JP2019501111A - キノリンアミドおよびその使用法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、35 U.S.C. § 119(e)の下で2015年10月28日提出の米国特許仮出願第62/247,572号に対する優先権を主張し、その開示は全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本発明は、国立衛生研究所により授与されたGM094693の下、政府支援により行った。政府は本発明において一定の権利を有する。
バイオポリマーは、特定の構造にフォールディングすることを可能にする、前駆体の特定の配列の存在によって人工ポリマーから区別される。前駆体の極めて少ないセット(DNA/RNAでは4つ、およびタンパク質では20)が幅広いフォールディングを生み出し、生命に必須の機能を生み出す。これに対して、合成ポリマーは本質的に無制限の一連の前駆体変種が利用できる;しかしながら、配列制御の欠如および独特の立体配座の結果、機能の幅は生物学によってせばめられる。
式中、R1の各存在は-OH、-O(C1-C6)アルキル、-O(C1-C6)ハロアルキル、-O(C1-C6)ヘテロアルキル、-O(CH2)mC(=O)OR5、-OC(=O)R5、-NH2、-SH、-SO3Hおよび-PO(OH)2からなる群より独立して選択され;R2は-(C1-C6)アルキル、-(C1-C6)ヘテロアルキル、-OR5、-(C3-C10)ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され、ここでアルキル、ヘテレオアルキル、ヘテロシクリル、アリールまたはヘテロアリール基は置換されていてもよく;R3およびR4はH、-(C=O)0-1(C1-C6)アルキル、-(C=O)0-1(C3-C8)シクロアルキル、-(C=O)0-1(C1-C6)ヘテロアルキル、-(C=O)0-1アリール、および-(C=O)0-1ヘテロアリールからなる群より独立して選択され、ここでアルキル、シクロアルキル、アリールもしくはヘテロアリール基は置換されていてもよく;またはR3およびR4は、R3およびR4が連結している窒素と一緒に-(C3-C10)ヘテロシクリルもしくは-NO2を形成し;R5の各存在はH、-(C1-C6)アルキル、-(C1-C6)ヘテロアルキル、-(C3-C8)シクロアルキル、-(C4-C10)ヘテロシクリル、アリール、および-(C5-C10)ヘテロアリールからなる群より独立して選択され、ここでアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリール基は置換されていてもよく;mの各存在は独立して1〜5の範囲の整数であり;kは1〜5の範囲の整数であり;かつ式(I)の化合物は生理的pHで正味の負電荷を有する。一定の態様において、化合物は式(II)の化合物、またはその塩、溶媒和物、もしくはN-オキシド、およびそれらの任意の組み合わせである:
式中、R1の各存在は-OH、-O(C1-C6)アルキル、-O(C1-C6)ハロアルキル、-O(C1-C6)ヘテロアルキル、-O(CH2)mC(=O)OR5、-OC(=O)R5、-NH2、-SH、-SO3Hおよび-PO(OH)2からなる群より独立して選択され;(i)R2は-X1-LINKER-CARGOであるか、または(ii)R3は-X2-LINKER-CARGOであり;X1は結合、-NH-、-O-または-S-であり;X2は-C(=O)-または-C(=S)-であり;LINKERは-(CH2)n-、-(CH2CH2O)n-および-(AA)n-からなる群を含み、ここでnの各存在は独立して1〜10の範囲の整数であり、かつAAの各存在は独立して天然アミノ酸であり、さらに-X-LINKERはジスルフィド結合をさらに含んでもよく;かつCARGOはオリゴヌクレオチド、オリゴデオキシヌクレオチド、小分子およびポリペプチドから選択される分子であり;R2が-X1-LINKER-CARGOである場合、R3およびR4はH、-(C=O)0-1(C1-C6)アルキル、-(C=O)0-1(C3-C8)シクロアルキル、-(C=O)0-1(C1-C6)ヘテロアルキル、-(C=O)0-1アリール、および-(C=O)0-1ヘテロアリールからなる群より独立して選択され、ここでアルキル、シクロアルキル、アリールもしくはヘテロアリール基は置換されていてもよく;またはR3およびR4は、R3およびR4が連結している窒素と一緒に-(C3-C10)ヘテロシクリルもしくは-NO2を形成し;ならびにR3が-X2-LINKER-CARGOである場合、R2は-(C1-C6)アルキル、-(C1-C6)ヘテロアルキル、-OR5、-(C3-C10)ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールからなる群より選択され、ここでアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクリル、アリールまたはヘテロアリール基は置換されていてもよく;かつR4はHであり;R5の各存在はH、-(C1-C6)アルキル、-(C1-C6)ヘテロアルキル、-(C3-C8)シクロアルキル、-(C4-C10)ヘテロシクリル、アリール、および-(C5-C10)ヘテロアリールからなる群より独立して選択され、ここでアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリール基は置換されていてもよく;mの各存在は独立して1〜5の範囲の整数であり;kは1〜5の範囲の整数であり;かつ式(II)の化合物は生理的pHで正味の負電荷を有する。
