JP2019211473A - 未知の分子種の標識化状態を検出するための方法 - Google Patents

Abstract

【課題】質量分析を使用し、不変同位体標識化プロセスに曝露された試料中に含まれる未知の分子種Ｍの標識化状態を検出する方法を提供する。【解決手段】−質量分析計を用いて、参照試料の少なくとも１つの質量スペクトルＩを測定する、−不変同位体により試料を標識化する、−標識化後に、質量分析計を用いて試料の質量スペクトルＩを測定する、−参照試料測定質量スペクトルＩに基づいて、参照試料の未知の分子種Ｍの１つ以上の最も可能性の高い元素組成Ｃを決定する、−参照試料に含まれる未知の分子種Ｍのそれぞれの決定された１つ以上の最も可能性の高い元素組成Ｃについて、試料の測定質量スペクトルＩにおいて、試料に含まれる対応する分子種Ｍを検出する、−参照試料に含まれる未知の分子種Ｍのそれぞれの特定された１つ以上の最も可能性の高い元素組成について、試料の測定質量スペクトルＩから試料中の対応する分子種Ｍの標識化状態を決定する方法。【選択図】なし

Description

本発明は、試料が不変(non-changing)同位体標識化プロセスに曝露されたときに、質量分析により試料中の未知の分子種Ｍの標識化状態を検出するための方法に関する。

ある量の様々な分子種を含む複雑な試料中の化学反応プロセスを理解するために、科学、医学および製薬等のいくつかの産業に大きな関心が寄せられている。そのような試料は、特に細胞、血液、組織および細菌等の生化学的試料であり得る。特に化学反応および反応経路を理解するために、同位体標識化の技術によって同位体マーカーを目的の試料に供給することができる。同位体標識化プロセスの同位体マーカーは、様々な元素を含み得る１つの分子種を少なくとも含み得る。本特許出願において同位体マーカーの標識化分子種と命名されたこの分子種は、本質的に存在量が少ない、分子の少なくとも１つの特定の元素Ｅの特定の同位体^xＥ、マーキング同位体の濃縮によって標識化することができる。例えば、炭素原子を含む分子では、同位体¹³Ｃが濃縮され得る。別の例では、標識化された分子種は、元素Ｅ₁の特定の同位体^xＥ₁および元素Ｅ₂の特定の同位体^yＥ₂の濃縮によって標識化することができ、両方の元素Ｅ₁およびＥ₂が標識化された分子種内に含まれている。

標識化された分子種における特定の同位体^xＥの濃縮は、一般に、特定の元素Ｅの１つまたはいくつかの原子が、標識化された分子種において特定の同位体^xＥによって置き換えられることを意味する。

本特許出願において単一濃縮同位体標識化プロセスと呼ばれる同位体標識化プロセスの特定の実施形態では、この濃縮は、標識化分子の特定の元素Ｅの１原子を特定の同位体^xＥと交換することによってのみ行われる。

本特許出願において単一同位体標識化プロセスと呼ばれる特定の標識化プロセスでは、供給される同位体マーカーは、ただ一つの特定元素Ｅの特定の同位体^xＥのみが濃縮された標識化された分子種のみを含む。。この濃縮は、特定の元素Ｅの１つまたはいくつかの原子を、特定の同位体^xＥで置き換えることができる。

好ましくは、同位体マーカーは１つの標識化分子種のみを含むが、それはいくつかの異なる分子種であってもよい。次いで、これらのすべての分子において、同位体^xＥは、分子内の元素Ｅの原子のみを置き換えることによって濃縮される。

他の特定の同位体標識化プロセスでは、供給される同位体マーカーは、少なくとも１つの特定の元素Ｅの特定の同位体^xＥが濃縮された標識化分子種のみを含み、この濃縮は、標識化された分子内の特定の元素Ｅの少数の原子を特定の同位体^xＥと交換することによってのみ行われる。これらの標識化プロセスの一実施形態において、この濃縮は、標識化分子の特定の元素Ｅの最大４原子までを特定の同位体^xＥと交換することによってのみ行われる。これらの標識化プロセスの別の実施形態において、この濃縮は、標識化分子の特定の元素Ｅの最大３原子までを特定の同位体^xＥと交換することによってのみ行われる。これらの標識方法の好ましい態様において、この濃縮は、標識化分子の特定の元素Ｅの最大２原子までを特定の同位体^xＥと交換することによってのみ行われる。好ましくは、同位体マーカーは、１つの標識化分子種のみを含むが、それはいくつかの異なる分子種であってもよい。次いで、これらのすべての分子において、同位体^xＥは、分子内の少数の原子Ｅのみを置き換えることによって濃縮される。好ましくは、より標識化された分子種では、同位体^xＥは、分子内の１つの原子Ｅのみを置き換えることによって濃縮されている。

好ましくは、標識化プロセスにおいて、標識化された分子種のある特定の部分が標識化された同位体マーカーが使用される。典型的には、分子のこの部分は、分子の量の５０％超であるが、７５％〜９５％の範囲であってもよい。例えば、標識化分子の種の８０％または９０％が標識化されてもよい。

そのような特定の同位体マーカーが、生物であってもよい試料または試料の源に投与され得る場合、異なる同位体標識化プロセスが生じ得る。いくつかの同位体標識化プロセスでは、以下の名称の不変同位体標識化プロセスにおいて、同位体マーカーの投与のために新しい分子は生成されない。試料の分子内の同位体マーカーの投与のために、マーキング同位体^xＥの存在のみを増加させることができる。

不変同位体標識化プロセスで試料を標識化するための様々な方法が先行技術から知られている。

本特許出願において不変単一同位体標識化プロセスと呼ばれる特定の同位体標識化プロセスでは、供給される同位体マーカーは、１つの特定の元素Ｅのみの特定の同位体^XＥのみが濃縮された標識化された分子種のみを含み、この濃縮は、標識化分子の特定の元素Ｅの原子を特定の同位体^xＥと交換することによってのみ行われ、同位体マーカーの投与のために新しい分子は生成されない。そのような同位体標識化プロセスでは、標識化された試料の分子は、特定の同位体^XＥでのみ標識化することができ、試料中の分子内の特定の同位体^xＥの各濃縮は、同位体マーカーの標識化分子が関与した化学反応に基づき、少なくとも２つの分子が特定の同位体^xＥを含むことによってすでに標識化されている場合、さらに試料の分子の化学反応に基づいてもよい。

本特許出願において部分同位体標識化プロセスと呼ばれる特定の同位体標識化プロセスでは、試料中の分子内の少なくとも特定の元素Ｅの特定の同位体^xＥの濃縮は、同位体マーカーの標識化分子が関与した化学反応のみに基づき、標識化分子は、少なくとも特定の元素Ｅの特定の同位体^xＥのすべてを試料中の最終的な分子に移動させるわけではない。

不変同位体標識化プロセスの場合、試料中に含まれる様々な分子種の標識化状態を検出することが知られている異なるアプローチがある。特に、標識化状態は、質量分析計により検出された試料の質量スペクトルによって検出することができる。

１つのアプローチは、試料中の分子種を考慮に入れるだけであり、それらが質量ピークとして試料の質量スペクトルにおいて検出可能であるようにある特定の量で試料中に含まれることが知られる。

全体の説明の間、質量スペクトルおよび質量分析計の測定を説明する際に、用語「質量」が使用される。この用語は、質量対電荷比ｍ／ｚという用語も包含する広い意味で用いられる。一般に質量スペクトルは、質量スペクトル中のピーク位置ｐに相関する特定の質量対電荷比ｍ／ｚを有する検出イオンの数に相関する信号Ｉ（ｐ）の検出強度を示している。ピーク位置は、質量対電荷比ｍ／ｚだけでなく、周波数ω（例：Ｏｒｂｉｔｒａｐ…）や飛行時間（例：飛行時間型質量分析計）等の他のパラメータに対しても可能である。検出されたすべてのイオンが電荷状態ｚ＝１を有する場合にのみ、ピーク位置は直接イオンの質量に対するものとなる。そうでなければ、イオンが電荷状態ｚ＝ｎを有する場合、質量ｍのイオンだけでなく、質量ｎ＊*ｍのイオンもまた、特定のｍ／ｚ値で検出される。本発明の議論のために、異なる荷電状態ｚのイオンの検出は詳細には記載されないが、それでも質量分析計の任意の測定において可能である。

