TW201800581A

TW201800581A - 製備治療神經疾病之血小板顆粒裂解液及其用途

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Publication number: TW201800581A
Application number: TW106109630A
Authority: TW
Inventors: 大衛戴弗斯; 台瑞白; 珍克里斯托夫德威簡; 周明莉
Original assignee: 里爾中央醫學中心; 里爾第二健康與法律大學; 法國濱海大學; 法國國家健康及醫學硏究中心; 臺北醫學大學
Priority date: 2016-03-23
Filing date: 2017-03-22
Publication date: 2018-01-01
Also published as: PL3432895T3; CN109310711B; IL261981B; JP2022180609A; CA3018637A1; TWI744300B; AU2017238476B2; EP3432895A1; DK3432895T3; AU2017238476A1; JP2019513154A; IL261981A; US20190099448A1; WO2017162830A1; CN109310711A; HUE058308T2; ES2908723T3; EP3432895B1; JP7189123B2; PT3432895T

Abstract

一種製備改良性熱處理的血小板顆粒裂解液的方法，該方法包括以下步驟，(a)提供血小板顆粒裂解液；(b)在55℃至65℃的溫度下，對血小板顆粒裂解液持續進行熱處理20至40分鐘；(c)純化經過步驟(b)之熱處理的血小板顆粒裂解液，獲得改良性熱處理的血小板顆粒裂解液，其中改良性熱處理的血小板顆粒裂解液的蛋白質總含量小於步驟(a)之血小板顆粒裂解液之蛋白質總含量的70%。

Description

製備治療神經疾病之血小板顆粒裂解液及其用途

本發明涉及獲得一種新穎的血小板顆粒裂解液的方法、血小板顆粒本身及其用於治療神經系統疾病的用途，如神經退化性疾病、神經炎症、神經發展疾患和/或神經血管性疾病(即中風)，也涉及腦損傷(創傷性腦損傷、缺氧…等)。

考慮到神經系統疾病對患者和護理人員施加的巨大社會和經濟影響，迫切需要開發有效的“疾病修復策略”以提供神經保護、神經恢復和神經生成，以治療神經退化性疾病，如帕金森症(PD)、肌萎縮性側索硬化症(ALS)和阿爾茨海默症(AD)。

神經元的損失若缺乏有效的治療，會伴隨中樞神經系統的損傷，如分娩或心跳驟停後的嚴重缺氧或嚴重創傷性腦損傷。因此，非常急迫地等待開發出能提供神經恢復和神經生成的有效治療方法，以補償損失的神經元。

有很多證據表明作為神經元訊號通路的活化劑和調節劑的神經滋養因子(Neurotrophins)代表神經系統疾病¹ 的治療策略邏輯。在細胞和動物模型2,3的神經保護和修復試驗中，單一重組神經滋養生長因子的治療應用提供了令人鼓舞的結果。

在幾種神經元損傷動物模型4中，血小板衍生性生長因子-CC(Platelet-derived growth factor-CC．PDGF-CC)被證明是一種有效的神經保護因子，而通過腦內(intra cerebro-ventricular．ICV)途徑施藥的血小板衍生性生長因子-BB(PDGF-BB)和大腦衍生神經滋養因子(brain-derived neurotrophic factor．BDNF)可促進神經生成5。此外，BDNF在局灶性中風的光血栓模型中的全身給藥可以誘發神經生成並提高感覺運動功能⁶ 。轉型生長因子-β(Transforming growth factor-β．TGF-β)可以促進多巴胺能神經元的發育和存活，以及帕金森症動物模型⁷ 中的神經保護作用，並增強神經膠質細胞因子(GDNF)在半帕金森症大鼠⁸ 中的營養作用。

臨床前研究顯示鹼性纖維母細胞生長因子(basic-fibroblast growth factor．b-FGF)⁹ 和血管內皮生長因子-β¹⁰ (vascular endothelial growth factor-β．VEGF-β)的神經保護作用，以及GDNF促進神經保護和神經恢復。

不幸的是，涉及大劑量單一生長因子之ICV治療的所有隨機臨床研究，未產生任何顯著的積極臨床效果^16-18 。

目前，在這種複雜和多方面的神經退化性疾病病變中，以單一神經滋養因子施藥尚不足以產生有意義的治療結果。

因此，需要開發一種組合幾種更強大且可能的重組神經滋養因子的新方法，然而這在概念上是有挑戰性的，從而為其他再生醫學領域開闢了更務實的策略。

血小板濃厚液(Platelet Concentrate，PC)是世界衛生組織基本藥物模型清單¹⁹ 中的一個成熟的治療產品，通常用於預防和治療由血小板減少症引起的出血性疾病²⁰ 。除了它們在止血中的作用^20,21 ，血小板在傷口癒合和組織修復^21-23 中發揮關鍵性的生理功能。

評估血小板以及血小板裂解液(Platelet Lysate，PL)用於再生藥物²⁴ 和細胞治療²⁵ 之應用範圍正在擴大。血小板在組織癒合中的治療效果是多種因素造成，由主要存在於α-顆粒中，並作用於協同作用^22-24,26 的無數生物活性介質產生的。這些包括神經營養生長因子，如PDGF(-AA，-AB和-BB同種型)、BDNF、VEGF、TGF-β、bFGF或表皮生長因子(epithelium growth factor．EGF)。最近顯示中風的動物模型中血小板裂解液的顱內輸送，可以刺激內膜神經幹細胞(endogenous neural stem cells．eNSC)的增殖和腦室周圍和周圍皮質中的血管生成，導致功能改善和損傷減輕，並隱含神經保護作用²⁷ 。

然而，血小板裂解液含有血漿纖維蛋白原(Plasma-borne Fibrinogen)，這種蛋白質在神經系統疾病中起著重要作用，其能做為炎症的有效誘導劑和神經突生長抑製劑³⁵ 。這可能是為什麼在人類神經退化性疾病領域如帕金森症中還沒有報導應用血小板裂解液進行治療的原因。

本發明基於意想不到的發現，在特定條件下製備血小板顆粒裂解液(Platelet Pellet Lysate，PPL)時，能夠更好的誘發神經保護作用以及神經恢復來增強神經系統疾病的治療。

特別地，本發明人發現在製備PPL期間的熱處理，降低了裂解液中的蛋白質總含量並且促進神經保護和神經恢復潛力的增強。

本發明涉及製備改良性熱處理的血小板顆粒裂解液的方法，所述方法包括以下步驟： (a)提供血小板顆粒裂解液；(b)於55℃至65℃的溫度下，對血小板顆粒裂解液持續進行熱處理20至40分鐘；以及(c)純化經過步驟(b)之熱處理的血小板顆粒裂解液，獲得改良性熱處理的血小板顆粒裂解液，其中改良性熱處理的血小板顆粒裂解液的蛋白質總含量小於步驟(a)之血小板顆粒裂解液之蛋白質總含量的70%。

