JP2019513154A - 血小板ペレット溶解物の調製及び神経学的障害の処置のためのその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
a)血小板ペレット溶解物を準備する工程、
b)この血小板ペレット溶解物を20〜40分にわたり55℃〜65℃の温度で熱処理する工程、
c)工程b)の熱処理血小板ペレット溶解物を精製して、工程a)の血小板ペレット溶解物の総タンパク質含有量の70%未満の総タンパク質含有量を有する改変熱処理血小板ペレット溶解物を得る工程
を含む方法に関する。
i.血小板濃縮物を準備する工程、
ii.前記血小板濃縮物を遠心分離して、血小板ペレット及び第1の上清を得る工程、
iii.この上清を除去し、このペレットを生理学的緩衝液に懸濁させる工程、
iv.前記懸濁ペレットを凍結解凍する工程、
v.工程iv)で得られた懸濁液を遠心分離して、血小板ペレット溶解物及び第2の上清を得る工程。
下記の定義及び説明は、本明細書及び特許請求の範囲の両方を含む本出願全体を通して使用される用語に関する。
BAFF:B細胞活性化因子
BDNF:脳由来神経栄養因子
C5/C5a:補体成分5/活性化型;
CSF:脳脊髄液
Ctrl:対照
Dkk-1:Dickkopf WNTシグナル伝達経路阻害剤1
DPPIV:ジペプチジルペプチダーゼIV
EGF:上皮成長因子
EMMPRIN:細胞外マトリックスメタロプロテイナーゼ誘導因子
ENA-78:上皮由来好中球活性化ペプチド78
FGF:線維芽細胞成長因子
FGF-β:線維芽細胞成長因子-β
Fas L:fasリガンド
G-CSF:顆粒球コロニー刺激因子
GDF-15:成長分化因子15
HGF:肝細胞成長因子
IGFBP-2:インスリン様成長因子結合タンパク質-2
IL:インターロイキン
IP-10:インターフェロンタンパク質10
I-TAC:インターフェロン誘導性T細胞アルファ走化性因子
kDa:キロダルトン
LIF:白血病抑制因子
MCP:単球走化性サイトカイン(monocyte chemoattractant cytokine)
MCP-1:単球走化性サイトカイン1
M-CSF:単球コロニー刺激因子
MIF:遊走阻止因子
MIG:インターフェロンガンマ誘導性モノカイン
MIP-1a/1b:マクロファージ炎症性タンパク質
MIP-3a:マクロファージ炎症性タンパク質
MM:分子質量
MPP+:1-メチル-4-フェニルピリジニウム
MMP:マトリックスメタロプロテアーゼ
MMP-9:マトリックスメタロプロテアーゼ9
Neg Ctrl:陰性対照
PBS:リン酸緩衝生理食塩水
PC:血小板濃縮物
PDGF:血小板由来成長因子
PDGF-AB:血小板由来成長因子-AB
PDGF-AB/BB:血小板由来成長因子-AB/BB
PF4:血小板因子4
PL:血小板溶解物
PPL:血小板ペレット溶解物
PPLE:期限切れのPC由来の血小板ペレット溶解物
PPLF:期限切れではないPC由来の血小板ペレット溶解物
RANTES:活性化時に制御される正常T細胞の発現及び分泌(regulated on Activation Normal T cell Expressed and Secreted)
RAGE:高度糖化最終産物用のレセプター
RBP4:レチノール結合タンパク質4
SDS-PAGE:ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
TGF-β:形質転換成長因子-β
TNF:腫瘍壊死因子。
SHBG:ステロイドホルモン結合グロブリン
ST2:インターロイキン1レセプター様1
TARC:胸腺及び活性化制御ケモカイン
TFF3:トレフォイル因子ファミリ3
TfR:トランスフェリンレセプター
uPAR:ウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベーターレセプター
VEGF:血管内皮成長因子
vWF:Von Willebrand因子
- 血漿及び血小板の採取
Institutional Review Board of Taipei Medical Universityが本研究を承認した(第201301020号)。血小板濃縮物をTaipei Blood Center(Guandu、Taiwan)から入手した。この血小板濃縮物を、ボランティアの健康なドナーからアフェレーシス(MCS+; Haemonetics社、Braintree、MA、USA)により得た、白血球が減少していない血小板濃縮物から採取した。血小板及び他の血液細胞の総数を、ABC Vet(ABX Diagnostics社、Montpellier、France)を使用して、既に説明されているように各寄贈について測定した。
