TWI535848B - 包含眼窩脂肪衍生之幹細胞（ｏｆｓｃ）之細胞群及彼等之分離與應用 - Google Patents
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Description
本發明關於一種含有眼窩脂肪衍生之幹細胞(OFSCs)之細胞群及其分離、純化、特性分析及應用。特別是，該OFSCs可多元性分化(multilineage development)且表現至少CD90及CD105，而非造血及上皮細胞標記。
各種角膜疾病導致不可逆地損失角膜上皮細胞，因而引起角膜混濁且在晚期案例中導致失明。幹細胞移植對於眼組織的修復及再生帶來了極大的希望，目前為止，已有報導指出可由人類眼組織(如角膜緣上皮細胞、睫狀上皮細胞及米勒細胞(Müller glia))中分離出幹細胞及先驅細胞(progenitor cell)。在這些成績中，最主要的突破係自體角膜緣幹細胞移植，其可補充因角膜緣細胞不足而無法自發再生的損傷角膜上皮細胞，且已成功地用於患者治療，然而，其主要的缺點為對正常角膜員幹細胞造成的損傷及有限的來源。此外，對於那些嚴重且雙眼有角膜緣疾病的病人，不可能以角膜緣幹細胞移植而唯一的方式為異體角膜鞏膜移植術(Pellegrini G,De Luca M,Arsenijevic Y.,Semin Cell Dev Biol.2007；18：805-818)。但除非經常性的施予長期免疫抑制劑，否則異體角膜移植仍受到排斥反應而阻礙其長期成功(Liang L,Sheha H,Tseng SC.,Arch Ophthalmol.2009；127：1428-1434；Limb GA,Daniels JT,Cambrey AD,et al.,Curr Eye Res.2006；31：381-390)。因此，當務之急是
要尋找角膜表面移植之自體移植幹細胞來源替代品以避免排斥及損害正常眼部結構。
在胚胎發育時，大部份的眼部及眼眶部份源於神經外胚層。神經脊細胞，為一種源於神經外胚層的暫存細胞群，成為臉始基(facial primordia)之大部份的間葉細胞。在早期眼部發育時，神經脊細胞由間腦遷移並定位在視胞附近，除了細胞外肌肉纖維及血管內皮細胞襯以外，其對眼睛及眼窩中的結締組織成份有極大貢獻。技藝領域中已知人類脊幹細胞可直接分化為周邊神經系統及間質族系，此外，體內的族系追蹤研究發現，體髓間葉幹細胞(BM-MSCs)及脂肪細胞的發育起源在神經脊中。
脂肪細胞為幹細胞特別豐富的來源，已被證實在脂肪組織中含有多能幹細胞群，且其他研究也證明該組織為內皮細胞的來源(見美國專利號第5,372,945號)。Korn等人報導人體眼窩脂肪組織分離出脂肪衍生之幹細胞，其具有分化為脂肪、平滑肌及神經元/神經膠質族系的潛能(Ophthal Plast Reconstr Surg.2009 Jan-Feb；25(1)：27-32)。然而，Korn等人所報導的脂肪衍生之幹細胞表現CD34，意味著這些細胞為造血細胞來源。
鑒於由脂肪組織中分離出的幹細胞的治療目的，仍有需要發展由其他脂肪組織來源中之新穎幹細胞。
本發明提供一種細胞群，其包含至少表現CD90及CD105之眼窩脂肪衍生之幹細胞(OFSCs)，其中該OFSCs非造血
及上皮來源，且該OFSCs可多元性(multilineage)分化。
本發明亦提供了一種分離及純化本發明之含有OFSCs之細胞群，其包含步驟：(a)收集含有眼窩脂肪組織0.5至2ml的樣品；(b)分解眼窩脂肪組織並將所得之組織懸浮於含有細胞外基質(ECM)降解酶之緩衝溶液中；(c)過濾所得之溶液以獲得沉澱物；(d)再懸浮該沉澱物以獲得細胞懸浮溶液；(e)計數細胞懸浮溶液中的細胞，並將細胞以小於8,000/cm2之低接種密度培育於培養基中；(f)收集具有群落形成能力的細胞並將該細胞以非接觸的方式次培育；且(g)以細胞表面標記及多分化能力來鑑別及特性分析所得細胞，其中OFSCs為具有多元性分化且表現至少CD90及CD105但缺乏造血及上皮細胞表面標記之細胞。
本發明更提供了一種使眼窩脂肪衍生之幹細胞(OFSCs)分化為角膜上皮細胞之方法，其包含將OFSCs與角膜上皮細胞混合培養之步驟。
本發明更進一步提供了製備角膜上皮細胞製劑之方法，其包含：(a)由眼窩脂肪樣品中分離眼窩脂肪衍生之幹細胞(OFSCs)；(b)將OFSCs與標記之角膜上皮細胞混合培養以分化為角膜上皮細胞；且(c)移除標記之角膜上皮細胞以獲得OFSCs衍生之角膜上皮細胞製劑。
脂肪組織衍生的基質細胞及由基質血管部分所吸取出皮下脂肪所分離的細胞被證實具有幹細胞特性。本發明則證實人類眼窩脂肪組織(OFSCs)存在多潛能幹細胞，且多潛能OFSCs可由少量的眼窩脂肪組織分離出。本發明出人意料地發現眼窩脂肪為可分離具有多重潛能(包含可分化為骨、軟骨、脂肪及角膜上皮細胞的潛能)幹細胞的良好來源。
本文中之「脂肪組織」代表含有多種細胞類型的組織，包括脂肪細胞及微血管細胞。因此，脂肪組織意指脂肪，其含有儲存脂肪之結締組織。
本文中之「幹細胞」為當暴露於特異的環境狀態下，具有自我更新能力及多重分化能力的細胞。自我更新代表在細胞分裂時，兩個子細胞中至少一個為幹細胞。
本文中之「多潛能」代表細胞具有分化為至少兩種細胞的潛能。
本文中之「角膜上皮細胞(epithelia)」或「角膜上皮細胞(epithelium)」係由上皮組織所組成且覆蓋了前方的角膜。其由數層細胞所組成，在最底層的細胞為柱狀，接下來的二到三層為多角形細胞，大部分為與角質層中黏膜層所發現到的細胞類似的棘狀細胞。
本文中之「分化」係指形成可表現與更特異的細胞及接近不可進一步分裂或分化的終止分化細胞相關的功能標記的細胞。
本文中之「族系特定細胞(lineage committed cell)」係指不再具有多重潛能及確定分化成特定細胞族系的前驅細胞。
本文中之「自體移植物(autologous transplant)」係指移植材料源自於且移植至同一個體。
本文中之「增生」及「擴展」係指細胞數量的增加。
本文中之「細胞表面標記」係指表現在細胞表面的蛋白質，其可透過特異性的抗體而偵測。
本文中之「表現呈陽性」係指無論是細胞內或細胞外，標記可以任何方式(其包含但不限於流式細胞儀)在細胞內或細胞上偵測之。術語「表現呈陽性」、「陽性表現」、「表現」及用於上標的「+」在本文可交互使用。
本文中之「表現呈陰性」係指無論是細胞內或細胞外，使人感興趣的標記以任何方式(其包含但不限於流式細胞儀)在細胞內或細胞上無法偵測到。術語「表現呈陰性」、「陰性表現」、「不表現」及用於上標的「-」在本文可交互使用。