試料中に含まれることが知られている試料中の分子種について、分子種の標識化状態は、既知の分子種の標識化状態を検出するための標的化モードによって検出され得る。標識化状態を検出するためのそのような標的化モードは、先行技術から当業者に知られている。試料中に含まれている分子種は、信頼性のある情報を持っている研究者には知られている。研究者は、試料を調査するために以前に行った他の実験からの調査された試料の種類からこの知識を得ることができる。

別のアプローチは、分子種の特定の取り込みのみが試料に含まれるという知識に基づいていない。そのような「非標的化アプローチ」によって、試料中に含まれる任意の分子種の標識化状態を検出することができる。特に、未知である試料中に含まれるそのような分子種の標識化状態を検出することができる。試料の調査者がその分子種が試料に含まれているという説得力のある情報が利用できない場合、試料に含まれる分子種は、試料に含まれる未知の分子種である。したがって、特定の分子種が試料に含まれているかどうかの高い可能性を有する情報を提供するために、さらなる実験が必要である。

標識化状態を検出するためのそのような非標的化モードもまた、先行技術から当業者に知られており、それらは試料中の未知の分子種の標識化状態を検出することができるだけである。しかし、このアプローチには多くの不確実性があり、非常に複雑で複合的な評価プロセスを使用している。

質量分析法を用いて試料中の未知の分子種の元素組成を同定する方法は知られている。特に、そのような方法は、本出願人による非公開欧州特許出願第１８１５６９０３．９号に開示されており、本明細書にその全開示内容が組み込まれる。

本発明の目的は、不変標識化プロセスが試料に適用された場合に、未知の分子種である試料中に含まれる分子種の標識化状態を検出するための改良された方法を提供することである。特に、この方法は、より信頼性のある結果を提供しなければならず、また他方で評価プロセスの労力を軽減しなければならない。本発明のさらなる目的は、不変同位体標識化プロセスが複雑な試料に適用された場合に、複雑な試料における化学反応プロセスの反応フラックス分析の信頼性を改善することである。

上述の目的は、請求項１に記載の、質量分析を使用する、不変単一同位体標識化プロセスに曝露された試料中に含まれる未知の分子種Ｍの標識化状態を検出するための新たな方法によって解決される。

不変単一同位体標識化プロセスは、試料中の分子を標識化するために特定の元素Ｅの特定の同位体^xＥを使用している。この方法は、異なる順序で実行され得る以下のプロセスを含む。

この方法のプロセスにおいて、質量分析計を用いて参照試料の少なくとも１つの質量スペクトルＩ_ul（ｐ_ul）が測定された。この参照試料は、少なくとも１つの質量スペクトルのＩ_ul（ｐ_ul）の測定前に、試料が曝露された不変単一同位体標識化プロセスに曝露されていないか、または試料が曝露されたその標識化プロセスの開始時に不変単一同位体標識化プロセスに曝露されているのみである。

参照試料の測定質量スペクトルＩ_ul（ｐ_ul）（「ｕｌ」は非標識化試料を意味する）は、それらの質量ｍ（上で質量対電荷比として正確に説明されている）ｍ／ｚに依存して測定強度Ｉによって与えられるイオン化イオンの存在量を示し、それによってこの比は測定質量スペクトルＩ_meas（ｐ）のピーク位置ｐに類似するかまたは関連する。そのため、測定質量スペクトルＩ_ul（ｐ_ul）は、参照試料に含まれるすべての分子種Ｍの質量ｍに関する情報を含む。特に、それは、分子種Ｍのすべての同位体分子種の質量ｍに関する情報を含む。

参照試料は、未知の分子を含んでいる調査試料と相関する。本発明の意図は、適用された不変単一同位体標識化プロセスによる試料中のマーキング同位体^xＥの濃縮の観察によって化学反応プロセスを理解することである。分子の標識化の進行、およびそれに応じて試料の１つの分子から別の分子へのマーキング同位体^xＥの移動からも生じる反応経路を理解するために、不変単一同位体標識化プロセスが試料に適用される前に試料中にどの分子種が含まれるかを知ることが依然として重要である。したがって、参照試料はこの情報を提供するべきである。

好ましい実施形態において、試料自体が参照試料として使用され得る。次いで、試料の少なくとも１つの質量スペクトルＩ_ul（ｐ_ul）が、それが不変単一同位体標識化プロセスに曝露される前、またはそれが不変単一同位体標識化プロセスの開始時にのみその標識化プロセスに曝露された後に、質量分析計で測定される。

別の好ましい実施形態において、参照試料、および不変同位体標識化プロセスに曝露される試料は、共通の元の試料、好ましくは生化学試料の異なる部分である。したがって、参照試料および試料は元の試料のサブセットである。好ましくは、元の試料は、その分子組成において最大でも非常に小さい変動をもたらす均一系である。元の試料が単一同位体標識化プロセスの開始時にのみその標識化プロセスに曝露された後、参照試料が元の試料から採取され得る。

本発明の方法の別の実施形態において、不変標識化プロセスに曝露される試料と参照試料とは、異なる試料であってもよい。しかしながら、それらは同じ源、例えば生物、川おより岩石等の天然資源、工業源または農業源によって提供されてもよい。それらはまた、同じ生物または同じ工業生産プロセス等の、異なるが相関している源によって提供されてもよい。

該プロセスの開始時に不変単一同位体標識化プロセスに曝露されているのみである参照試料の少なくとも１つの質量スペクトルが測定される場合、標識化プロセスへの参照試料の曝露時間は非常に短く、したがって少なくとも１つの測定質量スペクトルからすでに検出可能であろう、特定の同位体^xＥによる分子の関連性のある標識化は生じない。したがって、検出可能なさらなる質量ピークはなく、ピークの強度シフトもない。一般に、標識がすでに検出可能であるかどうかは、測定を実行する質量分析計の分解能と相関している。測定質量スペクトルの高い分解能および／または高い信号対雑音比を有する機器においては、標識の開始がより早く検出され得る。したがって、参照試料では、すでに標識化されている分子はごく少量であるはずである。典型的には、参照試料中の分子の５％以下が標識化され、好ましくは参照試料中の分子の１％のみが標識化され、特に好ましくは参照試料中の分子の０．２％のみが標識化される。

一般に、参照試料の質量スペクトルを測定する際、質量スペクトルから非標識化試料の分子の元素組成を同定することができるように、未標識化試料、すなわち参照試料を示す質量スペクトルを有することが目的である。

好ましい実施形態において、参照試料の質量スペクトルはＬＣ／ＭＳ機器を用いて測定される。次いで、参照試料は、液体クロマトグラフィーシステム、特に液体クロマトグラフィーカラムを介して質量分析計、特にそのイオン源に提供される。次いで、液体クロマトグラフィーシステムの溶出液の一連の質量スペクトルが、質量スペクトルによって測定される。これは、特定の溶出時間で質量スペクトルを測定するために、溶出液の溶出の異なる時点で溶出液が質量分析計、特にイオン源に提供されることを意味する。次いで、一連の質量スペクトルから質量トレースを得ることができる。クロマトグラフィープロセスによれば、クロマトグラフピークは、分子種ごとにクロマトグラフィープロセス保持時間と呼ばれる特定の溶出時間で検出され得、これはこの時点で質量トレースとして示すことができる。典型的には、質量トレースは分子種の同位体分子種の質量で検出されるが、合体効果のために、質量は一連の質量スペクトルのある測定期間で逸脱し得る。合体効果を考慮に入れたそのような質量トレースの検出は、本出願人による非公開欧州特許出願第１８１７０７７９．５号に記載されており、本明細書にその全開示内容が組み込まれる。

