JP2019214631A

JP2019214631A - カルシウム吸収不良及び代謝性骨障害を治療するための非晶質炭酸カルシウム

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Publication number: JP2019214631A
Application number: JP2019181138A
Authority: JP
Inventors: サジ，アミール; Sagi Amir; シェクター，アッサフ; Shechter Assaf; シャルティエル—ゴールド，ガリット; Shaltiel-Gold Galit; シャルティエル―ゴールド，ガリット; ダニエリィ，ミハエル; Daniely Michal; メイロン，オレン; Meiron Oren
Original assignee: Amorphical Ltd
Current assignee: Amorphical Ltd
Priority date: 2011-12-13
Filing date: 2019-10-01
Publication date: 2019-12-19
Also published as: EP2790710B1; AU2012354056A1; CA2859122A1; AU2012354056B2; IL274755B; CN104114179A; AU2017279824A1; AU2020200704A1; US20190022133A1; CA2859122C; US10064890B2; US20150056306A1; CN109568338A; EP2790710A1; CA3056570C; IL233107A0; US10688124B2; IL233107B; IL274755A; ES2831699T3

Abstract

【課題】骨代謝に関連する障害、疾患又は状態に罹患している対象において骨ミネラル密度を向上させる。【解決手段】少なくとも１種の安定剤を含む安定な非晶質炭酸カルシウム（ＡＣＣ）およびビスホスホネートを併用して投与することによって、骨代謝に関連する障害、疾患又は状態に罹患している対象において骨ミネラル密度を向上させる。【選択図】なし

Description

本発明は、カルシウム吸収不良及び吸収不良に関連する障害、疾患及び状態を治療するのに使用するための、並びにカルシウム吸収不良及び骨代謝に関連する障害において骨ミネラル密度を高めるための天然の及び合成の非晶質炭酸カルシウム組成物に関する。

カルシウムはヒトの体内で最も重要なミネラルの１つであると考えられる。それは、骨ミネラル密度を維持するのに必要とされ、神経伝達物質のエキソサイトーシスに必須であり、筋肉細胞の収縮に関与し、心臓における脱分極ミネラルとしてナトリウムに取って代わり、多数の他の生理的機能に関与する。カルシウムの消化管吸収は、食事のカルシウムの利用性だけでなく、腸管の吸収能力にも左右され、それは、たとえば、カルシウム貯蔵、ホルモン調節又は以前の食事のカルシウム供給のような生理的な因子に影響される。胃におけるカルシウム塩（たとえば、炭酸カルシウム）の溶解は、近位小腸におけるカルシウムイオン（Ｃａ^２＋）としてのカルシウムの適切な能動的な及び受動的な吸収の１工程である。胃酸は難溶性のカルシウム塩の溶解及びイオン化を顕著に高める。酸が適切に分泌されなければ、カルシウム塩は最少限にしか溶解（イオン化）されず、その後、適切に及び効果的に吸収され得ない。萎縮性胃炎、胃の手術及び抗分泌剤の高用量で長期の使用は酸の分泌を顕著に減らすので、食事及び補完剤のカルシウムの吸収不良のリスク状態であり得、それによって長期の骨粗鬆症のリスクを高め得る（Ｓｉｐｐｏｎｅｎｅｔａｌ．，ＳｃａｎｄＪＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２０１０；４５（２）：１３３−８）。

カルシウムの消化管吸収は、肥満症手術後の患者、副甲状腺機能低下症、クローン病、嚢胞性線維症、炎症性大腸疾患又はセリアック病を患っている患者でも低下し得る。たとえば、プロトンポンプ阻害剤、抗痙攣剤、及び慢性のコルチコステロイドのような追加型の薬剤を使っている人もカルシウム吸収不良を発症し得る。

カルシウムの生体利用効率は、その消化管吸収及び吸収されたカルシウムの骨への取り込みに左右される。腸管の吸収については、生理的因子、特にホルモンがカルシウムの骨への取り込みにおいて主要な役割を担う。従って、カルシウムの生体利用効率は、腸管によって潜在的に吸収可能であり、生理的機能、特に骨のミネラル化に使用することができ、又は骨の損失を限定するのに使用することができる食事中のカルシウムの分画として定義され得る（Ｇｕｅｇｕｅｎｅｔａｌ，ＪＡｍＣｏｌｌＮｕｔｒ，２０００ｖｏｌ．１９ｎｏ．ｓｕｐｐｌ２１１９Ｓ−１３６Ｓ）。

骨ミネラル密度の低下は、たとえば、骨減少症、骨軟化症、くる病、嚢胞性線維性骨炎及び骨粗鬆症のような種々の代謝性骨疾患に関連する。研究によって食事中カルシウムの不適切な取り込みが骨粗鬆症のような多数の骨関連の疾患を誘導することができることが示されている。

特定の種類の骨量減少（骨粗鬆症を含む）の予防及び治療のための標準的な薬物は再吸収阻害剤である。再吸収阻害剤の非限定例の１つはビスホスホネート、たとえば、ビスホスホネート剤アレンドロネート（ＡＬＮ）である。ＡＬＮの投与は、ＡＬＮが骨再吸収阻害効果を有するので、骨ミネラル密度（ＢＭＤ）の低下を減衰させる。しかしながら、ＡＬＮは骨形成も抑制し、その投与が有害な症状のリスクに関連することは認知された課題である。併用での幾つかの薬剤の使用が患者のコンプライアンス及び治療効果の改善のために提案されている。

今日、サプリメントで使用されているカルシウムは、天然起源から得ようと、合成沈殿物から得ようと、有機カルシウム塩及び無機カルシウム塩の双方を含み得る。カルシウムの消化管吸収が限定されている特定の状態では、利用可能なサプリメントの標準的な摂取は吸収を促進するには不十分で、結果的に摂取量を高めることが必要になる。吸収不良に関連する状態にて高用量のカルシウムの摂取を必要とすることは、便秘、腎臓結石、血管の問題及びそれに続くコンプライアンスの低下のような有害な効果を招く。さらに、ほとんどのカルシウムサプリメントは胃腸を介して効率的に溶解され、吸収されるためには胃の低ｐＨを必要とするので、その生体利用効率は空腹状態で優れる。

過去２０年にわたって、非晶質炭酸カルシウム（ＡＣＣ）と称される、炭酸カルシウムの熱力学的に不安定な非晶質の多形体における急速に進展する科学的な関心が出現している。実際、ＡＣＣは、少数の生物、一時的なミネラル沈着状態でＡＣＣを安定化させる能力を発達させた、主として甲殻類及び他の無脊椎動物によって利用される。これらの生物は、カルシウムの周期的な移動、吸収及び沈殿のための例外的な効率的なミネラル源を必要とする。淡水ザリガニのような一部の甲殻類では、ＡＣＣは、胃石と呼ばれる特殊化された一時的な貯蔵臓器にて大量に保存される。

最近、本発明の発明者らの一部は、医薬カルシウム組成物及び栄養補助カルシウム組成物として有用な微粉に粉砕した胃石臓器の使用を開示している（ＷＯ０５／１１５４１４）。胃石成分を含む組成物の毎日の経口摂取が骨障害、骨折及び癌のような状態の範囲を劇的に改善することが開示された（ＷＯ２００８／０４１２３６）。種々の障害及び状態を治療するためのＡＣＣ及びリン酸化されたペプチド又はアミノ酸を含む医薬組成物及び栄養補助組成物がＷＯ２００９／０５３９６７にて開示されている。

カルシウムの吸収不良、カルシウムの吸収不良に関連する骨密度低下及び骨代謝に関連する疾患の効率的な治療に対する満たされないニーズがある。

本発明は、カルシウムの吸収不良を治療するための合成又は天然の安定なＡＣＣを含む組成物の使用方法を提供する。ＡＣＣは、カルシウムの吸収不良を患う患者でさえ、他の型のカルシウムサプリメントの欠陥を克服することができることが本明細書で初めて開示される。

カルシウム吸収不良の治療は、カルシウム欠乏が関連する障害、疾患の発症をさらに予防し、又は減らし、又は遅らせ得る。一部の実施形態によれば、カルシウム欠乏に関連する状態には、肥満症手術又は胃の手術後の患者、副甲状腺機能低下症、ビタミンＤ欠乏症、腎尿細管疾患、腎不全、膵炎、低タンパク血症、及び高リン血症を患っている患者が含まれる。代わりの実施形態によれば、カルシウム吸収不良が関与する疾患には、クローン病、嚢胞性線維症、炎症性大腸疾患、セリアック病、及びアトピー性胃炎が挙げられる。さらなる実施形態によれば、カルシウム吸収不良は、高い骨形成を伴う対象、コルチコステロイド、プロトンポンプ阻害剤、抗痙攣剤、リファンピン及び類似の抗生剤、キレート剤及び分泌阻害剤を摂取している人を包含し得る。

他のカルシウムサプリメントと比べて安定なＡＣＣの高いカルシウム消化管吸収は、閉経後の女性及び閉経周辺期の女性、高齢男性、小児、青年、妊娠女性及び授乳中女性を含む他の集団におけるカルシウム欠乏の結果生じる状態及び障害を遅らせ得る又は最少限にとどめ得る。

ＡＣＣの高いカルシウム生体利用効率は、カルシウム吸収不良を患う対象にて骨密素低下をさらに遅らせ得る又は最少限にとどめ得る。本発明は、代謝性の骨の障害、疾患及び状態における対象にて骨ミネラル密度を高めるための合成又は天然の安定なＡＣＣを含む組成物の使用を提供する。本発明の組成物は、骨軟化症、骨のパジェット病、骨減少症、嚢胞性線維性骨炎、くる病、骨粗鬆症及び急性アルコール摂取を含む前記障害、疾患又は状態の発症を遅らせるために及びそれらを治療するためにさらに使用される。

態様の１つでは、本発明は、少なくとも１つの安定剤を含む有効量の安定な非晶質炭酸カルシウム（ＡＣＣ）を対象に投与することを含む、そのような治療を必要とする前記対象にてカルシウム吸収不良を治療する方法を提供する。一部の実施形態によれば、ＡＣＣは合成起源のものである。他の実施形態によれば、ＡＣＣは天然起源のものである。

一部の実施形態によれば、安定剤は、有機酸、ヒドロキシカルボン酸のリン酸エステル又は硫酸エステル、ヒドロキシルを持つ有機化合物及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。一部の実施形態では、前記安定剤は、ヒドロキシカルボン酸のリン酸エステル又は硫酸エステル及びヒドロキシルを持つ有機化合物から選択される少なくとも１つの成分を含む。一部の実施形態では、前記安定剤は、リン酸化されたアミノ酸及びポリオールから選択される少なくとも１つの成分を含む。前記アミノ酸は、アミノ酸誘導体又はオリゴペプチド又はポリペプチドに存在してもよく、前記ポリオールはアルコール又は糖類を含んでもよい。各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。一部の実施形態によれば、リン酸化されたアミノ酸はホスホセリン及びホスホスレオニンから選択される。一部の実施形態によれば、前記安定剤は、単糖類、二糖類、オリゴ糖類及び多糖類から選択される少なくとも１つの糖類を含む。一部の実施形態によれば、前記安定剤は、少なくとも１つのアルカリ水酸化物とさらに組み合わせられたヒドロキシル持つ有機化合物を含む。一部の実施形態によれば、安定剤は、カルボン酸、好ましくはクエン酸、酒石酸又はリンゴ酸である。一部の実施形態では、前記安定剤は、リン酸化されたアミノ酸、リン酸化されたペプチド、少なくとも１つのペプチドを伴ったキチン、及びアルカリ水酸化物を伴ったポリオールから選択される少なくとも１つの化合物を含む。一部の例となる実施形態によれば、前記ＡＣＣは単離された甲殻類の胃石から得られる。一実施形態によれば、前記天然のＡＣＣはキチン及びポリペプチドによって安定化される。別の実施形態によれば、ＡＣＣは合成であり、前記合成のＡＣＣはホスホセリン及びホスホスレオニンから選択されるリン酸化されたアミノ酸によって安定化される。別の実施形態によれば、前記合成のＡＣＣはクエン酸と組み合わせたホスホセリンによって安定化される。さらに別の実施形態によれば、前記合成のＡＣＣはクエン酸によって安定化される。さらに別の実施形態によれば、前記ＡＣＣは水酸化ナトリウムと組み合わせたスクロースによって安定化される。

一部の実施形態によれば、対象は、８．８ｍｇ／ｄＬを下回る血漿カルシウム濃度の低下に関連するカルシウム吸収不良の障害を患う。一部の実施形態によれば、治療が必要な対象は、副甲状腺機能低下症、ビタミンＤ欠乏症、腎尿細管疾患、腎不全、膵炎、低タンパク血症、クローン病、嚢胞性線維症、炎症性大腸疾患、セリアック病、低リン血症、アトピー性胃炎を患っている患者、肥満症又は胃の手術後の患者、高い骨形成を伴う対象、及びコルチコステロイド、プロトンポンプ阻害剤、抗痙攣剤、リファンピン及び類似の抗生剤、キレート剤及び分泌阻害剤から選択される薬物を得ている対象から成る群から選択される。一部の実施形態によれば、対象は閉経後又は閉経周辺期の女性から選択される。一部の実施形態によれば、前記対象は、骨ミネラル密度の低下に関連する障害、疾患及び状態の発生に感受性である。カルシウム吸収不良の治療が必要な対象における骨密度の低下に関連する障害は骨粗鬆症であり得る。

別の実施形態では、本発明は、カルシウム吸収不良の治療で使用するための、有機酸、ヒドロキシカルボン酸のリン酸エステル又は硫酸エステル、及びヒドロキシルを持つ有機化合物から成る群から選択される少なくとも１つの安定剤を含む安定な非晶質炭酸カルシウム（ＡＣＣ）を含む医薬組成物を提供する。本発明に係る医薬組成物はさらにキャリア、補助剤、希釈剤又は賦形剤を含み得る。

別の実施形態では、本発明は、カルシウム吸収不良を治療するための、有機酸、ヒドロキシカルボン酸のリン酸エステル又は硫酸エステル、及びヒドロキシルを持つ有機化合物から成る群から選択される少なくとも１つの安定剤を含む非晶質炭酸カルシウムの使用を指向する。

別の実施形態では、本発明は、カルシウム吸収不良を治療するための薬物の調製における、有機酸、ヒドロキシカルボン酸のリン酸エステル又は硫酸エステル、及びヒドロキシルを持つ有機化合物から成る群から選択される少なくとも１つの安定剤を含む非晶質炭酸カルシウムの使用を指向する。

別の態様では、本発明は、カルシウム吸収不良に関連する障害、疾患及び状態を治療するための、少なくとも１つの安定剤を含む安定な非晶質炭酸カルシウム（ＡＣＣ）を含む組成物に関する。

本発明はさらに、カルシウム吸収不良に関連する障害、疾患及び状態におけるカルシウムの吸収不良を治療するための（摂食状態又は空腹状態にて）薬物の調製における安定な非晶質炭酸カルシウム（ＡＣＣ）を含む組成物の使用を包含し、その際、ＡＣＣは少なくとも１つの安定剤と微細に混合される。一実施形態では、安定なＡＣＣを含む組成物は、摂食状態で投与した場合、優れた消化管吸収を有する。別の実施形態では、安定なＡＣＣを含む組成物は、空腹状態で投与した場合、優れた消化管吸収を有する。

別の態様では、本発明は、安定な非晶質炭酸カルシウム（ＡＣＣ）及び少なくとも１つの安定剤を含む有効量の組成物を哺乳類対象に投与することを含む、骨代謝に関連する障害、疾患又は状態において骨ミネラル密度を高める方法を提供する。一部の実施形態によれば、ＡＣＣは合成起源のものである。他の実施形態によれば、ＡＣＣは天然起源のものである。一部の実施形態によれば、安定剤は、有機酸、ヒドロキシカルボン酸のリン酸エステル又は硫酸エステル、ヒドロキシルを持つ有機化合物及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。一部の実施形態では、前記安定剤は、ヒドロキシカルボン酸のリン酸エステル又は硫酸エステル及びヒドロキシルを持つ有機化合物から選択される少なくとも１つの成分を含む。一部の実施形態では、前記安定剤は、リン酸化されたアミノ酸及びポリオールから選択される少なくとも１つの成分を含む。前記アミノ酸は、アミノ酸誘導体又はオリゴペプチド又はポリペプチドに存在してもよく、前記ポリオールはアルコール又は糖類を含んでもよい。各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。一部の実施形態によれば、リン酸化されたアミノ酸はホスホセリン及びホスホスレオニンから選択される。一部の実施形態によれば、前記安定剤は、単糖類、二糖類、オリゴ糖類及び多糖類から選択される少なくとも１つの糖類を含む。一部の実施形態によれば、前記安定剤は、少なくとも１つのアルカリ水酸化物とさらに組み合わせられたヒドロキシル持つ有機化合物を含む。一部の実施形態によれば、安定剤は、カルボン酸、好ましくはクエン酸、酒石酸又はリンゴ酸である。一部の実施形態では、前記安定剤は、リン酸化されたアミノ酸、リン酸化されたペプチド、少なくとも１つのペプチドを伴ったキチン、及びアルカリ水酸化物を伴ったポリオールから選択される少なくとも１つの化合物を含む。一部の実施形態によれば、前記ＡＣＣは単離された甲殻類の胃石から得られる。

一部の実施形態によれば、骨ミネラル密度を高める方法は骨再吸収阻害剤と併用して安定なＡＣＣを含む組成物を投与することを含む。一部の実施形態によれば、骨再吸収阻害剤はビスホスホネートである。一部の実施形態によれば、ビスホスホネートは、アレンドロネート、リセドロネート、チルドロネート、イバンドロネート、ゾレンドロネート、パミドロネート、エチドロネート及びその塩及びエステルから選択される。一部の実施形態によれば、ビスホスホネートはアレンドロネートである。一部の実施形態では、カルシウムサプリメントなしで又は安定なＡＣＣ以外のカルシウムサプリメントと共に必要とされる用量に比べて、低い治療用量のビスホスホネート、アレンドロネートとの併用で投与される。一部の実施形態によれば、本発明は、骨粗鬆症、骨軟化症、骨のパジェット病、骨減少症、嚢胞性線維性骨炎、及びくる病から選択される骨代謝に関連する障害、疾患又は状態において骨ミネラル密度を高める方法を提供する。特定の一実施形態では、本発明は骨粗鬆症における骨ミネラル密度を高める方法を提供する。一部の実施形態によれば、本発明は、骨再吸収阻害剤との併用で前記組成物を投与することを含む、骨軟化症、骨のパジェット病、骨減少症、嚢胞性線維性骨炎、くる病、骨粗鬆症及び急性アルコール摂取から選択される骨代謝に関連する障害、疾患又は状態において骨ミネラル密度を高める方法を提供する。特定の一実施形態では、本発明はビスホスホネートアレンドロネートとの併用で前記組成物を投与することを含む、骨粗鬆症において骨ミネラル密度を高める方法を提供する。本発明の方法によれば、組成物は、閉経後の女性、高齢男性、小児、青年、妊娠女性、及び授乳中の女性から選択される哺乳類対象に投与される。一部の実施形態によれば、骨ミネラル密度を高める方法は安定なＡＣＣを含む組成物の投与を含み、その際、前記対象はカルシウム吸収不良及びカルシウム吸収不良に関連する障害、疾患及び状態を患う患者から選択される。

本発明はさらに、骨代謝に関連する障害、疾患又は状態において骨ミネラル密度を高めるための薬物の調製において使用するための、有機酸、ヒドロキシカルボン酸のリン酸エステル又は硫酸エステル、及びヒドロキシルを持つ有機化合物から成る群から選択される少なくとも１つの安定剤を含む安定な非晶質炭酸カルシウム（ＡＣＣ）を含む組成物の使用を提供する。本発明に係る医薬組成物はさらにキャリア、補助剤、希釈剤又は賦形剤を含み得る。

さらに別の態様では、本発明は、少なくとも１つの安定剤を含む有効量のＡＣＣを対象に投与することを含むカルシウム吸収不良を患う前記対象にてカルシウムの消化管吸収を高める方法を提供する。一部の実施形態によれば、投与は空腹状態及び摂食状態における対象から選択される前記対象に対して実施される。