本文中之「單離」係指單一細胞或細胞群，代表源於眼窩脂肪中實質上沒有其他類型細胞或細胞物質的細胞或細胞群。
在一方面，本發明提供了一種細胞群，其包含表現至少CD90及CD105之眼窩脂肪衍生之幹細胞(OFSCs)，其中該OFSCs非造血及上皮來源，且該OFSCs可多元性(multilineage)分化。
根據本發明，該OFSCs係由眼窩脂肪所衍生。它們在本發明的幾個特定實施例如重組、再生或令人關注的疾病的修復或製造套組為有用的。眼窩脂肪為半流動性的脂肪墊，排列於支持眼睛的眼窩骨中。根據本發明，OFSCs可由眼窩脂肪組織的基質及血管部分中分離出。
使用細胞表面標記及其他標記(如細胞內酵素)及細胞的光散射特性的組合，幹細胞移植可有效的為特別的治療用途而「訂做」。例如，生成造血族系的幹細胞可用於代替骨髓中的造血系統；生成間葉族系的幹細胞可用於修復肌肉骨骼疾病；幹細胞分化為上皮族系者可用於修復表面損上，包括角膜；幹細胞分化為神經細胞族系者可用於治療神經退化性疾病，包括視網膜變性。因此，於此所揭示的細胞標記的新穎組合賦予如辨別幹細胞來源而可功能性地且大量性地用於分離幹細胞等優勢。
抗體可用於辨別標的細胞分化性表現的表面分子。細胞表面標記代表表現於細胞表面的蛋白質，其可以特異性的抗體而偵測之。細胞標記及表面標記在本發明中為有益的，其包含但不限於，CD(表面分化抗原)抗原CD29、CD44、CD49b、CD49e、CD58、CD80、CD86、CD90、CD105、HLA-ABC、CK-19、CK-3、CD14、CD31、CD34、CD40、CD45、CD106、CD117、CD133、CD146及HLA-DR。CD29為一種表現於大部分細胞的整合蛋白(integrin)β1次單元；CD49b為VLA-2受體的整合蛋白α1次
單元；CD49e為纖維連結蛋白受體的整合蛋白α5次單元；CD44為細胞表面參與細胞-細胞交互作用的醣蛋白；CD58為表現在抗原呈現細胞(APC)(特別是巨噬細胞)的細胞黏附分子；CD90為在前胸腺細胞上的GPI-細胞錨定分子；CD105為內皮細胞中發現的二硫鍵單二聚體，但在大多數的T細胞及B細胞上則無；HLA-ABC為與β2-微球蛋白相關的MHC的I型抗原，且表現於人類所有的有核細胞；CK-19為第I型角蛋白；CK-3為角蛋白3；CD14為內生免疫系統的成分；CD31為所有內皮細胞及一些血小板及白血球上的同型黏附分子；CD34為高度醣基化的第I型穿膜蛋白，表現於1-4%的骨髓細胞上；CD40為在抗原呈現細胞上的共刺激蛋白；CD45為所有造血源的白血球共同抗原；CD80為活化的B細胞及單核球細胞上發現的蛋白，可提供T細胞活化及存活的共刺激訊號；CD86為表現於抗原呈現細胞的蛋白質，可提供T細胞活化及存活的共刺激訊號；CD106為VCAM1基因所編碼的蛋白質並作為細胞黏附的分子；CD117為在1-4%的骨髓幹細胞上發現的c-kit配位體；CD133為表現於未分化的造血原始細胞上之五聚(pentaspan)跨膜醣蛋白；及HLA-DR為MHC第II型分子。
在一實施例中，本發明之OFSCs可表現至少CD90及CD105。除了CD90及CD105，本發明之OFSCs可表現CD29、CD44、CD49b、CD49e、CD58、HLA-ABC或其組合。在另一實施例中，本發明之OFSCs可表現CD29、CD44、CD49b、CD49e、CD58、CD90、CD105及HLA-ABC。表現CD90及CD105顯示本發明之OFSCs表現間葉幹細胞標記。表現CD29、CD44、CD49b、CD49e或其組合則進一步確認OFSCs為間葉細胞源。
在一些實施例中，缺乏細胞表面標記定義了本發明之OFSCs。根據本發明，OFSCs對於至少造血幹細胞標記CD34為陰性，除了CD34以外，OFSCs對於造血幹細胞標記CD133、內皮初始細胞標記CD31、血管細胞黏附分子-1、CD106、血管內皮緊密接合標記CD146、白血球共同抗原CD45、單核球標記CD14及CD117(c-kit)或其組合亦為陰性，此意味著這些細胞並非造血細胞源。根據本發明，OFSCs對於CD40、CD80、CD86、HLA-DR或其組合為陰性，意味著這些細胞在哺乳類中不會引起排斥反應。
根據上述的獨特細胞表面抗原特徵，已可鑑別出具有獨特功能特性的特有幹細胞群。
在某些實施例中，在本發明的細胞群中至少70%、80%或90%的OFSCs表現令人關注的細胞標記；在其他實施例中，幹細胞群中至少80%或90%的OFSCs表現令人關注的細胞標記；又在另外的實施例中，幹細胞群中至少95%、96%、97%、98%、99%或甚至100%的OFSCs表現令人關注的細胞標記。「實質上缺乏」則代表細胞群中少於5%、4%、3%、2%、1%或甚至0%的細胞表現令人關注的細胞標記。雖然本文特別例示由眼窩脂肪中分離純化的細胞群，而由其他來源分離這些細胞亦可考量。
技術領域中所知的篩選方法及描述於此的方式可用於OFSCs的特性分析。通常，可將OFSCs的來源與單株抗體反應，且以量子點、透過補體介導裂解免疫磁珠、凝集方式或螢光激活分子分選(FACS)來篩選無論是陽性或陰性表現細胞表面抗原的次細胞群。具有被定義的細胞表面表型之所得的次細胞群之功能性特質接著以群落形成試驗決定之。
根據本發明，OFSCs具有群落形成能力及多元性分化能力。因此，本發明之OFSCs具有骨、軟骨及脂肪分化能力。除了中胚層三層系列分化外，OFSCs具有角膜上皮分化潛力。結合一起後，眼窩脂肪組織為具有分化潛能的多潛能幹細胞之新穎性來源。因此，OFSCs可用於細胞治療及組織工程，例如退化性疾病、組織損傷修復、器官再生及醫療美容之組織再生。
本發明亦提供了包含有本發明細胞群的組合物。根據本發明，除了細胞群外，上述的組合物包含一或多種醫藥上可用之非活化的載體。非活化的載體的例子包含有防腐劑、助溶劑、穩定劑等。組合物可用於非口服給藥，例如靜脈注射、皮下注射、腹腔給藥或局部施予。細胞群的劑量可根據疾病態樣、疾病嚴重程度、給藥途徑、或病人的體重、年齡及性別而調整。
本發明之OFSCs可使用多種方式由眼窩脂肪組織中分離及純化，包含本文所述之方式並例示如下。對於鑑別及特性分析，分離後的OFSCs可利用細胞表面標記之表現分選作陽性篩選及以缺乏細胞表面標記表現作陰性分選。