血小板溶解物を無菌条件下で調製し、図1で要約した。血漿中に懸濁させた治療グレードのアフェレーシス血小板濃縮物を使用して、-80/30℃±1℃での3回の凍結-解凍サイクル及び22±2℃での30分にわたる4500×gでの遠心分離によりペレット化して細胞残渣を除去することにより、血小板溶解物(PL)対照を調製した。本発明の方法の工程a)において出発物質として使用する血小板ペレット溶解物(PPL)を調製するために、血小板濃縮物(200〜250mL)を遠心分離し(3000×g;30分;22±2℃)、血漿上清を注意深く除去し、ペレットの表面を無菌PBS 2mLで緩やかに洗浄した。PBS(最初のPC体積の10%)を添加し、この混合物を緩やかにピペッティングして血小板を懸濁させ、次いで3回の凍結-解凍サイクル(-80/30±1℃)に供し、遠心分離(4500×g;30分;22±2℃)により清澄化した。このPPLのアリコート(500μl)を、使用するまで-80℃で冷凍保存した。30分にわたる45、56、65±1℃での乾燥浴中における熱処理及び氷上での少なくとも5分間の冷却により、いくつかの熱処理PPLを調製し、次いで遠心分離した(10000×g;15分;4±2℃)。37±1℃で乾燥浴を使用して、同様の方法で対照PPLも調製した。次いで、上清(熱処理PPL又は37℃で処理したPPL)を-80℃で冷凍保存した。
様々なPPLの総タンパク質を、標準としてのウシ血清アルブミン(Thermo Fischer Scientific社、Waltham、MA、USA)及びナノドロップ(NanoDrop社; Wilmington、DE、USA)を使用するマイクロブラッドフォードアッセイで測定した。タンパク質ゾーン電気泳動及びリポタンパク質電気泳動を、SPIFE 3000(Helena社、Texas、USA;タンパク質試料0.5mLをロードする)を使用して実行した。既に説明されているように30、4%〜12%勾配ゲル、試薬、Invitrogen社(Carlsbad、CA、USA)の電気泳動システム、及び予め染色したタンパク質分子量標準(Proteinラダー、Thermo社)を使用して、非還元条件下及び還元条件下でドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)を実施した。
成長因子を、既に説明されているように31〜33、供給業者の指示に従ってQuantikine ELISAキット(R&D Systems社、Minneapolis、MN、USA)を使用して3回の反復で測定した。
LUHMES細胞をDr. Scholzの研究室(University of Konstanz、Germany)から入手し、説明されているように培養した28。
分化した時点で(5日目)、細胞を1時間にわたり様々な濃度の血小板ペレット溶解物(0.025〜15%;体積/体積)に曝露し、続いて30μM MPP+(Sigma-Aldrich社)に曝露した。細胞生存率をMTTで48時間後に評価した。
分化を促すために、2日にわたり培養フラスコ中において0.5%FBS、4mM L-グルタミン、1%PS及び1μM all transレチノイン酸を補充した改良型DMEM/F12中で神経幹細胞(NSC-34)を増殖させた。次いで、細胞を、6時間にわたり、0.5%FSBを含む分化培養中において1つのウェル当たり3×104個の細胞の濃度にて24ウェルプレート中で播種した。次いで、この培地をFBSフリー分化培地と置き換えた。3日後、培地を、処理のためにレチノイン酸フリー分化培地に変更した。NSC-34細胞を1時間、2時間又は3時間にわたりメナジオン又はスタウロスポリン(STS)で最初に処理した後、合計で24時間にわたり改変熱処理PPLを添加(5%)した。細胞生存率及び酸化ストレスを、それぞれヨウ化プロピジウム及びヒドロエチジンを使用するフローサイトメトリーにより評価した。統計解析をノンパラメトリックマンホイットニー検定で行なった。
全ての動物手順を、国内の及び国際的なガイドライン(1987年10月19日の法令87-848;French Ministry of Agriculture and Forestry, Veterinary Service for Animal Health and Welfare)に従って行なった。使用したマウスは5ヶ月齢であり、体重は28〜30gであった。
結果を平均±標準偏差(SD)で表す。データの正規分布を調べた後に、一方向ANOVAを使用して統計分析を実施した。非正規分布の場合にはウィルコクソン及びクラスカル-ウォリスのノンパラメトリックテキストを実施した。<0.05のP値を統計的に有意と見なした。