本発明の上記及び他の特徴及び利点はすべて、添付の図面を参照して、その実施形態の以下の実例となり且つ非限定的である記載を介して理解されるであろう。

ラットへの結晶炭酸カルシウムの投与に対して非晶質炭酸カルシウム（ＡＣＣ）の投与の後、カルシウムのレベルが上昇することを示す図である。結果は平均値±ＳＥＭである。スチューデントのｔ検定：＊ｐ＜０．０５摂食後の閉経後女性における結晶炭酸カルシウム（ＣＣＣ）の投与に対して非晶質炭酸カルシウム（ＡＣＣ）の投与の後、カルシウムの分画吸収が各女性当たり２．１倍上昇することを示す図である。対応のあるｔ検定：ｐ＜０．０１摂食後の閉経後女性における結晶炭酸カルシウム（ＣＣＣ）の投与に対して非晶質炭酸カルシウム（ＡＣＣ）の投与の後、２つの別々の群を分析した場合、カルシウムの分画吸収が１．９倍上昇することを示す図である。結果は平均値±ＳＥＭである。スチューデントのｔ検定：＊ｐ＜０．０５空腹時の閉経後女性における結晶炭酸カルシウム（ＣＣＣ）の投与に対して非晶質炭酸カルシウム（ＡＣＣ）の投与の後、カルシウムの分画吸収が４．６倍上昇することを示す図である。各治療群からの代表的な遠位大腿骨の三次元再構成及び第４椎骨の断面を示す図である。疑似処置用の骨梁領域（図５Ａ）、結晶炭酸カルシウム（ＣＣＣ）（図５Ｂ）、非晶質炭酸カルシウム（ＡＣＣ）（図５Ｃ）、ＣＣＣ＋アレンドロネート（ＡＬＮ）（図５Ｄ）及びＡＣＣ＋ＡＬＮ（図５Ｅ）。スケール棒は１．５ｍｍの距離を表す。 μＣＴによって得られた群の骨梁骨ミネラル密度（Ｔｂ.ＢＭＤ）及び骨組織総容量からの骨容量を示す図である。遠位大腿骨のＴｂ.ＢＭＤ（図６Ａ）、第４腰椎のＴｂ.ＢＭＤ（図６Ｂ）。比率はＣＣＣ処理群（対照）からの上昇を表す。 μＣＴによって得られた群の骨梁骨ミネラル密度（Ｔｂ.ＢＭＤ）及び骨組織総容量からの骨容量を示す図である。遠位大腿骨のＢＶ／ＴＶ（図６Ｃ）、第４腰椎のＢＶ／ＴＶ（図６Ｄ）。比率はＣＣＣ処理群（対照）からの上昇を表す。各治療群からの代表的な遠位大腿骨の三次元再構成及び第４椎骨の断面を示す図である。疑似処置用の骨梁領域（図７Ａ）、対照（図７Ｂ）、胃石（Ｇａｓｔ）（図７Ｃ）、非晶質炭酸カルシウム（ＡＣＣ）（図７Ｄ）及びクエン酸塩（図７Ｅ）。スケール棒は１．５ｍｍの距離を表す。 μＣＴによって得られた群の骨梁骨ミネラル密度（Ｔｂ.ＢＭＤ）を示す図である。遠位大腿骨のＴｂ.ＢＭＤ（図８Ａ）、第４腰椎のＴｂ.ＢＭＤ（図８Ｂ）。一元配置ＡＮＯＶＡ：ｐ＜０．００１。文字はフィッシャーのＬＳＤ事後比較を表す。 μＣＴによって得られた治療群の総骨組織からの骨梁骨容量（ＢＶ／ＴＶ）を示す図である。遠位大腿骨のＢＶ／ＴＶ（図９Ａ）、第４腰椎のＢＶ／ＴＶ（図９Ｂ）。一元配置ＡＮＯＶＡ：ｐ＜０．００１。文字はフィッシャーのＬＳＤ事後比較を表す。腰椎の機械的な微細構造特性を示す図である。最大圧（図１０Ａ）、最大圧エネルギー（ＵＦ）（図１０Ｂ）。一元配置ＡＮＯＶＡ：ｐ＜０．０１。文字はフィッシャーのＬＳＤ事後比較を表す。棒はＳＥＭを表す。腰椎の機械的な微細構造特性を示す図である。強靭性（図１０Ｃ）、降伏時エネルギー（図１０Ｄ）。一元配置ＡＮＯＶＡ：ｐ＜０．０１。文字はフィッシャーのＬＳＤ事後比較を表す。棒はＳＥＭを表す。腰椎の機械的な微細構造特性を示す図である。骨梁骨パターン因子（ＴＢＰｆ）（図１０Ｅ）、構造モデル指標（ＳＭＩ）（図１０Ｆ）、異方性（ＤＡ）の程度（図１０Ｇ）。一元配置ＡＮＯＶＡ：ｐ＜０．０１。文字はフィッシャーのＬＳＤ事後比較を表す。棒はＳＥＭを表す。

本発明は、安定な非晶質炭酸カルシウム（ＡＣＣ）を含む組成物の以前未知であった使用を開示する。本発明に係る非晶質炭酸カルシウムに基づく組成物は、一般に市場に出回っているカルシウムサプリメントよりも優れたカルシウム源であることが分かった。ＡＣＣを含む組成物は、消化管及び骨においてさらに高い吸収性を含む驚くべき高いカルシウムの生体利用効率を有することが今や見いだされている。従って、ＡＣＣの使用は、カルシウム吸収不良に関連する障害、疾患及び状態（摂食状態及びさらに大きな利点のある空腹状態の双方で）並びに骨量低下に関連する障害及び状態において有益である。

用語「治療」は本明細書で採用されるとき、ＡＣＣの投与及び消化管と骨におけるカルシウム吸収の向上を指す。

用語「発症を遅らせること」又は「予防法」は本明細書で採用されるとき、骨疾患の発症の先送り、症状の発症の先送り及び／又は発症するであろう又は発症すると予想されるそのような症状の重症度の軽減を指す。

用語「安定なＡＣＣ」は、数週間から数年の長期間、５％以下の結晶への変換を伴って、炭酸カルシウムが前記期間の間、非晶質の状態で維持されることを示すように本明細書で使用される。たとえば、リン酸化されたアミノ酸、他の有機酸、ペプチド、塩、糖類又は脂質のような有機成分又は無機成分から選択される１以上の安定剤を添加することによって本発明に従ってＡＣＣの結晶化を阻害する。前記塩は、たとえば、マグネシウム、カリウム、ストロンチウム及びナトリウムから選択されるカチオン並びに炭酸塩、リン酸塩、硫酸塩、塩化物、臭化物、フッ化物、クエン酸塩、フマル酸塩、リンゴ酸塩又は他の有機アニオンから選択されるアニオンを含み得る；用語、アニオン及びカチオンは、前記分子の溶解性又はｐＨに関する何かを暗示することなく、単に塩組成物を記載するのに使用される。

用語「安定剤」又は「安定化剤」は本明細書で使用されるとき、相互交換可能に使用され、炭酸カルシウムを非晶質状態で維持する物質を指す。

用語「カルシウム吸収不良」は本明細書で使用されるとき、食事中カルシウムの消化管を介した吸収における異常を指す。用語「骨量低下」は本明細書で使用されるとき、対象における骨細胞又は骨組織の減少、骨質量の低下、骨ミネラルの減少又は骨ミネラル密度の低下を指す。

用語「有効量」は本明細書で使用されるとき、カルシウム吸収不良、カルシウム吸収不良やミネラル骨密度に関連する疾患、障害及び状態を治療する、並びに医療上又は栄養上の治療に適用可能な理に適った利益／リスクの比にてミネラル骨密度を高めるための安定なＡＣＣを含む組成物の有効量を指す。

一実施形態では、本発明は、安定なＡＣＣ及びＡＣＣを非結晶状態で維持するのに十分な量の安定剤を含む合成の（人工的な）組成物を提供する。安定剤は、有機酸、ヒドロキシカルボン酸のリン酸エステル又は硫酸エステル、及びヒドロキシルを持つ有機化合物から選択されるが、これらに限定されない。一部の実施形態によれば、前記安定剤は、たとえば、ホスホエノールピルベート、ホスホセリン、ホスホスレオニン、スルホセリン又はスルホスレオニンのようなヒドロキシカルボン酸のリン酸エステル又は硫酸エステル、及び単糖類、二糖類、三糖類、オリゴ糖類及び多糖類、たとえば、スクロース、マンノース、グルコースから選択されるヒドロキシルを持つ有機化合物から選択される少なくとも１つの成分を含む。ヒドロキシルを持つ有機化合物を含む安定剤はさらに、たとえば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のような少なくとも１つのアルカリ水酸化物を含み得る。本発明の一部の実施形態では、前記安定剤はリン酸化されたアミノ酸及びポリオールから選択される。リン酸化された酸はオリゴペプチド及びポリペプチドに存在し得る。本発明の他の実施形態では、安定剤は有機酸、好ましくはカルボン酸である。カルボン酸は好ましくはクエン酸、酒石酸又はリンゴ酸である。

本発明の一実施形態では、ＡＣＣはホスホセリン（Ｐ−Ｓｅｒ）又はホスホスレオニン（Ｐ−Ｔｈｒ）によって安定化される。別の実施形態では、ＡＣＣはスクロースと水酸化ナトリウムの組み合わせを含む。本発明のさらに別の実施形態では、ＡＣＣはクエン酸によって安定化される。本発明のさらに別の実施形態では、ＡＣＣはホスホセリンとクエン酸の組み合わせによって安定化される。本発明の好ましい実施形態では、微量の１以上の安定剤を含む安定なＡＣＣを含む人工的な組成物はカルシウム吸収を高める又は改善する必要がある人に投与される。

別の実施形態では、本発明は単離されたザリガニの胃石に存在する安定なＡＣＣを含む天然の組成物を提供する。粉砕した胃石はＡＣＣ、及び主としてキチン及びポリペプチド及び塩から成る有機物を含む。有機物に存在する成分がＡＣＣを安定化し、その結晶化を妨げる。

態様の１つでは、本発明で提示されるカルシウムの高い生体利用効率は分子を安定化することに関係しない。別の態様では、本発明は、カルシウムの高い生体利用効率が炭酸カルシウムの非晶質状態のみに関係することを主張する。

別の態様では、本発明は、カルシウム吸収不良及びカルシウム吸収不良に関連する障害、疾患及び状態を患う患者におけるカルシウム吸収不良の治療に使用するために、少なくとも１つの安定剤を含む安定なＡＣＣを含む組成物を提供する。別の態様では、少なくとも１つの安定剤を含む安定な非晶質炭酸カルシウムを含む有効量の組成物を対象に投与することを含む、カルシウム吸収不良を患う前記対象にてカルシウムの消化管吸収を高める方法が提供される。

一部の実施形態によれば、カルシウム欠乏に関連する状態には、肥満症又は胃の手術後の患者、副甲状腺機能低下症、ビタミンＤ欠乏症、腎尿細管疾患、腎不全、膵炎、低タンパク血症、及び高リン血症を患っている患者が含まれる。代わりの実施形態によれば、カルシウム吸収不良が関与する疾患には、クローン病、嚢胞性線維症、炎症性大腸疾患、セリアック病、及びアトピー性胃炎が挙げられる。さらなる実施形態によれば、カルシウム吸収不良は、高い骨形成を伴う対象、コルチコステロイド、プロトンポンプ阻害剤、抗痙攣剤、リファンピン及び類似の抗生剤、キレート剤及び分泌阻害剤を摂取している人を包含し得る。

カルシウムの消化管吸収の低下はさらに骨ミネラル密度の低下を招き得る。別の態様では、本発明は、カルシウム吸収不良に関連する障害、疾患及び状態を患う患者におけるミネラル骨密度を高めるのに使用するために、少なくとも１つの安定剤を含む安定なＡＣＣを含む組成物を提供する。本発明はさらに、カルシウム吸収不良を患う対象にて骨密度の低下を治療するために、少なくとも１つの安定剤を含む安定なＡＣＣを含む組成物を提供する。他のカルシウムサプリメントと比べて安定なＡＣＣのカルシウム消化管吸収の向上は、閉経後の女性、高齢男性、小児、青年、妊娠女性、及び授乳中の女性を含む集団にてカルシウム欠乏の結果生じる状態及び障害を遅延させ得る又はできるだけ抑え得る。

さらに別の態様では、本発明は、骨代謝に関連する障害、疾患又は状態における骨ミネラル密度の向上に使用するために、少なくとも１つの安定剤を含む安定なＡＣＣを含む組成物を提供する。本発明の一実施形態によれば、骨代謝に関連する障害、疾患又は状態は、骨軟化症、骨のパジェット病、骨減少症、嚢胞性線維性骨炎、くる病、骨粗鬆症及び急性アルコール摂取から選択される。一部の実施形態によれば、前記組成物は骨量低下の予防及び治療のために他の薬物との併用で投与され得る。骨量低下の予防及び治療のための薬物は、ビスホスホネート（ビスホスホン酸の塩）を含む骨再吸収阻害剤、エストロゲン受容体調節剤、アンドロゲン受容体調節剤、カルシトニン製剤、α−カルシトニン遺伝子に関連するペプチド製剤、イプリフラボン製剤、同化ステロイド製剤、抗ＲＡＮＫＬ（ＮＦ−κＢリガンドの受容体活性化因子）抗体等から選択される。骨ミネラル密度の低下の予防及び治療に使用されるビスホスホネートの非限定の一例はビスホスホネートアレンドロネートである。骨再吸収阻害剤との併用でのＡＣＣを含む組成物の使用は、骨ミネラル密度を高めることに対する相加効果を提供する。特定の理論によって束縛されることを望まないで、ＡＣＣによって提供される相加効果は高い生体利用効率及びその骨形成誘導効果に起因し得る。骨再吸収阻害剤との併用でのＡＣＣの投与は、結晶炭酸カルシウムとの併用でのＡＬＮの投与と比べて、観察される相加効果のために骨再吸収阻害剤の治療用量の減量を可能にする。一部の実施形態では、本発明は、ビスホスホネートとの併用で少なくとも１つの安定剤を含む安定なＡＣＣを含む組成物を投与することを含む、骨代謝に関連する障害、疾患又は状態における骨ミネラル密度を高める方法を提供する。本発明の文脈では、用語、併用療法は、単一剤形又は別々の剤形における２以上の有効成分の投与を包含する。別々の剤形は同時に又は順次投与されてもよく、又は全く独立した別の投薬計画で投与されてもよい。たとえば、ＡＣＣは毎日投与されてもよく、ビスホスホネートは少ない頻度で投与されてもよい。

一部の実施形態では、前記組成物は、カルシウムサプリメントなしで、又は安定なＡＣＣサプリメント以外のカルシウムサプリメントと共に必要とされる用量に比べて、低い治療用量でのビスホスホネートとの併用で投与される。一部の実施形態では、ビスホスホネートはアレンドロネートである。一部の実施形態では、前記組成物は、カルシウムサプリメントなしで、又は安定なＡＣＣサプリメント以外のカルシウムサプリメントと共に必要とされる用量に比べて、低い治療用量でのアレンドロネートとの併用で投与される。一部の実施形態では、骨粗鬆症において骨ミネラル密度を高めるのにＡＬＮとの併用で前記組成物が使用される。

さらに別の態様では、本発明は、骨ミネラル密度の低下に関連する障害の治療のために少なくとも１つの安定剤を含む安定なＡＣＣを含む組成物を提供する。本発明の一実施形態によれば、骨ミネラル密度の低下に関連する障害、疾患及び状態は、骨軟化症、骨減少症、嚢胞性線維性骨炎、くる病、骨粗鬆症及び急性アルコール摂取から選択される。

さらに別の態様では、本発明は、骨ミネラル密度の低下に関連する障害の発症を遅らせる又は予防するために少なくとも１つの安定剤を含む安定なＡＣＣを含む組成物を提供する。本発明の一実施形態によれば、骨ミネラル密度の低下に関連する障害、疾患及び状態は、骨軟化症、骨減少症、嚢胞性線維性骨炎、くる病、骨粗鬆症及び急性アルコール摂取から選択される。

本発明の方法によれば、安定なＡＣＣを含む組成物は、たとえば、閉経後の女性及び高齢男性のような骨ミネラル密度の低下及び骨代謝に関連する障害の発症に感受性の対象にて使用するのに特に有利である。別の態様では、本発明の組成物は、たとえば、小児、青年及び妊娠中や授乳中の女性のような高レベルのカルシウムを摂取する必要がある対象に投与される。さらに別の態様では、本発明の組成物はカルシウム吸収不良を患う対象に投与される。

態様の１つでは、本発明は、カルシウム吸収不良に関連する障害、疾患及び状態を患う患者におけるカルシウム吸収不良の治療のための薬物の調製における少なくとも１つの安定剤を含む安定なＡＣＣを含む組成物の使用に関する。

その上さらなる態様では、本発明は、骨代謝に関連する障害、疾患又は状態における骨ミネラル密度の向上のための薬物の調製における少なくとも１つの安定剤を含む安定なＡＣＣを含む組成物の使用に関する。一部の実施形態では、前記薬物は、骨再吸収阻害剤との併用で使用される。その上さらなる態様では、前記組成物は、骨ミネラル密度の低下に関連する障害、疾患及び状態の治療のための薬物の調製に使用される。その上さらなる態様では、本発明は、骨ミネラル密度の低下に関連する障害、疾患及び状態及びカルシウム吸収不良に関連する状態の予防のための薬物の調製におけるＡＣＣを含む組成物の使用に関する。その上さらなる態様では、本発明の組成物は、代謝性の骨の障害、疾患及び状態の発症に感受性である集団にてカルシウム吸収を高めるのに使用される。一実施形態では、本発明は、摂食状態で投与される場合、優れた消化管での生体利用効率を有する安定なＡＣＣを含む組成物の経口投与に関する。別の実施形態では、本発明は、さらに効率的な消化管での生体利用効率に達するために、空腹状態における安定なＡＣＣを含む組成物の経口投与に関する。

ＡＣＣとして投与される場合、カルシウムのさらに高い生体利用効率を促進するのは、安定化する分子又はメカニズムにかかわらず、非晶質炭酸カルシウムのみであるという考えを支持する証拠が提供されている。本発明の重要な実施形態では、合成のＡＣＣは摂食状態で投与する場合、消化管での優れた生物利用効率を有する。本発明の別の重要な実施形態では、合成のＡＣＣは空腹状態で投与する場合、胃での優れた生物利用効率を有する。本発明のさらに他の重要な実施形態では、天然起源のＡＣＣは摂食状態で投与する場合、胃での優れた生物利用効率を有する。本発明のさらに重要な実施形態では、天然起源のＡＣＣは空腹状態で投与する場合、胃での優れた生物利用効率を有する。一部の実施形態によれば、対象が空腹状態であろうと又は摂食状態であろうとに関わりなく、そのような治療を必要とする対象への少なくとも１つの安定剤を含む安定なＡＣＣの投与が実施される。

本発明の組成物は好ましくは、錠剤、カプセル、丸薬、粉剤、顆粒、エリキシル、チンキ剤、懸濁液、シロップ、エマルジョン含むがこれらに限定されない種々の経口形態にて及びゲル形態として経口で投与され得る。

経口投与が錠剤又はカプセルの形態である例では、組成物の成分は、たとえば、ラクトース、デンプン、スクロース、グルコース、修飾された糖類、修飾されたデンプン、メチルセルロース及びその誘導体、マンニトール、ソルビトール、及び他の還元性及び非還元性の糖類、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ステアリルフマル酸ナトリウム、ベヘン酸グリセリル、非晶質シリカゲル又は他の乾燥剤物質等のような非毒性の薬学上許容可能な不活性のキャリア又は賦形剤と組み合わせることができる。

本発明の組成物は０．５〜約５ｇの毎日用量で投与され得る。代わりの実施形態によれば、本発明の組成物は１．５〜約２０ｇの毎日用量で投与され得る。本発明の組成物は０．１５〜約１．５ｇの範囲で元素カルシウムを含む１日用量で投与され得る。代わりの実施形態によれば、本発明の組成物は０．５〜約６の範囲で元素カルシウムを含む１日用量で投与され得る。

液体形態での経口投与については、組成物の成分は、エタノール、グリセロール、水等のような非毒性の薬学上許容可能な不活性のキャリアと組み合わせることができる。所望であれば、又は必要であれば、好適な結合剤、潤滑剤、崩壊剤及び着色剤及び風味剤も混合物に組み入れることもできる。

本発明に係る組成物の特定の利点は、経口投与に関するその確認された低い毒性及び高い安全性である。従って、本発明の組成物は、本発明の他の態様では、病人向けの特別食として有利に使用される。

本発明者らは、安定なＡＣＣを含むカルシウム源の生体利用効率を評価する目的で実験を行った。ＡＣＣからのカルシウムの生体利用効率は、カルシウムの消化管吸収という点及び骨のミネラル化過程へのカルシウムの利用性という点で評価した。一般に健常な集団及びカルシウム吸収不良を患っている又はそれに感受性である集団におけるカルシウムの消化管吸収を評価した。カルシウムの消化管吸収の低下は骨密度低下の原因の１つである。従って、カルシウム吸収不良を患っている集団におけるカルシウムの骨吸収性も評価した。安定なＡＣＣの使用は、カルシウム吸収不良を患っている又はそれに感受性である対象においてカルシウムの消化管吸収を高め、骨ミネラル密度を高めるのに有益であり得る。骨量低下に関連する障害及び状態に感受性の集団、たとえば、閉経後の女性においてカルシウムの消化管吸収をさらに評価した。

骨のミネラル化過程へのカルシウムの高い利用性は、骨ミネラル密度を高め、他の骨パラメータに陽性に影響することが見いだされた。以下で例示されるように、異なる安定剤を含む安定なＡＣＣの種々の骨パラメータに対する効果を評価した。ラットの骨粗鬆症モデルにおける骨ミネラル密度と他の骨パラメータに対するＡＣＣの効果も評価した。非晶質炭酸カルシウムに基づく組成物をアレンドロネート、ビスホスホネート剤のような骨再吸収阻害薬とも組み合わせ、骨分画パラメータに対するその相互効果を評価した。