一般に、参照試料の少なくとも質量スペクトルの測定は数回繰り返すことができ、例えば次いで質量スペクトルを平均して、本発明の方法によって参照試料に含まれる分子種の元素組成を決定するための改善された基礎を得ることができる。単一の測定は、例えばクロマトグラフィー実験の繰り返しの間の、繰り返しまたは完全な一連の測定であってもよい。

参照試料の少なくとも１つの質量スペクトルＩ_ul（ｐ_ul）は、その分解能とは無関係に一種の質量分析計によって測定することができる。特に、質量分析器としてＯｒｂｉｔｒａｐ（登録商標）質量分析計または他の静電型イオントラップを有する質量分析計、フーリエ変換（ＦＴ）質量分析計、イオンサイクロトロン（ＩＣＲ）質量分析計または多重反射飛行時間型（ＭＲ−ＴＯＦ）質量分析計等の高分解能の質量分析計を使用することが好ましい。好ましく使用され得る他の質量分析計は、特に飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析計、および参照試料の少なくとも１つの質量スペクトルを測定するためのＨＲ四重極質量分析計を有する質量分析計である。

本発明の方法のさらなるプロセスでは、調査されるべき試料は、少なくとも１つの特定の元素Ｅのマーキング同位体^xＥで試料の分子を濃縮することを意図して、不変同位体標識化プロセスに曝露される。さらに、使用される不変の単一同位体標識化プロセスは、試料中の分子種を変化させない。同位体マーカーに含まれる分子種のみが、試料に追加される。したがって、これらの分子種に加えて、同じ分子種が参照試料および試料中で観察され得る。試料が不変同位体標識化プロセスに曝露された際、試料中の分子が標識化され得る。したがって、それに伴い、試料の分子において、不変同位体標識化プロセスの同位体マーカーによって提供される少なくとも特定の元素Ｅの特定の同位体^xＥの濃縮が観察され得る。

特に同位体マーカーは、新しい分子種を試料に追加しない不変同位体標識化プロセスにおいて使用することができる。したがって、参照試料および試料中で同じ分子種が観察され得る。これは、同位体マーカーの投与による試料に追加された分子種と相関しないさらなる質量ピークが試料の質量スペクトル内で検出されないという利点がある。さらに、そのような同位体マーカーの投与は、試料中の反応に影響を及ぼさない。試料が不変同位体標識化プロセスに曝露された際、試料中の分子が標識化され得る。したがって、それに伴い、試料の分子において、不変同位体標識化プロセスの同位体マーカーによって提供される少なくとも特定の元素Ｅの特定の同位体^xＥの濃縮が観察され得る。

さらに、本発明の方法の好ましい実施形態において、不変単一同位体標識化プロセスが使用され、供給された同位体マーカーは、１つの特定の要素Ｅのみの１つの特定の同位体^XＥのみが濃縮された標識化された分子種を含んでもよい。参照試料、および不変単一同位体標識化プロセスにおいて曝露された試料中に同じ種の分子が含まれ、標識化分子上の同位体マーカーによってのみ提供される、提供されたマーキング同位体^xＥでのみ標識化が生じ得るため、この種の標識化プロセスは、制御可能な様式で試料における標識化プロセスに従う利点を提供する。

さらに、本発明の方法の別の好ましい実施形態において、不変単一濃縮同位体標識化プロセスが使用され、濃縮は、標識化分子の特定元素Ｅの１原子を特定同位体^×Ｅと交換することによってのみ行われる。参照試料、および不変単一同位体標識化プロセスにおいて曝露された試料中に同じ種の分子が含まれ、標識化分子上の同位体マーカーによってのみ提供される、提供されたマーキング同位体^xＥでのみ標識化が生じ得、元素Ｅのただ１つの単一原子がマーキング同位体^xＥにより交換されているため、この種の標識化プロセスは、制御可能な様式で試料における標識化プロセスに従う利点を提供する。

使用される同位体標識化プロセスの選択は、試料の分子の標識化の複雑さを軽減する。選択の結果、本発明の方法は、本発明者らによって、不変同位体標識化プロセスの特定の特徴を考慮に入れて見出すことができた。本発明の方法の好ましい実施形態において、少なくとも１つの特定の元素Ｅの１つの特定の同位体同位体^xＥのみが濃縮される、標識化された分子種を含む不変同位体標識化プロセスによって供給される供給同位体マーカーでは、標識化された分子のすべての分子種が標識化されているわけではない。試料中には、人工的に富化された標識化分子しかない。典型的には、標識化分子種の全分子の５０％超が、同位体マーカーにおいて標識化されており（標識化割合５０％）、好ましくは標識化分子種の全分子の８０％超、特に９０％超、より好ましくは９５％超、９８％超、さらには９９％超の標識度で標識化されている。この種のすべての分子が標識化分子である。同位体マーカーのこの標識化割合は、製造コストを削減し、また以下に説明されるように標識化割合は本発明の方法において考慮されるため、試料中の分子種の標識化状態の検出にとって重要ではない。

本発明の方法のさらなるプロセスにおいて、試料の質量スペクトルＩ_l（ｐ_l）は、試料の不変同位体標識化プロセスの開始後に質量分析計で測定される。

これらの測定の意図は、試料に含まれる分子の標識化プロセスを観察することである。標識化プロセスにより、時間と共にますます多くの分子が少なくとも１つの元素Ｅの特定の同位体^xＥを含み、それらは分子内でその天然の存在率に応じて少なくとも１つの元素Ｅの原子を置き換えている。これにより、ほとんどの場合、原子Ｅと特定の同位体^xＥとの交換が実際には起こらないことが言及されるべきである。特定の同位体^xＥを含む試料中に含まれる標識化分子は化学反応の結果であり、同位体マーカーの標識種が関与して、試料の標識化された分子の組成物中の特定の同位体^xＥの原子を増加させるか、または、試料の標識化前の分子が関与して、標識化プロセスの前の試料の分子に含まれる特定の元素Ｅの原子の数まで、試料の標識化された分子の組成物中の特定の同位体^xＥの原子を増加させる。したがって、これらの反応によって、以前にそれにすでに存在している分子が形成され、今や特定の同位体^xＥの原子の数が増加する。したがって、不変単一同位体標識化プロセスの間の試料において、時間と共に、特定の同位体^xＥの原子数が試料の分子中で増加している。この増加は、試料に含まれるあらゆる分子種について変動する可能性があり、いくつかの分子については、増加に続き、特定の同位体^xＥの原子数の減少が観察され得る。単一濃縮同位体標識化プロセスでは、特定の同位体^xＥのｎ個の原子を含む分子Ｍは、本特許出願においてｎ回標識化分子Ｍ_lと呼ばれる。試料中の各分子について、その標識化プロセスは、強度寄与Ｌ_M（ｎ）または相対存在量ｃ_M（ｎ）によって説明され得る。

特定の同位体^XＥの濃縮を考慮しない場合、すべての分子のｎ回標識化分子Ｍ_lは、試料の非標識化分子Ｍと同じ元素組成を有する。試料の非標識化分子Ｍ−または０回標識化分子Ｍ−と呼ばれる分子は、強度寄与Ｌ_M（０）および相対存在量ｃ_M（０）を有する。非標識化分子Ｍの元素組成中に元素Ｅのｋ個の原子が含まれる場合、可能な最も高い標識化分子は、相対存在量ｃ_M（ｋ）を有するｎ回標識化分子Ｍ_lである。試料の非標識化分子Ｍと同じ元素組成を有する試料中の分子種のすべての相対存在量の和は、特定の同位体^xＥの濃縮が考慮されない場合、１に等しい。
ｃ_M（０）＋ｃ_M（１）＋ｃ_M（２）＋…＋ｃ_M（ｋ−１）＋ｃ_M（ｋ）＝１

したがって、標識化分子Ｍ_lおよび非標識化分子Ｍのすべての変種の強度寄与Ｌ_M（ｎ）の和が１に正規化される場合、相対存在量ｃ_M（ｎ）は、ｎ回標識化分子Ｍ_lの強度寄与Ｌ_M（ｎ）であり、標識化分子Ｍ_lおよび非標識化分子Ｍのすべての変種の数である、同じ元素組成を有する分子の総数に対する標識化分子Ｍ_lの各変種の比を説明している。

