JP2019512541A - ペプトイド親和性リガンド - Google Patents
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Abstract
Description
本明細書中に開示されるのは、ペプトイド親和性リガンドを含むペプトイドとその関連連化合物である。また、ペプトイド親和性リガンドを製造する方法及びこれを用いて、免疫グロブリン及びその関連化合物に結合させ、これを精製し、及び/又はこれを単離するための方法も開示される。
しかし、抗体に基づいた治療は、患者にとって非常に高価である。この高価であることは、部分的には、これらの生体分子を単離及び精製することが高コストであることによるものである。この高い精製コストは、主に、プロテインA又はプロテインGアフィニティークロマトグラフィー捕捉工程のユビキタスな使用に起因する。これらのタンパク質リガンドは、IgGに対する高い選択性にもかかわらず、高いコストと低い化学的及び生化学的安定性に悩まされている。プロテインA/Gベースのクロマトグラフ媒体の平均コストは、樹脂1リットル当たり約8,000〜約15,000ドルの範囲である。さらに、タンパク質リガンドは、不純物を除去するために日常的に適用され、規制ガイドラインによって要求される、アルカリ(0.1〜1.0M NaOH)を用いた洗浄及び衛生化操作に対して一般的に耐薬品性が低い。さらに、これらは、供給流中に存在する酵素によってタンパク質分解されがちである。化学薬剤と酵素薬剤のいずれも、リガンド分解及び樹脂からのリガンド断片の漏出を引き起こす可能性があり、その結果、これらは、それぞれ、カラムの短寿命化と、生成物の主流中に毒性及び免疫原性浸出液の存在をもたらす可能性がある。
第1に、いくつかの実施形態において、ペプトイド上の官能基の表示は、ペプチドのものに似ており、このことはペプトイドが、ペプチドリガンドのレベルに匹敵するレベルの親和性及び選択性で設計又は選択することができることを意味している。さらに、ペプトイドは、一級アミンを用いる、いわゆる「サブモノマー」合成プロトコルにより、天然アミノ酸を含むタンパク質リガンドやペプチドに可能な化学的多様性よりもはるかに広い化学的多様性を探索することができる。本発明においては、特異性及び親和性のより高い目標を達成するために、ペプトイドの組成を微調整する能力の理解が示される。最後に、ペプトイドはタンパク質分解に対して完全に耐性であり、したがって、全血漿及び細胞培養物、植物及び他の生物のその画分又は溶解物のような。活性酵素を含有する流体から抗体を精製するのに有利である。したがって、ペプトイドは、プロテインAの経済的な代替品である。これらのリガンドは、バイオ医薬品の精製の他、診断やプロセス制御などの分野でのさらなる用途を見つけることができる。
上記の本発明の実施態様、及び本明細書中に開示された発明によって全体的又は部分的に達成される本発明の実施形態は、以下に最もよく説明されている実施例を参照して説明が進むにつれて、明らかになるであろう。
本発明を説明する際に、多くの技術及び段階が開示されることが理解されるであろう。これら技術や段階の各々は個々の利益を有し、各技術や段階は他の開示された技術の1又はそれ以上又は場合によってはそれら全てと共に使用することもできる。
したがって、明瞭化のために、以下の説明は、個々の段階の可能な組み合わせを不要な方法ですべて繰り返すことをしない。それにもかかわらず、本明細書と特許請求の範囲は、このような組み合わせが完全に本発明の範囲及び特許請求の範囲内にあることを理解して読まれるべきである。
他に指示がない限り、明細書及び特許請求の範囲で使用される成分の量や反応条件などを表す全ての数字は、すべての場合において「約」という用語によって修飾されるものとして理解されるべきである。したがって、反対の意味であると示されない限り、本明細書及び添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、本発明によって得られることが求められる所望の特性によって変化し得る近似値である。
本明細書で使用される場合、「のみから成る(consisting of)」という語句は、特許請求の範囲内に明記されないいかなる要素、ステップ、又は成分も除外する。「のみから成る」という語句が、前文の直後ではなく、特許請求の範囲の本文の条項に出現する場合、それは、その条項内に説明される要素のみを限定し、他の要素は特許請求の範囲全体からは除外されない。
本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という語句は、特許請求の範囲を、明記される材料又はステップ、ならびに主張される主題の基本的及び新規の特徴(複数可)に実質的な影響を与えないものに限定する。
「から成る」、「のみから成る」、及び「から本質的になる」という用語に関して、これら3個の用語のうちの1つが本明細書で使用される場合、本開示の主張される主題は、その他の2個の用語のいずれかの使用を含み得る。
本明細書において単独で使用される、又は別の基の一部として使用される「複素環式」は、その環の構成部分として少なくとも2個の異なる元素の原子を有する環状化合物を指す。
本明細書で使用される「アルキニル」は、その中の2個の炭素原子の間に少なくとも1個の三重結合を含む上記のようなアルキル基を指す。
本明細書で使用される「アルキレン」は、1個の末端水素が除去されて2価の置換基が形成された上記のようなアルキル基を指す。
本明細書において単独で又は別の基の一部として使用される「芳香族」は、その環を形成する結合の相互作用によって安定化された平面状の不飽和原子環を含む基を指す。このような化合物は、場合によっては、ベンゼン及びその誘導体に代表されることがある。芳香族の官能基又は他の置換基を、アリール基と呼ぶこともできる。
本明細書で単独で又は別の基の一部として使用される「ヘテロ芳香族」は、その環に少なくとも1個の非炭素原子を有し、芳香族化合物又はアリール基の特性を有するものをいう。