生体利用効率の測定は、種々の薬剤及びサプリメントの評価に使用される広く報告されている生体利用効率モデルに基づいた、血清及び尿の試料採取による消化管における安定なＡＣＣ源からのカルシウム吸収の評価、及び種々の薬剤及びサプリメントの評価に使用される広く報告されている骨粗鬆症の予防及び治療のモデルに基づいた、骨ミネラル密度及び他の骨パラメータに対する安定なＡＣＣからのカルシウムの効果の評価を含んだ。安定なＡＣＣの生体利用効率は、吸収不良を患っている患者、たとえば、副甲状腺機能低下症を患っている患者及びコルチコステロイドを摂取している人において及び骨ミネラル密度に関連する障害を患っている集団において評価した。ＡＣＣ源からのカルシウムの高い生体利用効率は、種々のカルシウム吸収不良及び代謝性の骨関連の疾患、障害及び状態の治療及び予防にＡＣＣの単独での使用又は骨量低下の治療用の標準薬物との併用での使用を可能にする。今や一般的に本発明を記載してきて、以下の実施例への参照を介して同じことがさらに容易に理解されるであろうが、実施例は説明目的で提供されるのであって、本発明を限定することを意図するものではない。

実施例
治験１：ＡＣＣ源からのカルシウムの消化管吸収
本実験の目的は、ラットの放射性同位元素標識モデルにて安定な非晶質炭酸カルシウム（ＡＣＣ）を含むカルシウム源の消化管吸収を評価することであった。

体重２４０±１５ｇの２４匹の２ヵ月齢のオスのウイスターラットに、元々^４５Ｃａで標識したＡＣＣ（非晶質炭酸カルシウム）又はＣＣＣ（結晶性の炭酸カルシウム）のいずれかを含有する単一のゼラチンカプセルを経口で投与し、その後、血清におけるカルシウム分画の吸収及びカルシウム排泄を測定した。

図１は、投与した用量に対して標準化した放射性活性の読み取りによって算出した血清カルシウム濃度の変化を提示する。ＡＣＣを投与されたラットにおけるＣ_ｍａｘ値はＣＣＣ群のそれよりも有意に高かった（４０％まで）（図１及び表１）。

薬物動態解析は、ＡＣＣの消化管吸収がＣＣＣよりも有意に高い（曲線下面積ＡＵＣ値はそれぞれ２２．５％及び２０％高い）が、最大濃度に達するのに要する時間（Ｔｍａｘ）は群間で異なることはなかったことを示している（表１）。

図１で提示された保持値は、ＣＣＣを含有するカプセルを服用したラットは服用量の４８．５±１．３％を保持したことを示唆している。一方、ＡＣＣカプセルを服用したラットはそれぞれ服用量の６１．４±２．０％及び６０．６±２．１％を保持した。これは、ＣＣＣ処理群による保持に比べて２６．６％の保持の有意な増加に相当する（ｐ＜０．０５）。

実験の詳細
動物
動物はすべてＢｅｎ−Ｇｕｒｉｏｎ大学の動物飼育及び使用のプログラムのもとでイスラエルの動物福祉法に従って処理した。体重２４０±１５ｇの５１匹の２ヵ月齢オスのウイスター系ラット（イスラエル、エルサレムのＨａｒｌａｎ−Ｔｅｋｌａｄ）を環境制御された部屋（２３℃の温度、１２：１２時間の明暗サイクル）にて１２のステンレススチールのケージに無作為に収容した。ラットには、４８時間、栄養調整した実験ラット用の餌（イスラエル、ペクタ・チクヴァのＫｏｆｆｏｌｋ）を自由に与え、飲料水も自由摂取とした。実験開始の４日前、それぞれ０．０１％カルシウム（０．３％リン酸塩；Ｈａｒｌａｎ−Ｔｅｋｌａｄ）及び１％カルシウム（０．８％リン酸塩；Ｋｏｆｆｏｌｋ）を含有する２種類の餌を混合することによって特別に調製した０．２４±０．０５％のカルシウム（０．６７５±０．０５％のリン酸塩）を含有する低カルシウム餌によって通常の餌を置き換えた。２種類の餌はミルにて別々に粉砕し、２種類の粉体を得、それぞれ４：１の比で乾燥混合した後、微粉均質化した。均質化した粉体を押し出して新しい餌ペレットを形成した。

カプセル投与の１７時間前に、ラットの体重を測定し、血液試料を得た（ベースライン）。その後、ラットを個別代謝ケージに入れ、カプセル投与の３時間後まで餌と水を与えなかった。投与の３時間後及び２４時間後に、約１０ｇの低カルシウム餌ペレット（０．０１％カルシウム；Ｈａｒｌａｎ−Ｔｅｋｌａｄ）を各ラットに与えた。カプセル投与の３時間後から開始して蒸留水を自由に与えた。

動物へのゼラチンカプセルの投与
プロピレングリコール（ＢｉｏＬａｂ）で４：１（ｖ／ｖ）に希釈したイソフルラン（Ｍｉｎｒａｄ）によって３０秒間、各ラットに軽く鎮静をかけた。ステンレススチールのラット投与用シリンジ（ＨａｒｖａｒｄＡｐｐａｒａｔｕｓ）を用いて、特定の炭酸カルシウム製剤（すなわち、ＣＣＣ、ＡＣＣ又はＡＣＣ−Ｃ；各群についてｎ＝１７）を含有する単一のカプセルを実験用ラットのそれぞれに胃内投与した。

動物の採血及び化学分析
カプセル投与の１７時間前、及び投与（０時間）後２、３、６、１０、２４及び３４時間に各ラットの尾静脈から１２０〜１５０μＬの血液試料を採取した。卓上遠心機（スイス、バッハのＨｅｔｔｉｃｈＺｅｎｔｒｉｆｕｇｅｎ）を用いて血液試料を直ちに３０００ｇにて１０分間遠心した。シンチレーション液（英国、バークシャーのＺｉｎｓｓｅｒＡｎａｌｙｔｉｃ）を含有するプラスチックバイアルに２つ組試料（３０μＬ）の上清血清を移し、液体シンチレーションカウンタ（Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ２１００ＴＲ，マサチューセッツ州、ボストンのＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて放射活性を測定した。測定された放射活性及び各ラットが服用した特定の放射活性用量に従って、所与の用量からの血漿放射活性を標準化した［（血清のｃｐｍ×１００）／（総ｃｐｍ×血清の容積）］。

動物の糞便及び尿の採取並びに解析
カルシウムを評価するために、順化期間の間での１７時間の空腹期（ベースライン）及び実験の３４時間全体の間、糞便及び尿を採取した。シンチレーション液を満たしたプラスチックバイアルに尿の試料（５００μＬ）を移した。糞便はオーブンにて７０℃で一晩乾燥させた。微粉均質化するまで、乳鉢で試料を粉砕した。糞便試料（２００ｍｇ）を５ｍＬの１ＮのＮａＯＨ溶液（イスラエル、ネタニアのＧａｄｏｔ）に入れ、８０℃にて３時間インキュベートし、３，６００ｇにて１０分間遠心した。シンチレーション液を含有するプラスチックバイアルに２つ組試料の上清（３０μＬ）を移した。液体シンチレーションカウンタを用いて尿及び糞便の試料の放射活性を測定した。所与の用量から糞便及び尿において測定された放射活性を差し引くことによって保持値を算出した［（摂取−糞便及び尿への排泄）／（摂取×１００％）］

動物試料の薬物動態の算出
ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ５．２ソフトウエア（カリフォルニア州、マウンテンビューのＰｈａｒｓｉｇｈｔ）を用いて時間データに対する個々のラットのカルシウム濃度のノンコンパートメント解析を行った。

統計的解析
Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａ６．１ソフトウエア（オクラホマ州、タルサのＳｔａＳｏｆｔ）を用いて、保持値、薬物動態の結果及び溶解性の結果について分散の一元配置解析（ＡＮＯＶＡ）を行った。

Ｐｒｉｓｍ５ソフトウエアを用いて対応のあるｔ検定及びスチューデントのｔ検定を行った。＜０．０５のｐ値を有意であると見なした。

上記の治験の結果は、安定なＡＣＣが動物モデルにおいてＣＣＣよりも高い消化管吸収を有することを確認した。

治験２：副甲状腺機能低下症におけるカルシウムの消化管吸収
カルシウム吸収不良の治療における安定な非晶質炭酸カルシウム（ＡＣＣ）を含むカルシウム源の消化管での生体利用効率を評価する目的で実験を行った。原発の副甲状腺機能低下症の管理において非晶質炭酸カルシウム（ＡＣＣ）サプリメントを市販の結晶カルシウムサプリメント（ＣＣＳ）と比較する無作為、２フェーズ適応、次いで交差非盲検の試験を行う。

治験の第１フェーズの主な目的は、結晶カルシウムサプリメント（ＣＣＳ）に比べて低用量の、ＡＣＣに由来する元素カルシウムでの処置が目標の血清カルシウム（アルブミンに対して補正）値（７．０〜１０．０ｍｇ／ｄＬ）を維持することができるという考えの証明である。第１段階の二次的な目的は十分なＡＣＣ用量を評価することである。さらなる二次的な目的はＡＣＣの吸収に対する食物の効果を判定することである。

治験の第２フェーズの主な目的は、ＣＣＳに比べてＡＣＣに由来する低用量の元素カルシウムによる治療が目標の血清カルシウム（アルブミンに対して補正）値（７．０〜１０．０ｍｇ／ｄＬ）を維持することができるという仮説を調べることである。第２段階の二次的な目的はＣＣＳに比べてＡＣＣに由来する低用量の元素カルシウムによる治療が副甲状腺機能低下症の対象にて高カルシウム尿の増加を引き起こさないという仮説を調べることである。さらなる二次的な目的はＣＣＳに比べてＡＣＣに由来する低用量の元素カルシウムによる治療が高カルシウム摂取に関連する副作用を軽減するという仮説を調べることである。

試験集団の選択
試験集団には、各フェーズ１０人ずつの原発性副甲状腺機能低下症の２０人の対象が含まれる。

治験薬
試験に使用される安定な非晶質炭酸カルシウムは、Ａｍｏｒｐｈｉｃａｌ社によって提供される、低濃度のホスホセリンとクエン酸塩（最終製品の０．５％未満）によって安定化された合成ＡＣＣである。リン酸化されたセリン及び有機クエン酸は、非毒性で、天然に豊富であり、さらに単体の食事サプリメントとして摂取され、経口で服用した際、有害効果は報告されていない。

表２は、誘導結合プラズマ原子発光（ＩＣＰ−ＡＥ）、紫外線（ＵＶ）分光分析法、強熱減量（ＬＯＩ）及び炎光光度計を用いた炭酸カルシウムの米国薬局方パラメータに従って評価したＡＣＣの化学分析を要約する。特定しない限り、測定値の精度は±１０％である。

対照薬−標準治療
副甲状腺機能低下症の患者の治療にはカルシウム及びビタミンＤを投与することによって低カルシウム血症を正すことが含まれる（Ｃｕｓａｎｏｅｔａｌ，２０１２；Ｆｏｎｇ＆Ｋａｈｎ，２０１２）。術後の副甲状腺機能低下症に対する直後の処置については、経口補完は、元素カルシウム（１〜２ｇ、１日３回）及びカルシトリオール（０．２５〜１μｇ、１日２〜３回）で開始される。重度の及び／又は長期の低カルシウム血症のリスクがある患者では、元素カルシウムは１日３回２ｇの投与量で開始し、カルシトリオールは１日３回０．５μｇの投与量で開始する。幾つかの種類のカルシウム補完物がある。それは処方箋と共に又は処方箋なしで利用可能である。それらのすべては神経及び筋肉の性能を抑え、正常な心臓機能を亢進する（Ｓｔｒａｕｂ，２００７）。
・炭酸カルシウム（Ｔｕｍｓｅｘｔｒａｓｔｒｅｎｇｔｈ，Ｃａｌ−ｐｌｕｓ，Ｃａｌｔｒａｔｅ，Ｏｓ−Ｃａｌ５００）−利用可能なカルシウムサプリメント製剤すべての中で、炭酸カルシウムは、４０％の元素カルシウムを伴う最も濃縮されたカルシウムサプリメントの１つである。多数の市販製剤が存在する。元素カルシウムの１日総用量は、ビタミンＤの１日用量をできるだけ抑え、患者を無症状に保つように漸増する必要がある。イオン化されたカルシウムは酸性環境で最良に吸収され；４００ｍｇの元素カルシウムが１ｇの炭酸カルシウムに等しい。
・クエン酸カルシウム（Ｃｉｔｒａｃａｌ，Ｃａｌ−Ｃｙｔｒａｔｅ２５０）−２１０ｍｇの元素カルシウムが１ｇのクエン酸カルシウムに等しい。
・グルコン酸カルシウム（Ｋａｌｃｉｎａｔｅ）−ＩＶ用途で利用可能である。５〜１０分間かけてゆっくり点滴する；１０ｍＬのグルコン酸カルシウムはおよそ９０ｍｇの元素カルシウムを含有する；１０００ｍｇのグルコン酸カルシウムは９０ｍｇの元素カルシウムに等しい。

本試験では、対照群の患者は、いつものカルシウムサプリメントを摂取し続けるので、標準治療で治療される。

投与量及び投与
フェーズＩ
適格な対象がＡＣＣ錠剤を服用する。試験治験薬の各用量は、各錠剤におけるＡＣＣに由来する５０又は２００ｍｇの元素カルシウムから成る。

フェーズＩＩ
交差試験の設計で適格な対象がＡＣＣ錠剤を服用する。対照群は標準治療で治療される（いつものカルシウムサプリメントを服用することによって）。試験治験薬の各用量は、各錠剤におけるＡＣＣに由来する５０又は２００ｍｇの元素カルシウムから成る。

ＡＣＣの作用及び効果のメカニズムはまだ明らかにされていない。従って、投与量及び好ましい吸収条件（摂食／空腹）の選択は試験のフェーズＩの成績に基づく。最終的な投与量は患者ごとに具体的に決定されなければならない一方で、ＡＣＣ及びＣＣＳ間の容易な変換を可能にする両処方間の変換因子を決定することが可能であることが予想される。

対照群のカルシウム投与量は、各患者及び患者ごとの既知の既往歴及び投薬法に従って決定される。

錠剤の投与は、治療期間全体を通して１日３回対象によって行われる。ＩＰ投与は、臨床研究センター（ＣＲＣ）ＩＰ投与記録での各来診で症例報告書（ＣＲＦ）にて文書化される。未使用の錠剤の包みは来診日にＣＲＣユニットに返却され、ＣＲＦにて計数し、記録される。

対象の治療への割り当て
無作為化リストに従って対象を無作為に治療群の１つに割り当てる。無作為化はブロック無作為化を用いて行われる。

盲検化
これは非盲検試験である。対象、治験医師及び対象の評価、モニタリング、解析及びデータ管理に関与する関係者は対象の製剤の割り当てについて盲検化されない。スポンサーは治験薬ＩＰを調製すること、分配すること及びラベルを付けることに責任を負う。

試験設計
試験は２つのフェーズから成る。
フェーズＩ
原発性副甲状腺機能低下症であると以前診断され、慢性的に治療されている１０人の対象を登録する。毎日のＣＣＳ摂取をＡＣＣに由来する低下させた量の元素カルシウムで徐々に置き換える。５人の対象は食事前にＡＣＣを摂取し、他の５人の対象は食事後にＡＣＣを摂取する。このフェーズ全体を通して治療の安全性及び有効性を詳しくモニターする。

毎週のアルブミンに対して補正した血清カルシウム（ＣＡ）値の試験を用いてＡＣＣの吸収を評価する。尿におけるカルシウムの排泄はスクリーニングにて及びフェーズＩの終了時に調べる。

フェーズＩＩ
原発性副甲状腺機能低下症であると以前診断され、慢性的に治療されている１０人の新しい対象を登録する。

対象を以下の６週間の治療の１つに無作為に割り当てる。
（１）標準治療−試験前に日常的に使用されていた同じ元素カルシウム製剤及び投与量。
（２）ＡＣＣ−ＡＣＣに由来する確立した投与量の元素カルシウム（試験のフェーズＩにて見いだされた変換因子及び摂食／空腹条件に基づく）。

いつもの１日用量のビタミンＤ（１−αＤ３）と共に２種類の製剤を投与する。
治療の終了時、各群は別の６週間、もう一方の製剤を服用する。

血清カルシウム値を算出する毎週の血液検査を用いてＡＣＣの優れた吸収を評価する。尿におけるカルシウムの排泄はスクリーニングにて及びフェーズＩの終了時に調べる。

以下は試験手順の詳細な記載である。
適格な対象を以下のように治療する
フェーズＩ
Ｉの−２１日目（±１７）スクリーニング：原発性副甲状腺機能低下症であると診断され（定義については第４節を参照）、試験の開始前少なくとも１年カルシウムとビタミンＤの補完によって治療され、主要な腎疾患又は肝疾患がない対象がＣＲＣに招かれる。クリニックでは、対象が問診され、既往歴及び現在の投薬が記録され、彼らはインフォームドコンセントの書式（ＩＣＦ）に署名する。対象は血清カルシウム、Ｐ、クレアチニン及びアルブミンのレベルについて血液検査を受けるように差し向けられる。アルブミン補正したカルシウム（ＣＡ）の計算を行う。対象は、Ｃａ，Ｐ及びクレアチニンについて２４時間の採尿を行うように指示される。対象は連続３日間食物と投薬の日記を書き込んで毎日の食事カルシウム摂取を評価するように依頼される。出産年齢の女性は尿妊娠検査を受ける。試験対象患者基準すべてに適合し、除外基準を１つも有さない適格な対象が試験に登録される。

対象は、試験に加わるのに適格かどうかを電話によって又はその場で知らされる。

Ｉの０日目：適格な対象がＣＲＣに到着し、そこで最終来診以来の彼らの医学状態の変化について尋ねられる。血液検査を行って血清のカルシウム、Ｐ及びアルブミンのベースライン値を規定する。ベースラインでのＣＡの計算を行う。

対象はＡＣＣ錠剤の包みを受け取り、各錠剤は５０又は２００ｍｇの元素カルシウムを含有する（カルシウム補完の１日の総量に従って、１４日の供給＋予備の５錠）。ＣＣＳのＡＣＣによる置き換えは以下の式に従って算出される：
ＮＴＤＣ＝ＩＴＤＣ−［０．１×ＩＴＤＣ（ｍｇＣＣＳ）］＋［０．０５×ＩＴＤＣ（ｍｇＡＣＣ）］
＊ＩＴＤＣ：最初の１日カルシウム総摂取（ｍｇ）
＊＊ＮＴＤＣ新しい１日カルシウム総摂取（ｍｇ）
元素カルシウムの最初の総１日摂取のうちの１０％（ｍｇで）がＡＣＣ由来の５％の元素カルシウムによって置き換えられる（ｍｇにて、最初の総１日摂取の中で算出される）ビタミンＤの１日摂取は同じままである。

１日当たりの錠剤の数の計算が各対象について具体的に（カルシウム補完物の１日投与量に従って）医師によって実施される。

対象は個々の算出されたＮＴＤＣに従って１日その量のＡＣＣを服用するように指示される：
（１）５人の対象は、朝食後、昼食後及び夕食後に錠剤を服用するように指示される。
（２）５人の対象は、朝食前、昼食前及び夕食前に錠剤を服用するように指示される。
対象は、試験の間、日常の薬物摂取を継続するように指示される。

Ｉの３日目（±１）：対象はＣＲＣに到着し、彼らの血清のカルシウム、Ｐ及びアルブミンのレベルが調べられる。ＣＡの算出を行って低カルシウム血症（Ｃａ＜７．０ｍｇ／ｄＬ）を除外する。ＣＡ値が所望の標的範囲内（７．０〜１０．０ｍｇ／ｄＬ）にあれば、対象はＩの０日目にて指示されたカルシウム用量を服用し続ける。ＣＡ値が７．０ｍｇ／ｄＬを下回る又は１０．０ｍｇ／ｄＬを上回るのであれば、医師の決定に従ってカルシウム摂取の変更を行う。

Ｉの７日目（±１）：対象はＣＲＣに到着し、彼らの血清のカルシウム、Ｐ及びアルブミンのレベルが調べられる。ＣＡの算出を行う。
（ａ）変換因子０．５
ＣＡ＝ベースラインであれば、そのときは、元素カルシウムの２０％（ｍｇで、最初の１日総摂取から算出される）をＡＣＣに由来する元素カルシウムの１０％（ｍｇで、最初の１日総摂取から算出される）によって置き換える。
ＮＴＤＣ＝ＩＴＤＣ−［０．２×ＩＴＤＣ（ｍｇＣＣＳ）］＋［０．１×ＩＴＤＣ（ｍｇＡＣＣ）］

（ｂ）変換因子０．７５
ＣＡ＜ベースラインであれば、その時は、元素カルシウムの１０％（ｍｇで、最初の１日総摂取から算出される）をＡＣＣに由来する元素カルシウムの７．５％（ｍｇで、最初の１日総摂取から算出される）によって置き換える。
ＮＴＤＣ＝ＩＴＤＣ−［０．１×ＩＴＤＣ（ｍｇＣＣＳ）］＋［０．０７５×ＩＴＤＣ（ｍｇＡＣＣ）］
ＣＡ＜７．００ｍｇ／ｄＬは治療の終了を強要する。