したがって、分子種Ｍの標識化状態は、そのｎ回標識化分子Ｍ_lの強度寄与Ｌ_M（ｎ）、特に相対存在量ｃ_M（ｎ）によって定義される。ｎは、０（非標識化分子）〜ｎの間である。いくつかの特定の実施形態において、特に標識化分子Ｍ_lが非常に小さい相対存在量を有する場合、すべての標識化分子Ｍ_lが考慮されるわけではない。典型的には、これは、元素Ｅの多数の原子が特定の同位体^xＥによって置き換えられる場合に生じる。したがってｋよりも少数の標識化分子Ｍ_lのみが考慮される。

一般に、同位体標識化プロセスにおいて、ｗの異なる元素Ｅ_iの特定の同位体^xＥ_iのｎ_i個の原子を含む分子Ｍは、本特許出願において、（ｎ_1,ｎ_2,．．．，ｎ_w）回標識化分子Ｍ_lと呼ばれる。試料中の各分子について、その標識化プロセスは、特定の同位体^xＥ_iの濃縮が考慮されない場合、試料の非標識化分子Ｍと同じ元素組成を有するすべての分子の（ｎ_1,ｎ_2,．．．，ｎ_w）回標識化分子Ｍ_lの強度寄与Ｌ_M（ｎ_1,ｎ_2,．．．，ｎ_w）または相対存在量ｃ_M（ｎ_1,ｎ_2,．．．，ｎ_w）によって説明され得る。試料の非標識化分子Ｍ−または（０，０，…，０）回標識化分子Ｍ−と呼ばれる分子は、強度寄与Ｌ_M（０，０，…，０）および相対存在量ｃ_M（０，０，…，０）を有する。非標識化分子Ｍの元素組成において、元素Ｅ_iのｋ_i個の原子が含まれる場合、可能な最も高い標識化分子は、相対存在量ｃ_M（ｎ_1,ｎ_2,．．．，ｎ_i＝ｋ_i，ｎ_w）を有するｎ回標識化分子Ｍ_lである。試料の非標識化分子Ｍと同じ元素組成を有する試料中の分子種のすべての相対存在量の和は、特定の同位体^xＥが考慮されない場合、１に等しい。

したがって、標識化分子Ｍ_lおよび非標識化分子Ｍのすべての変種の強度寄与Ｌ_M（ｎ_1,ｎ_2,．．．，ｎ_w）の和が１に正規化される場合、相対存在量ｃ_M（ｎ_1,ｎ_2,．．．，ｎ_w）は、（ｎ_1,ｎ_2,．．．，ｎ_w）回標識化分子Ｍ_lの強度寄与Ｌ_M（ｎ_1,ｎ_2,．．．，ｎ_w）であり、標識化分子Ｍ_lおよび非標識化分子Ｍのすべての変種の数である、同じ元素組成を有する分子の総数に対する標識化分子Ｍ_lの各変種の比を説明している。

試料の少なくとも１つの質量スペクトルＩ_l（ｐ_l）は、その分解能とは無関係に一種の質量分析計によって測定することができる。特に、質量分析器としてＯｒｂｉｔｒａｐ（登録商標）質量分析計または他の静電型イオントラップを有する質量分析計、フーリエ変換（ＦＴ）質量分析計、イオンサイクロトロン（ＩＣＲ）質量分析計または多重反射飛行時間型（ＭＲ−ＴＯＦ）質量分析計等の高分解能の質量分析計を使用することが好ましい。好ましく使用され得る他の質量分析計は、特に飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析計、および参照試料の少なくとも１つの質量スペクトルを測定するためのＨＲ四重極質量分析計を有する質量分析計である。

本発明の方法の好ましい実施形態において、参照試料の少なくとも１つの質量スペクトルＩ_ul（ｐ_ul）および試料の少なくとも１つの質量スペクトルＩ_l（ｐ_l）が、同じ種類の質量分析計で測定され得る。参照試料の少なくとも１つの質量スペクトルＩ_ul（ｐ_ul）および試料の少なくとも１つの質量スペクトルＩ_l（ｐ_l）を同じ型の質量分析計で測定することがさらに好ましい。特に、参照試料の少なくとも１つの質量スペクトルＩ_ul（ｐ_ul）および試料の少なくとも１つの質量スペクトルＩ_l（ｐ_l）を同じ質量分析計で測定することが好ましい。

好ましい実施形態において、試料の質量スペクトルは、ＬＣ／ＭＳ機器を用いて測定される。次いで、試料は、液体クロマトグラフィーシステム、特に液体クロマトグラフィーカラムを介して質量分析計、特にそのイオン源に提供される。次いで、液体クロマトグラフィーシステムの溶出液の一連の質量スペクトルが、質量スペクトルによって測定される。これは、特定の溶出時間で質量スペクトルを測定するために、溶出液の溶出の異なる時点で溶出液が質量分析計、特にイオン源に提供されることを意味する。次いで、一連の質量スペクトルから質量トレースを得ることができる。クロマトグラフィープロセスによれば、クロマトグラフピークは、分子種ごとにクロマトグラフィープロセス保持時間と呼ばれる特定の溶出時間で検出され得、これはこの時点で質量トレースとして示すことができる。典型的には、質量トレースは分子種の同位体分子種の質量で検出されるが、合体効果のために、質量は一連の質量スペクトルのある測定期間で逸脱し得る。合体効果を考慮に入れたそのような質量トレースの検出は、本出願人による非公開欧州特許出願第１８１７０７７９．５号に記載されており、本明細書にその全開示内容が組み込まれる。

一般に、参照試料の少なくとも質量スペクトルの測定は数回繰り返すことができ、例えば次いで質量スペクトルを平均して、本発明の方法によって参照試料に含まれる分子種の元素組成を決定するための改善された基礎を得ることができる。単一の測定は、例えばクロマトグラフィー実験の繰り返しの間の、繰り返しまたは完全な一連の測定であってもよい。

一般に、不変同位体標識化プロセスの開始後、試料の質量スペクトルＩ_l（ｐ_l）が、試料中に含まれる分子種Ｍの標識化プロセスを観察するための期間測定される。このとき、特定の同位体^xＥの時間依存性濃縮を観察することができ、これは、試料の不変単一同位体標識化プロセスの開始後の時間であってもよい特定の時点ｔにおける分子種Ｍの標識化状態を表すそのｎ回標識化分子Ｍ_lの時間依存性相対存在量ｃ_M（ｎ，ｔ）によって表すことができる。

本発明の方法のさらなるプロセスでは、参照試料の少なくとも１つの測定質量スペクトルＩ_ul（ｐ_ul）に基づいて、参照試料に含まれる少なくとも１つの未知の分子種Ｍの１つ以上の最も可能性の高い元素組成Ｃ_M,i（＋０）が決定される。当業者には、この決定プロセスを実行するための様々な方法が知られている。

分子種は、同じ分子式を有する分子のクラスとして定義される（例えば、水は、Ｈ₂Ｏの分子式を有し、ベンゼンは、分子式Ｃ₆Ｈ₆を有する）。分子種の分子式により、分子種の元素組成が記述される。分子式は、ＩＵＰＡＣの化学元素の周期律表に従って元素の記号を示すことにより分子に含まれるすべての元素を列挙しており、元素の記号の右側にある指数により、分子が構成される元素の原子数を示している。したがって、簡単な例では、分子式Ｃ₆Ｈ₆を有するベンゼン分子は、６個の炭素原子（記号Ｃ）および６個の水素原子（記号Ｈ）からなる。同じ分子式を有する分子は、異なる鏡像異性体構造を有する異なる異性体形態により異なる構造式を有し得、それにより異なる物理的、化学的および生物学的特性がもたらされる。