本明細書で単独で又は別の基の一部として使用される「アリールアルキル」は、本明細書で定義されるアルキル基を介して親分子部分に結合した、本明細書で定義されるアリール基を指す。
アリールアルキルの代表例には、ベンジル、2-フェニルエチル、3-フェニルプロピル、2-ナフト-2-イルエチルなどが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「ヘテロアリール」は、上記のヘテロシクロに関連して記載された通りである。
本明細書で使用される「ハロ」は、−F、−Cl、−Br及びIを含む任意の適切なハロゲン原子を指す。
本明細書中で単独で又は別の基の一部として使用される「アシル」は、-C(O)R基(式中、Rはアリール、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル又は本明細書に記載の他の適切な置換基などの任意の適切な置換基を表す。)を指す。
本明細書において単独で又は別の基の一部として使用される「アルキルアミノ」は、-NHR(式中、Rはアルキル基を表す。)で表される基を意味する。
本明細書において単独で又は別の基の一部として使用される「アリールアルキルアミノ」は、-NHR(式中、Rはアリールアルキル基を表す。)で表される基を意味する。
本明細書中で単独又は別の基の一部として使用される「二置換アミノ」は、-NRaRb(式中、Ra及びRbは、独立して、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロシクロ、ヘテロシクロアルキルから成る群から選択される基を表す。)で表される基を意味する。
本明細書において単独で又は別の基の一部として使用される「アシルオキシ」は、-OR(式中、Rは本明細書で定義されるアシル基を表す。)で表される基を意味する。
本明細書において単独で又は別の基の一部として使用される「エステル」は、-C(O)OR(式中、Rは、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル又はアリールのような任意の適切な置換基を表す。)で表される基を意味する。
本明細書中で単独で又は別の基の一部として使用される「アミド」は、-C(O)NRaRb又はN(Ra)C(O)Rb(式中、Ra及びRbは、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル又はアリールのような任意の適切な置換基を表す。)で表される基を意味する。
本明細書で使用される「スルホニル」は、-S(O)(O)R(式中、Rはアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル又はアリールなどの任意の適切な置換基を表す。)で表される化合物を指す。
本明細書で使用される「スルホネート」は、-S(O)(O)OR(式中、Rはアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル又はアリールなどの任意の適切な置換基を表す。)で表される化合物を指す。
本明細書で使用される「スルホン酸」は、-S(O)(O)OHで表される化合物を指す。
本明細書中で単独で又は別の基の一部として使用される「尿素」は、-N(Rc)C(O)NRaRb(式中、Ra、Rb及びRcは、水素原子、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル又はアリールなどの任意の適切な置換基を表す。)で表される基を指す。
本明細書中で単独又は別の基の一部として使用される「アルコキシアシルアミノ」は、-N(Ra)C(O)ORb(式中、Ra及びRbは、水素原子、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル又はアリールなどの任意の適切な置換基を表す。)で表される基を指す。
本明細書において単独で又は別の基の一部として使用される「アミノアシルオキシ」は、-OC(O)NRaRb(式中、Ra及びRbは、水素原子、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル又はアリールなどの任意の適切な置換基を表す。)で表される基を指す。
本明細書で使用される「結合基」は、親分子又は介在するリンカー基(例えば、アルキル、アリール、アリールアルキル、又はアルキルアリールアルキル基などの脂肪族、芳香族、又は脂肪族/芳香族混合基である。)によって直接的に示される、アルケン、アルキン、アルコール、チオール、セレニル、ホスホノ、カルボン酸、ホルミル、ハロゲン化物又はアミン基などの、任意の適切な反応基であってもよい。
いくつかの実施態様において、この抗体又はFc断片(その融合タンパク質を含む)は、血液又は血液画分(例えば、血液血清、血漿)、卵黄及び/又はアルブミン、組織又は細胞増殖培地 、組織溶解物又はホモジネートなどの生体液中に保持される。
Rは、結合部分(例えば、Rは-OH、-NH2、-NHR''、-OR''、-OOR''などであり、R''はアルキルなどを表す。)又はZ-R'を表す。式中、Zは結合基を表し、R'は固体支持体を表す。
例えば、Zは-O-、-NH-、-O-NH-、-O-R''-S-、-NH-R''-S-、O-NH-R''-S-、-O-R''-SS-、-NH-R''-SS-、-O-NH-R''-S-S-、エーテル(-O-)、チオエーテル(-S-)、チオエステル、カーバメート、カーボネート、アミド、エステル、二級/三級アミン(例えば、還元的アミノ化カップリング反応によって得られる。)、アルキル(例えば、メタセシスカップリング反応によって得られる。)、アルケニル、ホスホジエステル、ホスホエーテル、オキシム、イミン、ヒドラゾン、アセタール、ヘミアセタール、セミカルバゾン、ケトン、ケテン、アミナール、ヘミアミナール、エナミン、エノール、ジスルフィド、スルホン、システアミン、システイン、リシン、2-アジドグリシン、2-アルキニルグリシン等である。
R1', R2', R3', R4', R5', R6, 及びR7'は、それぞれ独立して、不存在又はC1〜C4アルキレン基である。