本発明は、哺乳動物において膵島アミロイドポリペプチド(IAPP)に結合し、IAPPの(毒性)アミロイド状態の形成を防止する、新規キノリンフォルダマーの予想外の発見に一部関する。一定の態様において、本発明の化合物を用いて、ヒトなどの哺乳動物におけるI型および/またはII型糖尿病を処置または予防することができる。他の態様において、本発明の化合物を用いて、ミスフォールディングしたおよび/または構造不定のタンパク質に基づく神経変性疾患を処置することができる。本発明の範囲内で企図される例示的タンパク質には、α-シヌクレイン(パーキンソン病)、タウ(アルツハイマー病)および/またはAβ(アルツハイマー病)が含まれる。
特に記載がないかぎり、本明細書において用いられるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の技術者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または等価の任意の方法および材料を、本発明の実施または試験において使用し得るが、具体的な方法および材料を記載する。
本発明は、哺乳動物において膵島アミロイドポリペプチド(IAPP)に結合し、IAPPの(毒性)アミロイド状態の形成を防止する、キノリンフォルダマーなどの新規化合物の予想外の発見に一部関する。本発明は、それを必要としている哺乳動物に本発明のキノリンフォルダマーの治療的有効量を投与することにより、糖尿病を処置または予防する方法にも関する。本発明は、α-シヌクレイン(パーキンソン病)、タウ(アルツハイマー病)および/またはAβ(アルツハイマー病)などの、ミスフォールディングしたおよび/または構造不定のタンパク質に基づく神経変性疾患を処置または予防する方法にも関する。
本発明の化合物は、有機合成の技術分野において周知の技術を用いて合成してもよい。合成に必要な出発原料および中間体は、商業的供給元から得てもよく、または当業者には公知の方法に従って合成してもよい。
式中、R1の各存在は-OH、-O(C1-C6)アルキル、-O(C1-C6)ハロアルキル、-O(C1-C6)ヘテロアルキル、-O(CH2)mC(=O)OR5、-OC(=O)R5、-NH2、-SH、-SO3Hおよび-PO(OH)2からなる群より独立して選択され;
R2は-(C1-C6)アルキル、-(C1-C6)ヘテロアルキル、-OR5、-(C3-C10)ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され、ここでアルキル、ヘテレオアルキル、ヘテロシクリル、アリールまたはヘテロアリール基は置換されていてもよく;
R3およびR4はH、-(C=O)0-1(C1-C6)アルキル、-(C=O)0-1(C3-C8)シクロアルキル、-(C=O)0-1(C1-C6)ヘテロアルキル、-(C=O)0-1アリール、および-(C=O)0-1ヘテロアリールからなる群より独立して選択され、ここでアルキル、シクロアルキル、アリールもしくはヘテロアリール基は置換されていてもよく;またはR3およびR4は、R3およびR4が連結している窒素と一緒に-(C3-C10)ヘテロシクリルもしくは-NO2を形成し;
R5の各存在はH、-(C1-C6)アルキル、-(C1-C6)ヘテロアルキル、-(C3-C8)シクロアルキル、-(C4-C10)ヘテロシクリル、アリール、および-(C5-C10)ヘテロアリールからなる群より独立して選択され、ここでアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリール基は置換されていてもよく;
mの各存在は独立して1〜5の範囲の整数であり;
kは1〜5の範囲の整数であり;
式(I)の化合物は生理的pHで正味の負電荷を有する。
式中、R1の各存在は-OH、-O(C1-C6)アルキル、-O(C1-C6)ハロアルキル、-O(C1-C6)ヘテロアルキル、-O(CH2)mC(=O)OR5、-OC(=O)R5、-NH2、-SH、-SO3Hおよび-PO(OH)2からなる群より独立して選択され;
(i)R2は-X1-LINKER-CARGOであるか、または(ii)R3は-X2-LINKER-CARGOであり;
X1は結合、-NH-、-O-または-S-であり;
X2は-C(=O)-または-C(=S)-であり;
LINKERは-(CH2)n-、-(CH2CH2O)n-および-(AA)n-からなる群を含み、ここでnの各存在は独立して1〜10の範囲の整数であり、かつAAの各存在は独立してアミノ酸であり、さらに-X-LINKERはジスルフィド結合をさらに含んでもよく;かつ
CARGOはオリゴヌクレオチド、オリゴデオキシヌクレオチド、小分子およびポリペプチドから選択される分子であり;
R2が-X1-LINKER-CARGOである場合、R3およびR4はH、-(C=O)0-1(C1-C6)アルキル、-(C=O)0-1(C3-C8)シクロアルキル、-(C=O)0-1(C1-C6)ヘテロアルキル、-(C=O)0-1アリール、および-(C=O)0-1ヘテロアリールからなる群より独立して選択され、ここでアルキル、シクロアルキル、アリールもしくはヘテロアリール基は置換されていてもよく;またはR3およびR4は、R3およびR4が連結している窒素と一緒に-(C3-C10)ヘテロシクリルもしくは-NO2を形成し;ならびに
R3が-X2-LINKER-CARGOである場合、R2は-(C1-C6)アルキル、-(C1-C6)ヘテロアルキル、-OR5、-(C3-C10)ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールからなる群より選択され、ここでアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクリル、アリールまたはヘテロアリール基は置換されていてもよく;かつR4はHであり;
R5の各存在はH、-(C1-C6)アルキル、-(C1-C6)ヘテロアルキル、-(C3-C8)シクロアルキル、-(C4-C10)ヘテロシクリル、アリール、および-(C5-C10)ヘテロアリールからなる群より独立して選択され、ここでアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリール基は置換されていてもよく;
