JP2019205829A - 生体活性セメントペーストおよび生体活性セメントを製造するためのキット、生体活性セメントペーストおよびその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】適切な初期硬化時間を有する生体活性セメントペーストならびに非崩壊性および高い圧縮強度を有しかつ生体内で吸収されて骨と置換される生体活性セメントを製造するためのキットならびに生体活性セメントペーストおよびその製造方法を提供することを課題とする。【解決手段】セメント粉としてのリン酸水素カルシウム二水和物およびリン酸四カルシウムを含む粉体と、硬化剤としての生分解性多糖類および水を含む透明な中性水溶液との組み合わせであることを特徴とする生体活性セメントペーストおよび生体活性セメントを製造するためのキットにより、上記の課題を解決する。【選択図】図２−１７

Description

本発明は、生体活性セメントペーストおよび生体活性セメントを製造するためのキット、生体活性セメントペーストおよびその製造方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、適切な初期硬化時間を有する生体活性セメントペーストならびに非崩壊性および高い圧縮強度を有しかつ生体内で吸収されて骨と置換される生体活性セメントを製造するためのキットならびに生体活性セメントペーストおよびその製造方法に関する。

近年、疾患や事故などによる骨折や骨欠損の修復のために、生体内で水和硬化する骨補填材が一般に用いられている。例えば、骨粗鬆症や骨腫瘍による椎体の圧迫骨折では、骨補填材としての骨セメントを穿刺針により経皮的に椎体内に注入して椎体を再建する経皮的椎体形成術が行われている。

骨セメントとしては、現在、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）セメントおよびリン酸カルシウムセメント（ＣＰＣ）が主に用いられている。
ＰＭＭＡセメントは、硬化速度および硬化後の強度に優れているが、骨伝導能がないため骨組織との親和性に乏しく、未反応モノマーの毒性や重合熱の発生による周辺組織の損傷などの問題がある。
一方、ＣＰＣは、ＰＭＭＡセメントに比べて硬化速度および硬化後の強度の点で劣るが、生体内で骨類似ハイドロキシアパタイトに転化するので骨伝導能に優れている。ＣＰＣの材料であるリン酸カルシウム系化合物には、生体内で分解・吸収されることによって自然に消滅し、自家骨と置換されるという性質を有するものが多いことから、骨置換型のＣＰＣの開発も進んでいる。また、生体適合性物質であるキトサンをＣＰＣに配合することにより、機械的特性を改善したＣＰＣも開発されている。
また、近年では、内部に気孔と呼ばれる微小な空隙を多数有する多孔質のＣＰＣも開発され、ハイドロキシアパタイトなどのリン酸カルシウム系化合物を主成分とし、生体内で分解・吸収される物質を含む補填材も提案されている。

しかしながら、ＣＰＣに配合するために、硬化剤としてキトサンをリンゴ酸で溶解した酸性硬化液を用いる従来のセメントペーストでは、動物実験において、埋入箇所の近傍で骨溶解が起こることが指摘され、またセメントペーストの粘性が高いために、シリンジでの吐出が難しいという問題があった。
そこで、本願出願人は、セメント粉としてのリン酸水素カルシウム二水和物およびリン酸四カルシウムを含む粉体と、硬化剤としてのカルシウム非含有のリン酸塩、炭酸水素ナトリウムおよびキトサンを含む中性水溶液（「中性硬化液」ともいう）との組み合わせを特徴とする生体活性セメントペーストおよび生体活性セメントを製造するためのキットを提案した（特開２０１８−０３８５９０号公報：特許文献１）。
すなわち、特許文献１では、キトサンを酸で溶解後、塩析にて可溶性粉末を得、得られた粉末を溶解した中性硬化液を用いることにより、セメントペーストの粘性を低下させ、シリンジ注入を容易にした。

特開２０１８−０３８５９０号公報

しかしながら、特許文献１の塩析粉末のキトサンを含有する中性硬化液を用いたセメントペーストでは、動物実験において、酸性硬化液のような骨溶解は起こらないものの、キトサン含有量がまだまだ低く、キトサン含有量の増加による、硬化体の圧縮強度のさらなる向上が望まれている。
他方、セメント粉の硬化において、その周囲に繊維状の膜が形成されることも報告されている。この現象は、セメント粉の硬化に伴い、硬化液中のキトサンの溶け残りが硬化体の周囲に吐き出されて膜が形成されているものと考えられる。
このような点から、キトサンが高含有量であることに加えて、キトサンの溶け残りのない中性硬化液およびそれを含有するセメントペーストが求められている。
また、硬化剤としてのキトサンに代わる高含有量の生分解性多糖類を含む中性硬化液およびそれを含有するセメントペーストが求められている。

そこで、本発明は、キトサン含有量を向上させた、溶け残りがない、すなわち透明度の高い中性硬化液および硬化剤としてのキトサンに代わる高含有量の生分解性多糖類を含む中性硬化液を見出し、適切な初期硬化時間を有する生体活性セメントペーストならびに非崩壊性および高い圧縮強度を有しかつ生体内で吸収されて骨と置換される生体活性セメントを製造するためのキットならびに生体活性セメントペーストおよびその製造方法を提供することを課題とする。

本発明者は、上記の課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、キトサンと共にポリオールを硬化液に配合することにより、キトサンの溶解性が向上し、溶け残りがなく、透明度が高い均一な中性硬化液、硬化剤としてのキトサンに代わる高含有量の生分解性多糖類としてアルギン酸を硬化液に配合することにより、透明度が高い均一な中性硬化液が得られ、上記の課題が解決できることを意外にも見出し、本発明を完成するに至った。

かくして本発明によれば、セメント粉としてのリン酸水素カルシウム二水和物およびリン酸四カルシウムを含む粉体と、硬化剤としての生分解性多糖類および水を含む透明な中性水溶液との組み合わせであることを特徴とする生体活性セメントペーストおよび生体活性セメントを製造するためのキットが提供される。