R1, R2, R3, R4, R5, R6, 及びR7は、それぞれ独立して、本明細書に記載のように、得られたペプトイドが、本明細書に記載のような1又はそれ以上の免疫グロブリンに対して結合親和性を有するように、本明細書に記載の任意の順序で配列した1又はそれ以上の官能基又は機能的残基を含む。
これらの官能基又はR基は、本明細書中に例示されるが任意の側鎖、アミン、化学構造などを含み得るが、本明細書に開示され、考察され又は示される例に必ずしも限定されない。
いくつかの実施態様において、官能基は、D-アミノ酸及びβアミノ酸を含む非天然アミノ酸官能基を含む。
いくつかの実施態様において、本発明のペプトイド及びペプトイド親和性リガンドは、例えば、3〜10個のペプトイド残基、3〜9個のペプトイド残基、3〜8個のペプトイド残基、3〜7個のペプトイド残基などを含む、3〜15個又はそれ以上のペプトイド残基を含むペプトイド骨格を形成する連続的に結合したペプトイド残基を含むことができる。
本発明のペプトイドを用いて結合され、単離され又は精製されることができる免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、又はそれらの免疫グロブリン融合タンパク質は、例えば、哺乳類、鳥類、軟骨魚類などを含む任意の生物由来の免疫グロブリンなどを含むことができる。
いくつかの局面において、本発明のペプトイド親和性リガンドは、固体支持体に結合していてもよい。この固体支持体には、例えば、粒子、無機材料、及び/又は有機ポリマー材料が含まれるが、これに限定されない。いくつかの実施態様において、このような固体支持体は、例えば、再生セルロースを含む膜繊維又はフィルムから成ってもよい。このような固体支持体は、膜クロマトグラフィーなどの様々な用途において有用であり得る。
いくつかの実施形態において、このペプトイド親和性リガンドは、チオール結合以外の結合、好ましくはアミノ結合によって固前記体支持体に結合していてもよい。ペプトイドにチオール結合以外の結合を提供することにより、このペプトイドは、いくつかの実施形態において、チオール結合を有するペプトイド親和性リガンドよりも、少なくとも約10%〜約20%優れた免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、又はそれらの免疫グロブリン融合タンパク質に対する結合親和性を有することができる。任意の特定の理論又は作用機序に拘束されることなく、このような結合は、1又はそれ以上の免疫グロブリンに対する結合親和性を最適化及び/又は向上させるように、1又はそれ以上の官能基を配向又は配置させることができる。
式I〜Vで表される化合物及び表1〜3の化合物などの本発明のペプトイド化合物は、以下の文献の記載を含むがこれらに限定されない既知の技術に従って調製することができる:N.J. Brown, J. Johansson, and A.E. Barron, Acc. Chem. Res. 41, 1409-1417 (2008); N.P. Chongsiriwatana, J.A. Patch, A.M. Czyzewski, M.T. Dohm, A. Ivankin, D. Gidalevitz, R.N. Zuckermann, and A.E. Barron, PNAS 105, 2794-2799 (2008); K.E. Drexler, Peptide Science 96, 537-544 (2011); B.C. Gorske, B.L. Bastian, G.D. Geske, and H.E. Blackwell, J. Am. Chem. Soc. 129, 8928-8929 (2007); T. Hara, S.R. Durell, M.C. Myers, and D.H. Appella, J. Am. Chem. Soc. 128, 1995-2004 (2006); R.D. Haynes, R.J. Meagher, J.-I. Won, F.M. Bogdan, and A.E. Barron, Bioconjugate Chem. 16, 929-938 (2005); K. Kirshenbaum, A.E. Barron, R.A. Goldsmith, P. Armand, E.K. Bradley, K.T.V. Truong, K.A. Dill, F.E. Cohen, and R.N. Zuckermann, PNAS 95, 4303-4308 (1998); Y.-U. Kwon and T. Kodadek, J. Am. Chem. Soc. 129, 1508-1509 (2007); G. Maayan, M.D. Ward, and K. Kirshenbaum, PNAS 106, 13679-13684 (2009); S.M. Miller, R.J. Simon, S. Ng, R.N. Zuckermann, J.M. Kerr, and W.H. Moos, Drug Development Research 35, 20-32 (1995); P. Mora, I. Masip, N. Cortes, R. Marquina, R. Merino, J. Merino, T. Carbonell, I. Mingarro, A. Messeguer, and E. Perez-Paya, J. Med. Chem. 48, 1265-1268 (2005); J.E. Murphy, T. Uno, J.D. Hamer, F.E. Cohen, V. Dwarki, and R.N. Zuckermann, PNAS 95, 1517-1522 (1998); K.T. Nam, S.A. Shelby, P.H. Choi, A.B. Marciel, R. Chen, L. Tan, T.K. Chu, R.A. Mesch, B.