（ｃ）変換因子０．２５
ＣＡ＞ベースラインであれば、その時は、元素カルシウムの１０％（ｍｇで、最初の１日総摂取から算出される）をＡＣＣに由来する元素カルシウムの２．５％（ｍｇで、最初の１日総摂取から算出される）によって置き換える。
ＮＴＤＣ＝ＩＴＤＣ−［０．１×ＩＴＤＣ（ｍｇＣＣＳ）］＋［０．０２５×ＩＴＤＣ（ｍｇＡＣＣ）］

対象は、最終来診以来の副作用又は併用投薬において生じているＡＥ及び変化について尋ねられる。対象は、血清カルシウムレベルの変化に関連する症状及び兆候（テタニー、顔面の歪み、知覚異常、筋肉痛、不整脈、意気消沈）について尋ねられる。対象は、ＡＣＣの新しい投与に関する指示書を受け取り、（最初の割り当てに基づいて）食前又は食後、朝、昼及び夕方に個々の算出されたＮＴＤＣに従って１日その量の錠剤を服用するように念を押される。対象は試験の間、日常の薬物摂取を継続するように念を押される。

Ｉの１０日目（±１）：対象はＣＲＣに到着し、彼らの血清のカルシウム、Ｐ及びアルブミンのレベルが調べられる。ＣＡの算出を行って低カルシウム血症（Ｃａ＜７．０ｍｇ／ｄＬ）を除外する。ＣＡ値が所望の標的範囲内（７．０〜１０．０ｍｇ／ｄＬ）にあれば、対象はＩ−７日目にて指示されたカルシウム用量を服用し続ける。ＣＡ値が７．０ｍｇ／ｄＬを下回る又は１０．０ｍｇ／ｄＬを上回るのであれば、医師の決定に従ってカルシウム摂取の変更を行う。

Ｉの１４日目（±１）：対象はＣＲＣに到着し、彼らの血清のカルシウム、Ｐ及びアルブミンのレベルが調べられる。ＣＡの算出を行って低カルシウム血症（Ｃａ＜７．０ｍｇ／ｄＬ）を除外する。変換処方［Ｉの７日の（ａ）〜（ｃ）］のいずれも所望の標的範囲内（７．０〜１０．０ｍｇ／ｄＬ）での血清カルシウム値を生じなかったら、試験は終了する。

対象は、最終来診以来の副作用又は併用投薬において生じているＡＥ及び変化について尋ねられる。対象は、血清カルシウムレベルの変化に関連する症状及び兆候（テタニー、顔面の歪み、知覚異常、筋肉痛、不整脈、意気消沈）について尋ねられる。

Ｉの７日目［処方（ａ）〜（ｃ）］で見いだされた変換因子に基づいてＣＣＳの最初の１日補完の５０％がＡＣＣによって置き換えられる。
（ａ）変換因子０．５：元素カルシウムの５０％（ｍｇで、最初の１日総摂取から算出される）をＡＣＣに由来する元素カルシウムの２５％（ｍｇで、最初の１日総摂取から算出される）によって置き換える。
ＮＴＤＣ＝ＩＴＤＣ−［０．５×ＩＴＤＣ（ｍｇＣＣＳ）］＋［０．２５×ＩＴＤＣ（ｍｇＡＣＣ）］
（ｂ）変換因子０．７５：元素カルシウムの５０％（ｍｇで、最初の１日総摂取から算出される）をＡＣＣに由来する元素カルシウムの３７．５％（ｍｇで、最初の１日総摂取から算出される）によって置き換える。
ＮＴＤＣ＝ＩＴＤＣ−［０．５×ＩＴＤＣ（ｍｇＣＣＳ）］＋［０．３７５×ＩＴＤＣ（ｍｇＡＣＣ）］
（ｃ）変換因子０．２５：元素カルシウムの５０％（ｍｇで、最初の１日総摂取から算出される）をＡＣＣに由来する元素カルシウムの１２．５％（ｍｇで、最初の１日総摂取から算出される）によって置き換える。
ＮＴＤＣ＝ＩＴＤＣ−［０．５×ＩＴＤＣ（ｍｇＣＣＳ）］＋［０．１２５×ＩＴＤＣ（ｍｇＡＣＣ）］

対象はＡＣＣ錠剤の包みを受け取り、各錠剤は５０又は２００ｍｇの元素カルシウムを含有する（個々の算出されたＮＴＤＣに従って、１４日の供給＋予備の５錠）。対象は、ＡＣＣの新しい投与に関する指示書を受け取り、（最初の割り当てに基づいて）食前又は食後、朝、昼及び夕方に個々の算出されたＮＴＤＣに従って１日その量の錠剤を服用するように念を押される。対象は試験の間、日常の薬物摂取を継続するように念を押される。

Ｉの２１日目（±１）：対象はＣＲＣに到着し、彼らの血清のカルシウム、Ｐ及びアルブミンのレベルが調べられる。ＣＡの算出を行って低カルシウム血症（Ｃａ＜７．０ｍｇ／ｄＬ）を除外する。対象は、最終来診以来の副作用又は併用投薬において生じているＡＥ及び変化について尋ねられる。対象は、血清カルシウムレベルの変化に関連する症状及び兆候（テタニー、顔面の歪み、知覚異常、筋肉痛、不整脈、意気消沈）について尋ねられる。ＣＡ値が７．０ｍｇ／ｄＬを下回る又は１０．０ｍｇ／ｄＬを上回るのであれば、ＣＡ値が７．０ｍｇ／ｄＬを下回る又は１０．０ｍｇ／ｄＬを上回るのであれば、対象は（医師の決定に基づいて）試験から除外される。ＣＡ値が所望の標的範囲内（７．０〜１０．０ｍｇ／ｄＬ）にあれば、Ｉの７日目［処方（ａ）〜（ｃ）］で見いだされた変換因子に基づいて、ＣＣＳの毎日の補完のＡＣＣによる完全な置き換えを実施する：
（ａ）変換因子０．５：元素カルシウムの１００％（ｍｇで、最初の１日総摂取から算出される）をＡＣＣに由来する元素カルシウムの５０％（ｍｇで、最初の１日総摂取から算出される）によって置き換える。
ＮＴＤＣ＝ＩＴＤＣ−［ＩＴＤＣ（ｍｇＣＣＳ）］＋［０．５×ＩＴＤＣ（ｍｇＡＣＣ）］
（ｂ）変換因子０．７５：元素カルシウムの１００％（ｍｇで、最初の１日総摂取から算出される）をＡＣＣに由来する元素カルシウムの７５％（ｍｇで、最初の１日総摂取から算出される）によって置き換える。
ＮＴＤＣ＝ＩＴＤＣ−［ＩＴＤＣ（ｍｇＣＣＳ）］＋［０．７５×ＩＴＤＣ（ｍｇＡＣＣ）］
（ｃ）変換因子０．２５：元素カルシウムの１００％（ｍｇで、最初の１日総摂取から算出される）をＡＣＣに由来する元素カルシウムの２５％（ｍｇで、最初の１日総摂取から算出される）によって置き換える。
ＮＴＤＣ＝ＩＴＤＣ−［ＩＴＤＣ（ｍｇＣＣＳ）］＋［０．２５×ＩＴＤＣ（ｍｇＡＣＣ）］

対象は、ＡＣＣの新しい投与に関する指示書を受け取り、（最初の割り当てに基づいて）食前又は食後、朝、昼及び夕方に個々の算出されたＮＴＤＣに従って１日その量の錠剤を服用するように念を押される。対象は試験の間、日常の薬物摂取を継続するように念を押される。対象は容器を受け取り、次に予定された来診の前に２４時間の採尿を行う。

電話によるＩの２７日目（±１）：対象は２４時間の採尿を行うように念を押される。

Ｉの２８日目（±１）−フェーズＩの終了：対象はＣＲＣに到着し、彼らの血清のカルシウム、Ｐ及びアルブミンのレベルが調べられる。ＣＡの算出を行う。対象は、Ｃａ、Ｐ及びクレアチニン用の２４時間採尿の容器を提供し、カルシウム尿を調べる。対象は、最終来診以来の副作用又は併用投薬において生じているＡＥ及び変化について尋ねられる。対象は、血清カルシウムレベルの変化に関連する症状及び兆候（テタニー、顔面の歪み、知覚異常、筋肉痛、不整脈、意気消沈）について尋ねられる。

フェーズＩＩで計画された試験の交差部分に着手するかどうかを決定する前に、フェーズＩの成績を調べる。フェーズＩのデータを要約して、各対象について群別に又は全体として、服用したＣＣＳの代わりのＡＣＣの量によるＣＡレベル間の関係を示す。
フェーズＩＩ

原発性副甲状腺機能低下症であると以前診断され、慢性的に治療されている１０人の新しい対象を登録する。

対象を以下の６週間の治療の１つに無作為に割り当てる：
（１）標準治療（ＣＣＳ）：試験の前に日常的に使用されていた同じ元素カルシウムの投与量
（２）ＡＣＣ：ＡＣＣに由来する元素カルシウムの確立された投与量（試験の段階Ｉにて見いだされた変換因子及び摂食／空腹条件に基づく）。

２種類の製剤をいつもの１日投与量のビタミンＤ（１−αＤ３）と共に投与する。

治療の終了時、各群は別の６週間、もう一方の製剤を服用する。

血清ＣＡ値を算出する毎週の血液検査によってＡＣＣの優れた吸収を評価する。スクリーニングにて及び各治療の終了時に尿におけるカルシウムの排泄を調べる。

ＩＩの−２１日目（±１７）のスクリーニング：原発性副甲状腺機能低下症であると診断され、試験の開始前少なくとも１年カルシウムとビタミンＤの補完物を服用している、主要な腎疾患又は肝疾患がない対象がＣＲＣに招かれる。クリニックでは、対象が問診され、既往歴及び現在の投薬が記録され、彼らはインフォームドコンセントの書式（ＩＣＦ）に署名する。対象は血清カルシウム、Ｐ、クレアチニン及びアルブミンのレベルについて血液検査を受けるように差し向けられる。ＣＡの計算を行う。対象は、Ｃａ，Ｐ及びクレアチニンについて２４時間の採尿を行うように指示される。対象は連続３日間食物と投薬の日記を書き込んで毎日の食事カルシウム摂取を評価するように依頼される。出産年齢の女性は尿妊娠検査を受ける。試験対象患者基準すべてに適合し、除外基準を１つも有さない適格な対象が試験に登録される。

ＩＩの０日目：適格な対象がＣＲＣに到着し、そこで最終来診以来の彼らの医学状態の変化について尋ねられる。血液検査を行って血清のカルシウム、Ｐ及びアルブミンのベースライン値を規定する。ベースラインにてＣＡを算出する。

対象を以下の治療の１つに無作為に割り当てる：
（１）標準治療（ＣＣＳ）：試験の前に日常的に使用されていた同じ元素カルシウムの投与量
（２）ＡＣＣ：ＡＣＣに由来する元素カルシウムの確立された投与量（試験の段階Ｉにて見いだされた変換因子及び摂食／空腹条件に基づく）。

ＡＣＣ群に割り当てられた対象はＡＣＣ錠剤の入った容器を受け取り、各錠剤は２００ｍｇの元素カルシウムを含有する（３５日分の供給＋予備の５錠）。ＣＣＳ治療に割り当てられた対象は彼らの日常のカルシウム補完物を服用し続ける。

カルシウム補完物の正確な投与量は分かっている既往歴に従って各対象について決定される。

対象は治験の間、日常の薬物摂取を継続するように指示される。

ＩＩの３日目（±１）：対象はＣＲＣに到着し、彼らの血清のカルシウム、Ｐ及びアルブミンのレベルが調べられる。ＣＡの算出を行って低カルシウム血症（Ｃａ＜７．０ｍｇ／ｄＬ）を除外する。ＣＡ値が所望の標的範囲内（７．０〜１０．０ｍｇ／ｄＬ）にあれば、対象はＩＩの０日目にて指示されたカルシウム用量を服用し続ける。ＣＡ値が７．０ｍｇ／ｄＬを下回る又は１０．０ｍｇ／ｄＬを上回るのであれば、医師の決定に従ってカルシウム摂取の変更を行う。

ＩＩの７日目（±１）：対象はＣＲＣに到着し、彼らの血清のカルシウム、Ｐ及びアルブミンのレベルが調べられる。ＣＡの算出を行う。対象は、最終来診以来の副作用又は併用投薬において生じているＡＥ及び変化について尋ねられる。対象は、血清カルシウムレベルの変化に関連する症状及び兆候（テタニー、顔面の歪み、知覚異常、筋肉痛、不整脈、意気消沈）について尋ねられる。必要に応じてＡＣＣ又はＣＣＳの摂取の調整を行う。

対象はその割り当ての指示に従ってカルシウム補完物を服用するように念を押される。

対象は治験の間、日常の薬物摂取を継続するように念を押される。

ＩＩの１０日目（±１）：対象はＣＲＣに到着し、彼らの血清のカルシウム、Ｐ及びアルブミンのレベルが調べられる。ＣＡの算出を行って低カルシウム血症（Ｃａ＜７．０ｍｇ／ｄＬ）を除外する。ＣＡ値が所望の標的範囲内（７．０〜１０．０ｍｇ／ｄＬ）にあれば、対象はＩＩ−７日目にて指示されたカルシウム用量を服用し続ける。ＣＡ値が７．０ｍｇ／ｄＬを下回る又は１０．０ｍｇ／ｄＬを上回るのであれば、医師の決定に従ってカルシウム摂取の変更を行う。

ＩＩの１４日目（±１）：対象はＣＲＣに到着し、彼らの血清のカルシウム、Ｐ及びアルブミンのレベルが調べられる。ＣＡの算出を行う。対象は、最終来診以来の副作用又は併用投薬において生じているＡＥ及び変化について尋ねられる。対象は、血清カルシウムレベルの変化に関連する症状及び兆候（テタニー、顔面の歪み、知覚異常、筋肉痛、不整脈、意気消沈）について尋ねられる。

ＩＩの２１日目（±１）：対象はＣＲＣに到着し、彼らの血清のカルシウム、Ｐ及びアルブミンのレベルが調べられる。ＣＡの算出を行う。対象は、最終来診以来の副作用又は併用投薬において生じているＡＥ及び変化について尋ねられる。対象は、血清カルシウムレベルの変化に関連する症状及び兆候（テタニー、顔面の歪み、知覚異常、筋肉痛、不整脈、意気消沈）について尋ねられる。

対象は指示に従ってカルシウム補完物を服用するように念を押される。

対象は容器を受け取り、次に予定された来診の前に２４時間の採尿を行う。

ＩＩ−３４日目（±１）：電話によって対象は２４時間の採尿を行うように念を押される。

ＩＩの３５日目（±１）：対象はＣＲＣに到着し、彼らの血清のカルシウム、Ｐ及びアルブミンのレベルが調べられる。ＣＡの算出を行う。対象は、Ｃａ、Ｐ及びクレアチニン用の２４時間採尿の容器を提供し、カルシウム尿を調べる。対象は、最終来診以来の副作用又は併用投薬において生じているＡＥ及び変化について尋ねられる。対象は、血清カルシウムレベルの変化に関連する症状及び兆候（テタニー、顔面の歪み、知覚異常、筋肉痛、不整脈、意気消沈）について尋ねられる。

予めＣＣＳ治療群に割り当てられた対象はＡＣＣ錠剤の包みを受け取り、各錠剤は２００ｍｇの元素カルシウムを含有する（３５日分の供給＋予備の５錠）。予めＡＣＣ治療群に割り当てられた対象はいつものＣＣＳ補完物を再開するように指示される。

ＩＩの３８日目（±１）：対象はＣＲＣに到着し、彼らの血清のカルシウム、Ｐ及びアルブミンのレベルが調べられる。ＣＡの算出を行って低カルシウム血症（Ｃａ＜７．０ｍｇ／ｄＬ）を除外する。ＣＡ値が所望の標的範囲内（７．０〜１０．０ｍｇ／ｄＬ）にあれば、対象はＩＩ−３５日目にて指示されたカルシウム用量を服用し続ける。ＣＡ値が７．０ｍｇ／ｄＬを下回る又は１０．０ｍｇ／ｄＬを上回るのであれば、医師の決定に従ってカルシウム摂取の変更を行う。

ＩＩの４２日目（±１）：対象はＣＲＣに到着し、彼らの血清のカルシウム、Ｐ及びアルブミンのレベルが調べられる。ＣＡの算出を行う。対象は、最終来診以来の副作用又は併用投薬において生じているＡＥ及び変化について尋ねられる。対象は、血清カルシウムレベルの変化に関連する症状及び兆候（テタニー、顔面の歪み、知覚異常、筋肉痛、不整脈、意気消沈）について尋ねられる。必要に応じてＡＣＣ又はＣＣＳの摂取の調整を行う。

対象は割り当ての指示に従ってカルシウム補完物を服用するように念を押される。

ＩＩの４５日目（±１）：対象はＣＲＣに到着し、彼らの血清のカルシウム、Ｐ及びアルブミンのレベルが調べられる。ＣＡの算出を行って低カルシウム血症（Ｃａ＜７．０ｍｇ／ｄＬ）を除外する。ＣＡ値が所望の標的範囲内（７．０〜１０．０ｍｇ／ｄＬ）にあれば、対象はＩＩ−４２日目にて指示されたカルシウム用量を服用し続ける。ＣＡ値が７．０ｍｇ／ｄＬを下回る又は１０．０ｍｇ／ｄＬを上回るのであれば、医師の決定に従ってカルシウム摂取の変更を行う。

ＩＩの４９日目（±１）：対象はＣＲＣに到着し、彼らの血清のカルシウム、Ｐ及びアルブミンのレベルが調べられる。ＣＡの算出を行う。対象は、最終来診以来の副作用又は併用投薬において生じているＡＥ及び変化について尋ねられる。対象は、血清カルシウムレベルの変化に関連する症状及び兆候（テタニー、顔面の歪み、知覚異常、筋肉痛、不整脈、意気消沈）について尋ねられる。

ＩＩの５６日目（±１）：対象はＣＲＣに到着し、彼らの血清のカルシウム、Ｐ及びアルブミンのレベルが調べられる。ＣＡの算出を行う。対象は、最終来診以来の副作用又は併用投薬において生じているＡＥ及び変化について尋ねられる。対象は、血清カルシウムレベルの変化に関連する症状及び兆候（テタニー、顔面の歪み、知覚異常、筋肉痛、不整脈、意気消沈）について尋ねられる。

ＩＩの６９日目（±１）：電話によって対象は２４時間の採尿を行うように念を押される。

ＩＩの７０日目（±１）：フェーズＩＩの終了：対象はＣＲＣに到着し、彼らの血清のカルシウム、Ｐ及びアルブミンのレベルが調べられる。ＣＡの算出を行う。対象は、Ｃａ、Ｐ及びクレアチニン用の２４時間採尿の容器を提供し、カルシウム尿を調べる。対象は、最終来診以来の副作用又は併用投薬において生じているＡＥ及び変化について尋ねられる。対象は、血清カルシウムレベルの変化に関連する症状及び兆候（テタニー、顔面の歪み、知覚異常、筋肉痛、不整脈、意気消沈）について尋ねられる。

予定されていない来診は、対象の要求で又は治験医師が必要であると思うときに、試験中いつでも実施され得る。予定されていない来診の日付及び理由が記録される。割り当てはすべて任意であり、治験医師の裁量によって実施されるべきである。

対象が時期を早めて試験への参加を中断したら、早期中断のための来診が生じ、それは終了時の来診（フェーズＩの２８日目、フェーズＩＩの７０日目）に類似する。

試験の手順を表４及び表５にて要約する。
フェーズＩ

フェーズＩＩ

試験前（スクリーニング）の手順
各対象についてスクリーニングにて以下の査定を行う：
・インフォームドコンセントの書式に署名する
・対象の既往歴
・対象の現在の投薬
・対象の問診
・妊娠検査（妊娠年齢の女性について）
・連続３日間の食物と投薬の日記
・試験対象患者基準／除外基準の順守

投与前の手順
各対象について以下の査定を行う：
・血清ＣＡ値の算出、血清Ｐ及びアルブミンについての対象の血液検査
・カルシウム、Ｐ及びクレアチニンについての２４時間の採尿

試験の検査
血液検査
血液検査は各対象について各ＣＲＣ来診にて０日目及び前に進んで：フェーズＩの０、７、１０、１４、２１、２８日目、フェーズＩＩの０、３、７、１０、１４、２１、３５、３８、４２、４５、４９、５６、７０日目に実施する。

２４時間の採尿
２４時間の採尿は、
フェーズＩ：試験の終了（２８日目）
フェーズＩＩ：３５日目及び試験の終了（７０日目）にて実施する。

低カルシウム血症に関連する症状及び兆候
低カルシウム血症に関連する症状及び兆候を特定することを目的とする質問のリストは以下のＣＲＣ来診の間に依頼される：
フェーズＩ：７、１４、２１、２８日目
フェーズＩＩ：７、１４、２１、３５、４２、４９、５６、７０日目