また、本発明によれば、セメント粉としてのリン酸水素カルシウム二水和物およびリン酸四カルシウムを含む粉体に、前記セメント粉が硬化するために必要な量の硬化剤としての生分解性多糖類および水を含む透明な中性水溶液を添加・混和して生体活性セメントペーストを得ることを特徴とする生体活性セメントペーストの製造方法が提供される。
さらに、本発明によれば、上記の粉体と中性水溶液との混和物である生体活性セメントペーストが提供される。

本発明によれば、適切な初期硬化時間を有する生体活性セメントペーストならびに非崩壊性および高い圧縮強度を有しかつ生体内で吸収されて骨と置換される生体活性セメントを製造するためのキットならびに生体活性セメントペーストおよびその製造方法を提供することができる。
具体的には、実施例に記載のように、ポリオール含有の透明な中性キトサン含有硬化液（ｐＨ６．７１、透過率４３．７３％）が得られ、それを用いたセメントペーストでは、初期硬化時間１５．７±１．２分の短縮化を実現し、その硬化体では、殆ど溶解しないといえる静的崩壊率０．３７８±０．１０８％を実現し、かつ酸性硬化液での骨溶解現象および硬化体周辺での線維性組織生成の問題を解消した。
また、実施例に記載のように、透明なアルギン酸ナトリウム含有硬化液（ｐＨ７．００、透過率５６．３％）が得られ、それを用いたセメントペーストでは、初期硬化時間１１．５±０．５分の短縮化を実現し、その硬化体では、殆ど溶解しないといえる静的崩壊率０．６３±０．３０％を実現し、かつ酸性硬化液での骨溶解現象および硬化体周辺での線維性組織生成の問題を解消し、さらに骨形成能の優れた硬化体が得られた。

本発明のペーストは不定形混合物であり、セメント粉である粉体と硬化剤を含む中性水溶液とを混和した直後には、任意の形状に変化させることやチューブへの充填操作が可能である。そして、本発明のペーストは、時間経過により自己硬化し、水中または生体内において水和反応によりさらに硬化してＣＰＣの一種である硬化体になる。したがって、本発明のペーストは、骨補填材の前駆体として好適に用いることができる。

また、本発明の生体活性セメントペーストおよび生体活性セメントを製造するためのキットは、少なくとも次のいずれか１つの要件を満足する場合に、上記の効果をさらに発揮する。
（１）セメント粉としてのリン酸水素カルシウム二水和物およびリン酸四カルシウムを含む粉体と、硬化剤としてのキトサン、該キトサンの可溶化成分としてのポリオールおよび水を含む透明な中性水溶液との組み合わせである。
（２）ポリオールが、β−グリセロリン酸二ナトリウムである。
（３）中性水溶液中のキトサンおよびポリオールの濃度が、それぞれ０．５重量％以上１０重量％以下および０．５重量％以上５重量％以下である。
（４）セメント粉としてのリン酸水素カルシウム二水和物およびリン酸四カルシウムを含む粉体と、硬化剤としてのアルギン酸またはその塩および水を含む透明な中性水溶液との組み合わせである。
（５）中性水溶液中のアルギン酸またはその塩の濃度が、０．２重量％以上２０重量％以下である
（６）リン酸水素カルシウム二水和物とリン酸四カルシウムとの配合割合が、モル比で１：１である。
（７）粉体Ｐと中性水溶液Ｌとの配合割合Ｐ／Ｌが、重量比で１〜４である。

また、本発明の生体活性セメントペーストの製造方法は、少なくとも次のいずれか１つの要件を満足する場合に、上記の効果をさらに発揮する。
（８）セメント粉としてのリン酸水素カルシウム二水和物およびリン酸四カルシウムを含む粉体に、セメント粉が硬化するために必要な量の硬化剤としてのキトサン、該キトサンの可溶化成分としてのポリオールおよび水を含む透明な中性水溶液を添加・混和して生体活性セメントペーストを得る。
（９）セメント粉としてのリン酸水素カルシウム二水和物およびリン酸四カルシウムを含む粉体に、セメント粉が硬化するために必要な量の硬化剤としてのアルギン酸またはその塩および水を含む透明な中性水溶液を添加・混和して生体活性セメントペーストを得る。