令人驚奇和意想不到的是，與未經熱處理的PPL或在37℃的溫度下熱處理過之PPL相比，採用上述方法得到的改良性熱處理PPL提供較佳的神經保護作用。體外測定顯示，特別在低劑量和高劑量下，改良性熱處理的PPL可顯著改善神經元細胞的細胞存活率。此外，改良性熱處理的PPL在體外測定中可誘發神經恢復。

在不被任何理論束縛的前提下，發明人認為本發明揭露之改良性熱處理的PPL有助於神經恢復和改善神經保護活性，原因係在於改良性熱處理的PPL中的蛋白質總含量降低的結果。在55℃至65℃的溫度下之熱處理會誘發蛋白質的沉澱，導致在製行步驟(c)後沉澱的蛋白質會被移除。本發明的改良式熱處理的PPL中的蛋白質總含量明顯低於未進行熱處理的PPL中的蛋白質總含量。詳細來說，改良式熱處理的PPL中的蛋白質總含量確實具有小於步驟(a)的PPL中的蛋白質總含量的70%。較佳地，蛋白質總含量小於步驟(a)的PPL的蛋白質總含量的60%，特別是小於50%。例如改良式熱處理的PPL中的蛋白質總含量可以為4-6mg/mL。

本發明的熱處理也可能導致不同的相應蛋白質組成。例如，在製備起始PPL期間未除去的血漿纖維蛋白原以及血小板纖維蛋白原能夠經由熱處理被去除，因此降低改良性熱處理的PPL中之纖維蛋白原含量。

有利地，改良性熱處理的PPL的纖維蛋白原少於1.5 mg/mL，較佳小於1 mg/mL，更佳小於0.5 mg/mL，甚至更佳為0.1 mg/mL至0.3 mg/mL。此外，PPL的生長因子(Growth Factor)含量也可以通過本發明的改良性熱處理而改變。例如，與正常新鮮PPL(PPL^F )或過期PPL(PPL^E )相比，改良性熱處理之PPL的BDNF、bFGF、EGF和HGF濃度顯著相對降低，而VEGF和TGFβ濃度基本保持不變。術語“新鮮PPL”是指從收集後5天內(未過期)處理的血小板濃厚液製備的血小板顆粒裂解液。術語“過期PPL”是指由處理儲存超過5天的血小板濃厚液所製備的血小板顆粒裂解液。

在一個實施例中，從PPL^F 和PPL^E 獲得改良的血小板顆粒裂解液之生長因子相對含量，以每毫克總蛋白表示，其BDNF、bFGF和HGF顯著降低，PDGF-AB和EGF保持不變，TGFβ顯著增加。對於PPL^F 獲得改良的血小板顆粒裂解液，VEGF和血小板第四因子(Platelet Factor 4，PF4)含量保持不變；而從PPL^E 獲得的改良的血小板顆粒裂解液，其VEGF和PF4含量增加。

在一個實施例中，本發明改良的熱處理PPL，其血小板第四因子(Platelet Factor 4，PF4)含量大於步驟(a)的PPL之血小板第四因子含量的50%以上，較佳大於60%，更佳大於70%。

在步驟(b)的熱處理步驟中，較佳為在55℃至60℃的溫度下進行，更佳為在約56℃的溫度下進行。在約56℃下熱處理過的PPL，能獲得神經保護和神經恢復再現性方面之最希望的結果。

在一個較佳的實施例中，熱處理的持續時間為約30分鐘。

此外，在熱處理之後並且在純化步驟(c)之前，可以冷卻PPL至少5分鐘，較佳為冷卻PPL至約2至5℃的溫度。

熱處理的PPL之純化可以通過本領域已知的任何方法進行，例如離心法或過濾法。

離心法可有利地在約2至6℃的溫度下進行，例如在9000×g至11000xg下進行離心至少15分鐘。

使用過濾法時，熱處理的PPL順利地通過孔徑為5μm至0.2μm的過濾器，較佳地使用孔徑順序尺寸為5μm至0.2μm之相應遞減的連續兩個或更多的過濾器。

有利地，於步驟(c)中，採用離心進行經熱處理之PPL裂解液的純化。如上所述之內容，在不被任何理論束縛的前提下，認為在低溫下的離心有助於進一步除去沉澱的冷不溶性成分(Cold-insoluble Components)，如纖維蛋白原。

本發明的方法還可以包括在熱處理步驟之後，冷凍並儲存步驟(c)中獲得的改良性熱處理之PPL在-20℃至-85℃的溫度範圍內，較佳為-25℃〜-50℃，更佳為-30℃左右。或者，改良性熱處理之PPL可以在儲存之前先冷凍乾燥。

在另一個實施例中，本發明的方法還包括在步驟(c)之後以及在選擇性進行的冷凍步驟或冷凍乾燥步驟之前，進行病毒滅活的步驟，例如溶劑洗滌劑處理(S/D處理)或巴氏殺菌(在穩定劑存在下，於60℃處理10小時)和/或使用15奈米(nm)、20 nm或35 nm的專用病毒過濾器或等效的病原體去除過濾器，通過奈米過濾進行病毒或朊病毒除去的步驟。因此，獲得的改良性熱處理PPL具免病毒和朊病毒之安全性。術語“病毒滅活”是指病毒保持在血小板顆粒裂解液中但不能存活的情況，例如通過溶解其脂質包衣或破壞其病毒粒子結構。

術語“病毒去除”是指在血小板顆粒裂解液中具剛性的大尺寸結構之病毒，經由過濾留在過濾器上而被去除，而血小板顆粒裂解液成分藉由過濾器去除病毒並收回以進行進一步處理³⁶ ^、 ³⁷ 。

步驟(a)中提供的起始血小板顆粒裂解液(PPL)可以根據公知的方法製備。例如它可以如下製備： (i) 提供血小板濃厚液， (ii) 離心所述血小板濃厚液以獲得血小板沉澱物和第一上清液， (iii) 去除上清液並將血小板沉澱物懸浮在生理緩衝液中， (iv) 冷凍解凍(Freeze-thaw)所述懸浮顆粒， (v) 將步驟(iv)中獲得的懸浮液離心，以獲得血小板顆粒裂解液和第二上清液。

步驟(i)中提供的血小板濃厚液可以通過標準的適當收集方法，從自體或同種異體血小板獲得，特別是通過全血、或通過分離程式，並懸浮在血漿、或血漿和血小板添加劑的組合溶液或僅為血小板添加劑溶液中³⁹ 。此外，血小板濃厚液可減除白血球。