在另一方面，本發明發展了一種容易的方法，可由少量的(約0.5至2ml)眼窩脂肪組織中分離OFSCs。因此，本發明提供了一種分離並純化含有OFSCs細胞群的方法，其包含步驟：(a)收集含有眼窩脂肪組織0.5至2ml的樣品；(b)分解眼窩脂肪組織並將所得之組織懸浮於含有細胞外基質(ECM)降解酶之緩衝溶液中；(c)過濾所得之溶液以獲得沉澱物；(d)再懸浮該沉澱物以獲得細胞懸浮溶液；(e)計數細胞懸浮溶液中的細胞，並將細胞以小於8,000/cm2之低接種密度培育於培養基中；(f)收集具有群落形成能力的細胞並將該細胞以非接觸的方式次培育；且(g)以細胞表面標記及多分化能力來鑑別及特性分析所得細胞，其中OFSCs為具有多元性分化且表現至少CD90及CD105但缺乏造血及上皮細胞表面標記之細胞。
根據本發明，步驟(a)中之含有眼窩脂肪組織0.5至2ml的樣品可由眼眶內腔直接移除的眼窩組織中收集而得，或由眼瞼內翻、眼瞼外翻、眼瞼下垂或眼袋之瞼造型手術所收集而得。可利用無凝結燒灼、非吸取方式收集。較佳地，該樣品含有約0.5ml至約1.5ml或約0.5至約1.0ml的眼窩脂肪組織。更佳地，該樣品含有約1.0ml的眼窩脂肪組織。
根據本發明，步驟(b)之分解眼窩脂肪組織可以任何技術領域中已知的方式進行，例如，步驟(b)之眼窩脂肪組織可簡易的使用剪刀或鑷子支解。分解後，所得的組織置於含有細胞外基質(ECM)降解酶之緩衝溶液中。較佳地，該ECM-降解酶為膠原蛋白酶、基質金屬蛋白酶、胜肽內切酶或透明質酸酶。更佳地，該ECM-降解酶為膠原蛋白酶，較佳地，該膠原蛋白酶為第I型膠原蛋白酶。
根據本發明，步驟(c)的過濾方式可以任何技術領域中已知的方式進行以獲得細胞沉澱物。例如，可利用過濾、濾膜或濾網，而過濾後，可進一步進行離心。
根據本發明，步驟(d)的細胞沉澱物經再懸浮以獲得細胞懸浮溶液，接著，在步驟(e)，計數於細胞懸浮溶液中的細胞，並將細胞以小於8,000/cm2之低接種密度培育於培養基中。較佳地，接種密度約由500至8,000細胞/cm2、1,000至8,000細胞/cm2或3,000至5,000細胞/cm2。
根據本發明，在步驟(f)中，大多數初始接種的細胞在2-4週後會死亡並由壁上脫落(detached)，而殘餘者(約0.05細胞/cm2)具有群落形成能力。收集源於由單一群落的細胞並培養在適宜的培養基中(如曼森專門培養基，Mesen Pro Medium)以增加細胞數目。當貼壁細胞達約60%至70%滿時，將細胞打下並以1：3的比例在相同條件下重新培養。
根據本發明，在步驟(g)中，使用如本文所描述的細胞表面標記以辨別並特性分析步驟(e)所獲得的細胞。結果，細胞具有可分化為骨、脂肪及軟骨分化的多元性分化能力並表現至少CD90及CD105，但缺乏造血及上皮細胞表面標記。表現及不表現的細胞標記為那些描述於「眼窩脂肪衍生之幹細胞(OFSCs)細胞群」段落中者。
本發明僅需要少量的眼窩脂肪樣品就可獲得多數的多潛能OFSCs，其提供了一種獲得幹細胞的有利方式。
在另一方面，本發明提供了一種眼窩脂肪衍生之幹細胞(OFSCs)分化為角膜上皮細胞之方法，其包含將OFSCs與角膜上皮細胞混合培養之步驟。
本發明發現，與角膜上皮細胞直接接觸對於OFSCs要分化為角膜上皮細胞是不可或缺的，意味著對於其在眼表面喪失的角膜上皮細胞之再生潛能要透過與角膜上皮細胞接觸。
根據本發明，OFSCs與角膜上皮細胞混合培養可在任何適宜的培養基下進行。較佳地，適宜用於培養角膜上皮細胞的培養基可用於本發明的混合培養。例如，可使用貝克改良老鷹培養基(DMEM)。
根據本發明，在與角膜上皮細胞混合培養後，可發現喪失CD105表現且增進上皮細胞標記的表現(如上皮特異性抗原及帶狀封閉蛋白-1)。本發明亦以表現CK-19及CK-3來證實角膜上皮分化，而在相同的誘導條件下，當源於皮下脂肪的人類脂肪衍生之幹細胞與角膜上皮細胞混合培養無法分化為角膜上皮細胞。
因此，在另一方面，本發明提供了一種眼球表面上使喪失的角膜上皮細胞再生之方法，其包含將角膜上皮細胞與OFSCs接觸。也就是說，本發明提供了一種OFSCs於製備用於眼球表面上使喪失的角膜上皮細胞再生之藥劑的用途，其中該OFSCs與角膜上皮細胞接觸。當將角膜上皮細胞培養於轉移盤時，無法產生與接觸混合培養的相同誘導效能，因此，旁分泌作用在使角膜上皮細胞誘發成為上皮細胞及角膜上皮細胞分化中可能並非扮演重要的角色。在另一方面，本發明提供了一種在眼球表面上使喪失的角膜上皮細胞再生的套組，其包含OFSCs與角膜上皮細胞在分別的包裝之中。藉由使用此方法或套組，可以實現對於因喪失角膜上皮細胞而造成的角膜疾病的細胞療法及角膜上皮的組織工程。
根據本發明，可進一步將一或多種細胞分化劑，如細胞因子或生長因子，用於使喪失角膜上皮細胞的再生方法及套組中。
在另一方面，本發明提供了一種製備角膜上皮細胞製劑之方法，其包含：(a)由眼窩脂肪樣品中分離眼窩脂肪衍生之幹細胞(OFSCs)；(b)將OFSCs與標記之角膜上皮細胞混合培養以分化為角膜上皮細胞；且(c)移除標記之角膜上皮細胞以獲得OFSCs衍生之角膜上皮細胞製劑。
根據本發明，可由OFSCs衍生之角膜上皮的子代中有效的分離角膜上皮細胞。一種解決的方法是將角膜上皮細胞加上標記，因此可增加分離效率。特別是，步驟(b)中的角膜上皮細胞為受標記的。技術領域中任何可偵測系的標記皆可使用，例如可使用放射性同位素標記、酵素標記、磁珠或螢光標記。
根據本發明，在步驟(c)中，可使用技術領域中任何已知的方法將受標記的角膜上皮細胞由OFSCs衍生之角膜上皮細胞移除。
在一實施例中，在步驟(b)之前，可先進行OFSCs的擴增。
成為表皮族系的能力或分化為角膜表皮細胞意味著OFSCs對於因喪失角膜/角膜緣上皮細胞而致的角膜疾病之細胞治療潛在的臨床應用。
以下的實施例僅用於提供並證實具體情況及設定可於技術上應用，而非用於使發明的範圍及申請專利範圍限制於其中。
以下實施例僅用於提供並進一步說明本發明各種方面的特定實施例，而非用於限制本發明。實驗揭示如下，並使用了下列的材料及方法：
用於流式細胞儀，抗人類抗原CD10、CD29、CD31、CD34、CD44、CD49b、CD49e、CD54、CD58、CD90、CD106、CD117、CD146、CD166及HLA-DR之抗體購自BD Bioscience(聖荷賽，加州，美國)。抗人類抗原CD133抗體購自Miltenyi Biotec(貝吉施-格拉德巴赫，德國)。抗人類抗原CD14、CD45及HLA-ABC購自eBioscience(聖地牙哥，加州，美國)。抗人類抗原CD105及表皮特異性抗原(ESA)抗體購自R&D系統(明尼阿波利斯，MN，美國)。