-C. Lee, M.D. Connolly, C. Kisielowski, and R.N. Zuckermann, Nature Materials 9, 454-460 (2010); J.T. Nguyen, M. Porter, M. Amoui, W.T. Miller, R.N. Zuckermann, and W.A. Lim, Chem. Biol. 7, 463-473 (2000); P.E. Nielsen, ed., Pseudo-peptides in Drug Discovery, 1st ed. (Wiley-VCH, 2004); S.H. Park and I. Szleifer, J. Phys. Chem. B 115, 10967-10975 (2011); J.A. Patch and A.E. Barron, J. Am. Chem. Soc. 125, 12092-12093 (2003); I. Peretto, R.M. Sanchez-Martin, X. Wang, J. Ellard, S. Mittoo, and M. Bradley, Chem. Commun. 2312-2313 (n.d.); M.C. Pirrung, K. Park, and L.N. Tumey, J. Comb. Chem. 4, 329-344 (2002); M.M. Reddy and T. Kodadek, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 102, 12672-12677 (2005); M.M. Reddy, R. Wilson, J. Wilson, S. Connell, A. Gocke, L. Hynan, D. German, and T. Kodadek, Cell 144, 132-142 (2011); T.J. Sanborn, C.W. Wu, R.N. Zuckermann, and A.E. Barron, Biopolymers 63, 12-20 (2002); T. Schroder, N. Niemeier, S. Afonin, A.S. Ulrich, H.F. Krug, and S. Brase, J. Med. Chem. 51, 376-379 (2008); N.H. Shah, G.L. Butterfoss, K. Nguyen, B. Yoo, R. Bonneau, D.L. Rabenstein, and K. Kirshenbaum, J. Am. Chem. Soc. 130, 16622-16632 (2008); A. Statz, J. Kuang, C. Ren, A. Barron, I. Szleifer, and P. Messersmith, Biointerphases 4, FA22-FA32 (2009); A.R. Statz, J.P. Park, N.P. Chongsiriwatana, A.E. Barron, and P.B. Messersmith, Biofouling 24, 439-448 (2008); P.A. Wender, D.J. Mitchell, K. Pattabiraman, E.T. Pelkey, L. Steinman, and J.B. Rothbard, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 97, 13003-13008 (2000); C.W. Wu, S.L. Seurynck, K.Y.C. Lee, and A.E. Barron, Chem. Biol. 10, 1057-1063 (2003); R.N. Zuckermann, J.M. Kerr, S.B.H. Kent, and W.H. Moos, J. Am. Chem. Soc. 114, 10646-10647 (1992); R.N. Zuckermann, E.J. Martin, D.C. Spellmeyer, G.B. Stauber, K.R. Shoemaker, J.M. Kerr, G.M. Figliozzi, D.A. Goff, and M.A. Siani, J. Med. Chem. 37, 2678-2685 (1994).
いくつかの実施態様において、この抗体又はFc断片(その融合タンパク質を含む)は、血液又は血液画分(例えば、血液血清、血漿)、卵黄及び/又はアルブミン、組織又は細胞増殖培地、組織溶解物又はホモジネートなどのような、生体液中に保持される。
さらに、上記の全ての標的抗体/免疫グロブリンの光親和性標識を、このペプトイドの側鎖残基のいずれかをベンゾフェノン基のような光反応性基で置換することによって行うことができる。
ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の精製のためのペプトイドリガンドの固相合成及び精製
公知の方法(Fara et al. Tet. Lett. 2006 47, 1011-1014; Olivos et al. Org. Lett. 2002, 4(23), 4057-4059)を利用して、マイクロ波補助下でBiotage (R) Alstra自動ペプチド合成装置を用いて、ペプトイドリガンドを調整した。このペプトイドを、システアミン2-クロロトリチル樹脂を含む固相ペプチド合成(SPPS)用のポリスチレン系樹脂上で合成した。合成前に、この樹脂を70℃でDMF中で20分間膨潤させた。N-Fmoc-グリシン及びN-Fmoc-N-メチルグリシンのような保護されたモノマーとして添加された残基を、ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)及びOxymaをカップリング剤として用いて支持体に結合した。各カップリング段階は、75℃で5分間のDMF中で行われ、続いて室温で20%ピペリジンのDMF中でFmoc脱保護された。このペプトイド残基以外の残基を、従来のサブモノマーアプローチを介して加えた。まず、クロロ酢酸をDMF中のDICを用いて40℃で15分間カップリングさせた。次いで、適切な一級アミンを添加して、DMF中の末端塩化物の求核置換を60℃で15分間行った。このペプトイド合成で使用されたアミン及び対応するR基を表1に示す。合成されて試験に使用されたペプトイドの構造を表2, 3及び4に示す。