步驟(iii)中使用的合適的生理緩衝液，例如磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)、HEPES緩衝液、Tris-HCl緩衝液或乙酸鈉緩衝液或生理鹽水。

依據本發明的方法，步驟(a)中使用的血小板顆粒裂解液(PPL)可以是新鮮PPL(PPL^F )或過期PPL(PPL^E )，較佳為PPL^F 。

本發明還涉及改良性熱處理的PPL，其中改良性熱處理的PPL中的蛋白質總含量小於未經熱處理之PPL中的蛋白質總含量的70%、較佳小於60%、更佳小於50%。改良性熱處理PPL中的蛋白質總含量可以為例如4-6 mg/mL。本發明的改良性熱處理PPL可以通過上文描述的方法來獲得。有利的是，本發明的改良性熱處理的PPL含有小於1.5mg/mL、較佳小於1mg/mL，更佳地小於0.5 mg/mL，並且甚至更佳為0.1mg/mL至0.3mg/mL的纖維蛋白原。

在一個實施例中，本發明的改良性熱處理PPL的PF4含量大於未經熱處理PPL的PF4含量的50%以上，較佳大於60%，更佳大於70%。

如上所述，本發明的改良性熱處理的PPL提供了神經復原和改善的神經保護活性。

本發明更涉及用於生物藥物或“生物治療”的改良性血小板顆粒裂解液，特別是在治療和/或預防神經系統疾病，較佳是神經退化性疾病。在其他方面，本發明還涉及治療和/或預防神經系統疾病，包含向有需要的患者給予治療有效量之本發明的改良性血小板顆粒裂解液。較佳地，患者是溫血動物，更佳地是人。

本發明含義內的神經系統疾病包括但不限於神經退化性疾病；神經血管疾病；神經炎症性疾病；神經發育障礙如自閉症；腦損傷，如分娩後嚴重缺氧或心臟驟停或重度顱腦外傷/創傷性腦損傷，也就是嚴重損傷造成神經元顯著損失導致的障礙。

本發明意義上的神經退化性疾病包括但不限於多發性硬化症(multiple sclerosis．MS)、帕金森症(PD)、亨汀頓氏舞蹈症(Huntington’s disease．HD)、肌萎縮性側索硬化症(ALS)、中風、老年性黃斑部病變(age-related macular degeneration．AMD)、視網膜的退化性疾病和癡呆，後者包括但不限於阿爾茨海默症(AD)、血管型失智症(vascular dementia)、額顳葉型失智症(frontotemporal dementia)、語意型失智症(semantic dementia)和路易體失智症(dementia with Lewy bodies)。優選的神經退化性疾病是多發性硬化症、阿爾茨海默氏症，帕金森症、亨汀頓氏舞蹈症、肌萎縮性側索硬化症。

在較佳的實施例中，神經退化性疾病選自帕金森症、肌萎縮性側索硬化症和阿爾茨海默症。在特別優選的實施例中，神經退化性疾病是帕金森症。在另一個優選的實施例中，神經退化性疾病是肌萎縮性側索硬化症。

較佳的其他神經系統疾病包括中樞神經系統的創傷，例如分娩後嚴重缺氧或心跳驟停或嚴重顱腦損傷。也就是說嚴重的創傷造成神經元的顯著損失所導致之障礙。在早期治療時，創傷後使用改良性熱處理PPL，可以增強生理神經恢復和神經生成能力。

改良性熱處理的PPL可以如下使用，如封裝在天然或合成的奈米顆粒⁴⁰ 或微粒中，或者包含在進一步包括至少一種藥學上可接受的載體、稀釋劑、賦形劑和/或佐劑的藥物溶液中。藥物溶液可以進一步包含複合物、分子、肽、鹽、載體或任何其他化合物，其可以改善或可以有益於治療神經系統疾病。

給藥途徑和劑量方案取決於疾病的嚴重程度、患者的年齡、體重和性別等。

本發明的改良性熱處理PPL可用於治療任何患者，特別是溫血動物如哺乳動物，較佳為人。

有利的是，通過體內試驗證實，本發明的改良性熱處理PPL適合於腦部給藥。具體地說，所述改良性熱處理的PPL適用於脊髓腔內(例如，作為脊髓病理學的肌萎縮性側索硬化症)或腦室內(ICV)給藥，例如進入右側腦室，較佳為閉合於心室內孔，並使其將改良性血小板顆粒裂解液施藥於第三腦室。例如，為達到給藥之目的，可以使用泵，如被Alzet商業化之ALZET泵。

本發明的改良性熱處理的PPL的施藥也可以通過本領域技術人員已知的任何其他方法進行，例如鼻內、眼內施藥、或灌注或輸注器官(即直接輸注腦組織的一部分)。

用於施藥的暴露劑量可以根據各種參數來調整，特別是使用的給藥方式、相關病理學或所需治療持續時間的函數。定義

下面的定義和解釋涉及在整個應用中使用的術語，包括說明書和申請專利範圍。

術語“神經保護活性”或“神經保護”是指與不受神經毒素影響的神經元細胞相比，受神經毒素影響的神經元細胞的神經元結構和/或功能的保護。神經保護旨在通過停止或至少減緩神經元的損失來預防或減緩疾病惡化和次發性損傷。例如，與不罹患帕金森症影響的患者相比較，指保護帕金森症患者紋狀體和/或黑質中的神經元數量。