用於免疫螢光染色，抗人類帶狀封閉蛋白-1(ZO-1)兔抗體購自Abcam(劍橋，MA，美國)。抗人類細胞角蛋白19(CK-19)及細胞角蛋白3(CK-3)鼠抗體購自Millipore(比爾里卡，MA，美國)。作為二級抗體，Cy3-共軛的綿羊抗兔IgG抗體購自Sigma-Aldrich(聖路易斯，MO，美國)，而Cy2-共軛的山羊抗鼠IgG抗體購自Jackson ImmunoResearch(西格羅夫，PA，美國)。
在局部麻醉下，由健康捐贈者在進行瞼造型手術下由內眼窩腔中分離多餘的脂肪組織(n=5)。由每個捐贈者中收集1毫升的眼窩脂肪組織，且組織以手術用剪刀剪碎並於37℃下懸浮於含有0.1%第I型膠原蛋白酶(Worthington Biochemical Corporation，雷克伍德，NJ，美國)的磷酸鹽緩衝溶液(PBS，Gibco，大島，NY，美國)中。在4小時消化後，剪碎的組織以70 μm篩網過濾。溶液以PBS清洗三次，並在室溫下以1000 rpm離心5分鐘兩次。離心物重新懸浮後，計數細胞並以接種密度3,000至5,000細胞/cm2接種於無塗層的組織培養瓶中。細胞培養於Mesen Pro培養基中(Invitrogen，卡爾斯巴德，CA，美國)使其過夜貼附，而未貼附的細胞則在更換培養基時清除。最初的群落形成細胞密度約為0.05/cm2。
根據先前報導的方式分離BM-MSCs(Lee KD,Kuo TK,Whang-Peng J,et al.Hepatology.2004；40：1275-1284)。簡言之，進行陰性篩選及限制性稀釋由骨髓抽出物中的單核球部份分離單一細胞衍生、群落-擴增的MSCs。根據文獻的報導(Zuk PA,Zhu M,Mizuno H,et al.Tissue Eng.2001；7：211-228)，由腹部手術中獲得的脂肪組織中的基質血管部份分離ADSCs。
一旦貼壁細胞達60%至70%滿時，使用0.25胰蛋白酶-EDTA(乙二胺四乙酸，Gibco)將其打下，並以PBS清洗兩次，以1000 rpm離心五分鐘，並在相同的培養條件下以1：3重新接種。計數細胞數目並累積族群加倍數值(PDs)，每代皆計算累積時間。以下所有的實驗皆至少有三個獨立的捐贈者而進行(n>=3)。BM-MSCs及ADSCs皆以上述方式培養並擴增於Mesen Pro培養基(Invitrogen)中。
對於細胞表面抗原的免疫分型，打下六至八代的眼窩脂肪衍生之細胞或人類角膜上皮細胞(HCE-T)(Ho JH,Chuang CH,Ho CY,Shih YR,Lee OK,Su Y.,Invest Ophthalmol Vis Sci.2007；48：27-33；Ho JH,Tseng KC,Ma WH,Chen KH,Lee OK,Su Y.,Br J Ophthalmol.2008；92：992-7)並以FITC-或PE-共軛的抗體染色，且以FACSCalibur(BD Bioscience)分析之。
進行誘導體外分化，第八至十代的眼窩脂肪衍生之細胞以先前描述用於骨髓及臍帶血衍生之間葉幹細胞的骨、軟骨或脂肪培養基處理(Lee OK,Kuo TK,Chen WM,Lee KD,Hsieh SL,Chen TH.,Blood.2004；103：1669-1675；Ho JH,Ma WH,Su Y,Tseng KC,Kuo TK,Lee OK.,J Orthop Res.2010；28：131-138)。
組織、細胞化學及免疫細胞化學分析
對於成骨分化，進行鹼性磷酸酶染色，而礦物化的基質則透過馮柯薩(von kossa)染色來評估。對於軟骨分化，細胞顆粒固定並包埋。切片並以蘇木紫及伊紅(H&E)及番紅O(safranin O)染色。對於脂肪分化，則以油紅O染色細胞內的油滴。所有的染色方式以描述於先前的報導中(Lee OK,Kuo TK,Chen WM,Lee KD,Hsieh SL,Chen TH.,Blood.2004；103：1669-1675；Ho JH,Ma WH,Su Y,Tseng KC,Kuo TK,Lee OK.,J Orthop Res.2010；28：131-138)。
總RNA分離及即時RT-PCR
由3×105個OFSCs及分化後的細胞抽取RNA以反轉錄為cDNA，並如先前報導(Ho JH,Ma WH,Su Y,Tseng KC,Kuo TK,Lee OK.,J Orthop Res.2010；28：131-138)的方式擴增。RT-PCR中使用的引子列於表1中。
OFSCs或ADSCs以2.9×104細胞(30%分滿)接種於6孔盤中，並維持在Mesen Pro培養基中過夜。次日，將Mesen Pro培養基移除，於孔盤中加入3.5×104個HCE-T細胞(30%分滿)。接下來的5到7天，細胞培養於HCE-T用之培養基中(Ho JH,Chuang CH,Ho CY,Shih YR,Lee OK,Su Y.,Invest Ophthalmol Vis Sci.2007；48：27-33；Ho JH,Tseng KC,Ma WH,Chen KH,Lee OK,Su Y.,Br J Ophthalmol.2008；92：992-7；Araki-Sasaki K,Ohashi Y,Sasabe T,et al.,Invest Ophthalmol Vis Sci.1995；36：614-621)，其為外加有5%胎牛血清(HyClone,Logan,UT，美國)，5 μg/ml胰島素，0.1 μg/ml霍亂毒素(Sigma-Aldrich)，10 ng/ml重組人類表皮生長因子(hEGF)(BD Biosciences)及0.5 % DMSO的DMEM/HamF12(1：1)培養基中(Araki-Sasaki K,Ohashi Y,Sasabe T,et al.,Invest Ophthalmol Vis Sci.1995；36：614-621)。
OFSCs以2.9×104細胞(30%分滿)接種於6孔盤中，並維持在Mesen Pro培養基中過夜。次日，將Mesen Pro培養基移除，並將OFSCs培養於上述之用於培養HCE-T細胞的培養基中。
OFSCs以2.9×104細胞(30%分滿)接種於6孔TC盤中(BD FalconTM Cat.No.353502)，且HCE-T細胞接種在0.4 μm孔洞膜的細胞培養內嵌盤中(BD FalconTM Cat.No.353090)。細胞培養於上述之用於培養HCE-T細胞的培養基中。