mの各存在は独立して1〜5の範囲の整数であり;
kは1〜5の範囲の整数であり;かつ
CARGOが無い場合の式(II)の化合物は生理的pHで正味の負電荷を有する。
本発明の化合物を、当業者には公知の合成法を用い、本明細書に記載の一般スキームによって調製してもよい。
本発明は、少なくとも1種の本発明の化合物を含む薬学的組成物を含む。一定の態様において、組成物は、糖尿病を処置または予防する少なくとも1種の追加の治療剤をさらに含む。
本発明は、それを必要としている対象において糖尿病を処置または予防する方法を含む。本発明は、パーキンソン病および/またはアルツハイマー病などの、ミスフォールディングしたおよび/または構造不定のタンパク質に基づく神経変性疾患を処置または予防する方法をさらに含む。
本発明の方法の範囲内で有用な化合物を、糖尿病を処置するために有用な1つまたは複数の追加の治療剤との組み合わせで用いてもよい。これらの追加の治療剤は、市販の化合物または当業者には合成的に入手可能な化合物を含んでもよい。これらの追加の治療剤は、糖尿病の症状を処置、予防、または低減するために公知である。
投与レジメンは、有効量を構成するものに影響をおよぼし得る。治療用製剤を、疾患または障害の発症前または発症後のいずれかに対象に投与してもよい。さらに、いくつかの分割投薬量ならびに時差(staggered)投薬量を毎日もしくは逐次投与してもよく、または用量を持続的に注入してもよいしもしくはボーラス注射であってもよい。さらに、治療用製剤の投薬量は治療的または予防的状況の緊急性によって指示されるように比例的に増加または減少させてもよい。
経口適用のために、特に適しているのは、錠剤、糖衣錠、液剤、滴剤、坐剤、またはカプセル剤、カプレットおよびジェルキャップである。経口使用が意図される組成物を、当技術分野において公知の任意の方法に従って調製してもよく、そのような組成物は、錠剤の製造に適した不活性非毒性薬学的賦形剤からなる群より選択される1つまたは複数の作用物質を含んでもよい。そのような賦形剤には、例えば、ラクトースなどの希釈剤;コーンスターチなどの造粒および崩壊剤;デンプンなどの結合剤;ならびにステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤が含まれる。錠剤はコーティングしていなくてもよく、またはエレガンスのため、もしくは活性成分の放出を遅延させるために、公知の技術によってコーティングしてもよい。経口使用のための製剤は、活性成分が不活性希釈剤と混合されている、ゼラチン硬カプセルとして提供してもよい。
非経口投与のために、本発明の化合物を注射または注入用に、例えば、静脈内、筋肉内もしくは皮下注射もしくは注入用に、またはボーラス用量での投与および/もしくは持続注入用に製剤化してもよい。任意に懸濁化剤、安定化剤および/または分散剤などの他の製剤用作用物質を含む、油性または水性媒体中の懸濁剤、液剤または乳剤を用いてもよい。
本発明の追加の剤形には、米国特許第6,340,475号;第6,488,962号;第6,451,808号;第5,972,389号;第5,582,837号;および第5,007,790号に記載の剤形が含まれる。本発明の追加の剤形には、米国特許出願第20030147952号;第20030104062号;第20030104053号;第20030044466号;第20030039688号;および第20020051820号に記載の剤形も含まれる。本発明の追加の剤形には、PCT出願国際公開公報第03/35041号;国際公開公報第03/35040号;国際公開公報第03/35029号;国際公開公報第03/35177号;国際公開公報第03/35039号;国際公開公報第02/96404号;国際公開公報第02/32416号;国際公開公報第01/97783号;国際公開公報第01/56544号;国際公開公報第01/32217号;国際公開公報第98/55107号;国際公開公報第98/11879号;国際公開公報第97/47285号;国際公開公報第93/18755号;および国際公開公報第90/11757号に記載の剤形も含まれる。
一定の態様において、本発明の製剤は、短期放出製剤、急速オフセット(rapid-offset)製剤、ならびに制御放出製剤、例えば、持続放出製剤、遅延放出製剤およびパルス放出製剤であってもよいが、それらに限定されない。
本発明の化合物の治療的有効量または用量は、患者の年齢、性別および体重、患者の現在の医学的状態、ならびに処置中の患者の疾患または障害の進行に依存する。当業者であれば、これらおよび他の因子に応じて適切な投薬量を決定することができる。
材料
チオフラビンT(ThT)はAcros Organics(Fair Lawn、NJ)から、脂質[ジオレオイルホスファチジルグリセロール(DOPG)およびジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)]はAvanti Polar Lipids, Inc.(Alabaster、AL)から、96穴プレート(黒、w/平底)はGreiner Bio-One(Monroe、NC、USA)から、シリカプレート(w/UV254、裏面アルミニウム、200ミクロン)およびシリカゲル(標準等級、粒径40〜63ミクロン、230×400メッシュ)はSorbent Technologies(Atlanta、GA、USA)から、無水溶媒はSigma Aldrich(St. Louis、MI)またはVWR(Bridgeport、NJ、USA)から、2,6-ジクロロ-3-ニトロピリジン、ヨウ化アルキル、トリエチルアミン(無水)、ヨウ化2-クロロ-1-メチルピリジニウム、ブロモ酢酸tert-ブチル、トリフルオロ酢酸(TFA)、およびトリエチルシラン(TES)はSigma Aldrich(St. Louis、MI、USA)から、ならびに膵島アミロイドポリペプチド(IAPP)はGenscript(Piscataway、NJ、USA)およびElim Biopharmaceuticals(Hayward、CA、USA)から購入した。