ＣＰＣペーストの調製（練和）に用いた器具、（ａ）シャーレおよび（ｂ）薬さじと練和前の様子を示す図である。 ＣＰＣの作製に用いた器具、（ａ）テフロン（登録商標）割型、（ｂ）プラスチック板および（ｃ）クリップを示す図である。 ＣＰＣの作製に用いた器具、（ａ）テフロン割型、（ｂ）テフロン型固定板、（ｃ）平頭ネジ、（ｄ）ナットおよび（ｅ）組立図を示す図である。 ＣＰＣペーストの初期硬化に用いた保存容器およびその中の様子を示す図である。 ＣＰＣペーストの初期硬化時間の測定に用いた、（ａ）ビガー針試験機および（ｂ）その試験の様子を示す図である。 ＣＰＣ硬化体の圧縮強度試験に用いた引張−圧縮変換器を示す図である。 ＣＰＣの静的崩壊率の測定に用いた、（ａ）ＣＰＣ計量用シリンジおよび（ｂ）ＣＰＣ分離膜を示す図である。 ＣＰＣの静的崩壊率の測定に用いた、（ａ）プラスチック容器および（ｂ）ステンレス金網台を示す図である。 インビボ試験において家兎大腿骨関節部に作製した孔（矢印）の様子を示す図である。 比表面積測定に用いた細孔分布測定装置の外観を示す図である。 （ａ）生成ＴＴＣＰおよび（ｂ）市販ＴＴＣＰの回折図形ならびに（ｃ）ＴＴＣＰの回折線図（ＩＣＤＤ ＰＤＦ Ｎｏ．２５−１１３７）である。 （ａ）湿式粉砕前のＤＣＰＤおよび（ｂ）湿式粉砕後のＤＣＰＤの回折図形ならびに（ｃ）ＤＣＰＤの回折線図（ＩＣＤＤ ＰＤＦ Ｎｏ．１１−０２９３）である。 （ａ）湿式粉砕前のＤＣＰＡおよび（ｂ）湿式粉砕後のＤＣＰＡの回折図形ならびに（ｃ）ＤＣＰＡの回折線図（ＩＣＤＤ ＰＤＦ Ｎｏ．０９−００８０）である。 （ａ）生成ＴＴＣＰ、（ｂ）市販ＴＴＣＰ、（ｃ）湿式粉砕後のＤＣＰＤおよび（ｄ）湿式粉砕後のＤＣＰＡの粒度分布を示す図である。 （ａ）生成ＴＴＣＰ、（ｂ）市販ＴＴＣＰ、（ｃ）湿式粉砕前のＤＣＰＤ、（ｄ）湿式粉砕後のＤＣＰＤ、（ｅ）湿式粉砕前のＤＣＰＡおよび（ｆ）湿式粉砕後のＤＣＰＡのＳＥＭ像を示す図である。 生成ＴＴＣＰのガス吸着量測定による（ａ）吸脱着等温線および（ｂ）ＢＥＴプロットを示す図である。 市販ＴＴＣＰのガス吸着量測定による（ａ）吸脱着等温線および（ｂ）ＢＥＴプロットを示す図である。 湿式粉砕前のＤＣＰＤのガス吸着量測定による（ａ）吸脱着等温線および（ｂ）ＢＥＴプロットを示す図である。 湿式粉砕後のＤＣＰＤのガス吸着量測定による（ａ）吸脱着等温線および（ｂ）ＢＥＴプロットを示す図である。 （Ｌ１）キトサン含有酸性硬化液（Liquid１）、（Ｌ２）キトサン含有中性硬化液（Liquid２）、（Ｌ３）ポリオール−キトサン含有硬化液（Liquid３）および（Ｌ４）キトサン溶液（Liquid４）の状態を示す図である。 （Ｌ２）キトサン含有中性硬化液（Liquid２）、（Ｌ３）ポリオール−キトサン含有硬化液（Liquid３）および（Ｌ４）キトサン溶液（Liquid４）の可視光透過スペクトルを示す図である。 （Ｌ３）および（Ｌ３−１）〜（Ｌ３−４）ポリオール−キトサン含有硬化液（Liquid３およびLiquid３−１〜Liquid３−４）の状態を示す図である。 （Ｌ３）および（Ｌ３−５）〜（Ｌ３−９）ポリオール−キトサン含有硬化液（Liquid３およびLiquid３−５〜Liquid３−９）の状態を示す図である。 硬化液として（ａ）水、（ｂ）キトサン含有酸性硬化液（Liquid１）および（ｃ）キトサン含有中性硬化液（Liquid２）をそれぞれ用いたＣＴＣペーストでのインビボ試験（動物埋入試験）の試料のマイクロＸ線ＣＴ画像である。 硬化体ＣＰＣ１、ＣＰＣ２およびＣＰＣ３のビガー針試験の結果を示す図である。 硬化体ＣＰＣ３およびＣＰＣ４のビガー針試験の結果を示す図である。 硬化体ＣＰＣ１、ＣＰＣ２およびＣＰＣ３の各浸漬時間における圧縮強度を示す図である。 硬化体ＣＰＣ３、ＣＰＣ５、ＣＰＣ６およびＣＰＣ７ならびにＰＡのセメント粉の各成分の粒径比と圧縮強度との関係を示す図である。 セメント粉１と硬化液Liquid３を用いて作製した硬化体ＣＰＣ３の各浸漬時間における粉末Ｘ線回折図形である。 セメント粉１〜４と硬化液Liquid３を用いて作製した硬化体ＣＰＣ３、ＣＰＣ５、ＣＰＣ６およびＣＰＣ７の１日浸漬における粉末Ｘ線回折図形である。 ＴＴＣＰ、ＤＣＰＤ、ＤＣＰＡおよびＨＡｐの回折線図（それぞれＩＣＤＤ ＰＤＦ Ｎｏ．２５−１１３７、Ｎｏ．１１−０２９３、Ｎｏ．０９−００８０およびＮｏ．７４−０５６６）である。 硬化体ＣＰＣ３の静的崩壊率測定の様子を示す図である。