参照試料では、特定の同位体による標識化は検出されていないか、または検出できない。したがって、参照試料に含まれる分子種Ｍからの各元素組成は、式Ｃ_M,i（＋０）により記述され、式中、＋０は、すべてのｗ元素について標識化がなく、適用された不変同位体標識化プロセスにより標識化が可能であることを意味する（ｎ₁＝０、ｎ₂＝０…、ｎ_w＝０）。この表記法は、特許出願全体を通して、非標識化分子種および非標識化分子に対して使用される（長期間の０を避けるため）。

さらに、式Ｃ_M,i（＋０）における指数Ｍは、分子種Ｍを特定しており、指数ｉは、異なる調査された最も可能性の高い元素組成に関連している。典型的には、Ｃ_M,i（＋０）は、元素組成の分子式である。

最も可能性の高い元素組成がどれほど考慮されるかは、元素組成の決定プロセスの結果に依存し得る。本発明の方法の１つの好ましい実施形態において、最も可能性の高い１つの元素組成のみが考慮される。したがって、すべての決定された分子種に対する指数ｉは１のみである。別の実施形態において、本方法でさらに使用される最も可能性の高い組成物の数は、元素組成の可能性の基準に依存し得る。特に、いくつかの可能な元素組成のうち、他のものよりもはるかに高い可能性を有するものがあり、より高い可能性の元素組成のみが考慮され得る。本発明の方法の次のプロセスで使用される決定された元素組成の数は、分子種ごとに異なり得る。

元素組成を決定するためのプロセスを用いて、参照試料の既知の分子の組成もまた検証され得ることは明白である。本発明の方法はさらに、試料中の既知の分子種Ｍの標識化状態も検出することができる。特に、これらの結果は、本発明の方法が、不変同位体標識化プロセスによる試料中の分子の標識化の進行を分析する方法の一部である場合にも使用することができる。そのような方法は、しばしばフラックス分析プロセスと呼ばれる。この用語は、本特許出願においても使用される。

本発明の方法の好ましい実施形態において、プロセスは、少なくとも１つの分子種Ｍの１つ以上の最も可能性の高い元素組成Ｃ_M,i（＋０）を決定することであり、これは、非公開欧州特許出願第１８１５６９０３．９号に開示されており、本明細書にその全開示内容が組み込まれる。

本発明の方法のさらなるプロセスにおいて、参照試料中に含まれる少なくとも１つの未知の分子種Ｍのそれぞれの決定された１つ以上の最も可能性の高い元素組成Ｃ_M,i（＋０）について、試料中に含まれる対応する分子種Ｍ_lが試料の測定質量スペクトルＩ_l（ｐ_l）において検出される。

このプロセスは、参照試料中に含まれる少なくとも１つの未知の分子種Ｍのそれぞれの特定された１つ以上の最も可能性の高い元素組成Ｃ_M,i（＋０）に対して実行される以下の３つのサブステップを含む。

元素組成Ｃ_M,i（＋０）および該元素組成Ｃ_M,i（＋０）の少なくとも１つの別個の標識化状態Ｃ_M,i（＋ｎ₁，＋ｎ₂，．．．，＋ｎ_w）について、試料中に含まれる対応する分子種Ｍ_lを検出するためのプロセスの第１のサブステップにおいて、同位体ピークパターンＩ_{M(+u1,+u2,…,+uw),i}が決定される。

同位体ピークパターンＩ_{M(+u1,+u2,…,+uw),i}を決定するために、当業者に公知の方法が適用される。好ましくは、試料の質量スペクトルＩ_l（ｐ_l）を測定する質量分析計の分解能が、同位体ピークパターンＩ_{M(+u1,+u2,…,+uw),i}を決定するために考慮される。

本発明の方法の好ましい実施形態において、不変同位体標識化プロセスの間、標識化分子の種のすべての分子が標識化されることが、同位体ピークパターンＩ_{M(+u1,+u2,…,+uw),I}の決定のためにさらに考慮される。したがって、同位体マーカーの標識化率が考慮される。

特定の好ましい実施形態において、同位体ピークパターンＩ_{M(+u1,+u2,…,+uw),i}は、元素Ｅ_vの特定の同位体^XＥ_vでの別個の標識化状態のｕ_V回標識化のために、分子種における元素Ｅ_vのｕ_v原子が元素Ｅ_vの標識化率で特定の同位体^XＥ_Vにより置き換えられるように決定される。したがって、例えば、炭素の標識化率が、炭素原子の８０％が特定の同位体¹³Ｃにより置き換えられ、別個の標識化状態が炭素で３回標識化される場合、標識化分子種の３個の原子について、天然に豊富に存在するＣ原子の８０％は、特定の同位体¹³Ｃで置き換えられる。

試料中に含まれる対応する分子種Ｍ_lを検出するためのプロセスの第２のサブステップにおいて、対応する分子種Ｍ_lの検出可能な質量ｍ_Ml,mが、元素組成Ｃ_M,i（＋０）について、元素組成Ｃ_M,i（＋０）の同位体ピークパターンＩ_{M(+u1,+u2,…,+uw),i}、および該元素組成Ｃ_M,i（＋０）の少なくとも１つの別個の標識化状態Ｃ_M,i（＋ｎ₁，＋ｎ₂，．．．，＋ｎ_w）を使用して決定される。

元素組成Ｃ_M,i（＋０）の同位体ピークパターンＩ_{M(+u1,+u2,…,+uw),i}、および該元素組成Ｃ_M,i（＋０）の少なくとも１つの別個の標識化状態Ｃ_M,i（＋ｎ₁，＋ｎ₂，．．．，＋ｎ_w）において、非標識化元素組成Ｃ_M,i（＋０）および該元素組成Ｃ_M,i（＋０）のそれぞれの別個の標識化状態Ｃ_M,i（＋ｎ₁，＋ｎ₂，．．．，＋ｎ_w）の異なる同位体分子種の強度ピークが観察され得る。同時に質量分析計によって検出される際、試料の質量スペクトルＩ_l（ｐ_l）を測定する質量分析計によって互いに分解され得る場合、すべての決定された同位体ピークパターンＩ_{M(+u1,+u2,…,+uw),i}のすべての強度ピークが比較される。これにより、試料の質量スペクトルＩ_l（ｐ_l）を測定する際、使用される質量分析計の分解能および／または質量許容誤差が考慮され、特に、使用される質量分析計の分解能および質量許容誤差が考慮される。分解できないピークについては、好ましくは強度ピークの正規化最大強度よりも、強度ピークの中心の質量値および／または強度ピークの最高値における質量値および／または強度ピークの最大強度を考慮することによって、共通の質量中心ｍ_Ml,mが定義される。好ましい実施形態において、強度ピークの最高値における質量値は、強度ピークの正規化最大強度によって重み付けされ、次いで平均されて、共通の質量中心ｍ_Ml,mが決定される。質量分析計の分解能に応じて、試料の質量スペクトルＩ_l（ｐ_l）を測定する際、同位体分子種の微細構造を区別することができる。この場合、微細構造のそれぞれの異なる同位体分子種について、次の第３のサブステップで試料中に含まれる対応する分子種Ｍ_lを検出するために別々の検出可能な質量ｍ_Ml,mを同定することができる。

試料中に含まれる対応する分子種Ｍ_lの対応する種を検出するための方法のこの第３のサブステップにおいて、対応する分子種Ｍｌの同位体ピークパターンＩ_Ml,mは、元素組成Ｃ_M,i（＋０）について、対応する分子種Ｍｌの決定された検出可能な質量ｍ_Ml,mでの試料の少なくとも１つの測定質量スペクトルＩ_l（ｐ_l）から決定される。