IAPPは再精製し、組織内で以下のとおりに処理した:IAPP(約2mg)を7M塩酸グアニジニウム中で可溶化した。溶液をろ過(0.2ミクロン)し、C-18スピンカラムに移し、水で2回(各400μL)と、続いて10%アセトニトリル/水、0.1%ギ酸(v/v)で洗浄し、次いで200μLの50%アセトニトリル/水、0.1%ギ酸(v/v)中に溶出した。IAPPの濃度を280nm(ε=1400M-1.cm-1)で計算した。IAPP溶液をいくつかの一定量(20〜50μL、1〜2mM)に分割し、凍結乾燥し、白色固体として-80℃で保存した。各実験のために、凍結乾燥した一定量からIAPPの新鮮保存溶液を水中で調製した。Alexa-594標識IAPPを調製した(Magzoub, et al., FASEB J. 2012, 26, 1228-1238)。
特に記載がないかぎり、この作業で用いたLUVはDOPG/DOPCの1:1混合物から調製した。凍結乾燥混合物を100mM KCl、50mMリン酸ナトリウム、およびpH7.4中で20分間水和した。緩衝液中の脂質の20mg/mL溶液を、ポリカーボネート膜(細孔径=100nm)を21回通過させた。最終材料のリン脂質含有量を、全リンアッセイを用いて計算した(Chen, et al., Anal. Chem. 1956, 28, 1756-1758)。
アミロイド反応を、黒色96穴プレート中、リポソーム(630μM脂質)および20μM ThTを含む緩衝液中で実施した。この後、DMSOに溶解した小分子(最終DMSO濃度=0.5%(v/v))を加えた。線維形成を、IAPP保存溶液の添加により開始した。各ウェルの最終量は200μLであった。細線維化の動力学を、FluoDia T70蛍光プレート(Photon Technology International、Edison、NJ、USA)を用いてThT蛍光(Ex 450nmおよびEm 485nm)によりモニターした。データは、ブランクを差し引き、IAPPだけを含む反応の最大強度に対して再規格化した。各動力学トレースをシグモイド式にフィッティングした:
式中、Iは蛍光強度であり、tは時間であり、かつb、m、およびτは従属フィッティング変数である。すべての試料を少なくとも三つ組で実行し、文中に示す誤差バーは±1の標準偏差を表す。
10μM IAPPを630μM LUVを含む緩衝液(100mM KCl、50mMリン酸ナトリウム、pH7.4)中、IAPP:小分子=1:1の存在下および非存在下でインキュベートした。一定量を、グロー放電(25mAおよび30秒)し、カーボンコーティングした300メッシュ銅格子上で60秒間インキュベートした。乾燥後、格子を酢酸ウラン(2%、w/v)で60秒間ネガティブ染色した。顕微鏡写真をPhillips Tecnai 12透過電子顕微鏡(Hillsboro、Oregon、USA)により120kV加速電圧で撮影した。この作業における画像から得たすべての結論は、画像を調製および分析した研究者に試料同一性を知らせなかった、少なくとも1回の繰り返しを含む。
ITC実験をNANO-ITC(TA instruments、New Castle、DE、USA)で実施した。小分子の溶液(1mM KCl、20mM Tris、pH7.4中100μM)を、10μM IAPP(1mM KCl、20mM Tris、pH7.4中250μL)を含む等温試料セル中に300rpmの撹拌速度で逐次滴定(ロータリーシリンジにより50μL注入)した。10秒注入を240秒間隔で分配した。各注入(オリゴキノリン:IAPP)に関連する熱を、NanoAnalyzeソフトウェア(New Castle、DE、USA)を用いて、それぞれの曲線下面積を積分することにより導き出した。IAPPに結合している小分子の熱を、緩衝液中へのオリゴキノリン注入の熱を差し引くことにより補正した。最終の補正した熱をモル比(オリゴキノリン:IAPP)の関数としてプロットし、one binding siteモデルによりフィッティングした。
100mM KClおよび50mMリン酸ナトリウム、pH7.4中、1200μM LUVと混合した25μM IAPPについて、CDスペクトルをAVIV MODEL 215(AVIV Instruments, Inc. Lakewood、NJ、USA)で収集した。データを、10秒の平均時間で平均4回くり返し、0.5nm間隔で200〜260nmから収集した。オリゴキノリン存在下でのCDスペクトルを、1:1(オリゴキノリン:IAPP)の化学量論比で200〜500nmから収集した以外は、前述のとおりに記録した。
小分子精製の最終段階を、VYDAC逆相カラム(4.6×100mm、1mL/分、分析用;10×100mm、3mL/分、半調製用)を備えたVarian ProStarを用いてHPLCにより実施した。移動相はA:5%ACN、95%H2O、0.1%TFA(v/v)ならびにB:95%ACN、5%H2O、および0.08%TFA(v/v)からなった。小分子の溶液NMRスペクトルを400、500、および600MHz Agilent分光計で記録した。O-tertブチルエステル保護および脱保護(O-COOH)オリゴキノリンのために用いた重水素化溶媒は、それぞれCDCl3および(CD3)2SOであった。解釈が難しい分裂パターンを多重線(m)または広幅(b)と示す。質量スペクトルを、MALDI-TOF Voyager DE Pro(Yale University、CBIC center)またはUniversity of Illinois Mass Spec. Facilityのいずれかを用いて得た。高分解能エレクトロスプレーイオン化質量スペクトルを、Waters Synapt G2-Si ESI MS質量分析計(Milford、MA、USA)を用いて得た。