術語“神經修復”是指補償現有的改變和促進受損神經活性的結構和功能恢復。

術語“患者”是指正在等待或接受醫療護理的溫血動物，更佳的是人，或者是可能成為醫療過程的對象。

術語“人”是指性別和發育的任何階段(即新生兒，嬰幼兒，青少年，青少年，成年人)的受試者。在一個實施例中，人是指青少年或成年人，較佳是成年人。

本文所用的術語“治療”，包括緩解或消除病症或疾病和/或其伴隨症狀。

本文所用的術語“預防”，是指延遲或排除疾病發作或疾病和/或其伴隨症狀發作的方法，防止患者罹患病症或疾病，或降低患者罹患病情或疾病的風險。

本文所用的術語“治療有效量”(或更簡單地“有效量”)是指本發明的改良性血小板顆粒裂解液的量，足以在給藥個體中達到所需的治療或預防效果。

術語“給藥”或其變體(例如“施藥”)是指本發明的改良性血小板顆粒裂解液，單獨或作為藥學上可接受的溶液的一部分提供給患者，其中所述病症、症狀將被治療或預防。

參考以下實施例和附圖將更好地理解本發明。這些實施例旨在代表本發明的具體實施方案，並不旨在限制本發明的範圍。

在整份說明書、圖式和申請專利範圍中使用以下縮寫：BAFF: B細胞活化因子 (B-cell-activating factor)BDNF: 大腦衍生神經滋養因子(brain derived neurotrophic factor)C5/C5a: 補體成分C5/C5(complement component 5/activated)CSF: 腦脊髓液(cerebrospinal fluid)Ctrl: 對照組(control)Dkk-1: WNT訊號通路抑製劑1 (Dickkopf WNT signaling pathway inhibitor 1 dickkopf)DPPIV : 二肽基肽酶 4 (dipeptidyl peptidase IV)EGF: 表皮生長因子 (epithelium growth factor)EMMPRIN: 細胞外基質金屬蛋白酶誘導劑(extracellular matrix metalloproteinase inducer)ENA-78: 表皮衍生的嗜中性粒細胞活化肽78(epithelial-derived neutrophil-activating peptide78)FGF: 纖維母細胞生長因子 (fibroblast growth factor)FGF-β: 纖維母細胞生長因子-β(fibroblast growth factor-β)Fas L: fas配體(fas Ligand)G-CSF: 顆粒性細胞株刺激因子( granulocyte Colony stimulating factor) GDF-15: 生長分化因子15( growth differentiation factor 15)HGF: 肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor)IGFBP-2: 似胰島素生長因子結合蛋白(insulin-like Growth Factor Binding Protein-2)IL :介白素(interleukin)IP-10: 幹擾素誘導蛋白10( interferon protein 10)I-TAC: 幹擾素誘導性T細胞α趨化因子( interferon-inducible T-cell alpha chemoattractant)kDa: 千道爾頓(kilo Daltons)LIF: 白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor)MCP: 單核球趨化蛋白( monocyte chemoattractant cytokine)MCP-1: 1單核球趨化蛋白-1( monocyte chemoattractant cytokine)M-CSF: 巨噬細胞株刺激因子(monocyte Colony stimulating factor)MIF: 巨噬細胞移行抑制因子( migration inhibition factor)MIG: 幹擾素-γ誘導單核細胞因子(monokine induced by Interferon gamma)MIP-1a/1b: 巨噬細胞發炎蛋白-1a /1b( macrophage inflammatory protein)MIP-3a: 巨噬細胞發炎蛋白-3a (macrophage inflammatory protein)MM: 分子量(molecular mass)MPP+: 1-甲基-4-苯基吡啶(1-methyl-4-phenylpyridinium)MMP: 基質金屬蛋白酶(matrix metalloprotease)MMP-9: 基質金屬蛋白酶-9( matrix metalloprotease 9)Neg Ctrl: 負控制組(negative control)PBS :磷酸鹽緩衝液(phosphate buffer saline)PC: 血小板濃厚液(platelet concentrate)PDGF: 血小板衍生性生長因子(platelet-derived growth factor)PDGF-AB: 血小板衍生性生長因子- AB (platelet-derived growth factor-AB)PDGF-AB/BB: 血小板衍生性生長因子- AB/BB( platelet-derived growth factor-AB/BB)PF4: 血小板第四因子 (platelet factor 4)PL: 血小板裂解液(platelet lysate)PPL: 血小板顆粒裂解液(platelet pellet lysate)PPL^E : 從過期之血小板濃厚液所得之血小板顆粒裂解液(platelet pellet lysate from expired PCPPL^F : 從未過期之血小板濃厚液所得之血小板顆粒裂解液(platelet pellet lysate from non-expired PC)RANTES: 調節活化正常T細胞表達和分泌( regulated on Activation Normal T cell Expressed and Secreted)RAGE: 高糖化終產物接收器(receptor for advanced glycation end products)RBP4: 視黃醇結合蛋白-4(retinol-binding protein 4)SDS-PAGE: 聚丙烯醯胺凝膠電泳(sodium-dodecyl-sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) TGF- β : 轉型生長因子-β(transforming growth factor-β)TNF :腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor)SHBG: 性腺荷爾蒙結合球蛋白( steroid Hormone Binding Globulin) ST2: 白介素1受體樣1(interleukin 1 receptor-like 1)TARC: 胸腺活化調節趨化因子(thymus and Activation Regulated Chemokine)TFF3: 三葉因子家族3( trefoil Factor Family 3)TfR: 運鐵蛋白受體( transferrin Receptor) uPAR: 尿激酶型纖維蛋白溶解酶原活化因子受體(urokinase-Type Plasminogen Activator Receptor)VEGF: 血管內皮生長因子(vascular endothelium growth factor)vWF: 溫韋伯氏因子(Von Willebrand Factor)

『材料與方法』

[血漿和血小板之收集]

臺北醫學大學人體研究處核准此研究計畫(編號201301020)。血小板濃厚液自臺北捐血中心(臺灣關渡)取得。從健康的自願捐血者採集血液(MCS+； Haemonetics Corp., Braintree, MA, USA) 從而取得非減白之血小板濃厚液。如前所述，使用ABC Vet(ABX Diagnostics, Montpellier, France)確定每位捐血者之血小板和其他血細胞計數。

將血小板濃厚液保持在22±2℃的血小板震盪器上。

處理5天內採集的血小板濃厚液(未過期)用於製備PPL^F (“新鮮PPL”)，而儲藏5天以上的血小板濃厚液用於製備PPL^E (“過期PPL”)。

[血小板顆粒裂解液的製備]

在無菌條件下製備血小板裂解液，如圖1所示。懸浮在血漿中的治療級分離術(therapeutic-grade apheresis)血小板濃厚液(PC)用以在-80/30℃±1℃下通過三個凍融循環來製備血小板裂解液(PL)對照組，並在22℃±2℃下以4500×g離心30分鐘，沉澱並除去細胞碎片。在本發明的方法步驟(a)中，為了製備在本發明步驟(a)中所使用的起始血小板顆粒裂解液(PPL)，將血小板濃厚液(200-250mL)離心(3000×g； 30分鐘； 22±2℃)，小心取出血漿上清液，並用2mL無菌PBS輕輕清洗沉澱物的表面。加入PBS(初始PC體積的10%)，輕輕吸取混合物使血小板懸浮，然後進行三次凍融循環(-80/+ 30±1℃)，接著通過離心(4500×g ； 30分鐘； 22±2℃)澄清。等份(500μl)PPL並在-80℃下保持冷凍直到使用。在45、56、65±1℃的乾浴中熱處理30分鐘以製備幾種不同熱處理過程的PPL，並在冰上冷卻至少5分鐘，然後進行離心(10000×g； 15分鐘； 4±2 C)。對照組PPL也以相同的方式製備，但其為在37±1℃下進行乾浴。然後在-80℃下冷凍保存上清液(經熱處理的PPL或在37℃處理之PPL)。

[血小板顆粒裂解液的蛋白質組成、電泳圖譜和蛋白質Western blot分析]