OFSCs以2.9×104細胞(30%分滿)接種於6孔盤中，並維持在Mesen Pro培養基中過夜。次日，將OFSCs培育於不同濃度(1、2、5及10 nM)的量子點(Invitrogen)中一小時，之後以PBS清洗兩次，並於帶有量子點標記的OFSCs孔盤中加入3.5×104個HCE-T細胞(30%分滿)。
對於ESA及CD105偵測，先將細胞打下後，以FITC-共軛抗體染色，並以FACSCalibur(BD Bioscience)分析。對於ZO-1染色，細胞以4%福馬林固定20分鐘，接著以PBS清洗兩次，以5%牛奶阻滯1小時後，細胞在室溫下培育於抗-ZO-1(1：100)一小時，接著以Cy3-共軛的抗兔抗體(1：200)培育額外30分鐘。最後，細胞核以4,6-聯脒-2-苯基吲哚(DAPI)染色，並在螢光顯微鏡(Leitz，德國)下擷取細胞影像。影像以SPOT RT影像系統(Diagnostic Instruments，英鎊高地，MI，美國)表現。
對於CK19及CK3分析，細胞以4%福馬林固定20分鐘，接著以PBS清洗兩次，以5%牛奶阻滯1小時後，細胞在室溫下以抗-CK19(1：200)或抗-CK3(1：200)培育一小時，接著以Cy2-共軛的抗鼠抗體(1：200)培育30分鐘。細胞核以4,6-聯脒-2-苯基吲哚(DAPI)染色，並在螢光顯微鏡(Leitz，德國)下擷取細胞影像。影像以SPOT RT影像系統(Diagnostic Instruments，英鎊高地，MI，美國)表現。
以社會科學-10軟體的統計套件進行統計分析(SPSS Inc.,芝加哥，IL，美國)。在混合培養系統中CD105及ESA表現細胞的改變在95%信賴區間中，以ANOVA試驗及特奇(Tukey's)事後檢定分析。按照字母順序，不同的字母代表不同量的顯著性。成骨、軟骨及脂肪標記基因和量子點標記細胞中ESA的表現的結果皆以雙邊、非配對t試驗分析，且P值<0.05視為有統計上的意義。
OFSCs由五個平均年齡為73.6歲的捐贈者(男：女=2：3)中分離出。群落形成細胞的出現頻率為1/60,000-1/100,000，OFSCs為貼附生長、紡錘狀、似纖維母細胞狀之細胞(圖1A)。這些細胞可廣泛的擴增超過45累計群體倍增，且OFSCs生長動力曲線可媲美骨髓衍生之間葉幹細胞(BM-MSCs)之生長動力曲線。以流式細胞儀分析OFSCs的表面免疫分型特性發現，造血幹細胞標記CD34及CD133、內皮初始細胞標記CD31、血管細胞黏附分子-1 CD106、血管內皮緊密接合標記CD146、白血球共同抗原CD45、單核球標記CD14及CD117(c-kit)為陰性，意味著這些細胞並非造血來源。OFSCs高度表現β1整合蛋白CD29、α2整合蛋白CD49b、α5整合蛋白CD49、基質受體CD44及中度表現α4整合蛋白CD49d，暗示其為間葉細胞來源。除此之外，這些細胞的CD58(LFA-3)、CD90(Thy-1)、CD105(內皮糖蛋白)呈陽性，並表現HLA-ABC，但不表現HLA-DR(圖1C)，與BM-MSCs的表型類似(Lee KD,Kuo TK,Whang-Peng J,et al.,Hepatology.2004；40：1275-1284)。除此之外，缺乏ESA表現不包含在這些細胞的上皮表型中。
表現CD105及CD90以及缺少造血及上皮細胞表面標記意味著這些細胞為間葉細胞的性質(圖1)。
為了測試中胚層三系列分化的能力，將OFSCs的培養條件由Mesen Pro培養基中轉移到誘導培養基中。在一星期的骨誘導後，細胞高度表現骨標記，如鹼性磷酸酶(ALP)、第I型膠原α1及α2(Col IAI及Col IA2)、骨橋蛋白(osteopontin，OP)、黏骨素(osteonectin，ON)及骨鈣素(osteocalcin，OC)，展現了成骨能力。比起在Mesen Pro培養基中(圖1A)，骨培養基內的細胞較為扁平及狹長(圖2B)。在一星期的誘導後，細胞的ALP染色呈現陽性(圖2B)，且三個禮拜的誘導後，馮柯薩(von kossa)染色呈陽性染色(圖2C)，顯示其可分化為成熟骨細胞的能力。
以細胞顆粒培養方式檢視軟骨分化能力(圖3B)。經過為期1週的軟骨細胞誘導後，軟骨細胞標記基因向上調節，如軟骨聚集蛋白多醣(aggrecan，ACAN)、第II型α1膠原(Col IIA1)、軟骨酸性蛋白1(CRTAC1)、多配體蛋白聚醣2(syndecan 2，SDC2)、軟骨寡聚基質蛋白(COMP)及軟骨基質胞外基質蛋白(MATN1)，意味著其分化為軟骨的潛能(圖3A)。而晚期軟骨標記，含硫化肝素蛋白醣2(HSPG2)的表現則沒有改變。六週後，將細胞顆粒切片後，顯示了細胞外基質聚集且可以番紅O染色(圖3C)，意味著其具有分化為成熟軟骨細胞的的能力。
在脂肪誘導下，過氧化物酶增殖劑活化受體加瑪(PPARgamma)的向上調節意味了分化成脂肪的能力(圖4A)。在為期一週的誘導終期，不僅是脂肪標記基因如脂肪酸結合蛋白(aP2)、脂肪酸合成酶(FASN)、補體因子D(Adipsin)，且脂聯素皆在分化細胞中表現。值得注意的是，在脂肪誘導後，這些脂肪標記基因皆有極高的表現(圖4A)。此外，在兩週的誘導後，細胞以油紅O染色可輕易的見到有大量的細胞內油滴(圖4B)，意味著其可分化為成熟脂肪細胞的能力。在OFSCs中的脂肪荷爾蒙如脂聯素及瘦體素的基礎表現量非常的低(未顯示數據)，而當早期脂肪分化後，OFSCs分化細胞表現極高量的脂聯素(圖4A)而非瘦體素(未顯示數據)。脂聯素，在肥胖時會向下調節，已知可透過降低肝中葡萄糖的製造、增進骨骼肌中葡萄糖的吸收及脂肪酸氧化以及抑制免疫反應以增進胰島素敏感性。
OFSCs具有三系列分化能力，因其可分化為骨細胞(圖2)、軟骨細胞(圖3)及脂肪細胞(圖4)。比較OFSCs及BM-MSCs的分化潛能，分化為骨細胞的能力相似，OFSCs(圖2)及BM-MSCs(Zuk PA,Zhu M,Ashjian P,et al.,Mol Biol Cell.2002；13：4279-4295；Zuk PA,Zhu M,Mizuno H,et al.,Tissue Eng.2001；7：211-228)兩者皆需要三到四週來分化為可製造礦物化基質的成熟骨細胞。對於軟骨分化潛能，在細胞顆粒培養6週後，BM-MSCs及OFSCs兩者皆可分化為可製造豐富細胞外基質的成熟軟骨細胞。對於脂肪分