FCS測定を、以前にMiddleton, et al., Effects of Curvature and Composition on α-Synuclein Binding to Lipid Vesicles (Biophys. J. 2010, 99, 2279-2288)に記載された通りに、Olympus IX71顕微鏡(Olmpus、東京、日本)を用いて倒立顕微鏡の周りに基礎を置く研究室で作製した装置で行った。簡単に言うと、連続発光488nmダイオードポンプ式固体50mWレーザーを5〜20mWの出力電力に設定し、顕微鏡に入る直前にニュートラルデンシティフィルターで18μWの電力にさらに調節した。蛍光を対物レンズを通して収集し、Z488rdcロングパスダイクロイックおよびHQ600/200mバンドパスフィルター(Chroma、Bellows Falls、VT、USA)を用いて励起レーザーから分離した。蛍光を、アバランシェフォトダイオード(Perkin Elmer、Waltham、MA、USA)に連結した50μm光ファイバーの開口上に集中させた。デジタル相関器(Flex03LQ-12;Correlator.com、Bridgewater、NJ、USA)を用いて、自己相関曲線を生成した。
式中、rは拡散時間τd,1で急速拡散する成分の割合であり、一方τd,2は遅延成分の拡散時間である。構造因子、sは、遊離Alexa Fluor 488ヒドラジド色素の溶液の自由パラメーターとして決定し、次いで続くすべてのフィッティングのために、0.17の実験的に決定した値に固定した。IAPP存在下での実験のために、ADM-116の拡散係数、三重項拡散時間、および振幅のあらかじめ決定した値を固定することにより、網羅的解析を実施した。IAPP結合および非結合ADM-116の三重項状態は同じと考えた。
画像を、20000〜25000細胞/ウェルで播種した8ウェルNUNCチャンバー(Thermo Scientific、Rochester、NY、USA)中で得た。48時間培養した後、培地を実施する実験に従った成分を含む培地で置き換えた。IAPPの時間依存的局在化実験のために、培地は100nM IAPP594、13μM非標識ペプチドを含み、指定の時点インキュベートした。ADM-116FおよびADM-3F存在下での実験のために、さらなるフルオレセイン標識および非標識小分子、それぞれ200nMおよび13μMを培地中に導入した。小分子の遅延添加実験のために、培地を二回除去し、小分子を含む培地で置き換えた。48時間の全インキュベーション時間の後、画像を取得した。撮像をYale Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology撮像施設で、Zeiss LSM 510共焦点顕微鏡により、DIC能力を有する×63 Plan-Apo/1.4-NA油浸対物レンズ(Carl Zeiss、Oberkochen、Germany)を用いて実施した。標識IAPPの取り込みに対して報告するすべての実験について、レッドチャンネルのゲイン設定は試料どうし一定に維持した。画像取得および処理はZeiss Efficient Navigation(ZEN)およびImage Jソフトウェアを用いて達成した。
次いで、INS-1成長培地を、100nM IAPP594を含む培地で置き換え、18時間インキュベートした。次いで、培地を200nM ADM-116Fを含む培地で二回置き換えた。5時間のインキュベーション後、画像を撮った。バックグラウンドFRETを、100nM IAPP594を最初にさらなる13μMの非標識IAPP存在下のセル中で18時間インキュベートする並行実験を用いて決定した。次いで、培地を200nM ADM-116Fを含む培地で置き換えた。撮像を、Zeiss LSM 510共焦点顕微鏡により、DIC能力を有する×100 Plan-Apo/1.4-NA油浸対物レンズ(Carl Zeiss、Oberkochen、Germany)を用いて実施した。ADM-116Fのために、フルオレセインを488nm Argon2レーザーで励起し、505〜550nm発光フィルターを通して検出した。IAPP594を561 Argon2レーザーで励起し、590〜630nm発光フィルターを通して検出した。すべての実験のために、ピンホールを各フィルターチャンネルのZ-スリック厚に対して一定に維持した。単細胞画像を供与体単独、受容体単独、および供与体-受容体融合チャンネルについて取得した。画像取得および処理はZeiss Efficient Navigation(ZEN)およびImage Jソフトウェアを用いて達成した。Image Jプラグイン、RiFRETを用いて、各チャンネルについてブリードスルーを計算して除去し、ピクセルでのFRET効率を計算した。次いで、FRET距離を下記を用いて計算した:
式中、EはFRETエネルギー移動の効率計算値であり、R0はフェルスター距離(フルオレセイン-Alexa594対では60Å)であり、rは供与体と受容体との間の距離である。
ラットインスリノーマINS-1細胞(832/13、Dr. Gary W. Cline、Department of Internal Medicine、Yale University)を、10%ウシ胎仔血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(Life Technologies、Carlsbad、CA、USA)、および2%INS-1保存溶液(500mM HEPES、100mM L-グルタミン、100mMピルビン酸ナトリウム、および2.5mMβ-メルカプトエタノール)を補足した、フェノールレッドを含まないRPMI 1640培地中、37℃および5%CO2で培養した。細胞を約95%コンフルエンスに達した後に継代し(0.25%トリプシン-EDTA、Life Technologies)、増殖させ、および/または実験で用いた。実験で用いる細胞をペレット化し、トリプシン-EDTAを含まない新鮮培地中に再懸濁した。