出発血小板濃縮物の血球の総数及び血小板溶解物のキャラクタリゼーション
血小板ペレット溶解物及び血小板溶解物を調製するために使用した血小板濃縮物は、1240±252×109個/Lの血小板、0.08±0.05×1012個/Lの赤血球及び0.5±0.2×109個/Lの白血球の平均総数を有した。
血小板ペレット溶解物を最初に30分にわたり56℃で処理して、本発明に係る改変熱処理PPLを得た。
インビトロでのPPL神経保護能力を更に証明するために、LUHMES細胞に対する0.1〜5%(体積/体積)PPLの毒性の欠如(図10A)を最初に確認した。
37℃で処理したPPL及び本発明に係る改変熱処理PPLのICV注射の可能性を検証するための実験は、4つの選択した投与量(1%、2.5%、5%及び10%)にて明らかな悪影響はないことを示した。この実験の1週間の持続時間にわたりPPL注入後に即時の検出可能な毒性効果はなかった。この手順と関連する死亡率は低かった(10匹の動物中1匹)。
Claims (17)
- 改変熱処理血小板ペレット溶解物を調製する方法であって、
a)血小板ペレット溶解物を準備する工程、
b)血小板ペレット溶解物を20〜40分にわたり55℃〜65℃の温度で熱処理する工程、
c)工程b)の熱処理血小板ペレット溶解物を精製して、工程a)の血小板ペレット溶解物の総タンパク質含有量の70%未満の総タンパク質含有量を有する改変熱処理血小板ペレット溶解物を得る工程
を含む方法。 - 工程c)の精製が、遠心分離又はろ過で実行される、請求項1に記載の方法。
- 工程b)での熱処理が、55℃〜60℃の温度で、より好ましくは約56℃の温度で実施される、請求項1に記載の方法。
- 工程b)での熱処理の持続時間が、約30分である、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 工程c)の後に、
- 血小板ペレット溶解物を含有する上清を約-80℃で凍結保存する工程
を更に含む、請求項1に記載の方法。 - 非熱処理血小板ペレット溶解物の総タンパク質含有量の、70%未満、60%未満、より好ましくは50%未満の総タンパク質含有量を有する、改変熱処理血小板ペレット溶解物。
- 1.5mg/mL未満、好ましくは1mg/mL未満、より好ましくは0.5mg/mL未満、更により好ましくは0.1mg/mL〜0.3mg/mLのフィブリノゲンを有する、請求項6に記載の改変熱処理血小板ペレット溶解物。
- 非熱処理血小板ペレット溶解物のPF4含有量の50%超、好ましくは60%超、より好ましくは70%超のPF4含有量を有する、請求項6又は7に記載の改変熱処理血小板ペレット溶解物。
- 薬物としての使用のための、請求項6から8のいずれか一項に記載の改変熱処理血小板ペレット溶解物。
- 神経学的障害の処置における、請求項9に記載の使用のための改変熱処理血小板ペレット溶解物。
- 神経学的障害が、神経変性障害、神経炎症性障害、神経発達障害、神経血管障害及び脳傷害から選択される、請求項10に記載の使用のための改変熱処理血小板ペレット溶解物。
- 神経学的障害が、多発性硬化症(MS)、パーキンソン病(PD)、ハンチントン病(HD)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、脳卒中、加齢性黄斑変性(AMD)、アルツハイマー病(AD)、血管性認知症、前頭側頭型認知症、意味性認知症及びレビー小体型認知症から選択される神経変性障害である、請求項11に記載の使用のための改変熱処理血小板ペレット溶解物。
- 神経変性障害が、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、加齢性黄斑変性及びアルツハイマー病から選択される、請求項12に記載の使用のための改変熱処理血小板ペレット溶解物。
- 神経学的障害が、低酸素症又は外傷性脳損傷から選択される脳傷害である、請求項11に記載の使用のための改変熱処理血小板ペレット溶解物。
- 改変熱処理血小板ペレット溶解物が、髄腔内経路、眼内経路、鼻腔内経路又は脳室内経路で投与される、請求項9から14のいずれか一項に記載の使用のための改変熱処理血小板ペレット溶解物。
- 改変熱処理血小板ペレット溶解物が、脳室内経路で投与され、より具体的には右側脳室に投与され、好ましくは脳室内孔に閉じ込められ、より好ましくは第3の脳室に投与される、請求項15に記載の使用のための改変熱処理血小板ペレット溶解物。
- 前記血小板ペレット溶解物が、ポンプで投与されるように適合されている、請求項16に記載の使用のための改変熱処理血小板ペレット溶解物。
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