化，BM-MSCs至少需要三週才可分化為有細胞內油滴聚集的成熟脂肪細胞(Lee KD,Kuo TK,Whang-Peng J,et al.,Hepatology.2004；40：1275-1284；Ho JH,Ma WH,Su Y,Tseng KC,Kuo TK,Lee OK.,J Orthop Res.2010；28：131-138)；然而，對OFSCs而言，可由一週的脂肪誘導後即表現高度(>104倍)向上調節的脂肪細胞標記基因而證實有較佳的脂肪分化潛能(圖4A)，且在脂肪誘導的一開始兩週內，就同時有快速且大量的細胞內油滴聚集(圖4B)。
為了探討OFSCs及ADSCs間上皮細胞分化潛能的差異，將OFSCs(圖5A)或ADSCs(圖5B)與HCE-T細胞混合培養於HCE-T培養基中。在5天的混合培養後，細胞幾乎已長至全滿(圖5C及D)。與HCE-T細胞混合培養5天後，在OFSCs及ADSCs中的CD105-陽性細胞出現的頻率顯著的減少(圖5E)。然而，僅在OFSCs中ESA-陽性百分比有顯著的增加(圖5F)，意味著由細胞表型由間葉細胞轉移成上皮細胞僅在OFSCs中發生，但ADSCs中則無。
接著，為了直接證實細胞表型轉移為上皮細胞，將OFSCs以量子點標記。首先，劑量依賴標記效能顯示於圖6A；具有紅色螢光訊號的量子點標記OFSCs可輕易的在與鵝卵石樣HCE-T細胞混合培養的細胞中辨別出(圖6B)。在5天的混合培養後，有一部分的量子點標記細胞，特別是那些圍繞著鵝卵石樣的HCE-T細胞者，形狀由橢圓形變圓形(圖6C)。流式細胞儀分析顯示在五天混合培養後，20.1±0.77%之量子點標記的細胞開始表現ESA(圖6D)。此外，在5天的混合培養後，可在量子點標記的細胞及其鄰近細胞的接點中偵測到ZO-1(圖6E)(一種表現在HCE-T細胞的上皮緊密接點標記，但不表現在培養於HCE-T培養基中的OFSCs(圖6F))。上述的發現表明了OFSCs具有可分化為上皮細胞的潛能。
為了近一步試驗是否OFSCs具有分化為角膜上皮細胞的潛能，將量子點標記的OFSCs細胞與HCE-T細胞混合培養5天後，以免疫螢光染色偵測角膜上皮初始細胞的標記CK19及表現於HCE-T細胞(Araki-Sasaki K,Ohashi Y,Sasabe T,et al.,Invest Ophthalmol Vis Sci.1995；36：614-621)的成熟角膜上皮細胞標記CK3(Kinoshita S,Adachi W,Sotozono C,et al.,Prog Retin Eye Res.2001；20：639-673)。發現到，在混合培養後，一些與HCE-T細胞接觸的量子點標記細胞表現CK19，而HCE-T細胞中則沒有任何CK19的表現(圖7A及B)。CK3亦在一些量子點標記的細胞中可測得，且在HCE-T細胞中有高度表現(圖7C及D)。為了試驗是否與HCE-T細胞共培養對於OFSCs角膜上皮細胞表型是不可或缺的，將OFSCs單獨培養在相同條件但沒有HCE-T的狀態下5天。可發現到，在沒有HCE-T細胞下，OFSCs的型態沒有改變，且CK19及CK3也未被誘導(圖7E至H)。
與角膜上皮細胞混合培養的系統中，OFSCs可快速的表現上皮細胞表型(圖5及6)以及角膜上皮細胞表型(圖7)。
為了探討是否ADSCs是否也可分化為角膜上皮細胞，進行類似的ADSCs與HCE-T細胞共培養實驗。然而在與HCE-T細胞混合培養5天後，量子點標記ADSCs不表現CK19(圖8A及B)，且在HCE-T細胞島邊緣的量子點標記的ADSCs僅有少量表現CK3(圖8C及D)。與OFSCs相較之下，ADSCs中CK3的表現百分比極低(圖7D)。
除了中胚層三系列分化外，OFSCs在體外透過混合培養系統亦展現了上皮分化潛能(圖6及7)。在混合培養一週後，當OFSCs與HCE-T細胞以接觸方式共培養，細胞上CD105巨量的損失且增進了ESA表現(圖5F)證實了混合細胞群轉移為上皮表型(圖5E)。在混合培養1天後，ESA族群的降低(圖6D)排除了OFSCs的損失及HCE-T細胞的增生。耐人尋味的是，混合培養系統中量子點標記的OFSCs其型態的變化及ZO-1的表現皆出現在OFSCs與HCE-T細胞島接觸的連接區域(圖6C及圖6G)，然而，當OFSCs單獨培養在HCE-T培養基中則沒有顯著的型態改變以及ZO-1表現(圖6F)。而表現CK19及CK3以證實角膜上皮細胞分化能力(圖7A至7D)則意味著OFSCs可用於補充損失的角膜上皮細胞的治療潛力。值得注意的是，以混合培養下，由皮下脂肪組織獲得的ADSCs非常難形成上皮細胞族系及分化為角膜上皮細胞(圖5及8)。這些發現證實了OFSCs可因在胚胎發育中相同的分化起緣而具有分化成角膜上皮細胞的潛能。
與HCE-T細胞直接混合培養可誘導OFSCs上皮細胞分化。為了試驗是否OFSCs與HCE-T細胞的直接細胞接觸對於此現象是不可或缺的，將其置於轉移盤以非接觸的方式共培養7天。發現到，以轉移盤和HCE-T共培養的OFSCs，CD105及ESA的表現沒有改變(圖9A)，且轉移盤共培養方式下，上皮細胞標記ZO-1(圖9B)及角膜上皮細胞標記CK19(圖9C)及CK3(圖9D)也沒有被誘導。
除此之外，也證實了HCE-T與OFSCs直接接觸對於OFSCs的上皮分化扮演了極為重要的角色(圖7及9)，表明了其在眼球表面上使喪失的角膜上皮細胞再生的潛能必須透過與角膜上皮細胞接觸。
圖1顯示眼窩脂肪衍生之幹細胞(OFSCs)的形態、生長動力及免疫表型特徵。(A)OFSCs為貼附、紡錘狀、似纖維母細胞狀之細胞。(B)在相同的培養條件下，OFSCs的生長動力曲線可媲美於骨髓衍生之間葉幹細胞(BM-MSCs)之生長動力曲線(n=3)。(C)表面免疫分型結果顯示OFSCs起源於間葉而非造血或上皮(n=3)。
圖2顯示OFSCs之體外成骨分化。(A)在成骨誘導一週後，細胞表現了成骨標記基因，包括鹼性磷酸酶(ALP)、第I型膠原α1及α2(Col IAI及Col IA2)、骨橋蛋白(osteopontin，OP)、黏骨素(osteonectin，ON)及骨鈣素(osteocalcin，OC)。骨膜蛋白(periostin，POSTN)的表現沒有顯著的差異(t試驗，* P<0.05，n=3)。(B)具有較強ALP活性之分化後OFSC細胞在誘發一週後形狀更加扁平且狹長。(C)分化後之OFSC細胞產生礦物質化的基質，其於成骨誘發3週後可被馮柯薩(von kossa)染色呈陽性染色(每張照片的細胞源於不同捐贈者)。