ＣＰＣペーストの調製（練和）に用いた治具と練和前の様子を示す図である。 ＣＰＣの作製（初期硬化）に用いた型の構成（器具）を示す図である。 テフロン製割型、（ａ）テフロン型、（ｂ）テフロン型固定板、（ｃ）平頭ネジ、（ｄ）ナットおよび（ｅ）組立図を示す図である。 ＣＰＣの初期硬化に用いる容器を示す図である。 ＣＰＣ硬化体の圧縮強度試験に用いた引張−圧縮変換器を示す図である。 ＣＰＣ硬化体の初期硬化時間測定に用いた（ａ）ビガー針試験機および（ｂ）その試験の様子を示す図である。 ＣＰＣ硬化体の静的崩壊率測定に用いた（ａ）プラスチック容器および（ｂ）ステンレス金網台を示す図である。 ＣＰＣ硬化体の押出力測定に用いた、先端を切断したシリンジを示す図である。 ＣＰＣ硬化体の押出力測定の様子を示す図である。 ＣＰＣ硬化体の吸収性インビトロ試験（溶解性試験）の（ａ）試験装置の様子を示す図および（ｂ）その模式図である。 （ａ）生成物Ａ、（ｂ）市販ＴＴＣＰおよび（ｃ）市販ＴＴＣＰ(2)の回折図形ならびに（ｄ）ＴＴＣＰ（ＩＣＤＤ ＰＤＦ Ｎｏ．２５−１１３７）の回折線図である。 （ａ）湿式粉砕前のＤＣＰＡ、（ｂ）３０時間湿式粉砕後のＤＣＰＡ、（ｃ）４８時間湿式粉砕後のＤＣＰＡおよび（ｄ）９６時間湿式粉砕後のＤＣＰＡの回折図形ならびに（ｅ）ＤＣＰＡ（ＩＣＤＤ ＰＤＦ Ｎｏ．０９−００８０）の回折線図である。 乾式粉砕のＴＴＣＰ（粉砕時間１時間）、（II）乾式粉砕のＴＴＣＰ（粉砕時間１．５時間）、（III）市販のＴＴＣＰおよび（IV）市販ＴＴＣＰ(2)の粒度分布を示す図である。 （Ｖ）湿式粉砕のＤＣＰＡ（粉砕時間３０時間）、（VI）湿式粉砕のＤＣＰＡ（粉砕時間４８時間）および（VII）湿式粉砕のＤＣＰＡ（粉砕時間９６時間）の粒度分布を示す図である。 アルギン酸含有硬化液、（ａ）LiquidＡ２、（ｂ）LiquidＡ３および（ｃ）LiquidＡ４の様子を示す図である。 アルギン酸含有硬化液、（ａ）LiquidＡ２、（ｂ）LiquidＡ３および（ｃ）LiquidＡ４の透過率を示す図である。 硬化体ＣＰＣ４、ＣＰＣ７およびＣＰＣ８の２４時間浸漬における圧縮強度を示す図である。 硬化体ＣＰＣ４の各浸漬時間に対する圧縮強度を示す図である。 硬化体ＣＰＣ４、ＣＰＣ２およびＣＰＣ４の１日および７日浸漬における圧縮強度を示す図である。 硬化体ＣＰＣ１０およびＣＰＣ６の１日および７日浸漬における圧縮強度を示す図である。 １日および７日浸漬した硬化体ＣＰＣ４の回折図形である。 １日、７日および１ヶ月浸漬した硬化体ＣＰＣ２の浸漬時間ごとの回折図形である。 １日および７日浸漬した硬化体ＣＰＣ９の浸漬時間ごとの回折図形である。 １日および７日浸漬した硬化体ＣＰＣ１０の浸漬時間ごとの回折図形である。 １日および７日浸漬した硬化体ＣＰＣ６の浸漬時間ごとの回折図形である。 ＴＴＣＰ、ＤＣＰＤ、ＤＣＰＡおよびＨＡｐの回折線図（それぞれＩＣＤＤ ＰＤＦ Ｎｏ．２５−１１３７、Ｎｏ．１１−０２９３、Ｎｏ．０９−００８０およびＮｏ．７４−０５６６）である。 硬化体ＣＰＣの静的崩壊率の実験の様子を示す図である。 ｐＨ５．５に調製した酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液中での硬化体ＣＰＣ２のカルシウム濃度の経時変化を示す図である。 ｐＨ５．５に調製した酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液中での硬化体ＣＰＣ６のカルシウム濃度の経時変化を示す図である。 吸収性試験後の硬化体ＣＰＣ２のマイクロフォーカスＸ線ＣＴ像を示す図である。 硬化体ＣＰＣ２のＦＥ−ＳＥＭを示す図である。 硬化体ＣＰＣ６のＦＥ−ＳＥＭを示す図である。

（１）生体活性セメントペーストおよび生体活性セメントを製造するためのキット
本発明の生体活性セメントペーストおよび生体活性セメントを製造するためのキット（以下、単に「キット」ともいう）は、セメント粉としてのリン酸水素カルシウム二水和物およびリン酸四カルシウムを含む粉体と、硬化剤としての生分解性多糖類および水を含む透明な中性水溶液との組み合わせであることを特徴とする。
本発明において「生体活性セメントペースト（以下、単に「ペースト」ともいう）」とは、上記セメント粉としての粉体と硬化剤を含む中性水溶液とを混和した直後、少なくともシリンダに充填して押し出すまでの混和物をいう。後述するように、ペーストは混和直後から徐々に初期硬化が始まり、生体内でさらに水和反応により硬化体（生体活性セメント）になる。

本発明のキットは、セメント粉を含む粉体と、硬化剤を含む中性水溶液とがそれぞれ別個の容器に収められた二試薬型のキットであることが好ましい。
それらの容器の形状は特に限定されず、例えば、粉体を中性水溶液との混和が可能な混練注入器に収め、中性水溶液も注入器に収めることなどが挙げられる。この場合、本発明のキットは、注入針をさらに含んでいてもよく、得られる組成物の粘度を調整するための水をさらに含んでいてもよい。
本発明において用いられる生分解性多糖類とは、セメント粉と組み合わせてその硬化剤となり、かつ優れた骨形成機能を発揮させ得るものであれば特に限定されない。
このような生分解性多糖類としては、キトサン、アルギン酸、デンプン、グリコーゲン、デキストラン、イヌリン、コンドロイチンなどが挙げられ、これらの中でも、キトサンおよびアルギン酸が特に好ましい。

したがって、本発明のキットは、
セメント粉としてのリン酸水素カルシウム二水和物およびリン酸四カルシウムを含む粉体と、硬化剤としてのキトサン、該キトサンの可溶化成分としてのポリオールおよび水を含む透明な中性水溶液との組み合わせである（実施形態１）、および
セメント粉としてのリン酸水素カルシウム二水和物およびリン酸四カルシウムを含む粉体と、前記硬化剤としてのアルギン酸またはその塩および水を含む透明な中性水溶液との組み合わせである（実施形態２）
であるのが好ましい。
粉体および中性水溶液の各構成成分およびそれらの配合割合などの詳細については、以下の（２）生体活性セメントペーストの製造方法および（３）生体活性セメントペーストにおいて説明する。
上記の（２）については、実施形態１および実施形態２に分けて説明する。

（２）生体活性セメントペーストの製造方法
（２−１）実施形態１
本発明の生体活性セメントペーストの製造方法は、セメント粉としてのリン酸水素カルシウム二水和物およびリン酸四カルシウムを含む粉体に、セメント粉が硬化するために必要な量の硬化剤としてのキトサン、該キトサンの可溶化成分としてのポリオールおよび水を含む透明な中性水溶液を添加・混和して生体活性セメントペーストを得ることを特徴とする。