決定された検出可能な質量ｍ_Ml,mに対して、対応する分子種Ｍ_lの同位体ピークパターンＩ_Ml,mを達成するために、好ましくは検出可能な質量ｍ_Ml,mにその中心を有する検出可能な質量の周囲に質量ウィンドウが定義され、本特許出願において各検出可能な質量ｍ_Ml,mの質量チャネルと呼ばれる。質量分析計が試料の少なくとも１つの測定質量スペクトルＩ_l（ｐ_l）を測定している場合、質量ウィンドウは、質量分析計の分解能および／または質量精度によって定義される。好ましくは、質量ウィンドウは、試料の少なくとも１つの測定質量スペクトルＩ_l（ｐ_l）を測定する場合、質量分析計の分解能および質量精度の総和であると定義される。次いで、質量チャネル内で試料の測定質量スペクトルＩ_l（ｐ_l）中に質量ピークが同定され得る場合、対応する分子種Ｍ_lの同位体ピークパターンＩ_Ml,mは、各検出可能質量ｍ_Ml,mの質量チャネルを探すことによって決定される。好ましくは、質量ピークは、それが好ましくは１．５、特に好ましくは３である特定の値よりも高いシグナル対ノイズ比を有する場合に特定される（確認のため）。対応する分子種Ｍ_lの同位体ピークパターンＩ_Ml,mは、特定された質量ピークによって与えられる。実験によれば、対応する分子種Ｍ_lの同位体ピークパターンＩ_Ml,mは、単一の質量スペクトル、一組の質量スペクトル、または完全クロマトグラムの質量スペクトルまたはクロマトグラム中の質量トレースについて検出することができる。特に、同位体ピークパターンＩ_Ml,mは、それにおける標識化プロセスの進行を研究し（フラックス分析とも呼ばれる）、また試料中のプロセス、例えば細胞内の自然プロセス、または薬物が細胞に提供される際のプロセスのこの反応経路から導出するために標識化プロセスの特定の時間に決定することができる。

参照試料中に含まれる少なくとも１つの未知の分子種Ｍのそれぞれ特定された１つ以上の最も可能性の高い元素組成のための本発明のさらなるプロセスにおいて、試料中の対応する分子種Ｍ_lの標識化状態が、試料の測定質量スペクトルＩ_l（ｐ_l）から決定される。

試料中の対応する分子種Ｍ_lの標識化状態は、（ｎ_1,ｎ_2,．．．，ｎ_w）回標識化分子Ｍ_lおよび非標識化分子Ｍのその強度寄与Ｌ_M（ｎ_1,ｎ_2,．．．，ｎ_w）または相対存在量ｃ_M（ｎ_1,ｎ_2,．．．，ｎ_w）により説明され得る。

このプロセスでは、元素組成Ｃ_M,i（＋０）の試料中の対応する分子種Ｍ_lの標識化状態は、対応する分子種Ｍ_lのそれぞれの決定された検出可能な質量ｍ_Ml,mについて、対応する分子種Ｍ_lの決定された同位体ピークパターンＩ_Ml,mにおける決定された検出可能な質量ｍ_Ml,mにおけるピーク強度を、同位体ピークパターンＩ_{M(+u1,+u2,…,+uw),i}が決定された元素組成Ｃ_M,i（＋０）および別個の標識化状態Ｃ_M,i（＋ｎ₁，＋ｎ₂，．．．，＋ｎ_w）の同位体ピークパターンＩ_{M(+u1,+u2,…,+uw),i}における決定された検出可能な質量ｍ_Ml,mのピーク強度と比較することにより、元素組成Ｃ_M,i（＋０）について、同位体ピークパターンＩ_{M(+u1,+u2,…,+uw),i}が決定された元素組成Ｃ_M,i（＋０）の非標識化状態および別個の標識化状態Ｃ_M,i（＋ｎ₁，＋ｎ₂，．．．，＋ｎ_w）の強度寄与Ｌ_M,i（ｎ_1,ｎ_2,．．．，ｎ_w）を決定することによって決定される。

好ましくは、同位体ピークパターンＩ_{M(+u1,+u2,…,+uw),i}が決定された元素組成Ｃ_M,i（＋０）および別個の標識化状態Ｃ_M,i（＋ｎ₁，＋ｎ₂，．．．，＋ｎ_w）の同位体ピークパターンＩ_{M(+u1,+u2,…,+uw),i}は、比較の前に正規化される必要がある。この正規化は、典型的に、全同位体ピークパターンＩ_{M(+u1,+u2,…,+uw),I}の積分強度が、すべての同位体ピークパターンに対して、好ましくは１である同じ値を有するように行われる必要がある。

本発明の方法の好ましい実施形態である、参照試料に含まれる少なくとも１つの未知の分子種Ｍのそれぞれの特定された１つ以上の最も可能性の高い元素組成について、対応する分子種Ｍ_lのそれぞれの決定された検出可能な質量ｍ_Ml,mに対する測定質量スペクトルＩ_l（ｐ_l）から試料中の対応する分子種Ｍ_lの標識化状態を決定するプロセスにおいて、比較は、対応する分子種Ｍ_lの決定された同位体ピークパターンＩ_Ml,mにおける決定された検出可能な質量ｍ_Ml,mにおけるピーク強度を、元素組成Ｃ_M,i（＋０）の非標識化状態および別個の標識化状態Ｃ_M,i（＋ｎ₁，＋ｎ₂，．．．，＋ｎ_w）の強度寄与Ｌ_M,i（ｎ_1,ｎ_2,．．．，ｎ_w）と、同位体ピークパターンＩ_{M(+u1,+u2,…,+uw),i}が決定された元素組成Ｃ_M,i（＋０）および別個の標識化状態Ｃ_M,i（＋ｎ₁，＋ｎ₂，．．．，＋ｎ_w）の同位体ピークパターンＩ_M(+u),iにおける予測される検出可能な質量ｍ_Ml,mにおけるピーク強度との線形結合と比較することにより行われる。

通常、比較による元素組成Ｃ_M,i（＋０）の非標識化状態および別個の標識化状態Ｃ_M,i（＋ｎ₁，＋ｎ₂，．．．，＋ｎ_w）の強度寄与Ｌ_M,i（ｎ_1,ｎ_2,．．．，ｎ_w）の決定は、過剰決定の問題に突き当たり、強度寄与Ｌ_M,i（ｎ_1,ｎ_2,．．．，ｎ_w）の最も可能性のある値を見つけるためには、最適化アプローチを使用する必要がある。好ましくは、条件付き最適化の方法が使用され得る。決定のための特に好ましい方法は、非負最小二乗法である。標識化実験に応じて、強度寄与Ｌ_M,i（ｎ_1,ｎ_2,．．．，ｎ_w）を決定するために、他の最適化アプローチがより適切となり得る。

異なるプロセスが本発明の方法の他のプロセスの結果を使用していない限り、本発明の方法のすべてのプロセスはプロセスの任意の順序で実行することができ、プロセスのこの順序のいずれも、説明および請求される本発明の方法に包含されるものとする。

本発明の方法のプロセスのいくつかは、独立型であるか、接続されているか、もしくはクラウドシステム内にある支援コンピュータまたはプロセッサであってもよく、またプロセスを実行するためのソフトウェアであってもよい。

本出願に記載の実施形態において、本発明の方法の例を示す。したがって、本発明は、各実施形態のみによって、または記載された実施形態のいくつかもしくはすべての特徴の組み合わせによって、いかなる制限もなしに実現され得る。

本発明の方法を例示するためのフローチャートである。 定義された標識化状態を有する試験試料に適用された本発明の方法の結果を示す図である。 試験試料中の２つの特定の分子の定義された標識化状態を示す図である。

図１は、本発明の方法のプロセスがどのように実行され得るかを１つの順序のフロー図として示す。これは本発明の方法の一例にすぎない。

ここで、異なる順序のプロセスを使用する本発明の方法の別の例を説明する。

この例では、標識化プロセスとして、特定の同位体^xＥのみで標識化された同位体マーカーを使用する単一不変単一濃縮同位体標識化プロセスが使用される。

この例では、均一な元の試料は、細菌培養物であってもよく、初めに、参照試料および標識化されるべき試料の部分に分けられる。

方法の第１のステップにおいて、質量分析計を用いて参照試料の質量スペクトルＩ_ul（ｐ_ul）を測定した。

参照試料の質量スペクトルは、ＬＣ／ＭＳ機器を用いて測定される。参照試料は、液体クロマトグラフィーシステム、特に液体クロマトグラフィーカラムを介して質量分析計、特にそのイオン源に供給される。次いで、液体クロマトグラフィーシステムの溶出液の一連の質量スペクトルが、質量スペクトルによって測定される。次いで、一連の質量スペクトルから質量トレースを得ることができる。クロマトグラフィープロセスによれば、クロマトグラフピークは、分子種ごとにクロマトグラフィープロセス保持時間と呼ばれる特定の溶出時間で検出され得、これはこの時点で質量トレースとして示すことができる。典型的には、質量トレースは分子種の同位体分子種の質量で検出されるが、合体効果のために、質量は一連の質量スペクトルのある測定期間で逸脱し得る。合体効果を考慮に入れたそのような質量トレースの検出は、本出願人による非公開欧州特許出願第１８１７０７７９．５号に記載されており、本明細書にその全開示内容が組み込まれる。