圖3顯示了OFSCs之體外軟骨分化。(A)在為期一個禮拜的軟骨誘導後，OFSC-分化細胞可偵測到軟骨細胞標記基因向上調節，如軟骨聚集蛋白多醣(aggrecan，ACAN)、第II型α1膠原(Col IIA1)、軟骨酸性蛋白1(CRTAC1)、多配體蛋白聚醣2(syndecan 2，SDC2)、軟骨寡聚基質蛋白(COMP)及軟骨基質胞外基質蛋白(MATN1)。含硫化肝素蛋白醣2(HSPG2)的表現則沒有顯著的差異(t試驗，* P<0.05，n=3)。(B)在六個星期的粒狀培養後，顆粒的大小增加，且(C)顆粒以組織切片後，在番紅O(safranin O)染色後顯示有軟骨性胞外基質的形成(每張照片的細胞源於不同捐贈者)。
圖4顯示OFSCs之體外脂肪分化。(A)在成脂誘導下，為期一個禮拜的脂肪分化，OFSCs-分化細胞表現高度的脂肪標記基因，如過氧化物酶增殖劑活化受體加瑪(PPARgamma)、脂肪酸結合蛋白(aP2)、脂肪酸合成酶(FASN)、補體因子D(Adipsin)及脂聯素(t試驗，* P<0.05，n=3)。(B)誘導兩周後，以油紅O染色證實有大量的細胞內脂肪滴(每張照片的細胞源於不同捐贈者)。
圖5顯示OFSCs與人類角膜上皮(HCE-T)細胞混合培養後具有上皮分化的能力，但ADSCs則無。(A)OFSCs與HCE-T細胞混合培養於HCE-T培養基中。(B)ADSCs與HCE-T細胞混合培養於HCE-T培養基中。(C)在混合培養五天後，可發現聚滿(confluence)的細胞，並觀察到島狀的鵝卵石般細胞被纖維原細胞狀的細胞圍繞。(D)ADSCs與HCE-T混合培養細胞也觀察到類似的型態改變。(E)與HCE-T細胞混合培養後，OFSCs與ADSCs之CD105陽性細胞數量沒有顯著的不同。(F)與HCE-T細胞混合培養後，OFSCs中ESA陽性細胞的量顯著高於ADSCs(t試驗，* P<0.05，n=3)。
圖6顯示在混合培養系統中OFSCs的上皮分化。(A)由1至10 nM之量子點顯示OFSCs中劑量依賴標記效率。(B)在混合培養系統中，帶有紅色螢光信號的量子點-標記之OFSCs可輕易的由鵝卵石狀的HCE-T細胞中辨別。(C)在鵝卵石樣細胞島邊緣的量子點標記細胞形狀由橢圓形變圓形。(D)五天混合培養後，20.1±0.77%之量子點標記的細胞亦表現ESA(t試驗，* P<0.05，n=3)。(E)HCE-T細胞表面表現帶狀封閉蛋白(ZO-1)。(F)OFSCs單獨培養於HCE-T培養基中不表現ZO-1。(G)在混合培養5天後，鵝卵石樣細胞島邊緣的量子點標記細胞與鄰近細胞接觸並在細胞間聯接處表現ZO-1。
圖7顯示當與HCE-T細胞混合培養之OFSCs之角膜上皮分化。(A-D)量子點標記的OFSCs細胞與HCE-T混合培養5天。量子點標記細胞在鵝卵石樣細胞島的邊緣(A，箭頭)開始表現CK19(B，箭頭)。大多的HCE-T細胞(D)及一些量子點標記細胞表現CK3(C及D，箭頭)。當OFSCs單獨培養於HCE-T培養基5天後，不僅細胞的型態未改變(E，G)，且未表現CK19(F)及CK3(H)。
圖8顯示了僅少量的ADSCs能分化為角膜上皮細胞。(A-D)量子標記的ADSCs與HCE-T細胞混合培養5天。HCE-T及ADSCs不表現CK19(A，B)，且在混合培養後，僅有極少的量子點標記細胞(C，D箭頭)表現CK3。
圖9顯示與HCE-T直接接觸對於OFSCs的上皮分化為不可或缺的。OFSCs與HCE-T細胞共培養於轉移盤(tranwell)中以非接觸式系統培養7天，OFSCs中的CD105-及ESA-陽性細胞群沒有改變(A)(n=3)。OFSCs在轉移盤中共培養5天後，發現了ZO-1(B)、CK-19(C)及CK3(D)的陰性染色。
<110> 臺北醫學大學 <120> 包含眼窩脂肪衍生之幹細胞(OFSC)之細胞群及彼等之分離與應用 <140> 100105862 <141> 2011-02-22 <160> 38 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子 <400> 1 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子 <400> 2 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子 <400> 3 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子 <400> 4 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子 <400> 5 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子 <400> 6 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子 <400> 7 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子 <400> 8 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子 <400> 9 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子 <400> 10 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子 <400> 11 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子 <400> 12 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子 <400> 13 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子 <400> 14 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子 <400> 15 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子 <400> 16 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子 <400> 17 