以使用牛血清白蛋白作為標準的Bradford測定法(Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA)和nanodrop(NanoDrop； Wilmington, DE, USA)測定不同PPL的總蛋白。使用SPIFE 3000 (Helena, Texas, USA；使用0.5mL蛋白質樣品)進行蛋白質區帶電泳和脂蛋白電泳。使用來自Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)的4%至12%梯度凝膠、試劑、電泳系統和前述³⁰ 之預製蛋白質分子量標準(Protein ladder, Thermo)，在非還原和還原之條件下進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。

對於二維凝膠電泳，首先使用2-D清潔試劑盒(GE Healthcare, LittleChalfont, United Kingdom)將樣品脫鹽，在pH 3-10梯度及使用4-12%聚丙烯醯胺之SDS-PAGE下進行等電聚焦(Ettan IPGphor 3, GE Healthcare, Little Chalfont, United Kingdom)。蛋白質檢測係使用蛋白質凝膠快速染色溶液染色(強生物科技有限公司，臺北，臺灣)。

進行蛋白質Western blot分析以檢測纖維蛋白原和vWF。簡言之，熱處理的PPL樣品與4x樣品緩衝液{0.35M Tris(pH 6.8)、10%w/v SDS、30%v/v甘油、0.6M DTT和0.012%w/v溴酚藍混合}並加熱至95℃維持5分鐘。接下來通過SDS-PAGE分離蛋白質，然後轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。將膜用含5%無脂奶之TBS-0.1%之Tween 20阻隔，並以兔抗人纖維蛋白原抗體(GeneTex, California, USA)及兔抗人溫韋伯氏因子(vWF)抗體(Agilent's Dako ，加利福尼亞，美國)依次溫育。使用HRP綴合的二抗，進行增強的化學發光(ECL)檢測(GeneTex, California, USA)。

[由酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)和細胞激素陣列所測定之生長因子和細胞因子含量]

按照供應商的說明，如前所述^31-33 ，使用Quantikine ELISA試劑盒(R＆D Systems, Minneapolis, MN, USA)，一式三份測定生長因子。

將血小板顆粒裂解液樣品稀釋500倍(對於37˚C和56˚C處理的樣品)以進行PDGF-AB測定；對於BDNF測定，則分別在37℃下稀釋500和在56℃下稀釋50倍；對於bFGF測定，則分別為在37℃下稀釋10倍及在56℃下無稀釋；對於VEGF測定，則在37℃和56℃下均稀釋為5倍；對於EGF測定，則在37℃和56℃下均稀釋為100倍；對於HGF測定，則在37℃和56℃下均沒有稀釋；對於TGF-β測定，則在37℃和56℃下均稀釋為400倍；對於PF4測定，則在37℃和56℃下均稀釋為1×10⁶ 倍。稀釋因子分別為血小板裂解液的200倍、100倍、1倍、2倍、50倍、2倍、100倍和1×10⁵ 倍。

對於TGF-β1測定，取40μL的樣品在20μL、濃度為1N之HCl中酸化10分鐘，然後用20μL、濃度為1.2N的NaOH/0.5M HEPES中和³¹ 。

根據製造商說明書(R＆D Systems)內容，對於150μg之熱處理PPL、不在56℃熱處理之PPL或在65℃熱處理之PPL，以人類XL細胞激素陣列檢測102種細胞激素/生長因子的相對含量。使用Imagine J軟體量化信號強度。

[LUHMES細胞之維持和分化]

自Scholz博士實驗室(德國康斯坦茨大學)獲得LUHMES細胞，並按照所述方法²⁸ 進行培養。

簡而言之，使用Nunclon^TM (Nunc, Roskilde, Denmark)之塑膠細胞培養瓶，以及在37℃下之水中預先塗佈50μg/ mL聚-L-鳥氨酸和1μg/ mL纖連蛋白(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA)的多孔板3小時，以繁殖未分化的LUHMES細胞。除去塗佈溶液後，用無菌蒸餾水洗滌培養瓶並置於空氣中乾燥。細胞在37℃，空氣溼度為95%，以及5%CO₂ 氣氛中培養。增殖培養基為Advanced Dulbecco之改良Eagle's培養基(Advanced DMEM)/ F12，包含1×N-2補充劑(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)、2mM L-穀氨醯胺(Gibco, Rockville, MD, USA)和40ng/mL之重組bFGF(R＆D Systems)。當達到約80%匯合時，用0.025%胰蛋白酶溶液(Gibco, Rockville, MD, USA)分離細胞，並以3×10⁶ 個細胞/燒瓶做傳代培養。為了誘發神經元細胞的分化，將2×10⁶ 個LUHMES接種並培養於裝有增殖培養基之T75燒瓶內24小時，然後在含有1×N-2補充劑、2mM L-穀氨醯胺(Gibco)、1mM二丁醯cAMP(Sigma-Aldrich)、1μg/ mL四環素(Sigma-Aldrich)和2ng/mL重組人類GDNF(R＆D Systems)的Advanced DMEM/F12中培養。在分化條件下培養兩天後，在第5天將LUHMES移至24孔板培養以進行接下來的實驗。

[LUHMES細胞之神經毒性刺激和細胞存活率分析]

於分化後(第5天)，將細胞暴露於各種濃度的血小板顆粒裂解液(0.025至15%； v/v)中1小時，然後暴露於30μM之MPP +(Sigma-Aldrich)中。於48小時後以MTT評估細胞存活率。

將0.5mg/ml(最終濃度)之MTT(3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-四唑溴化物)加入到細胞培養基中。在37℃下培養1小時後除去培養基，將活細胞中的紫色結晶在DMSO中劇烈震盪10分鐘。等分樣品並轉移到96孔板中，在570nm進行吸光度檢測(以690nm作為背景值)。

使用含有對照組的兩種不同的細胞培養板，重複對每種條件進行評估。與LUHMES不暴露於MPP +的控制條件相比，資料表示為%細胞存活率。

[改良性熱處理PPL(於56℃)誘發神經恢復]

為了促進分化，於培養瓶內，在補充有0.5%FBS、4mM左旋麩醯胺酸(L-glutamine)、1%PS和1μM全反式維甲酸(all trans retinoic acid)之改良型DMEM/F12中，培養神經幹細胞(NSC-34)2天。然後以每孔含3×10⁴ 之細胞濃度，將細胞接種於含有0.5%FSB之分化培養基中的24孔板內6小時。隨後將培養基替換為不含FBS的分化培養基。於3天後，用不含全反式維甲酸的分化培養基替換培養基以做試驗。在把NSC-34細胞加入(5%)改良性熱處理PPL之前，首先用甲萘醌(menadione)或星孢菌素(straurosporine，STS)處理NSC-34細胞1小時、2小時或3小時，處理總時間共24小時。分別使用碘化丙啶(propidium iodide)和氫化乙啶(hydroethidine)之流式細胞術來評估細胞存活率和氧化壓力。並通過非參數Mann Whitney檢驗進行統計分析。

