも1つの突然変異を有するFC領域を含む、請求項1、20、21のいずれか一項に記載の結合分子。
- 前記結合分子は、以下の特性:
a)IL−17AのKDが10−11M以下;
b)IL−17FのKDが10−7M以下;
c)TNFαのKDが10−11M以下;
d)HT1080細胞におけるIL−6アッセイにおいて、200ng/mL未満の濃度にて少なくとも50%IL−17Aおよび/またはIL−17A/TNFαの活性を阻害する;
e)HT080細胞によるIL−17A依存性IL−6放出を阻害する;
f)HT1080細胞におけるIL−6の産生を阻害する;
g)WEHI−13VAR細胞において100ng/mL未満の濃度にて少なくとも50%TNFα依存性細胞毒性を阻害する;
h)ウサギ、マウス、またはモルモットのTNFαには結合しない;
i)IL−17AおよびTNFαに同時に結合する;
j)カニクイザルIL−17AおよびTNFαに結合する;
k)ヒト血清における37℃での7日のインキュベーション後、安定したままである;
l)半減期が、in vivoで、12日を超える;
m)in vivo関節炎モデルにおいて炎症誘発性効果を有する;そして
l)IL−17およびTNFαの活性をin vivo阻害する
の少なくとも1つを有する、請求項1、20、21のいずれか一項に記載の結合分子。 - 請求項1〜28のいずれか一項に記載の結合分子、および薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物。
- 請求項3〜20のいずれか一項に記載の結合分子の前記第1の結合ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
- 請求項11〜20のいずれか一項に記載の結合分子の前記第2の結合ドメインの、前記重鎖、前記軽鎖、またはそれらの双方をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
- a)請求項3〜20のいずれか一項に記載の結合分子の前記第1の結合ドメインをコードするヌクレオチド配列;
b)請求項11〜20のいずれか一項に記載の結合分子の前記第2の結合ドメインの重鎖をコードするヌクレオチド配列;
c)請求項11〜20のいずれか一項に記載の結合分子の前記第2の結合ドメインの前記軽鎖をコードするヌクレオチド配列;または
d)a)〜c)のあらゆる組合せ
を含む、単離された核酸分子。 - 請求項3〜20のいずれか一項に記載の結合分子の前記第1の結合ドメインをコードするヌクレオチド配列、および請求項11〜20のいずれか一項に記載の結合分子の前記第2の結合ドメインの前記軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含み、場合によっては、ペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、単離された核酸分子。
- 配列番号1〜15のいずれか1つのアミノ酸配列をコードする、単離された核酸分子。
- 請求項30〜34のいずれか一項に記載の単離された核酸分子を含むベクターであって、発現制御配列をさらに含むベクター。
- a)請求項3〜20のいずれか一項に記載の結合分子の前記第1の結合ドメインをコードするヌクレオチド配列;
b)請求項11〜20のいずれか一項に記載の結合分子の前記第2の結合ドメインの重鎖をコードするヌクレオチド配列;および
c)請求項11〜20のいずれか一項に記載の結合分子の前記第2の結合ドメインの前記軽鎖をコードするヌクレオチド配列
を含む宿主細胞。 - 配列番号5をコードするヌクレオチド配列、および配列番号7をコードするヌクレオチド配列を含む宿主細胞。
- 請求項36または請求項37に記載の宿主細胞を用意することと、前記宿主細胞を、前記結合分子の発現に適した条件下で培養することと、生じた前記結合分子を単離することとを含む、請求項1〜28のいずれか一項に記載の結合分子の生産方法。
- 請求項1〜28のいずれか一項に記載の結合分子、または請求項29に記載の医薬組成物を必要とする患者を処置する方法であって、前記結合分子または前記医薬組成物を前記患者に投与することを含む方法。
- 前記患者は、IL−17A、IL−17F、またはTNFαによって媒介される障害を患っている、請求項39に記載の方法。
- 患者の関節リウマチ、乾癬、または乾癬性関節炎を処置する方法であって、前記患者に、請求項1〜28のいずれか一項に記載の結合分子、または請求項29に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
- 前記方法はさらに、抗炎症剤または免疫抑制剤を投与することを含む、請求項41に記載の方法。
- 前記患者はヒトである、請求項39に記載の方法。
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