試験での測定
血液検査−アルブミン補正のカルシウム（ｃａ）の算出、リン及びアルブミンの血清レベル
カルシウム及びアルブミン
低カルシウム血症の最初の査定は普通、アルブミン濃度に対して補正した血清の総カルシウムに基づく。正常のＣＡ値は８．５〜１０．２ｍｇ／ｄＬの範囲である。副甲状腺機能低下症の対象では、所望の目標ＣＡ値は７．０〜１０．０ｍｇ／ｄＬである。

血清総カルシウムとアルブミンの関係は、以下の規則：血清総カルシウム濃度は血清アルブミン濃度における１ｇ／ｄＬの低下ごとについて０．８ｍｇ／ｄＬずつ低下することによって定義される。この規則は正常なアルブミンが４．０ｇ／ｄＬに等しく、正常なカルシウムが１０．０ｍｇ／ｄＬであると想定する。

計算：カルシウム（補正された、ミリモル／Ｌ）＝カルシウム（測定された、ミリモル／Ｌ）＋｛４０−アルブミン（ｇ／ｄＬ）×０．０２｝

リン（Ｐ）
血清リンの検査は血中のリン酸塩の量を測定する。正常な値は２．４〜４．１ｍｇ／ｄＬの範囲である。

２４時間の採尿検査
２４時間の採尿については、２４時間にわたる期間の尿のすべてを採取しなければならない。尿試料には、採取開始の２４時間後の最後の尿が含まれなければならない。

カルシウム
検査結果は食事摂取を反映し得る：

尿のカルシウムのレベル＞３００ｍｇ／２４時間又は４ｍｇ／体重ｋｇ／２４時間は低カルシウム血症と見なされる。

クレアチニン
２４時間かけて採取した尿の試料にてクレアチニンクリアランス検査を行う。糸球体濾過率を測定することが使用され、それは腎臓がどのように上手く機能するかを測定するのに役立つ。

リン
リン酸塩尿検査は２４時間かけて採取した尿の試料におけるリン酸塩の量を測定する（２４時間尿検査）。リン酸塩は鉱物リンを含有する荷電したイオンである。

尿中のリン酸塩を測定する検査の結果はそれ自体ではめったに有用ではない。それらは常に他の検査の結果と共に解釈されるべきである。カルシウムとリン酸塩のレベルは同時に測定されることが多い。

低カルシウム血症に関連する症状及び兆候の査定
対象は、低カルシウム血症に関連する症状及び兆候（テタニー、顔面の歪み、知覚異常、筋肉痛、不整脈、及び意気消沈）の存在についての質問に答えるように依頼される。

対象の回答はＣＲＦにて記録される。

治療の安全性
カルシウム、Ｐ及びアルブミンの血清レベル
正常なＣＡ値は８．５〜１０．２ｍｇ／ｄＬの範囲である。副甲状腺機能低下症の対象では、所望の目標ＣＡ値は７．０〜１０．０ｍｇ／ｄＬである。低カルシウム血症の最初の査定は普通、以下の式：カルシウム（補正された、ミリモル／Ｌ）＝カルシウム（測定された、ミリモル／Ｌ）＋｛４０−アルブミン（ｇ／ｄＬ）×０．０２｝に従って、アルブミン濃度に対して補正した血清の総カルシウムの測定に基づく。

血清リンの検査は血中のリン酸塩の量を測定する。正常な値は２．４〜４．１ｍｇ／ｄＬの範囲である。

尿中のカルシウム、Ｐ及びクレアチニンの検査
尿中カルシウムレベル＞３００ｍｇ／２４時間又は＞４ｍｇ／体重のｋｇ／２４時間は高カルシウム尿症と見なされる。

男性（４０歳未満）における尿中の正常なクレアチニンのレベルは１０７〜１３９ミリリットル／分（ｍＬ／分）又は１．８〜２．３ミリリットル／秒（ｍＬ／秒）であり、女性（４０歳未満）では、８７〜１０７ｍＬ／分又は１．５〜１．８ｍＬ／秒である。クレアチニンクリアランスの値は普通、年齢と共に低下する（正常値は２０歳を過ぎると１０年毎に６．５ｍＬ／分ずつ低下する）。

尿中カルシウムと（ｍｇ／ｄＬ）と尿中クレアチニン（ｍｇ／ｄＬ）の比に関する正常な参照間隔は＜０．１４である。

正常なリン酸塩のレベルは０．４〜１．３グラム（ｇ）／２４時間尿試料である。
合併症

低カルシウム血症に関連する症状及び兆候（テタニー、顔面の歪み、知覚異常、筋肉痛、不整脈、意気消沈）はドキュメントである。
統計的解析

これは、副甲状腺機能低下症の対象にてＣＣＳの代替としてＡＣＣを評価する２段階前向き試験である。多い用量のＣＣＳに取って代わる少ない量のＡＣＣが副甲状腺機能低下症の人によって要求される補完カルシウムを提供することができる程度によって有効性が評価される。安全性は、尿中のカルシウム排泄に関連するものを含む有害事象（ＡＥ）によって評価される。統計的な計画及び解析はＴｅｃｈｎｏＳＴＡＴ社によって実施される。
設計の検討

これは、第１フェーズが副甲状腺機能低下症の対象にてＣＣＳからＡＣＣへの所定の変換因子を評価する２段階試験である。このフェーズの間に、対象の応答に応じて、従ってこのフェーズの適応的性質に応じてＣＣＳの大きな集団がＡＣＣによって徐々に置き換えられる。

第１フェーズが変換因子の安全性を実証すれば、第２フェーズが開始される。第２フェーズは、新しく動員された対象、すなわち、試験の第１フェーズに参加しなかった対象との交差試験を含む。これらの対象のそれぞれは、ＣＣＳ対照又はＡＣＣ治療に１：１の比にてブロック無作為化される。交差の第２の区分では、各対象は、彼又は彼女が第１の区分で服用しなかったもう一方の製剤を服用する。フェーズＩに参加している対象当たりの試験期間はスクリーニング（−２１日目）から終了（２８日目）の４９日であり、フェーズＩＩに参加している対象当たりスクリーニング（−２１日目）から終了（７０日目）までの９１日である。

ＣＲＣへの来診は、それぞれフェーズＩ及びフェーズＩＩについて０（ベースライン）、３、７、１０、１４、２１及び２８日目（フェーズＩの終了）及び０（ベースライン）、３、７、１０、１４、２１、３５、３８、４２、４５、４９及び７０日目（フェーズＩの終了）に行われる。

血液検査及び尿検査及び臨床質問はクリニックでの対象の来診の間に行われる。
解析の設定

安全性の集団
安全性の集団は、試験手順の一部としてＡＣＣ又はＣＣＳが投与された双方の試験段階における患者すべてから成る。
有効性の集団

有効性の集団は、転帰に影響を与えそうな主な登録違反のない、血清のＣＡレベルに関してベースラインと少なくとも若干の治療後のデータがあるフェーズＩＩの患者から成る。登録違反が転帰に影響を与えそうな程度は転帰に対して盲検化された審査官によって判定される（すなわち、盲検審査）。

失くした値の処理：観察されたデータのみを使用し；失くしたデータは帰属させない。
終点

安全性
製品に関連する有害事象の全体としての発生
有害事象及び深刻な有害事象のすべてを回収し、記録する。

一次有効性
・フェーズＩ：血清ＣＡ及び尿中カルシウムのレベルにおける標準化を達成するＡＣＣに由来する元素カルシウム用量での変化
・フェーズＩＩ：血清ＣＡ及び尿中カルシウムのレベル

二次有効性
二次有効性の終点には以下が挙げられる：
・カルシウムのレベルに関連する副作用
・低カルシウム血症に関連する症状
・血清リンのレベル
データの解析
概観

安全性及び対象の傾向の分析は安全性の集団にて実施する。有効性の解析は有効性の集団で行う。フェーズＩ及びフェーズＩＩの成績を分析し、別々に提示する。

データは、連続するデータについての平均値、標準偏差、中央値、最小値、最大値及び対象の数を列記する表にて、並びに適宜、分類されたデータについての計数及び比率を列記する表にて要約される。表は試験群によって、経時的に、全体として提示される。フェーズＩでは試験群は食前又は食後でのＡＣＣの摂取から成る。フェーズＩＩでは、試験群はＣＣＳ又はＡＣＣから成る。

統計的な解析をすべて行い、ＳＡＳ（登録商標）システムを用いてデータ付録を創る。服薬不履行、脱落、及びたとえば、年齢や性別のよう考えられる共変量の影響を査定してこの試験の成績の一般的な適用可能性に対する影響を判定する。
対象の傾向

対象の傾向を表にする；登録した、経験した、時期を早めて終了した、及び完了した対象の数を要約する。

中断の理由及び中断の時間を含めて脱落のリストを作成する。
安全性

安全性の解析は、ＭｅｄＤＲＡによってコード化され、体組織、好まれる期間、試験群、重症度及び手順との関連によって表にされるＳＡＥ及びＡＥによって実際記述的であり、物語風である。「正常」値と「異常」値の間での変化を示す記述的統計学及びシフト解析の表が臨床検査のために適宜提供される。

一次有効性の解析：フェーズＩ
フェーズＩのデータは、各対象について群及び全体によって、服用したＣＣＳのＡＣＣ置換の量によるカルシウムのレベル間の関係を示すフェーズＩのデータが数字として及びグラフによって要約される。ＡＣＣ及び血清ＣＡのレベルは経時的に各個人について、群及び全体によって、数字として、シフト表によって及びグラフによって記載される。

一次有効性の解析：フェーズＩＩ
血清ＣＡは、経時的に群によって及び並行な対の時点に関して（Ｄ０，Ｄ３５；Ｄ３，Ｄ３８；Ｄ７，Ｄ４２；Ｄ１０，Ｄ４５；Ｄ１４，Ｄ４９；Ｄ２１，Ｄ５６）経時的に群間での差異について数字として及びグラフによっての双方で要約される。並行な時点での群間のＣＡレベルにおける差異は、対応するｔ検定又は差異の分布に応じたＷｉｃｏｘｏｎの符号付き順位検定によって比較される。

二次解析
変化に関連する副作用は血清カルシウムのレベルであると共に、低カルシウム血症に関連する症状がフェーズＩ及びフェーズＩＩの群によって記載される。血清リンのレベルがフェーズＩ及びフェーズＩＩにて経時的に群によって記載される共に、フェーズＩＩにおける並行する時点での群間の差異によって記載される。シフト表は双方のフェーズの群によって提供される。

中間解析
２つの試験フェーズのいずれかの範囲内での正式に計画された中間解析はない。しかしながら、血清のＣＡ及びリンのレベルを含む安全性データは連続してモニターされる。フェーズＩＩで計画されている試験の交差部分に着手するかどうかを決定する前に、フェーズＩの成績を検討する。

データ管理
治験データは紙のＣＲＦに記録される。ＣＲＦは登録された対象によってのみ満たされる（スクリーニングの失敗ではない）。彼／彼女のＣＲＦ上の署名を介して治験医師は各患者について採取されたデータが正確であり、完全で読みやすいことを保証する。

現在の臨床治験で生成されたデータはすべてＴｅｃｈｎｏＳＴＡＴ標準手順に従って管理される。データ及び他の試験文書は治験の完了後最低６年間アーカイブに保管される。
安全性
有害事象の定義

有害事象は、ＩＰ関連であると見なされようが、見なされまいがＩＰの使用と一時的に関連する厄介な医学的兆候（異常な臨床検査値を含む）、症状及び疾患である。新しい状態又は以前存在する状態の悪化はＡＥと見なされる。臨床的に有意であると見なされた異常な知見はすべて有害事象として記録しなければならない。

治験責任医師によって有意であると見なされる急性に医療状況（試験の開始から４８時間以内に査定される）の症例（たとえば、しびれ感覚、口の周りの無感覚、痙攣、不安、筋肉の収縮、発作、喘鳴、精神病、吐き気、嘔吐、食欲不振、便秘、胃痛、喉の渇き、口渇、及び排尿増加）は症例報告書（ＣＲＦ）に記録し、対象を実験から除外する。

症例すべてにおいて、ＡＥの病因を出来る限り特定すべきであり、ＣＲＦにおいて記録することによってスポンサーに通知する。

有害事象のＩＰとの関係は以下のように定義される。

重篤な有害事象（ＳＡＥ）は：
・死亡を招いた
・命を脅かす病気又は傷害を生じた
・生体の構造又は生体の機能の永続的な損傷を生じた
・入院患者の入院又は既存の入院の延長を必要とした
・生体の構造又は生体の機能の永続的な損傷を防ぐために内科的な又は外科的な介入を生じた
・胎児仮死、胎児の死亡、先天異常又は出生異常を生じた
有害事象である。
有害事象強度の定義

治験医師によって以下の定義が使用されて有害事象の強度を記載すべきである。

以下は有害事象の強度を記載するために使用されるべきである定義にすぎない。たった１つの重症度の定義が各有害事象に使用されるべきである（たとえば、「軽い〜中程度の」は許容されない）。

異常な臨床検査値

以下の状態のいずれか１つが満たされれば臨床検査の異常性が記録される：
・臨床検査の異常性が繰り返した試験で存在する
・異常性が積極的な管理（たとえば、用量の変更、治療の中断、さらに頻繁な経過観察査定等）を必要とする程度である。
正常な臨床検査値は：
・血清カルシウム（アルブミン補正された）：７．０〜１０．０ｍｇ／ｄＬ
・血清リン：２．４〜４．１ｍｇ／ｄＬ
・尿中カルシウム：＞３００ｍｇ／２４時間
・尿中クレアチニン：４０〜３００ｍｇ／ｄＬ
・尿中リン酸塩：０．４〜１．３グラム（ｇ）
正常な参照範囲の範囲内にない異常な臨床検査成績は記録され、治療される。
有害事象の記録

以下の詳細のすべては各有害事象について対象のＣＲＦにて記録されるべきである。
・有害事象の完全な記載
・発症の日付及び時間
・解決の日付及び時間
・第１６．２節における定義に従って治験医師によって評価されるべき事象の重症度
・試験ＩＰとの関係が治験医師によって評価される
・（もしあれば）取られる行動
・転帰及びさらなる経過観察の詳細
予想される副作用（有害事象）

以下はＡＣＣ治験薬の考えられる有害事象のリストである。リストは天然のＡＣＣの使用からの以前の経験及び結晶形態のカルシウム摂取に関連する効果に基づく：
・おくび
・おなら
・便秘
・吐き気
・嘔吐
・食欲不振
・排尿増加
・腎臓の損傷
・精神錯乱
・不整脈
治験３：コルチコステロイドを摂取している個人におけるカルシウムの骨吸収

カルシウムの吸収不良に関連する疾患、障害及び状態を患っている対象にて骨ミネラル化のために安定な非晶質炭酸カルシウム（ＡＣＣ）を含むカルシウム源の生体利用効率を評価する目的で実験を実施する。コルチコステロイドで慢性的に治療されている患者の骨ミネラル密度に対する非晶質炭酸カルシウム（ＡＣＣ）と結晶炭酸カルシウム（ＣＣＣ）の効果を比較する多施設前向き無作為並行二重盲検実薬対照試験を行う。

試験の主要な目的は、コルチコステロイドの長期治療にさらされた患者における骨ミネラル密度の維持におけるＣＣＣに比べたＡＣＣ由来のカルシウムによる治療の有効性を評価することである。二次的な目的は、試験期間の間、骨折の有病率に対するＣＣＣと比べたＡＣＣの効果を評価することである。さらなる二次的な目的は、骨代謝の生体マーカーに対するＣＣＣと比べたＡＣＣの効果を評価することである。治験のさらなる目的はこの集団におけるＡＣＣの安全性特性を評価することである。

試験集団の選択
試験集団は、連続した長期のコルチコステロイド療法を受けている６０人の対象であり、各治療群は３０人の対象である。

治験薬の記載
試験で使用される安定な非晶質炭酸カルシウムは、上文で開示されたようなＡｍｏｒｐｈｉｃａｌ社によって提供される低濃度のホスホセリン及びクエン酸塩（最終産物にて０．５％未満）によって安定化した合成ＡＣＣである。

対照薬の記載
対照薬は各カプセルに５００ｍｇの結晶炭酸カルシウム（２００±５ｍｇの元素カルシウム）及び１６７ｍｇのスクロースを含有した。対照薬における元素カルシウムのレベルは、結晶炭酸カルシウムと比較して非晶質炭酸カルシウムの効果を評価するために、治療群における元素カルシウムのレベルと等しかった。

投与量及び投与
適格な対象が無作為に２つの治療の１つを受け取った。試験サプリメントの各用量は各カプセルにて６６７ｍｇのＡＣＣ又は５００ｍｇのＣＣＣから成った。

投与量の選択は１９〜５０歳の対象のために推奨された元素カルシウムの毎日摂取（１０００ｍｇ／日）に基づく。対照におけるカルシウム投与量はＡＣＣ薬における元素カルシウムのレベルと等しい。

対象の治療への割り当て
対象は無作為化リストに従って治療群の１つに無作為に割り当てられる。２つの試験群のそれぞれへの無作為化は施設内のブロック無作為化を用いて実施される。

盲検化
臨床試験にて投与される経口カルシウム治療は盲検化される。対象、治験医師及び対象の評価、モニタリング、解析及びデータ管理に関与する関係者は、治験薬を調製し、分配し、ラベルを付けることに責任を持つスポンサーを除いて、対象の製剤の割り当てに対して盲検化される。盲検化されていないスポンサーによって投与に先立って盲検化されたラベルがバイアルに貼られる。

無作為化の手順
試験は二重盲検化されるので、ＣＲＣのスタッフ及び対象は試験全体を通してコード割当に対して盲検化されたままである。投与に先立って、各対象は個体番号によって割り振られ、所定のコンピュータが生成した無作為化リストに従って治療される。コンピュータが生成したアルゴリズムを用いて対象を治療群に割り当てる。治療組成物はスポンサーによって調製され、出荷前にラベルがバイアルに貼られる。病院薬剤師はコホート割り当てリストに従ってＣＲＣに薬剤を分配するように指導される。
試験の設計

現在長期の（≧６ヵ月）のグルココルチコイド治療を開始している６０人の患者を２つの治療群（Ｎ＝３０）の１つに無作為に割り当てる。治療群の患者は非晶質炭酸カルシウム（ＡＣＣ）を服用し、実薬対照群の患者は結晶炭酸カルシウム（ＣＣＣ）を服用する。双方の製剤は医師の決定に基づいて必要に応じてビタミンＤで補完される。治験の全体を通して安全性パラメータが評価される。

種々の医学状態のためにＣＲＣに入院している患者は日常的に評価される。その医学状態のためにグルココルチコイドによる長期の治療を開始している対象は治験について考慮される候補者であり、スクリーニングのためにＣＲＣに招かれる。

スクリーニング（−７日目）：対象はインフォームドコンセントの書式（ＩＣＦ）に署名する。化学的及び血液学的な検査が実施される：ナトリウム、カリウム、ヘモグロビン、アルカリホスファターゼ、クレアチニン及びアルブミンが測定される。また、血清ＰＴＨ、２５−ヒドロキシビタミンＤ及び甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）が調べられる。カルシウム及びクレアチニンの尿中排泄が測定される。既往歴及び身体検査によって一般的な健康状態が調べられる。試験対象患者基準すべてに適合し、除外基準を１つも有さない適格な対象が試験に登録される。

来診１（０日目）：適格な対象がＣＲＣに来診する。ＤＥＸＡの走査をベースラインで行う。ＢＭＤを腰椎（Ｌ２〜４）、大腿頸部及び全身について測定する。既存の骨折の証拠を記録する。アルブミン、カルシウム（Ｃａ）、リン及びクレアチニン（Ｃｒ）の血清レベル、並びに尿中のＣａ及びＣｒを測定する。骨代謝の生体マーカー（血清オステオカルシン（ＯＣＮ）、ＰＩＮＰ（総プロコラーゲン１型Ｎ末端プロペプチス）、骨型アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）及び１型コラーゲンが架橋したＮ−テロペプチド（ＮＴＸ）を測定する。対象は無作為に錠剤の包みを受け取り、各カプセルは製剤（ＡＣＣ又はＣＣＣ）の１つによる２００ｍｇの元素カルシウムを含有する（４２日分の２１０錠＋予備の２０錠、合計２３０錠）。対象は最初の６週間（０〜４２日目）、１日に５カプセル、朝２錠、夕方３錠、食後に服用するように指導される。カルシウム関連の副作用をできるだけ抑えるために、カルシウムを定期的に服用する対象は、治験の全体を通してカルシウムサプリメントの摂取を中断するように指導される。対象は医師の決定に基づいてビタミンＤ３補完物を服用するように忠告される。対象はかれらのグルココルチコイドの使用を記録する毎日の日記を保持するように依頼される。