[小鼠1-甲基-1,2,3,6-四氫吡啶模型(MPTP-小鼠模型)的立體定位和血小板顆粒裂解液試劑]

所有動物手術均按照國家和國際指導方針進行(Decree 87-848 of October 19, 1987； French Ministry of Agriculture and Forestry, Veterinary Service for Animal Health and Welfare)。所用小鼠為5個月大，體重為28g至30g。

在估計小鼠腦脊髓液體積(40μL)下注射1%、2.5%、5%和10%的PPLs。

根據所需的前後側和立體定位座標(根據Paxinos和Watson腦圖集，B - 0.34 mm，L + 1 mm)插入腦套管，然後用丙烯酸水泥錨定顱骨。

填充鹽水(對照組)或填充血小板顆粒裂解液於Alzet泵(Durect Corporation, Cupertino, CA, USA)中，於37℃連接到特定插管並在手術前進行注射。在插入腦套管之前，將泵皮下插入滑鼠背部。手術後兩天，一些小鼠用MPTP急性中毒(間隔2小時於腹膜內注射20mg/kg MPTP 4次)。連續注射血小板顆粒裂解液7天(中毒後5天)，觀察小鼠在實驗期間的毒性症狀。

通過免疫染色和計算黑質中存在的酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase．TH)陽性細胞數量，對血小板顆粒裂解液的任何神經保護作用進行初步評估。如前所述，對小鼠麻醉、灌注甲醛、進行腦切片和與抗體一起溫育並觀察TH陽性神經元數量。

[統計分析]

結果以平均值±標準偏差(SD)表示。在檢查資料的正態分佈後，使用單因素ANOVA分析進行統計學分析。在非正態分佈的情況下，進行Wilcoxon和Kruskal-Wallis的非參數文本分析。P值小於0.05時，此統計結果具有統計學意義。

『結果』

[起始血小板濃厚液的血細胞計數和血小板裂解液的特性]

用於製備血小板裂解液和製備平均數量為1240±252×10⁹ /L血小板，0.08±0.05×10¹² /L紅血球和0.5±0.2×10⁹ /L白血球的血小板裂解液之血小板濃厚液。

首先顯示PPL的蛋白質組成特性。PPL^F 和PPL^E (約11mg/ml)的蛋白質含量(圖2A)沒有顯著差異(p＞ 0.05)，並且比PL(約65mg/ml)低得多(p ＜0.001)。

與PPL^F (圖2C)和/或PPL^E (未圖示)相比，PL(圖2B)的區帶電泳圖譜顯示，在白蛋白和γ區域遷移的蛋白質比例較低，遷移較多的是α1、α2和 β，而白蛋白/γ(A/G)較低(0.5 vs 1.6)。

PPL^F (和PPL^E ；未圖示)的SDS-PAGE圖譜(圖2D)顯示蛋白質的分子量分佈範圍廣大，分別約在60kDa、48kDa和15kDa時具有顯著的條帶。在非還原和還原條件下，為約在68kDa、48kDa和15kDa時具有顯著的條帶。 2D-電泳圖(圖2D)顯示PPL是由與血小板蛋白質組複雜性一致的多個成分組成。

因此，與血小板裂解液(PL)相比，血小板顆粒裂解液(PPL)具有獨特的蛋白質組成。

[熱處理改良蛋白質的含量]

首先在56℃下處理血小板顆粒裂解液30分鐘，以獲得本發明的改良性熱處理的PPL。

加熱的蛋白質導致沉澱造成上清液(圖3A)中的蛋白質總含量，熱處理PPL^E (p ＜0.01)和PPL^F (p ＜0.001)均顯著低於正常PPL^F 、PPL^E 和PL對照組(p ＜0.001)。

通過ELISA(圖3B)的測量或每毫克含有的蛋白質(圖3C)含量顯示生長因子的含量受到熱差異的影響。

雖然與各相應未經熱處理的PPL^F 或PPL^E 相比，PDGF-AB、BDNF、bFGF、EGF和HGF的濃度顯著下降(p ＜0.001)，但對於VEGF、TGF-β和CXCL4/PF4(對於PPL^E )，其濃度沒有顯著差異。

熱處理PPL^F 和PPL^E (即改良性熱處理PPL，以每毫克的總蛋白表示)的生長因子相對含量，其BDNF、bFGF和HGF顯著下降(p ＜0.001)；其PDGF-AB、VEGF(在PPLF中)和EGF保持不變(p＞ 0.05 )；VEGF(在PPL^E 中)、TGF-β和PF4顯著增加(p ＜0.001)。

在非減少或減少之PPL的SDS-PAGE圖譜上，對在45℃、56℃和65℃熱處理的影響(圖4B)進行研究。

在56℃和65℃熱處理導致蛋白質的組成發生重大變化，其特性在於除去各種分子量的蛋白質。蛋白質Western blot分析(圖4A)表明，在56℃和65℃下的熱處理除去了血小板生成纖維蛋白原(MM約為270kDa)，而vWF相對保持不受影響。

與在37℃下處理的PPL(對照組)相比，在56℃或65℃熱處理的改良性PPL中的細胞激素陣列鑒定了一些PPL成分中的相對富集(圖4C、圖5和圖6)，包括PDGF-AA，-AB/BB和脂聯素(Adiponectin)，並且在BDNF，EGF等其他條件中相對貧乏。此外，與在37℃下處理的PPL相比，在56℃或65℃下熱處理的改良性PPL之細胞因子比例表明一個相對變化的含量。

實際上，56℃下熱處理的PPL與在37℃下處理的PPL的比例表明，脂質運載蛋白-2(lipocalin-2)、腺嘌呤素(adinopectin)和C-反應蛋白(C-reactive protein)的相對含量增加，而補體因子D(complement factor D)、ENA- 78、BDNF、血管生成素-1(Angiopoietin-1)和內皮糖蛋白(Endoglin)的相對含量減少(圖7)。

在37℃下對PPL進行熱處理的改良性PPL與在37℃下之PPL相比，脂質運載蛋白-2、adinopectin、PDGF-AA和PDGF-AB/BB的相對含量增加，而補體因子D、ENA -78、BDNF、血管生成素-1、內皮因子、Dkk-1、CD14、C-反應蛋白、EGF、血小板反應蛋白-1(Thrombospondin-1)、RANTES、RBP4、維生素D和血管促生蛋白(Angiogenin)的相對含量減少(圖8)。