［セメント粉］
セメント粉は、リン酸水素カルシウム二水和物（ＤＣＰＤ）およびリン酸四カルシウム（ＴＴＣＰ）を含む。
ＤＣＰＤとＴＴＣＰとを配合することで、自己硬化後の水和反応による硬化が進行すると共に、得られる硬化体において両者が反応してハイドロキシアパタイトへと徐々に転化する。

［リン酸水素カルシウム二水和物（ＤＣＰＤ）］
ＤＣＰＤは、市販のものを用いてもよいし、公知の方法により自ら製造したものを用いてもよい。
また、ＤＣＰＤに代えて、その無水物であるリン酸水素カルシウム（ＤＣＰＡ）を用いることもできる。ＤＣＰＡは、市販のものを用いてもよいし、公知の方法により自ら製造したものを用いてもよい。
ＤＣＰＤおよびＤＣＰＡの粒径は特に限定されないが、水和反応およびＴＴＣＰとのハイドロキシアパタイトの転化形成の点で、０．２〜１０μｍの範囲が好ましく、０．５〜５μｍの範囲がより好ましい。なお、ＤＣＰＤおよびＤＣＰＡの粉体が好ましい粒径でない場合には、湿式粉砕などの公知の方法で粉砕して粒径を調節してもよい。
また、リン酸水素カルシウム二水和物の代わりにリン酸水素カルシウム無水物を用いることができ、その他の条件にも因るが、無水物の方が二水和物に比べて、得られる硬化体の強度向上に優れることがある。

［リン酸四カルシウム（ＴＴＣＰ）］
ＴＴＣＰは、市販のものを用いてもよいし、公知の方法により自ら製造したものを用いてもよい。
例えば、ＴＴＣＰの粉体は、炭酸カルシウムの粉体とリン酸水素カルシウム二水和物の粉体とを水性媒体中で湿式混合し、得られた混合物を温度１２００〜１７００℃で３〜６時間焼成し、得られた焼成物を粉砕することで製造することができる。
ＴＴＣＰの粒径は特に限定されないが、水和反応およびＤＣＰＤとのハイドロキシアパタイトの転化形成の点で、１５０μｍ未満であるのが好ましく、７５μｍを超える場合には硬化体中にＴＴＣＰが残存することがあり、３２μｍ未満であるのがより好ましい。なお、ＴＴＣＰの粉体が好ましい粒径でない場合には、ふるい選別などの公知の方法で選別して粒径を調節してもよい。
［ＤＣＰＤとＴＴＰＣとの割合］
ＤＣＰＤとＴＴＰＣとの配合割合は、モル比で１：１であるのが好ましい。
このような配合割合のセメント粉とすることにより、下式のようにハイドロキシアパタイトが生成され、均一な組成物（ペースト）を得ることができる。
２Ｃａ₄Ｏ(ＰＯ₄)₂＋２ＣａＨＰＯ₄→１０Ｃａ²⁺＋６ＰＯ₄ ^3-＋２ＯＨ^-
→Ｃａ₁₀(ＰＯ₄)₆(ＯＨ)₂

［中性水溶液］
中性水溶液（「中性硬化液」ともいう）は、硬化剤としてのキトサン、該キトサンの可溶化成分としてのポリオールおよび水を含む。
本発明の「透明な中性水溶液」の「透明な」とは、含有するキトサンの溶け残りがないことを示す指標であり、実施例において記載するように、可視光透過率スペクトル測定において、４０％以上の透過率を有することを意味する。
透過率が４０％未満では、水溶液中にキトサンの溶け残りが存在して、配合した量のキトサンの効果が得られないことがある。
また、「中性」とは、ｐＨが６〜７．５であることを意味する。
ｐＨが６未満では、生体内の硬化体周辺で骨溶解現象が起こることがある。一方、ｐＨが７．５を超えると、不均一な硬化による強度低下や硬化液化液の調合中に泡を生じることがある。

［ポリオール］
ポリオールは、中性水溶液中のキトサン含有量を増加させる機能、ひいては中性かつ透明な硬化液を与え得る機能を有する。
ポリオールは、複数のアルコール性ヒドロキシ基を有する脂肪族化合物、すなわち多価アルコールであり、２個のヒドロキシ基を有する、エチレングリコール（Ｃ₂Ｈ₄(ＯＨ)₂）などのグリコール（ジオール）、３個のヒドロキシ基を有する、グリセロール（Ｃ₂Ｈ₅(ＯＨ)₃）などのトリオールが挙げられる。
本発明においては、セメント粉との親和性の観点で、複数のヒドロキシ基のいずれかがリン酸エステル化されたものおよびその塩が好ましい。ここで、塩としては、ナトリウムなどのアルカリ金属塩が挙げられる。

このようなリン酸エステル化されたポリオールとしては、例えば、グリセロールの３個のヒドロキシ基のいずれかがリン酸エステル化されたグリセロールリン酸およびその塩が挙げられ、これらの中でも、硬化液の粘性とペーストの注入の観点で、β−グリセロリン酸二ナトリウム（ＮａＧＰ：Ｃ₃Ｈ₇Ｎａ₂Ｏ₆Ｐ）が特に好ましい。

ＮａＧＰは、骨芽細胞の培地に用いられる化合物であり、骨化の誘導や良好な石灰化を示すこと、固相時に水を急速に吸収する一方で、溶媒中では水の放出が遅いため吸湿性を示すことが知られている。
また、ＮａＧＰをキトサン溶液に加えることにより、インジェクタブルで中性を示す生分解性の溶液が得られることも知られている。この中性溶液は、キトサンとＮａＧＰの水素結合や静電相互作用および疎水相互性作用の相乗的な力から得られるものと推測され、生細胞や治療用タンパク質の保持などに用いられている。さらに、セメント粉にＮａＧＰを配合することにより、注出時の押出力の低下、すなわち流動性の向上につながることが知られている。しかしながら、本発明のように、ＮａＧＰをキトサンと共に、セメント粉と併用した例は知られていない。