来診２（４２±３日目）：対象は、生じたかもしれない副作用及びＡＥについて尋ねられる。対象はＣＲＣへの最後の来診以来生じた骨折事象について尋ねられる。対象は錠剤の追加の包みを受け取り、各錠剤は前の来診にて受け取った同じ製剤（ＡＣＣ又はＣＣＣ）の２００ｍｇの元素カルシウムを含有する（合計２１０錠、４２日分＋予備の２０錠）。対象は次の６週間（４２〜８４日目）、１日に５カプセル、朝２錠、夕方３錠、食後に服用するように念を押される。カルシウム関連の副作用をできるだけ抑えるために、カルシウムを定期的に服用する対象は、治験の全体を通してカルシウムサプリメントの摂取を中断するように念を押される。対象は医師の決定に基づいてビタミンＤ３補完物を服用するように忠告される。対象はかれらのグルココルチコイドの使用を記録する毎日の日記を保持するように依頼される。

来診３（８４±３日目）：ＤＥＸＡの走査を行う。ＢＭＤを腰椎（Ｌ２〜４）、大腿頸部及び全身について測定する。アルブミン、カルシウム（Ｃａ）、リン及びクレアチニン（Ｃｒ）の投与前血清レベル、並びに尿中のＣａ及びＣｒを測定する。骨代謝の生体マーカーを測定する。対象は、生じたかもしれない副作用及びＡＳについて尋ねられる。対象はＣＲＣへの最後の来診以来生じた骨折事象について尋ねられる。対象は錠剤の追加の包みを受け取り、各錠剤は０日目に受け取った同じ製剤の２００ｍｇの元素カルシウムを含有する（合計２１０錠、４２日分＋予備の２０錠）。対象は次の６週間（８４〜１２６日目）、１日に５カプセル、朝２錠、夕方３錠、食後に服用するように指導される。カルシウム関連の副作用をできるだけ抑えるために、カルシウムを定期的に服用する対象は、治験の全体を通してカルシウムサプリメントの摂取を中断するように念を押される。対象は医師の決定に基づいてビタミンＤ３補完物を服用するように忠告される。対象はかれらのグルココルチコイドの使用を記録する毎日の日記を保持するように依頼される。

来診４（１２６±３日目）：対象は、生じたかもしれない副作用及びＡＥについて尋ねられる。対象はＣＲＣへの最後の来診以来生じた骨折事象について尋ねられる。対象は錠剤の追加の包みを受け取り、各錠剤は以前の来診で受け取った同じ製剤の２００ｍｇの元素カルシウムを含有する（合計２１０錠、４２日分＋予備の２０錠）。対象は次の６週間（１２６〜１６８日目）、１日に５カプセル、朝２錠、夕方３錠、食後に服用するように念を押される。カルシウムを定期的に服用する対象は、治験の全体を通してカルシウムサプリメントの摂取を中断するように念を押される。対象は医師の決定に基づいてビタミンＤ３補完物を服用するように忠告される。対象はかれらのグルココルチコイドの使用を記録する毎日の日記を保持し、次の来診の際、それを持って来るように依頼される。

来診５（１６８±１日目）：ＤＥＸＡの走査を行う。ＢＭＤを腰椎（Ｌ２〜４）、大腿頸部及び全身について測定する。アルブミン、カルシウム（Ｃａ）、リン及びクレアチニン（Ｃｒ）の投与前血清レベル、並びに尿中のＣａ及びＣｒを測定する。骨代謝の生体マーカーを測定する。対象はＣＲＣへの最後の来診以来生じた骨折事象について尋ねられる。対象はＣＲＣの担当者と共にＴＳＱＭアンケートを完成させる。対象は、生じたかもしれない副作用及びＡＥについて尋ねられる。
転帰の測定

・骨ミネラル密度（ＢＭＤ）の維持−ＢＭＤは二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＥＸＡ）走査によって定義される。ＤＥＸＡの結果はＺスコア（同じ年齢、体重、民族性及び性別の他の人々と特定の走査の結果を比べること）として提示される。−１．５未満のＺスコアは骨量低下に寄与する年齢以外の因子の懸念を高める。
・骨折の有病率−骨折事象は各来診で記録される。
・骨形成マーカーの上昇
・骨再吸収マーカーの低下
・カルシウム副作用の査定
安全性の解析

安全性の解析は実際記述的であり、物語風である。安全性の終点は、試験治療に関係しようとしまいと有害事象（ＡＥ）及び重篤なＡＥ（ＳＡＥ）である。含まれるのはまた血清カルシウムのレベル及び尿中のカルシウムとクレアチニンのレベルである。
有効性の解析

主要な有効性の終点は、ＤＥＸＡ走査によって算出されるＺスコアによるＢＭＤの維持である。これらがほぼ正規分布するのであれば、生の値で独立した群のｔ−検定によって仮説を調べる。データが実質的に正規分布から逸脱するのであれば、対数変換を行ってデータを正規化する。後者を適用した後、データが依然として正規分布から逸脱するのであれば、ノンパラメトリックのＷｉｌｃｏｘｏｎの符号順位検定を使用する。Ｚスコアが対照に対して治療にて有意に小さいのであれば、治験は成功であると見なされる。

以下は試験の二次的な有効性の終点である：
・骨折頻度の低下
・ＴＳＱＭ（投薬に対する治療満足度アンケート）の領域：４つの尺度：有効性の尺度、副作用の尺度、利便性の尺度及び広い満足度の尺度から成る１４項目の精神測定学的にしっかりした検証されたアンケート
治験４：骨粗鬆症の発症に感受性の集団におけるカルシウムの消化管吸収

本試験の目的は骨量低下に関連する疾患の発症に感受性の集団におけるＡＣＣ供給源からのカルシウムの消化管吸収を評価することだった。治験は、閉経後の女性で実施される二重安定カルシウム同位元素法を用いた臨床試験である。

閉経から５年以内の１０人の閉経後の女性（表１２における人口統計データ）を試験に含めた。１８〜２９のＢＭＩを示す対象はすべて一見したところ健康であり、主な病気又は代謝性の骨障害を患っていなかった。除外基準には、食物日記の消費に基づいて、組み合わせた食事（サプリメントと食品の双方から）を介した推定１日＞１１００ｍｇのカルシウム摂取、血清における＜２０ｎｇ／ｍＬの値によって示されるビタミンＤ欠乏症、高カルシウム血症、腎結石症、炎症性大腸疾患、吸収不良、慢性の下痢、過去１ヵ月以内の抗生剤の使用を有する女性、及び消化器疾患、肝疾患、腎疾患又は炎症性疾患を患っている女性が含まれた。過去６ヵ月以内に経口のステロイド、抗痙攣剤、ビスホスホネート、エストロゲン化合物、カルシトニン又はテリパラチドを服用している女性も試験から除外された。イスラエル、テルアビブのＳｏｕｒａｓｋｙ医療センターの倫理委員会によるプロトコールの認可の後、各女性から書面でのインフォームドコンセントを得た。

分画吸収の解析は、１０人の対象すべてがＣＣＣの代わりにＡＣＣを投与された場合、カルシウム吸収に有意な上昇を示すことを明らかにした。

朝食後にカプセルを服用した９人の女性から得た結果の対応のあるｔ−検定解析は、ＡＣＣについて分画カルシウム吸収の有意な上昇を示した。各女性についてＣＣＣに対するＡＣＣからのカルシウムの相対吸収における平均の上昇は２．１倍（ｐ＜０．０１、図２）だった。

概して２つの別々の治療群として、ＣＣＣに比べてＡＣＣを女性に投与した場合、カルシウムの分画吸収には１．９の上昇があった（ｐ＜０．０５、図３）。

一晩空腹の後、空っぽの胃でカプセルを服用した１０人の女性のうち１人はカルシウムの分画吸収で４．６倍の上昇を提示した（図４）。
実験の詳細
カプセル及びＣａＣｌ_２溶液の調製及び標識

^４４ＣａＣＯ_３（９６．１％に濃縮，ロシア、モスクワのＣＭＲ）と共に適当な量のＡＣＣ（Ａｍｏｒｐｈｉｃａｌ社）を３２％のＨＣｌに溶解し、その後、治療当たり１５ｍｇの^４４Ｃａで標識した１９２ｍｇの元素カルシウム（６００ｍｇ粉末）を含有するＡＣＣ粉末の再析出させることによってＡＣＣを本質的に標識した。全体として３バッチの^４４ＡＣＣを調製し、４４：４２のモル比解析のために磁場熱イオン化分光分析（ＭＡＴ２６１；ドイツ、ブレーメンのＦｉｎｎｉｇａｎ）に送付し、原子吸収によるカルシウム含量測定（イスラエル、ベエルシェバのＢｅｎ−Ｇｕｒｉｏｎ大学の分析研究サービス）に送付した。各バッチの非晶質含量を評価する追加の試験：Ｘ−線回析（ＸＲＤ；ＴｈｅＮａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ，Ｂｅｎ−ＧｕｒｉｏｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、定量的偏光分光分析（ＱＰＳ）、偏光光学顕微鏡（ＰＯＭ）及び乾燥を行った。ＣＣＣ（イスラエル、Ｒｉｓｈｏｎ−ＬｅｚｉｏｎのＺｉｆｒｏｎｉＣｈｅｍｉｃａｌｓＳｕｐｐｌｉｅｒｓ社）は、適当な量のそれを^４４ＣａＣＯ_３（９６％に濃縮，ロシア、モスクワのＣＭＲ）と共に均質化し、治療当たり１５ｍｇの^４４Ｃａで標識した１９２ｍｇの元素カルシウム（４８ｍｇ粉末）を含有するＣＣＣ粉末に達することによって本質的に標識した。ＡＣＣカプセルにおける容量を一致させるために、スクロース（治療当たり１２０ｍｇ; オランダ、ロッテルダムのＦＡＧＲＯＮＧｍｂｈ＆Ｃｏ．ＫＧ）を各カプセルに加えた。^４４ＣＣＣのバッチを１つ調製し、４４：４２のモル比解析のために磁場熱イオン化分光分析（ＭＡＴ２６１；ドイツ、ブレーメンのＦｉｎｎｉｇａｎ）に送付した。

無菌性を確保するために層流フードのもとでイスラエル、Ｋｆａｒ−ＳａｂａのＰｈａｒｍａｃｙ社の構想によって同位元素ｉ．ｖ．^４２ＣａＣｌ_２溶液の調製手順を実施した。適当量の^４４ＣａＣＯ_３（９６％に濃縮，ロシア、モスクワのＣＭＲ）を３７％ＨＣｌに溶解し、０．４５％のＮａＣｌと混合した。１０ＮのＮａＯＨでｐＨを５．５に調整した。溶液を０．２２μの滅菌フィルターに通して無菌容器に入れた。後での使用のために個々の用量（１．５ｍｇの^４２Ｃａ／用量）を無菌バイアルに移した。使用前に無菌性試験及び発熱試験（イスラエル、Ｎｅｓ−ＺｉｏｎａのＡｍｉｎｏｌａｂ）のために及び原子吸収によるカルシウム含量測定（イスラエル、ベエルシェバのＢｅｎ−Ｇｕｒｉｏｎ大学の分析研究サービス）のためにアリコートを送付した。試験におけるｉ．ｖ．溶液はすべて無菌であり、発熱物質を含まない。
採尿及び解析

各カプセルの投与に続いて、カルシウム、ナトリウム、カリウム、尿素、クレアチニンの測定及び安定な同位元素の解析のために、時間を決めた２４時間の採尿を行った。カルシウム吸収の解析は、以前公開された方法（Yergey et al 1994）に従って、米国テキサス州、ヒューストンのＢａｙｌｏｒ医科大学で行った。シュウ酸アンモニウムを用いて尿試料におけるカルシウム同位元素を沈殿させた（Yergey et al 1980）。次いで抽出したカルシウムの量をカルシウム同位元素の比の測定に用いた。この量は、磁場熱イオン化分光分析（ＭＡＴ２６１；ドイツ、ブレーメンのＦｉｎｎｉｇａｎ）を用いて決定した。
ヒト試料の薬物動態計算

食事中カルシウムの分画吸収（α_２４ｈ）は、Ｙｅｒｇｅｙら、１９９４にて記載されたように算出した。手短には、比α_２４ｈは、２つの標識の血漿消失曲線下面積の比の算術的に有効な説明である。
統計的解析

分散の統計的解析は治験１に記載したように実施した。

上記の治験の結果は、骨に関連する障害の発症に感受性のヒトのモデル双方にて安定なＡＣＣはＣＣＣよりも高い消化管吸収を有することを確認した。そのような高い吸収は、結晶性のカルシウムの吸収が限定され、カルシウムの過剰が有害事象を招き得るので骨ミネラル密度を維持するのに高いカルシウム摂取が必要とされる場合、有益であり得る。
治験５：骨ミネラル密度の低下に関連する障害における骨量低下の予防又は遅延

本治験の目的は、骨粗鬆症のラットモデル（卵巣摘出、ＯＶＸ）にて大腿骨及び脊椎骨のミネラル密度（ＢＭＤ）によって査定される骨ミネラル化過程について種々の安定剤（Ｐ−Ｓｅｒ、クエン酸又はスクロース）を含むＡＣＣ源からのカルシウムの利用率を評価することだった。

試験では、４群（３つが卵巣摘出、１つが偽摘出）のラットを調べた。表１３に従って動物を調べた。

表１４は、治験の間のラットの平均食物摂取及び体重を提示する。偽摘出のラットに比べてＯＶＸの３群では有意な体重増加が認められた。これは、偽摘出のラットに比べてＯＶＸの群ではすべて食物摂取が低いという事実ものかかわらず、である。

このモデルで予想されたように、ＯＶＸ群の大腿骨のマイクロＣＴ走査は骨梁の骨ミネラル密度（ｔｂ.ＢＭＤ）及び他の形態測定パラメータ、すなわち、骨容量／組織容量（ＢＶ／ＴＶ）、骨梁の数（Ｔｂ.Ｎ）、骨梁の厚さ（Ｔｂ.Ｔｈ）の有意な低下、及び骨梁の分離（Ｔｂ．Ｓｐ）の有意な増大を明らかにした。加えて、３つのＯＶＸ群は、大腿骨の微細構造トポロジー及び配向パラメータ、すなわち、骨梁骨因子（ＴＢＰｆ）、構造モデル指数（ＳＭＩ）及び異方性の程度（ＤＡ）にてすべて偽摘出の動物と有意に異なった（表１５）。

４Ｌ椎骨のマイクロＣＴ走査の結果は、偽摘出群は他のＯＶＸ群すべてと比べてＢＭＤ、ＢＶ／ＴＶ及びＴｂ．Ｎのパラメータで有意に高く、ＴＢＰｆ及びＳＭＩの微細構造パラメータで有意に低い（表１５）。

骨梁のＢＭＤとは対照的に、大腿骨及び椎骨双方の皮質骨のＢＭＤ（Ｃｔ．ＢＭＤ）では全群間で差異は認められなかった（表１５）。

マイクロＣＴで調べたパラメータすべてにおいて、大腿骨及び椎骨双方にてＡＣＣ＋Ｓｅｒ群、ＡＣＣ＋ＣＩＴ群及びＡＣＣ＋ＳＵＣ群の間で差異が認められなかった（表６）ということは、それ自体によってＡＣＣを安定化する化合物は、ＢＭＤ又は追加の骨形態測定パラメータ又は微細構造パラメータに影響を有さないことを示している。

実験の詳細
動物
平均体重２４７±１４ｇ、１６〜１７週齢の４０匹のメスのスプラーグ・ドーリー系ラット（イスラエル、エルサレムのＨａｒｌａｎ社）を１４のケージで群飼し（２〜３匹／ケージ）、制御室条件（２１±２℃及び１２時間の明暗サイクル）に順化した。７日間の順化の間、ラットは１％の元素カルシウムを含有する標準の実験動物餌（＃２０１８ＳＣラット用餌、イスラエル、エルサレムのＨａｒｌａｎ社）及び脱イオン水を自由摂取させた。

７日間の順化期間に続いて、ケタミン（米国、オーバーランドパークのＦｏｒｔＤｏｄｇｅＡＨ社）及びキシラジン（英国、ブラーデルのＥｕｒｏＶｅｔＡＨ社）を含有する麻酔溶液（０．１ｍＬ／１００ｇ）の腹腔内（ＩＰ）注射を用いてラットを麻酔した。

ラットを無作為に割り当て、割り当てられた４群に従って手術した：偽摘出（卵巣の偽摘出、ＣＣＣ由来の１％の元素カルシウムを含有する標準の実験動物餌で飼った）及び他の３群はＬａｓｏｔａ及びＤａｎｏｗｓｋａ−Ｋｌｏｎｏｗｓｋａ（２００４）、ＲｏｃｚＡｋａｄＭｅｄＢｉａｌｙｍｓｔ４９Ｓｕｐｐｌ１：１２９−１３１に従って両側背面アプローチを用いて卵巣摘出し（ＯＶＸ）、ＯＶＸ−ＡＣＣ＋ＰＳ、ＯＶＸ−ＡＣＣ＋ＣＩＴ及びＯＶＸ−ＡＣＣ＋ＳＵＣに分けた。手術に続いて、順化期間と同じ条件下で７日間の回復期間を与え、標準の実験動物餌を自由摂取させ、１．５ｍｌ／４００ｍｌのジピロン（イスラエル、ＢｉｎｙａｍｉｎａのＶｉｔａｍｅｄ社）及び１ｍｇ／ｋｇのエンロフロキサシン（ドイツ、ＬｅｖｅｒｋｕｓｅｎのＢｕｙｅｒ社）を含有する脱イオン水を与えた。
実験的治療

回復期間の終了時、上述と同じ制御室条件下で群割り当てに従ってラットを群飼した（２匹／ケージ）。治療期間全体の間（９０日間）、割り当てた餌ペレット（表１３に記載した）及び脱イオン水を自由摂取させた。食物摂取及び体重を毎週記録した（表１４に記載した）。動的な組織形態測定解析のために、蛍光色素カルセイン（２０ｍｇ／体重ｋｇ；イスラエル、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を７６及び８６日目にラットすべてにＩＰ注射した。９０日目にラットを代謝ケージで個別飼育し、食物と水を１８時間取り上げた。各代謝漏斗から尿を採取し、実験の終了時（時間９０）骨再吸収生化学マーカーのさらなる解析のために−８０℃に保存した。尿採取の直後、９０日目の形成生化学マーカーを評価するために血清試料を抽出した。ラットはすべてＣＯ_２によって屠殺した。右大腿骨と第４腰椎を切除し、生理食塩水緩衝液に浸したガーゼパッドに包んで骨のマイクロＣＴ走査のために−８０℃で保持した。機械的な試験のために右大腿骨と同じ条件で第５腰椎を保存した。右脛骨を切除し、構造的な及び動的な組織形態測定のために、直ちに４℃にて３．７％のホルムアルデヒド溶液（Ｆ１６３６、イスラエル、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に２４時間入れた。
マイクロ−コンピュータ断層撮影（μＣＴ）走査

右大腿骨と第４腰椎の骨梁骨及び皮質骨の微細構造をμＣＴスキャナー（ベルギー、ＫａｒｔｕｉｚｅｒｓｗｅｇＫｏｎｔｉｃｈのＳｋｙｓｃａｎ１１７４）で解析した。０．２５及び０．７５ｇ／ｃｍ^３の密度を持つ指定されたラットのファントムロッド（ベルギー、ＫａｒｔｕｉｚｅｒｓｗｅｇＫｏｎｔｉｃｈのＳｋｙｓｃａｎ）を用いて製造元の指示書に従って骨ミネラル密度（ＢＭＤ）についてスキャナーの較正を行った。

走査解析に先立って、大腿骨と第４腰椎を−８０℃から取り出し、（製造元の指針に従って）プラスチックの上に置いた。１３．８μｍの等方性分解能にて骨梁骨及び皮質骨のパラメータについて各大腿骨の遠位領域を走査した。ＳｋｙｃａｎＮｒｅｃｏｎソフトウエア（バージョン１.６．４、Ｓｋｙｃａｎ）を用いて改変したアルゴリズムを採用して再構築を行った。関心体積（ＶＯＩ）は成長板の下で０．８ｍｍに設定し、遠位に１．５ｍｍ伸ばした。ＶＯＩの中での骨梁及び皮質の断片は、スキャナーと共に提供されるＣＴ解析ソフトウエア（バージョン１．１１、Ｓｋｙｃａｎ）を用いて約５枚の切片ごとに楕円体の輪郭を描くことによって抽出した。骨梁及び皮質のＢＭＤ、骨容量（ＢＶ／ＴＶ、％）、骨梁の数（Ｔｂ．Ｎ）、骨梁の厚さ（Ｔｂ．Ｔｈ、μｍ）、骨梁の分離（Ｔｂ．Ｓｐ、μｍ）は、骨梁のパターン因子（ＴＢＰｆ）の微細構造パラメータ及び構造モデル指標（ＳＭＩ）と共に、ＣＴアナライザのソフトウエア（バージョン１．１１、Ｓｋｙｃａｎ）によって自動的に算出された。

各ラットからの第４腰椎を１３．８ｍｍの等方性分解能で走査し、大腿骨について上述されたのと同じ手順で骨梁及び皮質のパラメータの評価のために椎体の中央からの１．２５ｍｍ厚さの断面をカバーするようにＶＯＩを設定した。
治験６：代謝性の骨関連障害における高い骨ミネラル密度