血小板顆粒裂解液保護LHUMES之細胞存活率，並在加入MPP +之前加入可發揮顯著的神經保護活性，熱處理改善血小板顆粒裂解液之神經保護活性。

為了進一步證明在體外PPL的神經保護能力，首先證實了PPL對LUHMES細胞無毒性(圖10A)。

如圖10B所示，通過細胞存活率分析(MTT assay)顯示，對2%PPL^F 和PPL^E 的細胞進行預處理1小時，對30μM之MPP +發揮非常顯著(p ＜0.001)的保護作用。

用不同劑量的PPL^F (0.025%至15%)進行治療時，觀察到劑量反應效應，以2%的PPL^F 進行治療可獲得最大神經保護作用(圖10C)。

因此，PPL^F 和PPL^E 都能保護LUHMES細胞免受MPP +神經毒素的攻擊。

關於神經保護活性，在37℃(圖11A)處理的0.5%至15%PPL，PPL或在45℃(圖11B)、56℃(圖11C)或65℃(圖11D)下熱處理的改良性PPL，即使在濃度低至0.5%也仍維持高度顯著的神經保護活性。在較低劑量下，56℃的熱處理可改善細胞存活率。在56℃或65℃下使用0.5%劑量的改良性熱處理PPL治療LUHMES細胞，比使用在37℃下處理的PPL處理的LUHMES細胞(對照組)顯示更好的存活率。在56℃和65℃下，15%劑量的熱處理PPL也觀察到了這種存活率的改善。

圖11E顯示比較不同劑量PPL的神經保護作用，在最高溫度(56℃和65℃)處理的PPLs，其功效在0.5%至15%範圍內保持相似。

相比之下，未熱處理的PPL或僅在45℃熱處理的PPL之劑量反應效應顯示，在較低劑量(0.5%)下缺乏療效，或由於可能蛋白質超過負荷導致較高劑量(10%-15%)時的毒性或抑制作用。

輸注血小板顆粒裂解液於小鼠腦內不會引發急性毒性，並提供神經保護和神經恢復。

根據本發明，ICL注射37℃下處理之PPL和改良性熱處理PPL，驗證可能性實驗表明，四種選擇劑量(1%、2.5%、5%和10%)下沒有明顯的有害作用。在一周的實驗持續時間內，PPL輸注後沒有立即可檢測的毒性作用。與手術相關的死亡率很低(10隻動物中有1隻)。

細胞分析證明，在暴露於神經毒素甲萘醌或星孢菌素(圖9A和9B)1小時、2小時或3小時後，通過改良性熱處理的PPL治療，NCS-34細胞存活率幾乎完全恢復。這些結果表明，本發明的改良性熱處理PPL可誘使神經恢復。氧化壓力的評估證實了這些結果。事實上，通過本發明的改良性熱處理PPL(圖9C)的後處理治療，由於甲萘醌造成的氧化壓力(以對照組百分比表示的+ 1200%)降低到接近正常值。與對照組載體溶液(Veh)相比，黑質中TH陽性神經元的檢測和數量(圖12)證明了MPTP的顯著(p ＜0.05)神經毒性作用。單獨的5%或10%之PPL對TH陽性細胞數量沒有顯著影響。有趣的是，我們觀察到10%之改良性熱處理的PPL對MPTP表現出強烈和顯著(p ＜0.05)的神經保護作用。因此，PPL的ICV輸注劑量在至少佔總CFS體積的10%下似乎是安全的，其提供了對MPTP中毒的神經保護作用。

在暴露於神經毒性甲萘醌或星孢菌素之1小時、2小時或3小時後，也用37℃處理之PPL治療NCS-34細胞。該實驗的結果表明，儘管獲得了神經保護作用，但與如上所述的改良性熱處理PPL的治療結果相比，其療效降低了20%(參見圖9A和9B)。

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無

圖1係從血小板濃厚液製備血小板裂解液和血小板顆粒裂解液的方法；其中，血小板裂解液(PL)通過血小板濃厚液(PC)的3次凍融迴圈獲得。對於血小板顆粒裂解液(PPL)製備，將血小板沉澱然後除去血漿，接著進行3次凍融迴圈，而後離心除去細胞碎片，等分樣品後在-80℃冷凍直到試驗。圖2係PL和PPL的蛋白質特性；其中， (A)：PL、PPL^F 和PPL^E 的蛋白質總含量(mg/ml)比較。 (B)、(C)：PL和PPL的區域電泳圖譜。 (D)：非還原性處理和還原性處理之PPL的丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)圖譜。 (E)：PPL的二維電泳圖譜；在pH 3至10下進行等電聚焦分離。圖3係在56℃(+)(選自PPL^F 和PPL^E )的改良性熱處理的PPL和在37℃( - )處理的PPL之蛋白質特性；(A)：總蛋白含量(mg/ml)，在PDGF-AB、BDNF、FGF、VEGF、EGF、HGF、THG-β和PF4中，以ng/ml(B)和ng/mg之蛋白質(C)表示含量。圖4係比較在37℃下處理的改良性熱處理PPL和PPL之蛋白質組成。將37℃下處理的PPL(對照組PPL)或在45℃、56℃或65℃下熱處理的改良性PPL，在非還原和還原之條件下(B)，纖維蛋白原的Western blot分析和vWF(A)和SDS-PAGE圖譜。(C)：用細胞激素陣列，將56℃或65℃下熱處理的改良性PPL與37℃(對照組)處理的PPL相比，確定細胞因子之相對變化。圖5係經由細胞激素陣列測定，與在37℃下處理的PPL(對照組)相比，在56℃或65℃熱處理的改良性PPL中，各種細胞因子和蛋白質的相對增加或減少，其中數據表示為平均值和標準偏差(SD)。圖6係在37℃(對照組)處理的PPL、或在56℃或65℃下熱處理的改良性PPL之細胞激素陣列資料的圖像，其中數據表示為平均值和標準偏差(SD)。圖7係在56℃下熱處理的改良性PPL與在37℃下處理的PPL(對照組)，細胞激素陣列可檢測之細胞因子的減少和增加的比例。 * p ＜0.05。圖8係在65℃下熱處理的改良性PPL與在37℃下處理的PPL(對照組)，細胞激素陣列可檢測之細胞因子的減少和增加的比例。 * p ＜0.05。圖9係改良性熱處理PPL對神經恢復的功效；其中， (A)：在進行添加改良性熱處理PPL(56℃)之前用甲萘醌處理NSC-34的細胞存活率。符號說明：PPL：改良性熱處理PPL，m：甲萘醌，m3h + PPL：添加改良性熱處理PPL前3小時用甲萘醌處理，m2h + PPL：添加改良性熱處理PPL前2小時用甲萘醌處理，m1h + PPL：添加改良性熱處理PPL前1小時，用甲萘醌處理； (B)：在進行添加改良性的熱處理PPL(56℃)之前，用星孢菌素(straurosporine)處理NSC-34的細胞存活率。符號說明：PPL：改良性熱處理PPL，STS：星孢菌素，STS3h + PPL：添加改良性熱處理PPL前3小時用星孢菌素處理，STS2h + PPL：添加改良性熱處理PPL前2小時用星孢菌素處理，STS1h + PPL：添加改良性熱處理PPL前1小時用星孢菌素處理；以及 (C)：在進行添加改良性熱處理PPL之前，用甲萘醌處理NSC-34細胞的氧化壓力。圖10係通過PPL治療LUHMES缺乏毒性和神經保護作用；其中， (A)：通過不暴露在MPP +下之不同濃度(0.1%〜5%)在37℃下在處理的PPT(PPL對照組)進行治療； (B)：在暴露於30μM之MPP +之前1小時，在1(0)、3、6和7-10天(＞6)內，以PC製備的2%PPL液進行治療；以及 (C)：在暴露於30μM之MPP +之前，以37℃下處理之各種劑量(0.025%〜15%)的PPL(PPL對照組)進行治療。數據表示在標準培養基中生長且未暴露於MPP +(100%)的LUHMES細胞存活率的百分比。圖11係在暴露於MPP +之前，在45℃、56℃和65℃下之0.5-15%熱處理的改良性PPL或在37℃下處理的PPL，治療LUHMES細胞的神經保護作用。在37℃(A)處理的PPL或在45℃(B)、56℃(C)或65℃(D)下熱處理的改良性PPL。以增加37℃(對照組)處理的PPL劑量或以在45℃、56℃或65℃(E)下熱處理的改良性PPL治療LUHMES細胞，提供神經保護作用的範圍。數據表示標準培養基中生長且未暴露於MPP +(100%)的LUHMES細胞存活率的百分比。圖12係PPLs在MPTP-中毒小鼠的神經保護作用；其中， +：對指定條件與對照條件相比，p ＜0.05； *：指定條件與MPTP條件相比，p ＜0.05)。