ＮａＧＰは、下式のような化学構造を有する。

［キトサン］
キトサンは、ペーストの硬化速度およびその硬化体の圧縮強度を向上させる機能、さらにはペーストのゲル化剤としての機能、ならびに硬化体を生体内に注入もしくは埋入した後に、ペーストが硬化した硬化体から溶出して硬化体を多孔化させる機能を有する。
キトサンは、カニやエビなどの甲殻類の外骨格およびキノコなどの菌類の細胞壁に含まれるキチンを濃アルカリによって脱アセチル化することで得られる天然高分子として知られているが、本発明においては、キトサンの由来は特に限定されない。
キトサンの形態は特に限定されず、粉体、溶液のいずれの形態であってもよい。
本発明において、キトサンの脱アセチル化度は特に限定されないが、生分解がより容易である点で、７０〜１００％であるのが好ましい。

キトサンは、下式のような化学構造を有する。

キトサンの分子量は、一般にキトサン溶液の粘度に比例することが知られている。
本発明において、キトサンの平均分子量は、粘度に基づく分子量として１０，０００以上３１０，０００以下であるのが好ましい。
平均分子量が比較的中程度の上記範囲のキトサンを含むペーストは、平均分子量が比較的小さい１９０，０００未満のキトサンを含むペーストよりも、水和反応により得られる硬化体の破壊エネルギーが大きくなる傾向にあるので好ましい。

本明細書において、キトサン溶液の粘度は、１％酢酸水溶液にキトサンを１重量％となるように溶解させ、得られたキトサン溶液について、溶液温度２０℃でＢ型回転粘度計により測定した値をいう。そして、測定した粘度に基づいてキトサンの固有粘度を算出し、Mark-Houwink-Sakuradaの式より、キトサンの分子量を算出する。

［その他の成分］
中性水溶液は、本発明の効果を阻害しない限り、当該技術分野において公知の成分を含んでいてもよい。
リン酸二水素カリウムのようなカルシウム非含有のリン酸塩は、セメント粉を構成するリン化合物のリン成分を補足する機能を有するものと考えられる。
カルシウム非含有とは、リン酸塩がカルシウムを含まないこと、すなわちカルシウム塩でないことを意味する。カルシウムは、セメント粉の硬化過程において、リン酸と反応して針状あるいは棒状の長軸方向の成長が優越した結晶を析出し、それらが立体的に交差して初期硬化に作用し、硬化に弊害を及ぼすため、本発明ではリン酸のカルシウム塩を除外する。
カルシウム非含有のリン酸塩は、正リン酸および亜リン酸のアルカリ金属塩、ならびにリン酸水素アンモニウムから選択されるのが好ましく、アルカリ金属としては、ナトリウム、カリウムなどが挙げられ、例えば、リン酸三ナトリウム（Ｎａ₃ＰＯ₄）、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ₂ＨＰＯ₄）；リン酸三カリウム（Ｋ₃ＰＯ₄）、リン酸二水素カリウム（ＫＨ₂ＰＯ₄）、リン酸水素二カリウム（Ｋ₂ＨＰＯ₄）；亜リン酸ナトリウム（Ｎａ₂ＰＨＯ₃）、亜リン酸水素ナトリウム（ＮａＨＰＨＯ₃）；亜リン酸カリウム（Ｋ₂ＰＨＯ₃）、亜リン酸水素カリウム（ＫＨＰＨＯ₃）；リン酸二水素アンモニウム（ＮＨ₄Ｈ₂ＰＯ₄）、リン酸水素二アンモニウム（(ＮＨ₄)₂ＨＰＯ₄）などが挙げられる。これらの中でも、リン酸水素二カリウムおよびリン酸水素二ナトリウムがキトサン再析出を阻害する点で、特に好ましい。キトサンに対する量は、１５０〜２００重量％程度である。

クエン酸などのジカルボン酸は、キトサンの溶解に作用すると考えられる。キトサンに対する量は、３０〜２００重量％程度である。
デキストラン硫酸ナトリウムなどの高分子化合物は、前述のキトサン溶解液にゲル化剤として作用し、キトサン含有塩形成に働くものと考えられる。キトサンに対する量は、３０〜２００重量％程度である。
塩化ナトリウムなどは、塩形成に補助的に作用するものと考えられる。キトサンに対する量は、３０〜８００重量％程度である。

［中性水溶液の組成］
本発明の中性水溶液中のキトサンおよびポリオールの濃度は、それぞれ０．５重量％以上１０重量％以下および０．５重量％以上５重量％以下であるのが好ましい。

キトサンの濃度が０．５重量％未満では、硬化後多孔化の効果が乏しく、破壊エネルギーが上がらないことがある。一方、キトサンの濃度が１０重量％を超えると、硬化液の粘性が上がり、注入（インジェクタビリティ）が困難になることがある。完全に溶解しないことがある。
より好ましいキトサンの濃度は、１重量％以上１０重量％以下であり、さらに好ましくは１．５重量％以上２重量％以下である。

ポリオールの濃度が０．５重量％未満では、ゲル化が起こり、注入が困難となり、また中性にならないことがある。一方、ポリオールの濃度が５重量％を超えると、硬化が進まないことがある。
より好ましいポリオールの濃度は、１重量％以上４重量％以下であり、さらに好ましくは２重量％以上３重量％以下である。

［中性水溶液の調製］
本発明の中性水溶液は、例えば、キトサンを酸で溶解させたキトサン溶液に、ポリオール溶液を添加・混合することにより得ることができる。

［粉体粉Ｐと中性水溶液Ｌとの比率］
粉体Ｐと中性水溶液Ｌとの配合割合（粉液比）Ｐ／Ｌ（またはＰＬ比）は、重量比で１〜４であるのが好ましい。
ＰＬ比が１未満では、硬化強度が不足することがある。一方、ＰＬ比が４を超えると均等な練和が困難となることがある。
より好ましいＰＬ比は、２〜４であり、特に好ましいＰＬ比は、３〜４である。