必要に応じて、保護されたジアミンを使用して、このペプトンイドをその骨格配列の合成後にさらに官能基化した。直交保護基は、ペプトイド合成の条件下でも存続するように選択されたが、合成された樹脂から完成したペプトイド骨格を切断する際に脱保護された。次いで、樹脂からぺプトイドを切断した後、これらのアミンを変換した。第1級アミンからウレイド基への変換は、10当量のカリウムイソシアネートを含む氷酢酸中にぺプトイドを50mg/mLの濃度で溶解し、次いで60℃で2時間インキュベートすることによって行われた。これらのアミンからグアニジニル基への変換は、このリガンドをクロマトグラフィー樹脂に結合させた後に達成された。ウレイド基の付加をLC/MSにより確認した。
ペプトイド親和性リガンドのクロマトグラフィー支持体への結合
ペプトイドをクロマトグラフィー支持体に結合させて、抗体精製のための親和性吸着剤を調製した。このペプトイドを、ペンダントであるエポキシ、ブロモアセチル、トレシル又はブロモヒドリン基で活性化されたセファロース又はアガロースである、トヨパール(R)アミノAF-650-Mのような、クロマトグラフィー樹脂に結合させた。このペプトイドをエタノールに30mg/mLで溶解し、次いでペプトン系リガンド0.02ミリモルを、等量の0.2M K2CO3 (pH10)中に懸濁した活性化樹脂1mLに添加した。この懸濁液を室温で終末端運動で一晩攪拌した。次いで、この樹脂を濾過し、メタノール、0.1Mグリシン(pH2.5)、次いでリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄した。回収した上清及び洗浄画分を280nm又は260nmで分光光度分析して、溶液中のペプトイドの初期量に対する結合度を決定した。次いで、この樹脂を移動させて、0.05%アジ化ナトリウムを含むPBS中で50v/v%スラリーとして保存した。
この樹脂にペプトイドを結合した後、選択されたリガンドの3番目の残基の第1級アミノ基をグアニジニル基に変換した(図1)。この樹脂をpH9の0.2M K2CO3緩衝液に懸濁し、次いで10当量の1H-ピラゾール-1-カルボキサミジン塩酸塩を添加した。この懸濁液を60℃で3時間撹拌した。インキュベーション後、この樹脂をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で順次洗浄し、次に0.05%アジ化ナトリウムを含むPBS中で50v/v%スラリーとして保存した。
ペプトイド親和性樹脂に対するポリクローナルヒトIgGの親和性
ペプトイド−樹脂の組み合わせについての親和性を、ポリクローナルヒトIgGに対する各樹脂の吸着等温線を測定することによって決定した(Pakimna et al., J Applied Sci., 12(11): 1136-1141, 2012)。簡単に記すと、50%樹脂スラリー0.050mLを、96ウェルフィルタープレート(0.45ミクロン、PVDF、Harvard Apparatus)の6個の各ウェルにピペットで入れた。この樹脂を真空マニホールドを用いて2×250μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄した。各ウェルに、異なる濃度(10, 5, 2.5, 1.25, 0.625及び0.3125mg/mL)のヒトポリクローナルIgG溶液0.25mLを添加した。この樹脂/IgG懸濁液を、ロッキングテーブル上で30分間穏やかに攪拌した。次いで、この液体を真空によって回収し、この樹脂をリン酸緩衝生理食塩水(PBS) 0.25mLで洗浄した。次いで、ろ液及び洗浄液を、BCAアッセイによって分析して、この溶液の出発濃度に対する残留IgG濃度を決定した。
次いで、平衡濃度を用いて、各IgG濃度における樹脂の容量(q)を、以下の式を使用して決定した:
q = サンプルの体積×(初期濃度−平衡濃度)/樹脂の体積
qに対する平衡濃度のプロットを作成し、データを双曲線に当てはめて、以下の式に従って、親和定数(Kd)及び最大容量(qmax)を決定した。ここで、Cは溶液中の抗体の平衡濃度である。
q = qmax × C / (Kd + C)
典型的な吸着等温線を図2に示し、Kd及びqmaxデータを表2に示す。
正常ウサギ血清由来IgGに対するペプトイド親和性樹脂の選択性
96ウェルフィルタープレート(PVDF、0.45ミクロンフィルター)中の各ウェルに、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の50%スラリーとして0.025mLの樹脂を分注した。この樹脂を0.25mLのPBS、0.25mLの0.1Mグリシン(pH2.5)、次いで0.25mLのPBSで2回洗浄した。次いで、濾過していないウサギ血清(0.2mL)を、PBSにカプリル酸ナトリウムを50mg/mLで溶解した溶液0.05mLで希釈した。次いで樹脂を洗浄し、0.25mLの希釈血清で処理した。このプレートをプラスチック接着フィルムでシールし、ボルテックスし、30分間揺動させた。血清洗浄液を樹脂からろ過し、次いでこの樹脂を、PBSにカプリル酸ナトリウムを50mg/mLで溶解した溶液0.25mLで3回洗浄した。次に、この抗体を、pH4.0の0.1M酢酸ナトリウム緩衝液0.25mLを用いて、溶出した。次いで、この溶出液の純度を、クマシー色素で染色したポリアクリルアミドゲル電気泳動法(SDS-PAGE)ゲルを還元することによって分析した(図3)。
IgAに対するペプトイド親和性樹脂の選択性
50mgの樹脂18-59及びPV-19-1Bをスピンカラムに添加し、18CV(10mg/mLアジピン酸/0.8M NaCl pH5.8)で平衡化した。樹脂1mlあたり10.0mgのヒトIgAのサンプル負荷量を、CHOコンディショニング培地の存在下で負荷した。非結合タンパク質を18CVの平衡/洗浄緩衝液を用いてカラムから洗浄した。0.1M酢酸ナトリウムを含む18CV(pH4.0)を用いて生成物溶出を行った。