GPMVをINS-1細胞から単離した(Schlamadinger et al., Biophys. J. 2014, 107, 2559-2566, Kendhale et al., J. Org. Chem. 2011, 76, 195-200)。簡単に言うと、細胞を35mmの皿に播種し、48時間培養した。細胞を10mM HEPES、150mM NaCl、2mM CaCl2(pH=7.4)で2回洗浄し、次いで10mM N-エチルマレイミド(NEM、Sigma Aldrich、St. Louis、MI、USA)に2時間曝露した。次いで、回収した試料を、孔径400-HRのサイズ排除Sephacrylマトリックス(Sigma Aldrich、St. Louis、MI、USA)を含む重力流動カラムを通過させて、残存細胞デブリからGPMVを精製した。
画像を、250μlのGMPV保存溶液を含む8ウェルNUNCチャンバー(Thermo Scientific、Rochester、NY、USA)中で得た。ADM-116FまたはADM-3F存在下での実験のために、200nMの小分子をGMPV溶液中、室温で24時間インキュベートした。撮像を、Yale Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology撮像施設で、Zeiss LSM 510共焦点顕微鏡により、DIC能力を有する×63 Plan-Apo/1.4-NA油浸対物レンズ(Carl Zeiss、Oberkochen、Germany)を用いて実施した。すべての実験について、グリーンチャンネルのゲイン設定は試料どうし一定に維持した。画像取得および処理はZeiss Efficient Navigation(ZEN)およびImage Jソフトウェアを用いて達成した。
細胞生存度を、Cell-Titer Blue(CTB、Promega、Madison、WI、USA)フルオレセインベースのアッセイを用いて比色法により測定した。細胞を96穴プレート(BD Biosciences、San Diego、CA)中、5000細胞/ウェルの密度で播種した。48時間の培養後、各ウェルにペプチドを直接導入し、次いでさらに48時間インキュベートした。時間依存的実験のために、細胞をペプチドと共に指定の時点インキュベートした。インキュベーション期間の後、20μL CTB試薬を各ウェルに加え、37℃および5%CO2で2.5〜3.5時間インキュベートした。レゾルフィン生成物の蛍光をFluoDia T70蛍光プレートリーダー(Photon Technology International、Birmingham、NJ、USA)で測定した。試料ウェルに加えたペプチドの異なる濃度を明らかにするために、すべてのウェルは同じ量の水を含んだ。水媒体を含むが、ペプチドを含まないウェルを陰性対照(毒性0%)とし、10%DMSOを含むウェルを陽性対照(毒性100%)とした。毒性パーセントを以下の式を用いて計算した。
INS-1細胞を、N-末端をAlexa-594で標識した100nM IAPP(IAPPA594)と共にインキュベートした。0μMまたは13μMの非標識IAPPの同時添加は、それぞれ非毒性および毒性状態に対応する。5時間の時点で、非毒性条件下では、IAPPは有意に内部移行しなかった(図2)。12時間までに、細胞内IAPPは容易に観察され、最大の内部移行は24時間で明白であった(図2)。この非毒性条件下のすべての時点で、IAPPは、おそらくはこれらの条件下でのエネルギー依存的細胞取込の結果、散在性の点として現れた。毒性条件下では、IAPP取り込みのわずかな上昇が5時間までに見られた。12時間までに、毒性条件で対照的な挙動が明らかに見られ、外部および内部移行した点ならびにより大きい集合体が示された。24時間までに、細胞外IAPPは全IAPPのごく一部であった。48時間の時点で、大きい細胞内凝集体が現れ、72時間まで強度は上がり続けた。この進行は、凝集が細胞内環境によって媒介されることを示唆し、培養液および細胞膜がアミロイド形成に対して阻害的であることを示す研究と一致している。
膜結合IAPPの標的化、いくつかの溶液ベースの機能獲得の阻害、および細胞毒性救出の間には直接の相関がある。いかなる理論にも限定されることを望むものではないが、細胞内IAPPを標的とする化合物は、IAPP自己集合の膜活性阻害剤の中から見出されやすいであろう。溶液中で、10μM IAPPの線維への集合は18±1.4時間の反応中間点t50で起こった(図9)。大きい単層リポソーム(LUV)の存在下で行った同じ反応は、1.1±0.1時間のt50まで加速された(図3A)。後者を、小分子を二層の状況での活性について評価し得る、参照条件とする。
ADM-116の溶液活性および細胞活性は、IAPPとの別個の複合体の形成により可能になった。非標識IAPPを25nMフルオレセイン標識ADM-116(ADM-116F)の溶液中に滴定し、ペプチド非存在下および存在下での小分子の拡散時間を蛍光相関分光法(FCS)によりモニターした。ADM-116F単独では130±13μsのτDを示す(図5a)。IAPPによる滴定後、拡散時間τD=約400μsの第二の成分が明らかであった。滴定の間の拡散時間の一貫性は、別個の複合体を示す。結合ADM-116Fと非結合ADM-116Fとの振幅比をフィッティングすることにより、240±60nMのKdを得た。蛍光標識したIAPP単独のτDは230±4μsであった。すべての成分が球であると仮定すると、拡散は質量により変化する。この仮定の下での複合体の化学量論は1:1であった。非標識IAPPおよびADM-116を用いた等温滴定熱量測定(ITC)は、Ka=3.1±0.6×106M-1(Kd=320±60nM)の、一部位結合モデルに明らかに適合する発熱特性を示した(図5bおよび表1)。したがって、ADM-116はIAPPに対する強い親和性で別個の複合体を形成した。