［ペーストの調製］
本発明のペーストは、上記の粉体に、セメント粉が硬化するために必要な量の硬化剤としてのキトサン、該キトサンの可溶化成分としてのポリオールおよび水を含む透明な中性水溶液を添加・混和（混合または練和）することにより得ることができる。
その添加・混和手段は特に限定されず、添加量（混和量）などに応じて公知の混合手段から適宜選択すればよい。
粉体と中性水溶液との混合後、本発明のペーストは、通常３〜２０分程度で自己硬化が完了する(初期硬化)。このときの温度および湿度の条件は、一般的なＣＰＣの調製条件と特に変わるところはないが、通常、温度２０〜４０℃および湿度５０〜１００％であればよい。

（２−２）実施形態２
本発明の生体活性セメントペーストの製造方法は、セメント粉としてのリン酸水素カルシウム二水和物およびリン酸四カルシウムを含む粉体に、セメント粉が硬化するために必要な量の硬化剤としてのアルギン酸またはその塩および水を含む透明な中性水溶液を添加・混和して生体活性セメントペーストを得ることを特徴とする。
実施形態２では、硬化剤成分のアルギン酸およびその塩は、実施形態１の硬化剤成分のキトサンのようにポリオールのような可溶化剤を必要とせず、中性水溶液により多くの硬化剤を添加することができる。
また、実施形態２の硬化剤としてアルギン酸およびその塩を用いた場合は、実施形態１の硬化剤としてキトサンを用いた場合と同様に、「酸性硬化液での骨溶解現象を解消」および「硬化体周辺での線維性組織生成を解消」効果が得られ、かつ実施形態１と比較して、骨形成に優れている。

［セメント粉］
実施形態１に準ずる。
［リン酸水素カルシウム二水和物（ＤＣＰＤ）］
実施形態１に準ずる。
［リン酸四カルシウム（ＴＴＣＰ）］
実施形態１に準ずる。
［ＤＣＰＤとＴＴＰＣとの割合］
実施形態１に準ずる。

［中性水溶液］
中性水溶液は、硬化剤としてのアルギン酸および水を含む。
本発明の「透明な中性水溶液」の「透明な」とは、含有するアルギン酸の溶け残りがないことを示す指標であり、実施例において記載するように、可視光透過率スペクトル測定において、実施形態１と同様に、４０％以上の透過率を有することを意味する。
しかしながら、実施形態２では、透過率が数％以上４０％未満でも、室温で一定期間保持してもゲル化などの変化は見られず、安定であり、中性水溶液として用いることもできる。
また、「中性」とは、ｐＨが６〜７．５であることを意味する。
ｐＨが６未満では、生体内の硬化体周辺で骨溶解現象が起こることがある。一方、ｐＨが７．５を超えると、不均一な硬化による強度低下や硬化液化液の調合中に泡を生じることがある。

［アルギン酸］
アルギン酸は、ペーストの硬化速度およびその硬化体の圧縮強度を向上させる機能、さらにはペーストのゲル化剤としての機能、ならびに硬化体を生体内に注入もしくは埋入した後に、ペーストが硬化した硬化体から溶出して硬化体を多孔化させる機能を有する。
アルギン酸は、褐藻や紅藻のサンゴモなどに含まれる植物由来の多糖類であり、白または淡黄色で、繊維状、顆粒状または粉末状の形態を示す。
アルギン酸塩としては、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸アンモニウム、アルギン酸カリウム、アルギン酸カルシウムなどが挙げられ、これらは可溶性塩である。

アルギン酸は、下式のような化学構造（左：β-Ｄ-マンヌロン酸、右：α-Ｌ-グルロン酸）を有する。

アルギン酸の粘度は、一般にその重合度（分子量）に比例し、重合度が増す程より顕著になることが知られている。
本発明において用いられるアルギン酸は、アルギン酸ナトリウムの場合、低分子量（粘度２０〜５０ｍＰａ・ｓ）、中分子量（粘度８０〜１２０ｍＰａ・ｓ）のものが挙げられ、硬化液への添加割合を多くできかつ硬化液を低粘度にできることから、低分子量のものが好ましい。

［その他の成分］
実施形態１に準ずる。

［中性水溶液の組成］
本発明の中性水溶液中のアルギン酸の濃度は、０．２重量％以上２０重量％以下であるのが好ましい。

アルギン酸の濃度が０．２重量％未満では、硬化後多孔化の効果が乏しく、破壊エネルギーが上がらないことがある。一方、アルギン酸の濃度が２０重量％を超えると、硬化液の粘性が上がり、注入（インジェクタビリティ）が困難になることがある。完全に溶解しないことがある。
より好ましいアルギン酸の濃度は、２重量％以上２０重量％以下であり、さらに好ましくは８．８重量％以上１６．３重量％以下であり、さらに好ましくは１０重量％以上１５重量％以下である。

［中性水溶液の調製］
本発明の中性水溶液は、例えば、水にアルギン酸を添加・混合することにより得ることができる。
［粉体粉Ｐと中性水溶液Ｌとの比率］
実施形態１に準ずる。
［ペーストの調製］
実施形態１に準ずる。

（３）生体活性セメントペースト
本発明のペーストは、上記の粉体と中性水溶液との混和物である。
［用途］
上記の混和により得られた本発明のペーストは、賦形性があり、複雑形状に変化させて成形することができ、上述のとおり、骨補填材として生体に用いることができる。そして、本発明のペーストは、生体内で上記の初期硬化からさらに水和反応により硬化体（生体活性セメント）になる。
混和直後からシリンダに充填して押し出すまでのペーストの押出力が小さく、流動性が高いと、生体への注入が容易になるが、ペーストの粉液比（ＰＬ比）が低くなり、硬化体の強度が低下することになるので、ペーストは、その粉液比で規定するのが好ましい。一方、ペーストの押出力が２０００ｇ（１．２ＭＰａ）を超えると、両手を用いないとシリンダから押し出すことが困難になる。
好ましいペーストの押出力は、２００ｇ以下である。
水和反応により得られた硬化体は、少なくとも１０ＭＰａの圧縮強度を示す。