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子 <400> 18 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子 <400> 19 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子 <400> 20 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子 <400> 21 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子 <400> 22 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子 <400> 23 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子 <400> 24 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子 <400> 25 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子 <400> 26 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子 <400> 27 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子 <400> 28 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子 <400> 29 <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子 <400> 30 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子 <400> 31 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子 <400> 32 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子 <400> 33 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子 <400> 34 <210> 35 <211> 27 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子 <400> 35 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子 <400> 36 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子 <400> 37 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子 <400> 38
Claims (16)
- 一種分離之眼窩脂肪衍生之幹細胞(OFSCs)群，其高度表現CD90、CD105、CD29、CD44、CD49b、CD49e、CD58及HLA-ABC，中度表現CD49d，但不表現CD34、CD133、CD31、CD106、CD146、CD45、CD14、CD40、CD80、CD86、HLA-DR及CD117。
- 如請求項1之幹細胞群，其中該OFSCs具有骨、軟骨、脂肪及角膜分化潛能。
- 如請求項1之幹細胞群，其可用於細胞治療及組織工程。
- 如請求項1之幹細胞群，其可用於退化性疾病、組織損傷修復、器官再生及醫療美容之組織再生。
- 一種組合物，其包含如請求項1之幹細胞群。
- 一種分離及純化含有如請求項1之幹細胞群之方法，其包含步驟：(a)收集含有眼窩脂肪組織0.5至2ml的樣品；(b)分解眼窩脂肪組織並將所得之組織懸浮於含有細胞外基質(ECM)降解酶之緩衝溶液中；(c)過濾所得之溶液以獲得沉澱物；(d)再懸浮該沉澱物以獲得細胞懸浮溶液；(e)計數細胞懸浮溶液中的細胞，並將細胞以小於8,000/cm2之低接種密度培育於培養基中；(f)收集具有群落形成能力的細胞並將該細胞以非接觸的方式次培育；且 (g)以細胞表面標記及多分化能力來鑑別及特性分析所得幹細胞群，其中該幹細胞群高度表現CD90、CD105、CD29、CD44、CD49b、CD49e、CD58及HLA-ABC，中度表現CD49d，但不表現CD34、CD133、CD31、CD106、CD146、CD45、CD14、CD40、CD80、CD86、HLA-DR及CD117。
- 如請求項6之方法，其中步驟(a)中之樣品係由眼眶內腔直接移除的眼窩組織中收集而得，或由眼瞼內翻、眼瞼外翻、眼瞼下垂或眼袋之眼瞼矯型手術所收集而得。
- 如請求項6之方法，其中步驟(a)中之樣品含有約0.5至約1.5mL或約0.5至約1.0mL之眼窩脂肪組織。
- 如請求項6之方法，其中步驟(e)之接種密度約由500至8,000細胞/cm2。
- 如請求項6之方法，其中步驟(e)之接種密度約由1,000至8,000細胞/cm2。
- 如請求項6之方法，其中步驟(e)之接種密度約由3,000至5,000細胞/cm2。
- 一種使如請求項1之幹細胞群分化為角膜上皮細胞之方法，其包含將該幹細胞群與角膜上皮細胞混合培養之步驟，其中該幹細胞群缺乏CD105表現，且當與角膜上皮細胞混合培養後增加上皮細胞標記的表現；且其中眼窩脂肪衍生之幹細胞表現CK-19及CK-3代表角膜上皮分化。
- 如請求項12之方法，其中該上皮細胞標記包含上皮特異 性抗原及帶狀封閉蛋白-1(zonal occluding-1)。
- 一種如請求項1之幹細胞群於製備在眼球表面上使喪失的角膜上皮細胞再生之藥劑之用途。
- 一種製備角膜上皮細胞製劑之方法，其包含：(a)由眼窩脂肪樣品中分離如請求項1之幹細胞群；(b)利用如請求項12之方法，將該幹細胞群與標記之角膜上皮細胞混合培養以分化為角膜上皮細胞；且(c)移除標記之角膜上皮細胞以獲得該幹細胞群衍生之角膜上皮細胞製劑。
- 如請求項15之方法，其中於步驟(b)標記之角膜上皮細胞所使用之標記係放射同位素標記、酵素標記、磁珠或螢光標記。
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