参照試料の少なくとも１つの質量スペクトルＩ_ul（ｐ_ul）は、その分解能とは無関係に一種の質量分析計によって測定することができる。特に、Ｏｒｂｉｔｒａｐ（登録商標）質量分析器を有する質量分析計等の高分解能の質量分析計を使用することが好ましい。

本発明の方法のさらなるステップにおいて、調査されるべき試料は、特定の期間、不変単一濃縮同位体標識化プロセスに曝露される。

本方法の次のステップでは、試料の不変単一濃縮同位体標識化プロセスの開始後に、Ｏｒｂｉｔｒａｐ（登録商標）質量分析器を有する質量分析計等の質量分析計を用いて、試料の質量スペクトルＩ_l（ｐ_l）が測定される。

試料の質量スペクトルは、ＬＣ／ＭＳ機器を用いて測定される。次いで、試料は、液体クロマトグラフィーシステム、特に液体クロマトグラフィーカラムを介して質量分析計、特にそのイオン源に供給される。次いで、液体クロマトグラフィーシステムの溶出液の一連の質量スペクトルが、質量スペクトルによって測定される。これは、特定の溶出時間で質量スペクトルを測定するために、溶出液の溶出の異なる時点で溶出液が質量分析計、特にイオン源に提供されることを意味する。次いで、一連の質量スペクトルから質量トレースを得ることができる。クロマトグラフィープロセスによれば、クロマトグラフピークは、分子種ごとにクロマトグラフィープロセス保持時間と呼ばれる特定の溶出時間で検出され得、これはこの時点で質量トレースとして示すことができる。典型的には、質量トレースは分子種の同位体分子種の質量で検出されるが、合体効果のために、質量は一連の質量スペクトルのある測定期間で逸脱し得る。合体効果を考慮に入れたそのような質量トレースの検出は、本出願人による非公開欧州特許出願第１８１７０７７９．５号に記載されており、本明細書にその全開示内容が組み込まれる。

一般に、不変同位体標識化プロセスの開始後、試料の質量スペクトルＩ_l（ｐ_l）が、試料中に含まれる分子種Ｍの標識化プロセスを観察するための期間測定される。このとき、特定の同位体^xＥの時間依存性濃縮を観察することができ、これは、試料の不変単一同位体標識化プロセスの開始後の時間であってもよい特定の時点ｔにおける分子種Ｍの標識化状態を表すそのｎ回標識化分子Ｍ_lの時間依存性相対存在量ｃ_M（ｎ，ｔ）によって表すことができる。

本発明の方法の次のステップでは、参照試料の少なくとも１つの測定質量スペクトルＩ_ul（ｐ_ul）に基づいて、参照試料に含まれる少なくとも１つの未知の分子種Ｍの１つ以上の最も可能性の高い元素組成Ｃ_M,i（＋０）が決定される。

この方法では、少なくとも１つの分子種Ｍの最も可能性の高い元素組成Ｃ_M（＋０）のみが、本出願人の非公開欧州特許出願１８１５６９０３．９号に開示されているプロセスで決定される。

本方法の次のステップでは、参照試料に含まれる少なくとも１つの未知の分子種Ｍのそれぞれの決定された最も可能性の高い元素組成Ｃ_M（＋０）について、試料に含まれる対応する分子種Ｍ_lが、試料の測定質量スペクトルＩ_l（ｐ_l）において検出される。

このプロセスは、以下の３つのサブステップを含み、これらは参照試料に含まれる少なくとも１つの未知の分子種Ｍのそれぞれの特定された最も可能性の高い元素組成Ｃ_M,i（＋０）に対して実行される。

元素組成Ｃ_M（＋０）および該元素組成Ｃ_M（＋０）のすべての可能な別個の標識化状態Ｃ_M（＋ｎ）について、試料に含まれる対応する分子種Ｍ_lを検出するためのこのプロセスの最初のサブステップでは、同位体ピークパターンＩ_M(+u)が決定される。

同位体ピークパターンＩ_{M(+u1,+u2,…,+uw),i}を決定するために、当業者に公知の方法が適用される。同位体ピークパターンＩ_M(+u)を決定するために、試料の質量スペクトルＩ_l（ｐ_l）を測定する質量分析計の分解能が考慮される。

さらに、同位体マーカーの標識化率がこの決定において考慮される。

試料に含まれる対応する分子種Ｍ_lを検出するプロセスの第２のサブステップでは、元素組成Ｃ_M（＋０）の同位体ピークパターンＩ_M(+u)および該元素組成Ｃ_M（＋０）のすべての別個の標識化状態Ｃ_M（＋ｎ）を使用して、元素組成Ｃ_M（＋０）について対応する分子種Ｍ_lの検出可能な質量ｍ_Ml,mが決定される。

これにより、使用される質量分析計の分解能および／または質量許容誤差が考慮される。

分解できないピークについては、好ましくは強度ピークの正規化最大強度よりも、強度ピークの最高値における質量値および強度ピークの最大強度を考慮することによって、共通の質量中心ｍ_Ml,mが定義される。強度ピークの最高値における質量値は、強度ピークの正規化最大強度によって重み付けされ、次いで平均されて、共通の質量中心ｍ_Ml,mが決定される。

試料中に含まれる対応する分子種Ｍ_lを検出するための方法のこの第３のサブステップでは、対応する分子種Ｍ_lの同位体ピークパターンＩ_Ml,mは、元素組成Ｃ_M（＋０）について、対応する分子種Ｍ_lの決定された検出可能な質量ｍ_Ml,mでの試料の測定質量スペクトルＩ_l（ｐ_l）から決定される。

参照試料に含まれる少なくとも１つの未知の分子種Ｍのそれぞれの特定された最も可能性の高い元素組成のための方法の次のステップにおいて、試料中の対応する分子種Ｍ_lの標識化状態は、試料の測定質量スペクトルＩ_l（ｐ_l）から決定される。

この方法について、試料中の対応する分子種Ｍ_lの標識化状態は、ｎ回標識化分子Ｍ_lおよび非標識化分子Ｍのその強度寄与Ｌ_M（ｎ）または相対存在量ｃ_M（ｎ）により説明され得る。

このプロセスでは、元素組成Ｃ_M（＋０）の試料中の対応する分子種Ｍ_lの標識化状態は、対応する分子種Ｍ_lの決定された同位体ピークパターンＩ_Ml,mにおける決定された検出可能な質量ｍ_Ml,mにおけるピーク強度を、元素組成Ｃ_M（＋０）の非標識化状態および別個の標識化状態Ｃ_M（＋ｎ）の強度寄与Ｌ_M（ｎ）と、元素組成Ｃ_M（＋０）およびすべての別個の標識化状態Ｃ_M（＋ｎ₁）の同位体ピークパターンＩ_M(+u)における予測される検出可能な質量ｍ_Ml,mにおけるピーク強度との線形結合と比較することにより、元素組成Ｃ_M（＋０）の非標識化状態およびすべての別個の標識化状態Ｃ_M（＋ｎ）の強度寄与Ｌ_M（ｎ）を決定することによって決定される。