メカニズムに関する洞察を得るために、ADM-116をそのOCH3末端で蛍光標識し、INS-細胞に適用し、共焦点顕微鏡法により可視化した。非救出(200nM)および救出(200nM+15μM ADM-116)濃度のフルオレセイン標識ADM-116(ADM-116F)は、細胞膜を透過することができた(図6A)。これに対して、フルオレセイン標識ADM-3(ADM-3F)は細胞内部に移る能力を示さなかった(図6A)。次いで、巨大細胞膜由来小胞(GPMV)をINS-1生細胞から調製した。ADM-116はGPMVを透過する明らかな能力を示し、ADM-3は示さなかった(図6B)。これは、前者の小分子が実際に膜を通過するだけでなく、能動的細胞プロセスからの補助なしに通過することを示している。
ADM-116は疎水性コアを有するフォールディングした分子である。FDA承認薬物について、測定および計算したオクタノール-水分配係数は非常に類似している(図6C)。ADM-3の予測logPおよび実験logPは-0.7および-2.0で、その緩衝液中の実際的溶解性と一致している(図6C)。しかし、ADM-116では、7桁の差異がある。計算logPは7.6(コレステロールと同等)であったが、測定logPは0.6であった。この異常はADM-116のフォールディングした性質の結果であろう。全体として、ADM-116はアニオン性(-2)で水溶性であるが、なお受動的細胞膜透過が可能である。これは、小分子のフォールディング/再フォールディングがこのプロセスの中心である、細胞透過のパラダイムを示唆する。
Claims (38)
- 式(I)の化合物、またはその塩、溶媒和物、もしくはN-オキシド、およびそれらの任意の組み合わせ:
式中、R1の各存在は-OH、-O(C1-C6)アルキル、-O(C1-C6)ハロアルキル、-O(C1-C6)ヘテロアルキル、-O(CH2)mC(=O)OR5、-OC(=O)R5、-NH2、-SH、-SO3Hおよび-PO(OH)2からなる群より独立して選択され;
R2は-(C1-C6)アルキル、-(C1-C6)ヘテロアルキル、-OR5、-(C3-C10)ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され、ここでアルキル、ヘテレオアルキル、ヘテロシクリル、アリールまたはヘテロアリール基は置換されていてもよく;
R3およびR4はH、-(C=O)0-1(C1-C6)アルキル、-(C=O)0-1(C3-C8)シクロアルキル、-(C=O)0-1(C1-C6)ヘテロアルキル、-(C=O)0-1アリール、および-(C=O)0-1ヘテロアリールからなる群より独立して選択され、ここでアルキル、シクロアルキル、アリールもしくはヘテロアリール基は置換されていてもよく;またはR3およびR4は、R3およびR4が連結している窒素と一緒に-(C3-C10)ヘテロシクリルもしくは-NO2を形成し;
R5の各存在はH、-(C1-C6)アルキル、-(C1-C6)ヘテロアルキル、-(C3-C8)シクロアルキル、-(C4-C10)ヘテロシクリル、アリール、および-(C5-C10)ヘテロアリールからなる群より独立して選択され、ここでアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリール基は置換されていてもよく;
mの各存在は独立して1〜5の範囲の整数であり;
kは1〜5の範囲の整数であり;かつ
式(I)の化合物は生理的pHで正味の負電荷を有する。 - R1の少なくとも1つの存在が-O(CH2)mC(=O)OH、-SO3Hおよび-PO(OH)2からなる群より選択される、請求項1記載の化合物。
- R1の少なくとも1つの存在が-O(CH2)mCOOHである、請求項2記載の化合物。
- R1の少なくとも2つの存在が-O(CH2)mC(=O)OH、-SO3Hおよび-PO(OH)2からなる群より独立して選択される、請求項1記載の化合物。
- R1の少なくとも2つの存在が独立して-O(CH2)mC(=O)OHである、請求項4記載の化合物。
- (I)中の1つおきのキノリン基が、-O(CH2)mC(=O)OH、-SO3Hおよび-PO(OH)2からなる群より独立して選択されるR1をそれぞれの環の4位に有する、請求項1記載の化合物。
- (I)中の所与のキノリン基が-O(CH2)mC(=O)OH、-SO3Hおよび-PO(OH)2からなる群より選択されるR1を環の4位に有する場合、該所与のキノリン基が共有結合しているキノリン基は-OH、-O(C1-C6)アルキル、-O(C1-C6)ハロアルキル、-O(C1-C6)ヘテロアルキル、-OC(=O)R5、-NH2、および-SHからなる群より独立して選択されるR1置換基を対応する環の4位に有し、ここでR5はHではない、請求項6記載の化合物。
- kが3である、請求項1記載の化合物。
- R1の各存在が-OCH2CH3および-OCH2COOHからなる群より独立して選択され;NR3R4が-NO2であり;R2が-OMeであり;かつkが3である、請求項1記載の化合物。
- 共有結合しているいかなる2つのキノリン基も同じR1置換基を有さない、請求項9記載の化合物。
- 生理的pHにおいて、式(I)の化合物が、-1、-2、-3、-4、-5、および-6からなる群より選択される正味の負電荷を有する、請求項1記載の化合物。
- 式(II)の化合物、またはその塩、溶媒和物、もしくはN-オキシド、およびそれらの任意の組み合わせ:
式中、R1の各存在は-OH、-O(C1-C6)アルキル、-O(C1-C6)ハロアルキル、-O(C1-C6)ヘテロアルキル、-O(CH2)mC(=O)OR5、-OC(=O)R5、-NH2、-SH、-SO3Hおよび-PO(OH)2からなる群より独立して選択され;
(i)R2は-X1-LINKER-CARGOであるか、または(ii)R3は-X2-LINKER-CARGOであり;