結果を図4A及び4Bに示す。図4Aは、フロースルー及び溶出画分のポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)(還元条件)を示す。図中、「MM」は分子量マーカー、「SL」は サンプル負荷、「FT」はフロースルー画分、「EL」は溶出画分を示す。図4Bは、フロースルー及び溶出画分の酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)の結果を示す。ヒトIgA ELISA定量キットにより、回収した画分中のIgAの量を定量した。IgAの収率は、負荷された全IgAに対する溶出されたIgAの比として計算した。図中、「FT」はフロースルー画分、「EL」は溶出画分を示す。
IgMに対するペプトイド親和性樹脂の選択性
50mgの樹脂18-59及びPV-19-1Bをスピンカラムに添加し、18CV(10mg/mLアジピン酸/0.8M NaCl pH5.8)で平衡化した。樹脂1mlあたり10.0mgのヒトIgMのサンプル負荷量を、CHO細胞コンディショニング培地の存在下で負荷した。非結合タンパク質を18CVの平衡/洗浄緩衝液を用いてカラムから洗浄した。0.1M酢酸ナトリウムを含む18CV(pH4.0)を用いて生成物溶出を行った。
結果を図5A及び5Bに示す。図5Aは、フロースルー及び溶出画分のポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)(還元条件)を示す。図中、「MM」は分子量マーカー、「SL」は サンプル負荷、「FT」はフロースルー画分、「EL」は溶出画分を示す。図5Bは、フロースルー及び溶出画分の酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)の結果を示す。ヒトIgM ELISA定量キットにより、回収した画分中のIgMの量を定量した。IgMの収率は、負荷された全IgMに対する溶出されたIgMの比として計算した。図中、「FT」はフロースルー画分、「EL」は溶出画分を示す。
IgYに対するペプトイド親和性樹脂の選択性
50mgの樹脂18-59及びPV-19-1Bをスピンカラムに添加し、18CV(10mg/mLアジピン酸/0.8M NaCl pH5.8)で平衡化した。樹脂1mlあたり20.0mgのチキンIgYのサンプル負荷量を、CHO無血清培地の存在下で負荷した。非結合タンパク質を18CVの平衡/洗浄緩衝液を用いてカラムから洗浄した。0.1M酢酸ナトリウムを含む18CV(pH4.0)を用いて生成物溶出を行った。
結果を図6A及び6Bに示す。図6Aは、フロースルー及び溶出画分のポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)(還元条件)を示す。図中、「MM」は分子量マーカー、「SL」は サンプル負荷、「FT」はフロースルー画分、「EL」は溶出画分を示す。図6Bは、フロースルー及び溶出画分の酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)の結果を示す。チキンIgY ELISA定量キットにより、回収した画分中のIgYの量を定量した。IgYの収率は、負荷された全IgYに対する溶出されたIgYの比として計算した。図中、「FT」はフロースルー画分、「EL」は溶出画分を示す。
ここに開示された本発明の様々な詳細は、本発明の範囲から逸脱することなく変更され得ることが理解されるであろう。さらに、以上の説明は、単に本発明を例証するためのものであって、本発明の限定を目的とするものではない。
Claims (51)
- ペプトイド骨格を形成する連続して結合したペプトイド残基からなり、該ペプトイド骨格のペプトイド残基の窒素原子に1又はそれ以上の官能基が付加された、ペプトイド化合物を含有するペプトイド親和性リガンドであって、
該1又はそれ以上の官能基が、任意の順序であるが、該ペプトイド骨格上の連続したペプトイド残基に結合し、少なくとも2つの芳香族官能基と塩基性又は酸性の官能基のいずれかとを含み、
該ペプトイド骨格は、該ペプトイド骨格内のペプチド結合のα炭素(C)に結合した少なくとも1つの官能基を含み、
(i)塩基性残基、(ii)芳香族残基、及び(iii)塩基性残基又は親水性残基の官能基を有する3つのペプトイド残基の連続部分を含むペプトイド親和性リガンドはそれらから除外されることを条件として、
該ペプトイド親和性リガンドが、免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、又はそれらの免疫グロブリン融合タンパク質に特異的に結合し、該免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、又はそれらの免疫グロブリン融合タンパク質がIgG、IgA、IgE、IgD、IgM又はIgYのうちの1又はそれ以上である、
ペプトイド親和性リガンド。 - 前記ペプトイド骨格のN末端からC末端へ、及びN末端位置に、(i)塩基性残基、(ii)芳香族残基、及び(iii)塩基性残基又は親水性残基の官能基を有する3つのペプトイド残基の連続部分を含むペプトイド親和性リガンドはそれらから除外されることを条件とする、請求項1に記載のペプトイド親和性リガンド。
- 芳香族官能基がヘテロ芳香族官能基を含む、請求項1又は2に記載のペプトイド親和性リガンド。
- 前記ペプトイド骨格を形成する連続して結合したペプトイド残基が、3〜10個のペプトイド残基、好ましくは3〜8個のペプトイド残基を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載のペプトイド親和性リガンド。
- 前記ペプトイド親和性リガンドが、免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、又はそれらの免疫グロブリン融合タンパク質に対して、約0.05x10−6〜約50x10−6モル、好ましくは約0.5x10−6〜約10x10−6モルの平衡解離定数(Kd)を有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載のペプトイド親和性リガンド。