元素組成Ｃ_M（＋０）の非標識化状態および別個の標識化状態Ｃ_M（＋ｎ）の強度寄与Ｌ_M（ｎ）を決定するために、非負最小二乗法が用いられる。

図２および３に、本発明の方法の正当性を証明する試験結果を示す。いくつかの分子を含む試験試料を、特定の同位体¹³Ｃで標識化した同位体マーカーで標識化する。図２の下部の表の右欄に示すように、いくつかの標識化状態（０％、２５％、５０％、７５％、１００％）を異なる試験試料に対して調べた。試料の中央に示すように、試験試料はいくつかの分子種を含んでいる。一つの種はグルコースである。タイトル「状態交換率」の欄の分子量８８．１０９４を有する分子について、本発明の方法による標識化状態の決定の結果が示される。分子の別個の標識化状態の強度寄与は百分率値として示されている。３つの欄の左側には非標識化分子の百分率が示されており、隣接する各欄には、１つ以上の特定の同位体¹³Ｃが分子量８８．１０９４の分子に含まれる場合の百分率が示されている。

図３において、グルコースについては上の表に、また別の分子については下の表に同じ結果が示されており、未知の分子を同定しその標識化状態を決定した本発明の方法により初めて見出された。未知の分子は、グルコースとＨＣｌとの付加物として同定することができた。

結果は、本発明の方法が示された分子についての標識試験試料の標識化状態を同定することができることを明らかに示している。

Claims (6)

1. 質量分析を使用して、不変同位体標識化プロセスに曝露された試料中に含まれる未知の分子種Ｍの標識化状態を検出するための方法であって、
   − 質量分析計を用いて、前記不変同位体標識化プロセスに曝露されていない、または前記不変同位体標識化プロセスの開始時に前記プロセスに曝露されているのみである参照試料の少なくとも１つの質量スペクトルＩ_ul（ｐ_ul）を測定することと、
   − 前記不変同位体標識化プロセスにおいて前記試料を標識化することと、
   − 前記不変同位体標識化プロセスの開始後に、質量分析計を用いて前記試料の質量スペクトルＩ_l（ｐ_l）を測定することと、
   − 前記参照試料の前記少なくとも１つの測定質量スペクトルＩ_ul（ｐ_ul）に基づいて、参照試料に含まれる少なくとも１つの未知の分子種Ｍの１つ以上の最も可能性の高い元素組成Ｃ_M,i（＋０）を決定することと、
   − 前記参照試料に含まれる少なくとも１つの未知の分子種Ｍのそれぞれの決定された１つ以上の最も可能性の高い元素組成Ｃ_M,i（＋０）について、前記試料の前記測定質量スペクトルＩ_l（ｐ_l）において、前記試料に含まれる対応する分子種Ｍ_lを、前記参照試料に含まれる少なくとも１つの未知の分子種Ｍのそれぞれの特定された１つ以上の最も可能性の高い元素組成Ｃ_M,i（＋０）について、
   前記元素組成Ｃ_M,i（＋０）、および前記元素組成Ｃ_M,i（＋０）の少なくとも１つの別個の標識化状態Ｃ_M,i（＋ｎ₁，＋ｎ₂，．．．，＋ｎ_w）について、同位体ピークパターンＩ_M(+u),iを決定するステップと、
   前記元素組成Ｃ_M,i（＋０）について、前記元素組成Ｃ_M,i（＋０）の同位体ピークパターンＩ_{M(+u1,+u2,…,+uw),i}、および前記元素組成Ｃ_M,i（＋０）の前記少なくとも１つの別個の標識化状態Ｃ_M,i（＋ｎ₁，＋ｎ₂，．．．，＋ｎ_w）を使用して、前記対応する分子種Ｍ_lの検出可能な質量ｍ_Ml,mを決定するステップと、
   前記元素組成Ｃ_M,i（＋０）について、前記対応する分子種Ｍ_lの前記決定された検出可能な質量ｍ_Ml,mにおける前記試料の少なくとも１つの測定質量スペクトルＩ_l（ｐ_l）から、前記対応する分子種Ｍ_lの同位体ピークパターンＩ_Ml,mを決定するステップとを使用して検出することと、
   − 前記参照試料に含まれる少なくとも１つの未知の分子種Ｍのそれぞれの特定された１つ以上の最も可能性の高い元素組成について、
   前記対応する分子種Ｍ_lのそれぞれの決定された検出可能な質量ｍ_Ml,mについて、前記対応する分子種Ｍ_lの前記決定された同位体ピークパターンＩ_Ml,mにおいての前記決定された検出可能な質量ｍ_Ml,kにおけるピーク強度を、前記同位体ピークパターンＩ_{M(+u1,+u2,…,+uw),i}が決定された前記元素組成Ｃ_M,i（＋０）および別個の標識化状態Ｃ_M,i（＋ｎ₁，＋ｎ₂，．．．，＋ｎ_w）の同位体ピークパターンＩ_{M(+u1,+u2,…,+uw),i}における前記決定された検出可能な質量ｍ_Ml,mのピーク強度と比較することにより、前記元素組成Ｃ_M,i（＋０）について、前記同位体ピークパターンＩ_{M(+u1,+u2,…,+uw),i}が決定された前記元素組成Ｃ_M,i（＋０）の非標識化状態および前記別個の標識化状態Ｃ_M,i（＋ｎ₁，＋ｎ₂，．．．，＋ｎ_w）の強度寄与Ｌ_M,i（ｎ₁，ｎ₂，．．．，ｎ_w）を決定することによって、前記試料の前記測定質量スペクトルＩ_l（ｐ_l）から前記試料中の前記対応する分子種Ｍ_lの標識化状態を決定することと
   を含む方法。
2. 前記不変同位体標識化プロセスの開始後の期間中に、前記試料の質量スペクトルＩ_l（ｐ_l）が測定され、この期間中に、参照試料に含まれる少なくとも１つの分子種Ｍのそれぞれの特定された１つ以上の最も可能性の高い元素組成について、前記試料中の前記未知の分子種Ｍの標識化状態が、前記試料の前記測定された質量スペクトルＩ_l（ｐ_l）から決定される、請求項１に記載の方法。
3. すべての可能性のある別個の標識化状態について、前記同位体ピークパターンが決定され、前記方法の後続のステップにおいて使用される、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記参照試料に含まれる少なくとも１つの未知の分子種Ｍのそれぞれの特定された１つ以上の最も可能性の高い元素組成について、前記試料中の前記対応する分子種Ｍ_lの標識化状態が、前記対応する分子種Ｍ_lのそれぞれの決定された検出可能な質量ｍ_Ml,mについて、前記元素組成Ｃ_M,i（＋０）の前記非標識化状態および前記別個の標識化状態Ｃ_M,i（＋ｎ₁，＋ｎ₂，．．．，＋ｎ_w）の強度寄与Ｌ_M,i（ｎ₁，ｎ₂，．．．，ｎ_w）と、前記同位体ピークパターンＩ_{M(+u1,+u2,…,+uw),i}が決定された前記元素組成Ｃ_M,i（＋０）および前記別個の標識化状態Ｃ_M,i（＋ｎ₁，＋ｎ₂，．．．，＋ｎ_w）の前記同位体ピークパターンＩ_{M(+u1,+u2,…,+uw),i}における前記予測される検出可能な質量ｍ_Ml,mにおけるピーク強度との線形結合を、前記同位体ピークパターンＩ_{M(+u1,+u2,…,+uw),i}が決定された前記元素組成Ｃ_M,i（＋０）および前記別個の標識化状態Ｃ_M,i（＋ｎ₁，＋ｎ₂，．．．，＋ｎ_w）の前記同位体ピークパターンＩ_{M(+u1,+u2,…,+uw),i}における前記決定された検出可能な質量ｍ_Ml,mのピーク強度と比較することにより、前記試料の前記測定質量スペクトルＩ_l（ｐ_l）から決定される、請求項１〜３の少なくとも一項に記載の方法。
5. 前記試料が、不変単一濃縮同位体標識化プロセスによって標識化される、請求項１〜４の少なくとも一項に記載の方法。
6. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の試料中に含まれる未知の分子種Ｍの標識化状態を検出するための方法を使用するフラックス分析の方法。