Claims

一種製備改良性熱處理的血小板顆粒裂解液的方法，包括以下步驟：(a)提供一血小板顆粒裂解液；(b)於55℃至65℃的溫度下，對該血小板顆粒裂解液持續進行熱處理20至40分鐘；以及(c)純化經過步驟(b)之熱處理的該血小板顆粒裂解液，獲得改良性熱處理的血小板顆粒裂解液，其中該改良性熱處理的血小板顆粒裂解液的蛋白質總含量小於步驟(a)之該血小板顆粒裂解液之蛋白質總含量的70%。
如請求項1之方法，其中步驟(c)的純化係通過離心法或過濾法進行。
如請求項1之方法，其中步驟(b)係在55℃至60℃的溫度下進行。
如請求項3之方法，其中步驟(b)係在56℃的溫度下進行。
如請求項1至4其中任一項之方法，其中步驟(b)中的熱處理持續時間約為30分鐘。
如請求項1之方法，還包括在步驟(c)之後，將含有該血小板顆粒裂解液的上清液於約-80℃的溫度下冷凍並儲存的步驟。
一種改良性熱處理的血小板顆粒裂解液，其蛋白質總含量小於未經過熱處理的血小板顆粒裂解液之蛋白質總含量的70%。
如請求項7之改良性熱處理的血小板顆粒裂解液，其中該改良性熱處理的血小板顆粒裂解液之蛋白質總含量小於未經過熱處理的血小板顆粒裂解液之蛋白質總含量的50%。
如請求項7或8之改良性熱處理的血小板顆粒裂解液，其中該改良性熱處理的血小板顆粒裂解液具有小於1.5mg/mL的纖維蛋白原。
如請求項9之改良性熱處理的血小板顆粒裂解液，其中該改良性熱處理的血小板顆粒裂解液具有0.1mg/mL至0.3 mg/mL的纖維蛋白原。
如請求項7、 8、及10其中任一項之改良性熱處理的血小板顆粒裂解液，其中該改良性熱處理的血小板顆粒裂解液之血小板第四因子含量超過該未經過熱處理的血小板顆粒裂解液之血小板第四因子含量的50%以上。
如請求項11之改良性熱處理的血小板顆粒裂解液，其中該改良性熱處理的血小板顆粒裂解液之血小板第四因子含量超過該未經過熱處理的血小板顆粒裂解液之血小板第四因子含量的70%以上。
如請求項7、 8、 10及12其中任一項之改良性熱處理的血小板顆粒裂解液，其中該改良性熱處理的血小板顆粒裂解液當作藥物使用。
如請求項13之改良性熱處理的血小板顆粒裂解液，其中該改良性熱處理的血小板顆粒裂解液用於治療神經障礙。
如請求項14之改良性熱處理的血小板顆粒裂解液，其中該神經系統疾病選自神經退化性疾病、神經炎症、神經發展疾患、神經血管性疾病和腦損傷。
如請求項15之改良性熱處理的血小板顆粒裂解液，其中該神經系統疾病係進一步選自多發性硬化症(multiple sclerosis．MS)、帕金森症(PD)、亨汀頓氏舞蹈症(Huntington’s disease．HD)、肌萎縮性側索硬化症(ALS)、中風、老年性黃斑部病變(age-related macular degeneration．AMD)、阿爾茨海默症(AD)、血管型失智症(vascular dementia)、額顳葉型失智症(frontotemporal dementia)、語意型失智症(semantic dementia)和路易體失智症(dementia with Lewy bodies)。
如請求項16之改良性熱處理的血小板顆粒裂解液，其中該神經退化性疾病係進一步選自帕金森症、肌萎縮性側索硬化症、老年性黃斑部病變以及阿爾茨海默症。
如請求項17之改良性熱處理的血小板顆粒裂解液，其中該神經系統疾病係進一步選自創傷性腦損傷、缺氧的腦損傷。
如請求項14至18其中任一項之改良性熱處理的血小板顆粒裂解液，其中該改良性熱處理的血小板顆粒裂解液之給藥途徑係通過脊髓內注射、眼內施藥、鼻內或腦室內給藥。
如請求項19之改良性熱處理的血小板顆粒裂解液，其中該改良性熱處理的血小板顆粒裂解液係通過腦室內途徑給藥。
如請求項19之改良性熱處理的血小板顆粒裂解液，其中該改良性熱處理的血小板顆粒裂解液係通過進入第三腦室給藥。
如請求項20或21之改良性熱處理的血小板顆粒裂解液，其中該改良性熱處理的血小板顆粒裂解液適於使用泵給藥。