- 前記ペプトイド親和性リガンドが、結合し、つづいてpH約3〜約7、好ましくはpH約4〜約5において、結合した免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、又はそれらの免疫グロブリン融合タンパク質を放出する、請求項1〜5のいずれか一項に記載のペプトイド親和性リガンド。
- 免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、又はそれらの免疫グロブリン融合タンパク質がIgMを含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載のペプトイド親和性リガンド。
- 前記ペプトイド親和性リガンドが、IgMに対して約0.05×10−6〜約50×10−6モル、好ましくは約0.5×10−6〜約10×10−6モルの平衡解離定数(Kd)を有する、請求項7に記載のペプトイド親和性リガンド。
- 前記免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、又はそれらの免疫グロブリン融合タンパク質が哺乳動物由来である、請求項1〜8のいずれか一項に記載のペプトイド親和性リガンド。
- 前記免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、又はそれらの免疫グロブリン融合タンパク質が鳥類由来である、請求項1〜8のいずれか一項に記載のペプトイド親和性リガンド。
- 前記免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、又はそれらの免疫グロブリン融合タンパク質が軟骨魚類由来である、請求項1〜8のいずれか一項に記載のペプトイド親和性リガンド。
- 前記ペプトイド親和性リガンドが固体支持体に結合している、請求項1〜11のいずれか一項に記載のペプトイド親和性リガンド。
- 前記固体支持体が粒子を含む、請求項12に記載のペプトイド親和性リガンド。
- 前記固体支持体が無機材料を含む、請求項12に記載のペプトイド親和性リガンド。
- 前記固体支持体が有機ポリマー材料を含む、請求項12に記載のペプトイド親和性リガンド。
- 前記固体支持体が膜繊維を含む、請求項12に記載のペプトイド親和性リガンド。
- 前記ペプトイド親和性リガンドが、チオール結合以外の結合、好ましくはアミノ結合によって固前記体支持体に結合している、請求項12〜16のいずれか一項に記載のペプトイド親和性リガンド。
- 前記ペプトイド親和性リガンドが、免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、又はそれらの免疫グロブリン融合タンパク質に対して、チオール結合を有するペプトイド親和性リガンドよりも少なくとも約10%〜約20%優れた結合親和性を有する、請求項1〜17のいずれか一項に記載のペプトイド親和性リガンド。
- 前記ペプトイド骨格が環化されている、請求項1〜18のいずれか一項に記載のペプトイド親和性リガンド。
- 前記官能基が、D−アミノ酸及びβ−アミノ酸を含む非天然アミノ酸官能基を含む、請求項1〜19のいずれか一項に記載のペプトイド親和性リガンド。
- 前記ペプトイド親和性リガンドが複数の精製サイクルに適していて、前記ペプトイド親和性リガンドが、免疫グロブリンに結合するタンパク質ベースのリガンドよりも少なくとも50%以上タンパク質分解に耐性である、請求項1〜20のいずれか一項に記載のペプトイド親和性リガンド。
- 前記ペプトイド骨格が、該ペプトイド骨格内のペプチド結合の1又はそれ以上のα炭素(C)に結合した複数の官能基を含む、請求項1〜21のいずれか一項に記載のペプトイド親和性リガンド。
- ペプトイド骨格を形成する連続して結合したペプトイド残基からなり、該ペプトイド骨格のペプトイド残基の窒素原子に1又はそれ以上の官能基が付加された、ペプトイド化合物を含有するペプトイド親和性リガンドであって、
該1又はそれ以上の官能基が、少なくとも2つの芳香族官能基と少なくとも1つの塩基性又は酸性官能基とを含み、
該ペプトイド骨格は、該ペプトイド骨格内のペプチド結合のα炭素(C)に結合した少なくとも1つの官能基を含み、
該ペプトイド骨格のN末端からC末端へ、(i)塩基性残基、(ii)芳香族残基、及び(iii)塩基性残基又は親水性残基の官能基を有する3つのペプトイド残基の連続部分を含むペプトイド親和性リガンドはそれらから除外されることを条件として、
該ペプトイド親和性リガンドが、免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、又はそれらの免疫グロブリン融合タンパク質に特異的に結合し、該免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、又はそれらの免疫グロブリン融合タンパク質がIgG、IgA、IgE、IgD、IgM又はIgYのうちの1又はそれ以上である、
ペプトイド親和性リガンド。 - 前記ペプトイド骨格のN末端からC末端へ、及びN末端位置に、(i)塩基性残基、(ii)芳香族残基、及び(iii)塩基性残基又は親水性残基の官能基を有する3つのペプトイド残基の連続部分を含むペプトイド親和性リガンドはそれらから除外されることを条件とする、請求項23に記載のペプトイド親和性リガンド。
- 芳香族官能基がヘテロ芳香族官能基を含む、請求項23又は24に記載のペプトイド親和性リガンド。
- 前記ペプトイド骨格を形成する連続して結合したペプトイド残基が、3〜10個のペプトイド残基、好ましくは3〜8個のペプトイド残基を含む、請求項23〜25のいずれか一項に記載のペプトイド親和性リガンド。
- 前記ペプトイド親和性リガンドが、免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、又はそれらの免疫グロブリン融合タンパク質に対して、約0.05x10−6〜約50x10−6モル、好ましくは約0.5x10−6〜約10x10−6モルの平衡解離定数(Kd)を有する、請求項23〜26のいずれか一項に記載のペプトイド親和性リガンド。