本発明者らは、代謝性の骨障害、特に卵巣摘出ラットモデルで提示されるような骨粗鬆症における骨ミネラル密度及び骨断片に対する非晶質炭酸カルシウム（ＡＣＣ）の効果を評価することを目的とする試験を実施しているが、その際、ＡＣＣは骨粗鬆症に対する標準的な投薬に併用して投与される。本治験では、５群のラットを調べた（４群がＯＶＸで１群が偽摘出）。手術に続いて、ラットはすべて骨減少症を発症させるために２ヵ月の期間、未処理のままだった（標準の実験動物餌で飼った）。誘導期間の終了時、２つの異なるカルシウム源：非晶質炭酸カルシウム（ＡＣＣ）又は結晶炭酸カルシウム（ＣＣＣ）に由来するペレットの形態での特殊な餌混合物で動物を治療した。２種の混合物に由来するペレットは、元々の餌ペレットで見られる量（２２ＩＵのビタミンＤ／ｇ）を除いて添加のビタミンＤを伴わない原子吸収装置（米国、カリフォルニア州、パロアルトのＶａｒｉａｎＡＡ２４０）によって確認されたような約１％の元素カルシウムを含有した。加えて、表１６に記載されるような群の割り当てに従って、生理食塩水又は２μｇ／ｋｇのアレンドロネート（ＡＬＮ）を動物にｉ，ｖ．注射した（３回／週）。

表１７は、治験の間のラットの平均食物摂取及び体重を提示する。偽摘出に比べてＯＶＸのラットすべてにて有意な体重増加が認められた。これは、食物摂取が全群の間で類似しているという事実にもかかわらず、である。

各群からの代表的な遠位大腿骨及び第４腰椎のマイクロＣＴ（μＣＴ）三次元の模式的な微細構造の再構築を図５に提示する。大腿骨の骨梁幹端と同様に椎体の再構築は３つの異なる群：最高の観察された骨梁骨領域を持つ偽摘出含む第１の群（図５Ａ）、他の群すべてと比べて最低の骨梁骨領域を持つＯＶＸ−ＣＣＣを含む第２の群（図５Ｂ）、ＣＣＣに比べて骨梁骨領域の控えめな増大を伴うＯＶＸ−ＡＣＣ及びＯＶＸ−ＣＣＣ＋ＡＬＮを含む第３の群（図５Ｃ及び５Ｄ）、及び第３の群に比べて骨梁骨領域の相加的増大を伴うＯＶＸ−ＡＣＣ＋ＡＬＮを含む第４の群（図５Ｅ）の差別化を可能にする。

観察された４群間の差異はまた骨梁骨ミネラル密度（ＢＭＤ）及び図６及び表１８にて提示する大腿骨幹端及び第４腰椎の形態測定解析にも反映される。

図６Ａ〜Ｂにて説明されるように、偽摘出群の骨梁大腿骨のＢＭＤは４つのＯＶＸ群すべてと比べて有意に高かった。ＯＶＸ群の中では、ＡＣＣ治療群の骨梁大腿骨及び椎骨のＢＭＤは、ＣＣＣの骨梁大腿骨ＢＭＤと比べてそれぞれ２２％及び３９％高かった。ＣＣＣ＋ＡＬＮ治療群の骨梁大腿骨及び椎骨のＢＭＤは、ＣＣＣの骨梁大腿骨ＢＭＤと比べてそれぞれ４９％及び７２％高かった。ＡＣＣ＋ＡＬＮ治療群の骨梁大腿骨及び椎骨のＢＭＤは、ＣＣＣの骨梁大腿骨ＢＭＤと比べてそれぞれ７５％及び１０５％高かったし、ＣＣＣの代わりにＡＬＮにＡＣＣを添加することはそれぞれ大腿骨及び椎骨にてＢＭＤを２６％及び３３％高め、ＡＬＮとの併用でのＡＣＣについてのＢＭＤ値に対する相加陽性効果を表している。

骨梁ＢＭＤとは対照的に、大腿骨及び椎骨双方の皮質骨のＢＭＤ（Ｃｔ．ＢＭＤ）には全群間で差異は認められなかった（表１８）。

遠位大腿骨幹端及び第４腰椎の形態測定解析は、偽摘出に比べて卵巣摘出群すべてにおいて骨梁分画（ＢＶ／ＴＶ）の有意な低下を示した。ＯＶＸ群の大腿骨及び椎骨の中で、ＣＣＣ群に比べてＡＣＣはそれぞれ３４％及び２３％の有意に高い骨梁分画を提示した。類似の結果はＣＣＣ＋ＡＬＮ群についても得られ、それはＣＣＣに比べて大腿骨で３７％及び椎骨で４６％の増大を提示した。ＡＬＮの併用でのＡＣＣは、ＣＣＣに比べて大腿骨で５６％及び椎骨で７１％の増大、及びＡＬＮ＋ＣＣＣに比べてそれぞれ大腿骨と椎骨で１９％と２５％の増大を生じたということは、ＡＬＮとの併用でのＡＣＣについてのＢＶ／ＴＶ値の増大に対する相加効果を再び表している（図６Ｃ〜Ｄ）。

偽摘出と比べた卵巣摘出群のすべてにおいて骨梁の数（Ｔｂ.Ｎ）での有意な低下は大腿骨及び椎骨の双方で認められた。ＯＶＸ群の大腿骨及び椎骨の中では、ＣＣＣ群に比べてＡＣＣは平均１７％の高い骨梁数を提示した。さらに高い成績がＣＣＣ＋ＡＬＮ群で得られ、それはＣＣＣに比べて大腿骨及び椎骨で平均５０％の増大を提示した。ＡＬＮと併用したＡＣＣは、ＣＣＣと比較して大腿骨及び椎骨にて６２％の平均増大を生じ、ＡＬＮ＋ＣＣＣと比較して大腿骨及び椎骨にて１３％の平均増大を生じたということは、ＡＬＮとの併用でのＡＣＣについてＴｂ．Ｎ値の増加に対する相加効果を表している（表１８）。

偽摘出と比べた卵巣摘出群すべてにおける骨梁分離（Ｔｂ．Ｓｐ）の有意な増加は、大腿骨及び椎骨の双方で認められた。ＯＶＸ群の大腿骨及び椎骨の中では、ＡＣＣはＣＣＣ群と比べて平均１１％の低い分離数を提示した。さらに低い結果は、ＣＣＣ＋ＡＬＮ群で得られたが、それは、ＣＣＣと比較して大腿骨及び椎骨にて平均３８％の低下を提示した。ＡＬＮとの併用でのＡＣＣは、ＣＣＣとの比較で大腿骨及び椎骨にて５４％の類似した低下、及びＡＬＮ＋ＣＣＣとの比較で大腿骨及び椎骨にて１６％の平均した低下を生じたということは、ＡＬＮとの併用でＡＣＣの相加的効果をさらに支持する（表１８）。

骨梁の厚さ（Ｔｂ．Ｔｈ）の解析は、全試験群の間で大腿骨には変化がなく、椎骨にはわずかな変化にのみがあることを明らかにしたが、ＣＣＣに比べて偽摘出群における骨梁厚さにおけるたった１２％の増大、ＣＣＣ群に比べたＡＣＣ群における９％の増加、ＣＣＣのみに比べたＡＬＮ治療に続くたった２％の増加、及び偽摘出に類似する１１％のＴｂ．Ｔｈ値の増大によって反映されるＡＬＮとの併用でのＡＣＣの小さな相加効果を明らかにした（表１８）。

トポロジーの微細構造解析及び配向パラメータ：骨梁パターン因子（ＴＢＰｆ）及び構造モデル指標（ＳＭＩ）は、卵巣摘出介入が大腿骨及び椎骨の双方にてＴＢＰｆ及びＳＭＩの増加を生じることを明らかにした。大腿骨のＡＣＣでは、治療は、この領域でこれらのパラメータに対してわずかな効果しか有さないＣＣＣ＋ＡＬＮよりもＴＢＰｆ及びＳＭＩにて大きな低下を生じた。さらに、椎骨では、ＡＣＣによる治療は、ＣＣＣ＋ＡＬＮに比べてＴＢＰｆ及びＳＭＩの値で小さな低下を生じた。ＡＣＣ＋ＡＬＮによる治療は、ＣＣＣによる治療に比べてＴＢＰｆ及びＳＭＩの値について大腿骨で１２％及び椎骨で３７％の相加的な平均低下を生じた（表１８）。
実験の詳細
動物

平均体重２４６±１７ｇ、１６週齢の５３匹のメスのスプラーグ・ドーリー系ラット（イスラエル、エルサレムのＨａｒｌａｎ社）を２６のケージで群飼し（２〜３匹／ケージ）、制御室条件（２１±２℃及び１２時間の明暗サイクル）下で順化した。７日間の順化の間、ラットは１％の元素カルシウムを含有する標準の実験動物餌（＃２０１８ＳＣラット用餌、イスラエル、エルサレムのＨａｒｌａｎ社）及び脱イオン水を自由摂取させた。

異なるカルシウム源の投与のために、特定の餌ペレットを調製した。０．０２％のカルシウムを含有する低カルシウム齧歯類用ペレット（ラット餌＃ＴＤ９５０２７、イスラエル、エルサレムのＨａｒｌａｎ社）を微細に粉砕して２つの異なるカルシウム源と別々に混合した。結晶炭酸カルシウムに由来する１％元素カルシウムを含有するＣＣＣミックス（Ｓｏｃａｌ（登録商標）、沈殿させた炭酸カルシウム）及び安定な非晶質炭酸カルシウムに由来する１％元素カルシウムを含有するＡＣＣミックス（１％のホスホセリンと２％のクエン酸塩を含有する；イスラエル、Ｂｅｅｒ−ＳｈｅｖａのＡｍｏｒｐｈｉｃａｌ社）。ミックスごとに別々にペレット化し、室温にて密封袋に保持した。

７日間の順化期間に続いて、ケタミン（米国、オーバーランドパークのＦｏｒｔＤｏｄｇｅＡＨ社）及びキシラジン（英国、ブラーデルのＥｕｒｏＶｅｔＡＨ社）を含有する麻酔溶液（０．１ｍＬ／１００ｇ）の腹腔内（ＩＰ）注射によってラットを麻酔した。

ラットを無作為に割り当て、割り当てられた５群に従って手術した：偽摘出（卵巣の偽摘出、ｎ＝９）及び他の３群はＬａｓｏｔａ及びＤａｎｏｗｓｋａ−Ｋｌｏｎｏｗｓｋａ（２００４）、ＲｏｃｚＡｋａｄＭｅｄＢｉａｌｙｍｓｔ４９Ｓｕｐｐｌ１：１２９−１３１に従って両側背面アプローチを用いて卵巣摘出し（ＯＶＸ）、ＯＶＸ−ＣＣＣ（ｎ＝１０）、ＯＶＸ−ＡＣＣ（ｎ＝１０）、ＯＶＸ−ＣＣＣ＋ＡＬＮ（ｎ＝１２）及びＯＶＸ−ＡＣＣ＋ＡＬＮ（ｎ＝１２）に分けた。手術に続いて、３日間の回復期間を与え、その間に、１．５ｍｌ／４００ｍｌのジピロン（イスラエル、ＢｉｎｙａｍｉｎａのＶｉｔａｍｅｄ社）及び１ｍｇ／ｋｇのエンロフロキサシン（ドイツ、ＬｅｖｅｒｋｕｓｅｎのＢｕｙｅｒ社）を含有する脱イオン水で動物を処理した。動物は骨減少症を発症させるために標準の実験動物餌を自由摂取させ、順化期間と同じ条件下で２ヵ月の期間、未処理のままだった。

２ヵ月後、ラットは表１６に記載された割り当てに従って４カ月の期間の治療を開始した。治療期間全体にわたって、割り当てた補完ペレット及び脱イオン水は自由摂取で提供した。食物摂取及び体重を毎週記録した（表１７）。治療期間の終了時、ラットはすべてＣＯ_２によって屠殺した。右大腿骨と第４腰椎を切除し、生理食塩水緩衝液に浸したガーゼパッドに包んで骨のマイクロＣＴ走査のために−８０℃で保持した。
マイクロ−コンピュータ断層撮影（μＣＴ）走査

各ラットからの第４腰椎を１３．８ｍｍの等方性分解能で走査し、大腿骨について上述されたのと同じ手順で骨梁及び皮質のパラメータの評価のために椎体の中央からの１．２５ｍｍ厚さの断面をカバーするようにＶＯＩを設定した。

上記治験の結果は、安定なＡＣＣが骨ミネラル密度及び他の骨パラメータに対してＣＣＣよりも高い効果を有することを確認した。さらに、骨量低下の治療のための標準的な投薬と併用したＡＣＣの投与がＣＣＣに比べて相加的な効果を生じるということは、ビスホスホネートの投与量を減らすことを可能にし、骨ミネラル密度を高めるために及び代謝性の骨の障害、疾患及び状態を治療するために、生体利用効率の高いＡＣＣを単独で又は保存的投薬との併用で使用することができることを裏付けている。
治験７：代謝性の骨障害の発症を防ぐこと又は遅延させること

本発明者らは、骨の代謝性障害、特に卵巣摘出（ＯＶＸ）ラットモデルによって提示されるような骨粗鬆症の予防に対する結晶炭酸カルシウム（ＣＣＣ）と比べた安定な非晶質炭酸カルシウム（ＡＣＣ）に由来するカルシウムの効果を評価することを目的とする試験を実施した。

試験では、５群のラットを調べた（４群は卵巣摘出で１群は偽摘出）。４つの異なるカルシウム源：対照として役立つ市販の結晶炭酸カルシウム（ミックスＡ）、天然のＡＣＣ（胃石粉末）（ミックスＢ）、合成ＡＣＣ（微量のホスホセリンを含む）（ミックスＣ）及び市販の結晶クエン酸カルシウム（ミックスＤ）に由来するペレットの形態での特定の餌混合物によってＯＶＸ動物を飼育した。偽摘出群は対照と同じ餌を投与した。４種の混合物すべてのペレットは、元々の餌ペレットで見られる量（２２ＩＵのビタミンＤ／ｇ）除いてビタミンＤを添加しないで、原子吸収装置（米国、カリフォルニア州、パロアルトのＶａｒｉａｎＡＡ２４０）によって確認され、表１９に記載されたような約０．５％の元素カルシウムを含有した。

カルシウムの供給源は、市販の結晶性ＣａＣＯ_３（炭酸塩）、オーストラリアザリガニＣｈｅｒａｘｑｕａｄｒｉｃａｒｉｎａｔｕｓに由来する胃石粉末（胃石）、合成の安定な非晶質炭酸カルシウム（ＡＣＣ）及び市販のサプリメントに由来するクエン酸カルシウム（クエン酸塩）から入手した。値は平均値として表される。

表２０は、治験の間での平均食物摂取及び体重を表す。偽摘出と比べてＯＶＸラットすべてにおいて有意な体重増加が認められた。これは、食物摂取が全群間で類似するという事実にもかかわらず、である。

各群からの代表的な遠位大腿骨及び第４腰椎のマイクロＣＴ（μＣＴ）三次元の模式的な微細構造の再構築を図７に提示する。大腿骨の骨梁幹端と同様に椎体の再構築は、３つの異なる群：最高の観察された骨梁骨領域を持つ偽摘出含む第１の群（図７Ａ）、偽摘出と比べて最低の骨梁骨領域を持つＯＶＸ対照とクエン酸塩を含む第２の群（図７Ｂ及び７Ｅ）、並びに偽摘出と比べて骨梁骨領域の穏やかな低下を伴うＯＶＸ胃石とＡＣＣを含む第３の群（図７Ｃ及び図７Ｄ）の差別化を可能にする。

観察された４群間の差異はまた、骨梁骨ミネラル密度（ＢＭＤ）及び図８、図９及び表２１にて提示する大腿骨幹端及び第４腰椎の形態測定解析にも反映される。

図８Ａで説明するように、偽摘出群の骨梁大腿骨ＢＭＤはＯＶＸ４群すべてと比べて有意に高く：対照、胃石、ＡＣＣ及びクエン酸塩の群はそれぞれ、６４％、４５％、５０％及び６３％の有意差を伴った。匹敵する値は、ＯＶＸ４群すべてと比較した偽摘出群の、図８Ｂで提示された骨梁大腿骨ＢＭＤでも得られた。ＯＶＸ群の中では、胃石及びＡＣＣの骨梁大腿骨及び椎骨のＢＭＤ（図８Ａ及び８Ｂ）は、対照の骨梁ＢＭＤに比べてそれぞれ大腿骨で３８％及び椎骨で３２％有意に高かった。対照に比べてクエン酸塩の骨梁大腿骨及び椎骨のＢＭＤでは有意差はなかった。胃石群とＡＣＣ群の間での比較は、骨梁大腿骨ＢＭＤではＡＣＣに対して胃石に有利な１３％の統計的な差異を明らかにしたが、骨梁椎骨のＢＭＤでは差異はなかった。

骨梁のＢＭＤとは対照的に、大腿骨及び椎骨双方の皮質骨のＢＭＤ（Ｃｔ.ＢＭＤ）には全群間で有意差は認められなかった（表２１）。

遠位大腿骨幹端及び第４椎体の形態測定解析（図９及び表２１）は、偽摘出に比べて卵巣摘出の全群で骨梁の分画（ＢＶ／ＴＶ）及びその数（Ｔｂ．Ｎ）の有意な低下を示した。対照群は偽摘出に比べて、遠位大腿骨で平均６５％（図９Ａ及び表２１Ａ）、及び椎骨で６０％（図３Ｂ及び表３Ｂ）有意に低かった。ところが、遠位大腿骨におけるＯＶＸの胃石及びＡＣＣの群の平均は偽摘出に比べて、たった４１％及び４９％低かったし、椎骨ではそれぞれ４０％及び４１％低かった。ＯＶＸ群の大腿骨の中では、胃石とＡＣＣは対照に比べてそれぞれ平均６５％及び４９％有意に高い骨梁骨分画および骨梁の数を提示した。類似の結果は、胃石及びＡＣＣの群の腰椎でも得られ、それぞれ対照に比べて４８％及び４７％のさらに高かった。クエン酸塩と対照の間では骨梁分画とその数の間での有意な差異はなかった。

胃石群とＡＣＣ群の大腿骨間の比較は、骨断片、骨梁の厚さ及び骨梁の分離における有意差を明らかにした。図９Ａ及び表２１Ａにて提示される結果によれば、胃石群の大腿骨はＡＣＣに比べて１６％の有意に高い骨分画、９％の大きな骨梁厚さ及び２４％の小さな骨梁分離を示した。ＡＣＣに比べて１２％の有意に大きな骨梁厚さは胃石群の椎骨でも認められたが、胃石群とＡＣＣ群の間の形態測定パラメータの残りには有意差は認められなかった（図９Ｂ及び表２１Ｂ）。

微細構造の構造における群間の差異は、表２２Ａで提示されるように、近位脛骨の脱灰していない構造の組織形態測定解析にてさらに強調される。表２２Ａにて提示される結果によれば、ＯＶＸ群はすべて、すなわち、対照群、胃石群、ＡＣＣ群及びクエン酸塩群は偽摘出群に比べて有意に低い骨梁骨分画及び濃縮された骨梁値を提示した（それぞれ、平均５５％、１９％、３２％及び５５％）。さらに、骨梁分離は偽摘出群に比べてＯＶＸ群すべてにて、対照群については１３０％、胃石群については３０％、ＡＣＣ群については６０％及びクエン酸塩群については１４８％有意に高かった。ＯＶＸ群の中では、対照群に比べて、胃石群及びＡＣＣ群はそれぞれ、平均８０％及び５０％の有意に高い骨梁骨分画及び骨梁数を提示し、４４％及び３１％の低い骨梁分離を提示した。クエン酸塩群は対照群に比べて１３％の有意に大きな骨梁厚さを提示した。胃石群とＡＣＣ群の間での構造の組織形態測定のパラメータの比較は骨分画、骨梁の数及び骨梁分離にて有意差を明らかにした。表２２Ａによれば、胃石群は、それぞれＡＣＣ群に比べて１９％及び２１％の高い骨分画及び骨梁の数を提示し、ＡＣＣ群に比べて２０％の低い骨梁分離の値を提示した。

動的な組織形態測定解析の結果は表２２Ｂに提示する。結果によれば、偽摘出群に比べて、ＯＶＸの対照群及びクエン酸塩群の骨表面に対する骨形成率（ＢＦＲ／ＢＳ）及び骨表面に対するミネラル化表面（ＭＳ／ＢＳ）には有意差は認められなかった。それに対して、ＯＶＸの胃石群及びＡＣＣ群の骨形成率は偽摘出群に比べて５３％及び５０％高く、ＯＶＸの胃石群及びＡＣＣ群のＭＳ／ＢＳは偽摘出群に比べてそれぞれ４４％及び３８％の類似する上昇を提示した。ＯＶＸ群の中では、胃石群及びＡＣＣ群は対照群と比べてそれぞれ、３８％及び３５％の有意に高い骨形成率、並びに４０％及び３３％の有意に高いＭＳ／ＢＳを提示した。ＯＶＸのクエン酸塩群は、対照群とは有意差を示さなかったが、胃石群より２８％及びＡＣＣ群より２６％統計的に低い骨形成率を提示した。ＯＶＸのクエン酸塩群のＭＳ／ＢＳは対照群とは類似し、胃石群及びＡＣＣ群よりそれぞれ２９％及び２６％有意に低かった。