X1は結合、-NH-、-O-または-S-であり;
X2は-C(=O)-または-C(=S)-であり;
LINKERは-(CH2)n-、-(CH2CH2O)n-および-(AA)n-からなる群を含み、ここでnの各存在は独立して1〜10の範囲の整数であり、かつAAの各存在は独立して天然アミノ酸であり、さらに-X-LINKERはジスルフィド結合をさらに含んでもよく;かつ
CARGOはオリゴヌクレオチド、オリゴデオキシヌクレオチド、小分子およびポリペプチドから選択される分子であり;
R2が-X1-LINKER-CARGOである場合、R3およびR4はH、-(C=O)0-1(C1-C6)アルキル、-(C=O)0-1(C3-C8)シクロアルキル、-(C=O)0-1(C1-C6)ヘテロアルキル、-(C=O)0-1アリール、および-(C=O)0-1ヘテロアリールからなる群より独立して選択され、ここでアルキル、シクロアルキル、アリールもしくはヘテロアリール基は置換されていてもよく;またはR3およびR4は、R3およびR4が連結している窒素と一緒に-(C3-C10)ヘテロシクリルもしくは-NO2を形成し;ならびに
R3が-X2-LINKER-CARGOである場合、R2は-(C1-C6)アルキル、-(C1-C6)ヘテロアルキル、-OR5、-(C3-C10)ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールからなる群より選択され、ここでアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクリル、アリールまたはヘテロアリール基は置換されていてもよく;かつR4はHであり;
R5の各存在はH、-(C1-C6)アルキル、-(C1-C6)ヘテロアルキル、-(C3-C8)シクロアルキル、-(C4-C10)ヘテロシクリル、アリール、および-(C5-C10)ヘテロアリールからなる群より独立して選択され、ここでアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリール基は置換されていてもよく;
mの各存在は独立して1〜5の範囲の整数であり;
kは1〜5の範囲の整数であり;かつ
式(II)の化合物は生理的pHで正味の負電荷を有する。 - CARGOが検出可能な標識を含む、請求項13記載の化合物。
- 生理的pHにおいて、CARGOが無い場合の式(II)の化合物が、-1、-2、-3、-4、-5、および-6からなる群より選択される正味の負電荷を有する、請求項13記載の化合物。
- 水溶性である、請求項1〜15のいずれか一項記載の化合物。
- 細胞膜を受動的に透過することができる、請求項1〜15のいずれか一項記載の化合物。
- 式(II)の化合物がCARGOよりも高い細胞膜透過性を有する、請求項13〜15のいずれか一項記載の化合物。
- X1-LINKERまたはX2-LINKERが細胞内で切断される、請求項13〜15および18のいずれか一項記載の化合物。
- 検出可能な標識とさらに連結される、請求項1〜19のいずれか一項記載の化合物。
- 検出可能な標識が放射性同位体、安定同位体、フルオロフォア、高電子密度の金属、ビオチン、DNA、RNA、抗体エピトープ、スピン標識、反応性ペプチドタグ、量子ドットおよびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項20記載の化合物。
- 少なくとも1種の請求項1〜21のいずれか一項記載の化合物および少なくとも1種の薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
- 少なくとも1種の追加の治療剤をさらに含む、請求項22記載の薬学的組成物。
- それを必要としている対象において糖尿病を予防または処置する方法であって、少なくとも1種の請求項1〜21のいずれか一項記載の化合物の治療的有効量を該対象に投与する段階を含む、方法。
- 糖尿病を処置または予防する少なくとも1種の追加の治療剤を前記対象に投与する段階をさらに含む、請求項24記載の方法。
- 前記化合物および前記少なくとも1種の追加の治療剤を前記対象に同時投与する、請求項25記載の方法。
- 前記化合物および前記少なくとも1種の追加の治療剤が共製剤化される、請求項25記載の方法。
- 糖尿病がI型またはII型糖尿病である、請求項24記載の方法。
- 前記対象がヒトである、請求項24記載の方法。
- ミスフォールディングしたまたは構造不定のタンパク質によって引き起こされる神経変性疾患を予防または処置する方法であって、少なくとも1種の請求項1〜21のいずれか一項記載の化合物の治療的有効量を対象に投与する段階を含む、方法。
- 神経変性疾患を処置または予防する少なくとも1種の追加の治療剤を前記対象に投与する段階をさらに含む、請求項30記載の方法。
- 前記化合物および前記少なくとも1種の追加の治療剤を前記対象に同時投与する、請求項31記載の方法。
- 前記化合物および前記少なくとも1種の追加の治療剤が共製剤化される、請求項31記載の方法。
- 前記タンパク質がα-シヌクレイン、タウまたはAβを含む、請求項30記載の方法。
- 神経変性疾患がパーキンソン病またはアルツハイマー病を含む、請求項30記載の方法。
- 前記対象がヒトである、請求項30記載の方法。
- 分子CARGOの細胞膜透過性を高める方法であって、CARGOがオリゴヌクレオチド、オリゴデオキシヌクレオチド、小分子およびポリペプチドからなる群より選択され、方法が、CARGOを誘導体化して請求項13記載の化合物を形成する段階を含む、方法。
- 前記化合物が細胞内で切断されて、CARGOまたはその誘導体を遊離し、CARGOの誘導体がCARGOと本質的に同じ生物活性を有する、請求項37記載の方法。
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