- 前記ペプトイド親和性リガンドが、結合し、つづいてpH約3〜約7、好ましくはpH約4〜約5において、結合した免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、又はそれらの免疫グロブリン融合タンパク質を放出する、請求項23〜27のいずれか一項に記載のペプトイド親和性リガンド。
- 免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、又はそれらの免疫グロブリン融合タンパク質がIgMを含む、請求項23〜28のいずれか一項に記載のペプトイド親和性リガンド。
- 前記ペプトイド親和性リガンドが、IgMに対して約0.05×10−6〜約50×10−6モル、好ましくは約0.5×10−6〜約10×10−6モルの平衡解離定数(Kd)を有する、請求項23に記載のペプトイド親和性リガンド。
- 前記免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、又はそれらの免疫グロブリン融合タンパク質が哺乳動物由来である、請求項23〜30のいずれか一項に記載のペプトイド親和性リガンド。
- 前記免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、又はそれらの免疫グロブリン融合タンパク質が鳥類由来である、請求項23〜30のいずれか一項に記載のペプトイド親和性リガンド。
- 前記免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、又はそれらの免疫グロブリン融合タンパク質が軟骨魚類由来である、請求項23〜30のいずれか一項に記載のペプトイド親和性リガンド。
- 前記ペプトイド親和性リガンドが固体支持体に結合している、請求項23〜332のいずれか一項に記載のペプトイド親和性リガンド。
- 前記固体支持体が粒子を含む、請求項34に記載のペプトイド親和性リガンド。
- 前記固体支持体が無機材料を含む、請求項34に記載のペプトイド親和性リガンド。
- 前記固体支持体が有機ポリマー材料を含む、請求項34に記載のペプトイド親和性リガンド。
- 前記固体支持体が膜繊維を含む、請求項34に記載のペプトイド親和性リガンド。
- 前記ペプトイド親和性リガンドが、チオール結合以外の結合、好ましくはアミノ結合によって固前記体支持体に結合している、請求項34〜38のいずれか一項に記載のペプトイド親和性リガンド。
- 前記ペプトイド親和性リガンドが、免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、又はそれらの免疫グロブリン融合タンパク質に対して、チオール結合を有するペプトイド親和性リガンドよりも少なくとも約10%〜約20%優れた結合親和性を有する、請求項23〜39のいずれか一項に記載のペプトイド親和性リガンド。
- 前記ペプトイド骨格が環化されている、請求項23〜40のいずれか一項に記載のペプトイド親和性リガンド。
- 前記官能基が、D−アミノ酸及びβ−アミノ酸を含む非天然アミノ酸官能基を含む、請求項23〜41のいずれか一項に記載のペプトイド親和性リガンド。
- 前記ペプトイド親和性リガンドが複数の精製サイクルに適していて、前記ペプトイド親和性リガンドが、免疫グロブリンに結合するタンパク質ベースのリガンドよりも少なくとも50%以上タンパク質分解に耐性である、請求項23〜42のいずれか一項に記載のペプトイド親和性リガンド。
- 前記ペプトイド骨格が、該ペプトイド骨格内のペプチド結合の1又はそれ以上のα炭素(C)に結合した複数の官能基を含む、請求項23に記載のペプトイド親和性リガンド。
- 免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、又はそれらの免疫グロブリン融合タンパク質を含有する液体組成物から、免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、又はそれらの免疫グロブリン融合に結合するための方法であって、
(a)請求項1〜44のいずれか一項に記載のペプトイド親和性リガンドを含む固体支持体を提供する段階、
(b)該免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、又はそれらの免疫グロブリン融合タンパク質が、該固体支持体のペプトイド親和性リガンドに結合するように、該組成物を該固体支持体に接触させる段階、
(c)該固体支持体のペプトイド親和性リガンドに結合した免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、又はそれらの免疫グロブリン融合タンパク質を有する該液体組成物を、該固体支持体から分離する段階、及び
(d)該固体支持体のペプトイド親和性リガンドから、免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、又はそれらの免疫グロブリン融合タンパク質を分離する段階、を含む方法。 - 前記ペプトイド親和性リガンドから、免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、又はそれらの免疫グロブリン融合タンパク質を分離する段階が、pH約3〜約7、好ましくはpH約4〜約5で行われる、請求項45に記載の方法。
- 前記液体組成物が、更に、少なくとも1つのタンパク質分解酵素を含む、請求項45又は46に記載の方法。
- 前記液体組成物が生物学的液体を含む、請求項45〜47のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生物学的液体が、血液、血液血清、血漿、組織又は細胞培養培地、細胞溶解物、植物抽出物、又は組換え生物によって生成及び/又は分泌された液体を含む、請求項48に記載の方法。
- 前記接触させる段階及び分離する段階が、連続式又はバッチ式で行われる、請求項45〜49のいずれか一項に記載の方法。
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