石灰化速度（ＭＡＲ）は偽摘出群に比べてＯＶＸ群すべてにおいて有意差を示さず、対照群に比べてＯＶＸの胃石群、ＡＣＣ群及びクエン酸群の差異はなかった。実験終了時（９０日目）での各群の血清オステオカルシン（ＯＣ）形成マーカー及び尿デオキシピリジノリン（ＤＰＤ）再吸収マーカーによる骨代謝回転のＥＬＩＳＡキット査定を表２３に提示する。双方のマーカーは無作為化に先立ってベースラインについて評価された（０日目、データは示さず）。

９０日目では、偽摘出群とは有意差を示さず、対照群（３９％）及びクエン酸塩群（４８％）よりも有意に低いＤＰＤレベルを提示したＡＣＣ群を除いて、偽摘出群と比べてＯＶＸ群すべてにて有意に高いＤＰＤレベルが認められた。胃石群は対照群（１９％）より低いレベルでＡＣＣ群（３２％）より高いレベルのＤＰＤを提示した。胃石群のＤＰＤレベルはクエン酸塩群より有意に低くはなかったが、３１％の低下を示した。血清ＯＣマーカーでは、群間には有意な変化は認められなかった。

第５腰椎の機械的強度の解析の結果を図１０に提示する。結果によれば、ＯＶＸの対照群、胃石群及びクエン酸塩群の機械的強度特性は、それぞれ平均４１％、４０％及び４０％偽摘出群と比べて有意に低かった。それに対して、ＡＣＣの機械的強度値は偽摘出群と比べて平均１７％有意に低かった。これらの差異は、有意差のなかった最大圧パラメータ（図１０Ｄ）を除いて評価されたほとんどのパラメータにて統計的に有意だった。ＯＶＸ群の中では、ＡＣＣ群はあらゆる調べたパラメータ：最大圧（図１０Ａ）、最大圧エネルギー（図１０Ｂ）、強靭性（図１０Ｃ）及び降伏時エネルギー（図１０Ｄ）にて対照群に比べてそれぞれ平均で３７％、４９％、２９％及び６５％有意に高い値を提示した。これらの差異はまた胃石群及びクエン酸塩群と比べてそれぞれ平均で４２％及び３７％高いＯＶＸのＡＣＣ群の値に反映される。ＯＶＸの胃石群及びクエン酸塩群は調べた機械的強度のパラメータで対照群又はそれら間で有意差を提示しなかった。

第４腰椎のマイクロＣＴ解析は、骨梁骨のパターン因子（ＴＢＰｆ）が、ＯＶＸ−対照群、ＯＶＸ−胃石群及びＯＶＸ−クエン酸群よりも偽摘出群ではるかに低い（平均９１％）ことを示した。しかしながら、偽摘出群のＴＢＰｆはＯＶＸ−ＡＣＣ群について測定されたものよりも低かった（６１％）。ＯＶＸ群の中では、ＯＶＸ−ＡＣＣ群のＴＢＰｆは、ＯＶＸ−対照群、ＯＶＸ−胃石群及びＯＶＸ−クエン酸群よりも平均で３３％（図１０Ｅ、ｐ＜０．００１）有意に低かった。構造モデル指標（ＳＭＩ）の評価は同じ傾向を指摘し、ＯＶＸ−対照群、ＯＶＸ−胃石群及びＯＶＸ−クエン酸群よりも偽摘出群で有意に低かった（平均で４３％）。しかしながら、偽摘出群のＳＭＩはＯＶＸ−ＡＣＣ群について測定されたものよりも低かった（３０％）。ここで、ＯＶＸ−ＡＣＣ群で得られた値はＯＶＸ−対照群及びＯＶＸ−クエン酸群について測定されたものよりも有意に低かった（平均で１４％）。同時に、ＯＶＸ−ＡＣＣ群で得られたＳＭＩ値はＯＶＸ−胃石群で測定された指標に対して低下した（図１０Ｆ、ｐ＜０．００１）。測定された最後の微細構造パラメータ、すなわち、異方性の程度（ＤＡ）は、ＯＶＸ−対照群、ＯＶＸ−胃石群及びＯＶＸ−クエン酸群と比べて偽摘出群で平均２２％低かった。ＯＶＸ−ＡＣＣ群は他のＯＶＸ群で測定されたものより低い値を示したものの（図１０Ｇ；ｐ＜０．００１）、偽摘出群とＯＶＸ−ＡＣＣ群の間又はＯＶＸ全群間でＤＡにおける有意差は認められなかった。
実験の詳細
動物

平均体重２５０±１６ｇ、１６〜１７週齢の１００匹のメスのスプラーグ・ドーリー系ラット（イスラエル、エルサレムのＨａｒｌａｎ社）を３３のケージで群飼し（〜３匹／ケージ）、制御室条件（２１±２℃及び１２時間の明暗サイクル）に順化した。７日間の順化の間、ラットは１％の元素カルシウムを含有する標準の実験動物餌（＃２０１８ＳＣラット用餌、イスラエル、エルサレムのＨａｒｌａｎ社）及び脱イオン水を自由摂取させた。７日間の順化期間に続いて、代謝ケージにてラットを個別飼育し、１８時間餌と水を取り上げた。各代謝漏斗から尿を採取し、ベースライン（時間０）での骨再吸収生化学マーカーのさらなる解析のために−８０℃に保存した。

異なるカルシウム源の投与のために、特定の餌ペレットを調製した。０．０２％のカルシウムを含有する低カルシウム齧歯類用ペレット（ラット餌＃ＴＤ９５０２７、イスラエル、エルサレムのＨａｒｌａｎ社）を微細に粉砕して４つの異なるカルシウム源と別々に混合した。市販のサプリメントに由来する炭酸カルシウムを含有する対照のミックス（ミックスＡ）、オーストラリアザリガニＣｈｅｒａｘｑｕａｄｒｉｃａｒｉｎａｔｕｓから回収した胃石粉末を含有する胃石ミックス（ミックスＢ）（イスラエル、ＢｅｅｒＴｚｏｆａｒのＢｅｎ’ｓｆａｒｍ）、安定な非晶質炭酸カルシウムとＰ−セリン（Ｐ−Ｓｅｒ）を含有するＡＣＣミックス（バッチ＃ＥＴＳ００１，イスラエル、Ｂｅｅｒ−ｓｈｅｖａのＡｍｏｒｐｈｉｃａｌ社）（ミックスＣ）及び市販のサプリメントに由来する炭酸カルシウムを含有するクエン酸ミックス（ミックスＤ）。ミックスごとに別々にペレット化し、室温にて密封袋に保持した。

尿採取の直後、ケタミン（米国、オーバーランドパークのＦｏｒｔＤｏｄｇｅＡＨ社）及びキシラジン（英国、ブラーデルのＥｕｒｏＶｅｔＡＨ社）を含有する麻酔溶液（０．１ｍＬ／１００ｇ）の腹腔内（ＩＰ）注射によってラットを麻酔した。ラットの尾から血液を採取し（約１８０μＬ）、血清抽出のために卓上遠心機（スイス、バッハのＨｅｔｔｉｃｈＺｅｎｔｒｉｆｕｇｅｎ）を用いて３０００ｇにて１０分間遠心した。ベースライン（時間０）での骨形成生化学マーカーの将来の解析のために血清試料を−８０℃で保存した。

ラットを無作為に割り当て、割り当てられた５群に従って手術した：偽摘出（卵巣の偽摘出）はミックスＡで飼い、他の４群はＬａｓｏｔａ及びＤａｎｏｗｓｋａ−Ｋｌｏｎｏｗｓｋａ（２００４）、ＲｏｃｚＡｋａｄＭｅｄＢｉａｌｙｍｓｔ４９Ｓｕｐｐｌ１：１２９−１３１に従って両側背面アプローチを用いて卵巣摘出し（ＯＶＸ）、ＯＶＸ−対照群（ミックスＡで飼った）、ＯＶＸ−胃石群（ミックスＢで飼った）、ＯＶＸ−ＡＣＣ群（ミックスＣで飼った）及びＯＶＸ−クエン酸塩群（ミックスＤで飼った）に分け、ラットには、順化期間と同じ条件下で７日間の回復期間を与え、標準の実験動物餌を自由摂取させ、１．５ｍｌ／４００ｍｌのジピロン（イスラエル、ＢｉｎｙａｍｉｎａのＶｉｔａｍｅｄ社）及び１ｍｇ／ｋｇのエンロフロキサシン（ドイツ、ＬｅｖｅｒｋｕｓｅｎのＢｕｙｅｒ社）を含有する脱イオン水を与えた。
実験的治療

回復期間の終了時、上述と同じ制御室条件下で群割り当てに従ってラットを群飼した（２匹／ケージ）。治療期間全体の間（９０日間）、割り当てたサプリメントペレット及び脱イオン水を自由摂取させた。食物摂取及び体重を毎週記録した（表２）。動的な組織形態測定解析のために、蛍光色素カルセイン（２０ｍｇ／体重ｋｇ；イスラエル、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を７６及び８６日目にラットすべてにＩＰ注射した。９０日目にラットを代謝ケージで個別飼育し、食物と水を１８時間取り上げた。各代謝漏斗から尿を採取し、実験の終了時（時間９０）骨再吸収生化学マーカーのさらなる解析のために−８０℃に保存した。尿採取の直後、９０日目の形成生化学マーカーを評価するために血清試料を抽出した。ラットはすべてＣＯ_２によって屠殺した。右大腿骨と第４腰椎を切除し、生理食塩水緩衝液に浸したガーゼパッドに包んで骨のマイクロＣＴ走査のために−８０℃で保持した。機械的な試験のために右大腿骨と同じ条件で第５腰椎を保存した。右脛骨を切除し、構造的な及び動的な組織形態測定のために、直ちに４℃にて３．７％のホルムアルデヒド溶液（Ｆ１６３６、イスラエル、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に２４時間入れた。
マイクロ−コンピュータ断層撮影（μＣＴ）走査

右大腿骨と第４腰椎の骨梁骨及び皮質骨の微細構造をμＣＴスキャナー（ベルギー、ＫａｒｔｕｉｚｅｒｓｗｅｇＫｏｎｔｉｃｈのＳｋｙｓｃａｎ１１７４）を用いて解析した。０．２５及び０．７５ｇ／ｃｍ^３の密度を持つ指定されたラットのファントムロッド（ベルギー、ＫａｒｔｕｉｚｅｒｓｗｅｇＫｏｎｔｉｃｈのＳｋｙｓｃａｎ）を用いて製造元の指示書に従って骨ミネラル密度（ＢＭＤ）についてスキャナーの較正を行った。

走査解析に先立って、大腿骨と第４腰椎を−８０℃から取り出し、７０％エタノールに浸した新しいガーゼパッドに移し、７０％エタノールで満たされたプラスチックバイアルに入れた（製造元の指針に従って）。１３．８μｍの等方性分解能にて骨梁骨及び皮質骨のパラメータについて各大腿骨の遠位領域を走査した。ＳｋｙｃａｎＮｒｅｃｏｎソフトウエア（バージョン１.６．４、Ｓｋｙｃａｎ）を用いて改変したアルゴリズムを採用して再構築を行った。関心体積（ＶＯＩ）は成長板の下で０．５ｍｍに設定し、遠位に１．５ｍｍ伸ばした。ＶＯＩの中での骨梁及び皮質の断片は、スキャナーと共に提供されるＣＴ解析ソフトウエア（バージョン１．１１、Ｓｋｙｃａｎ）を用いて約５枚の切片ごとに楕円体の輪郭を描くことによって抽出した。骨梁及び皮質のＢＭＤ、骨容量（ＢＶ／ＴＶ、％）、骨梁の数（Ｔｂ．Ｎ）、骨梁の厚さ（Ｔｂ．Ｔｈ、μｍ）、骨梁の分離（Ｔｂ．Ｓｐ、μｍ）は、ＣＴアナライザのソフトウエア（バージョン１．１１、Ｓｋｙｃａｎ）によって自動的に算出された。

各ラットからの第４腰椎を１３．８ｍｍの等方性分解能で走査し、椎体の中央からの２．０ｍｍ厚さの断面をカバーするようにＶＯＩを設定した。骨梁骨及び皮質骨のパラメータを椎体にて評価し、頭蓋の成長板の下０．１４ｍｍで出発する２ｍｍの厚さの断面のＶＯＩをカバーするように設定した。遠位大腿骨について検討したのと同じ骨梁骨及び皮質骨のパラメータに加えて、トポロジーのパラメータ、すなわち、骨梁骨のパターン因子（ＴＢＰｆ）及び構造モデル指標（ＳＭＩ）；並びに骨梁配向パラメータ、異方性の程度（ＤＡ）も椎体にて測定した。
組織形態測定

右脛骨をホルムアルデヒド溶液から取り出し、エタノール勾配を介して脱水し、キシレン（２４２５０５２１，イスラエル、ＨａｉｆａのＢｉｏ−Ｌａｂ社）によって清浄化し、４℃で３日間、８０％メタクリル酸メチル（ＭＭＡ；Ｍ５５９９，イスラエル、ＲｅｈｏｖｏｔのＳｉｇｍａ）＋２０％フタル酸ジブチル（ＤＢＰ；６１−５０６２，ドイツ、ＨｏｈｅｎｂｒｕｎｎのＭｅｒｃｋ社）を浸潤させた。次いで４℃でのさらに６日間の浸潤のためにＭＭＡ＋ＤＢＰ＋過酸化ベンゾイル（６１７００８，ドイツ、ＨｏｈｅｎｂｒｕｎｎのＭｅｒｃｋ社）の溶液に検体を移した。浸潤手順に続いて、温度勾配（４日間の期間にわたって３８℃から５０℃まで）のもとで検体をＭＭＡ＋ＤＢＰ＋２．５％過酸化ベンゾイルに包埋した。炭化タングステンの小刀（使い捨ての刃；ＴＣ６５，イスラエル、Ｂｅｔ−ＮｅｋｕｆａのＲｈｅｎｉｕｍ社）に接続されたＬｅｃｉａＲＭ２０２５ミクロトーム（イスラエル、ＰｅｔａｃｈＴｉｋｖａのＬｅｃｉａＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を用いて各検体から正中矢状の（４μｍ）脱灰されていない切片を切り出した。ほとんどの切片は構造の組織形態測定のためにＭｃＮｅａｌの４色で染色した。残りの切片は動的な組織形態測定のために未染色のままだった。

近位脛骨幹端の構造的な及び動的な組織形態測定の測定値は、蛍光光源を備えた顕微鏡（イングランド、キングストンのＮｉｋｏｎＯｐｔｉｐｈｏｔ２）に接続されている半自動解析システム（ＢｉｏｑｕａｎｔＯＳＴＥＯ，ｖｅｒ．７．２０．１０，米国、ナッシュビルのＢＩＯＱＵＡＮＴＩｍａｇｅＡｎａｌｙｓｉｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて得られた。

骨容量（ＢＶ／ＴＶ、％）、骨梁の数（Ｔｂ．Ｎ）、骨梁の厚さ（Ｔｂ．Ｔｈ、μｍ）、骨梁の分離（Ｔｂ．Ｓｐ、μｍ）、骨形成率／骨試料（ＢＦＲ／ＢＳ）、ミネラル化表面／骨表面（ＭＳ／ＢＳ）及び石灰化速度（ＭＡＲ）のような組織形態測定のパラメータは、ＢＩＯＱＵＡＮＴ画像ソフトウエア解析（ＢｉｏｑｕａｎｔＯＳＴＥＯ，バージョン７．２０．１０）を用いて算出した。
骨代謝回転の生化学マーカーの評価

血清のオステオカルシン（ＯＣ）の濃度は、１：１０の血清希釈に続いてＥＩＡキット（＃ＢＴ−４９０，米国、ストートンのＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）によって決定した。

尿中のデオキシピリジノリン（ＤＰＤ）の濃度は、１：５０の希釈に続いて市販のＥＩＡキット（＃８００７，米国、サンディエゴのＱｕｄｉｅｌ社）によって決定した。ＤＰＤのレベルはクレアチニンのレベル（＃８００９，米国、サンディエゴのＱｕｄｉｅｌ社）に対して標準化した。
第５腰椎の機械的強度

第５腰椎椎体（Ｌ５）の圧迫試験から機械的特性（最大圧、最大圧エネルギー、堅牢性及び降伏時エネルギー）を得た。ノギスを用いて錐体の高さ及び尾部と頭部の直径の平均を測定することによって物質の特性の算出を行った。骨梁及び皮質殻の双方を含む骨全体を網羅するμＣＴ走査によって断面積（ＣＳＡ）及び骨容量（ＢＶ）を得た。
統計的解析

結果は本明細書では平均値±ＳＥＭとして表す。ＳＴＡＴＩＳＴＩＣＡ６．１ソフトウエア（オクラホマ州、タルサのＳｔａＳｏｆｔ）を用いて一元配置ＡＮＯＶＡ及びＦｉｓｈｅｒ−ＬＳＤ事後比較検定を行った。＜０．０５のｐ値が有意であると見なした。

上記治験の結果は、安定なＡＣＣが骨粗鬆症の発生に感受性である試験群にてＣＣＣよりも骨ミネラル密度及び他の骨パラメータに対して高い効果を有することを裏付けた。ＡＣＣの優れた生体利用効率は、代謝性の骨の障害、疾患及び状態の発症を防ぐ又は遅らせるためのその使用を可能にする。

説明の目的で本発明の実施形態を記載してきたが、本発明は特許請求の範囲の範囲を超えることなく、多数の変異、改変及び応用と共に実施され得ることが理解されるであろう。

Claims

安定な非晶質炭酸カルシウム（ＡＣＣ）とビスホスホネートとを含む、骨代謝に関連する障害、疾患又は状態に罹患している対象において骨ミネラル密度を向上させるのに使用するための組成物であって、前記ＡＣＣは、少なくとも１種の安定剤を含み、前記ビスホスホネートは、標準的な治療用量よりも低い用量で投与される、組成物。
安定な非晶質炭酸カルシウム（ＡＣＣ）を含む、骨代謝に関連する障害、疾患又は状態に罹患している対象において骨ミネラル密度を向上させる方法において使用するための組成物であって、前記方法は、前記対象に前記組成物を投与することと、前記対象にビスホスホネートを投与することと、を含み、前記ＡＣＣは、少なくとも１種の安定剤を含み、前記ビスホスホネートは、標準的な治療用量よりも低い用量で投与される、組成物。
ビスホスホネートを含む、骨代謝に関連する障害、疾患又は状態に罹患している対象において骨ミネラル密度を向上させる方法において使用するための組成物であって、前記方法は、前記対象に前記組成物を投与することと、前記対象に安定な非晶質炭酸カルシウム（ＡＣＣ）を投与することと、を含み、前記ＡＣＣは、少なくとも１種の安定剤を含み、前記ビスホスホネートは、標準的な治療用量よりも低い用量で投与される、組成物。
前記ビスホスホネートは、アレンドロネート、リセドロネート、チルドロネート、イバンドロネート、ゾレンドロネート、パミドロネート、エチドロネート、ならびにそれらの塩およびエステルから選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
前記ビスホスホネートは、アレンドロネートである、請求項４に記載の組成物。
前記安定剤は、有機酸、ヒドロキシカルボン酸のリン酸エステルもしくは硫酸エステル、およびヒドロキシルを有する有機化合物、からなる群より選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
前記安定剤は、ヒドロキシカルボン酸のリン酸エステル、およびヒドロキシルを有する有機化合物から選択される、少なくとも１種の成分を含む、請求項６に記載の組成物。
前記安定剤は、単糖類、二糖類、三糖類、オリゴ糖類および多糖類から選択される、ヒドロキシルを有する有機化合物である、請求項６に記載の組成物。
前記安定剤は、少なくとも１種のアルカリ水酸化物とさらに組み合わせられたヒドロキシルを有する有機化合物を含む、請求項６に記載の組成物。
前記安定剤は、カルボン酸または複数種のカルボン酸である、請求項６に記載の組成物。
前記カルボン酸は、クエン酸、酒石酸又はリンゴ酸から選択される、請求項１０に記載の組成物。
前記安定剤は、リン酸化されたアミノ酸、リン酸化されたペプチド、少なくとも１種のペプチドを伴ったキチン、及びアルカリ水酸化物を伴ったポリオールからなる群より選択される、少なくとも１種の化合物を含む、請求項６に記載の組成物。
前記安定剤は、リン酸化されたアミノ酸、及びポリオールから選択される、少なくとも１種の成分を含む、請求項６に記載の組成物。
前記リン酸化されたアミノ酸は、オリゴペプチド又はポリペプチドに存在する、請求項１２または１３に記載の組成物。
リン酸化されたアミノ酸は、ホスホセリン及びホスホスレオニンから選択される、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
医薬組成物として製剤化されている、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
前記医薬組成物は、キャリア、補助剤、希釈剤又は賦形剤をさらに含む、請求項１６に記載の組成物。
前記骨代謝に関連する障害、疾患又は状態は、骨軟化症、骨パジェット病、骨減少症、嚢胞性線維性骨炎、くる病、骨粗鬆症及び急性アルコール摂取からなる群より選択される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物。