さらに、硬化体は、生体内ではそこに含まれるキトサンが溶出することにより、多孔化する。このような硬化体の多孔化は、表面積を増大させ、生体内での骨置換を起こり易くさせることから、本発明のペーストは、骨補填材として好適に用いることができる。
なお、硬化体を生理食塩水に浸漬することにより硬化体の多孔化を生じさせることができる。したがって、硬化体を生理食塩水中に浸漬した後、重量測定や走査型電子顕微鏡などによる観察により、多孔化の有無およびその状態（崩壊率）を確認することができる。

本発明を以下の実施例および比較例により具体的に説明するが、本発明は実施例により限定されるものではない。
なお、実施例および比較例において「水」は、特に断りのない限り、超純水製造装置（メルク株式会社製、超純水システム Ｓｍａｒｔシリーズ、機種：Ｄｉｒｅｃｔ−Ｑ ＵＶ ３）を用いて精製したＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水「超純水」を意味する。

［実施形態１］
以下に記載の略号等は、本実施形態１内のみで有効とする。
［セメント粉の調製］
（１）リン酸四カルシウム（ＴＴＣＰ）の調製
電子天秤（アズワン株式会社製、型式：ｓｅｆｉ ＩＢＡ−２００：以下、原料（試薬の秤量に使用）を用いて、Ｃａ／Ｐ比が２になるように、水酸化カルシウム（Ｃａ(ＯＨ)₂、ＭＷ７４．０９２７、ナカライテスク株式会社製、等級：特級）および正リン酸（Ｈ₃ＰＯ₄、ＭＷ９８．００、和光純薬工業株式会社（現：富士フィルム和光純薬株式会社）製、等級：特級、含有率８５％）をそれぞれ３１．３２ｇ（０．４ｍｏｌ）および２３．０６ｇ（０．２ｍｏｌ）秤量し、それらのそれぞれを、メスシリンダーで秤量した４００ｍＬの水が入った容量５００ｍＬビーカーおよび５０ｍＬの水が入った容量１００ｍＬビーカーに加え、撹拌子を用いて回転数２００ｒｐｍおよび温度２５℃に設定したホットスターラー（アズワン株式会社製、型式：ＲＳＨ−１ＤＮ）で撹拌し、Ｃａ(ＯＨ)₂溶液およびＨ₃ＰＯ₄溶液を得た。
次いで、得られたＣａ(ＯＨ)₂溶液のビーカーにウォータージャケットを装着し、ウォータージャケットに低温恒温水槽（アズワン株式会社製、型式：ＬＴＢ−１２５Ａ）から温度５℃の水を循環させて、溶液温度を温度１０℃以下に保持し、かつトルネード（アズワン株式会社製、型式：ＰＭ−２０３）を用いて、軽く渦が生じる程度に撹拌力を適宜調節して溶液を撹拌しつつ、ガラスコック付きビュレット（アズワン株式会社製）を用いて、Ｃａ(ＯＨ)₂溶液にＨ₃ＰＯ₄溶液を一定量ずつ２時間かけて滴下した。
滴下終了後、混合液を室温で２４時間保持し、熟成させた。

その後、遠心分離機（株式会社トミー精工製、型式：Ｓｕｐｒｅｍａ２１）を用いて、得られた混合液を回転数５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、デカンテーションで上澄み液を取り除き、さらに回転数５０００ｒｐｍで７分間遠心分離した。分離した沈殿物をシャーレに入れ、プログラム定温乾燥機（アズワン株式会社、型式：ＤＯＶ−４５０Ｐ）内に設置し、温度１１０℃で２４時間乾燥させた。
乾燥させた試料をアルミナ製ボート（株式会社ニッカトー製、型式：ＳＳＡ−Ｈ２Ｂ）に入れ、電気炉（丸祥電器株式会社製、高性能小型高温電気炉ＳＵＰＥＲ ＭＩＮＩ、型式：ＳＰＭ）を用いて、大気中、温度１５００℃、昇降温速度１０℃／ｍｉｎの条件で５時間焼成した。
焼成後、試料を電気炉から取り出し、超硬質鋼乳鉢（株式会社伊藤製作所、型式：ＷＤ）で粉砕し、さらにメノウ乳鉢で乾式粉砕した。さらに、ミニふるい振とう機（アズワン株式会社製、型式：ＭＶＡ−１）およびステンレス製ふるい（サイズφ７５μｍ)を用いて、回転数２５００ｒｐｍで７５μｍ以下に分級し、生成ＴＴＣＰを得た。

（２）リン酸水素カルシウム二水和物（ＤＣＰＤ）の調製
電子天秤を用いて秤量したリン酸水素カルシウム二水和物（ＣａＨＰＯ₄・２Ｈ₂Ｏ、ＭＷ１７２．０９、和光純薬工業株式会社（現：富士フィルム和光純薬株式会社）製、等級：特級）１５．００ｇ（０．０８７ｍｏｌ）およびメスシリンダーで計量したエタノール（Ｃ₂Ｈ₅ＯＨ、キシダ化学株式会社製、等級：特級）１８０ｍＬを、パーソナル電子天秤（アズワン株式会社、型式：ＥＫ６００ｉ）で秤取った直径１０ｍｍのジルコニアボール（株式会社ニッカトー製）５００ｇと共に、ポットミル（株式会社ニッカトー製、型式：ＨＤ−Ａ３、外径：φ９０ｍｍ、容量：４００ｍＬ）に加えた。次いで、卓上型ポットミル回転台（アズワン株式会社製、型式：ＡＮＺ−５１Ｓ）を用いて、ポットミルを室温、回転数１１０ｒｐｍの条件で４８時間回転させ、その内容物を湿式粉砕した。
得られた湿式粉砕生成物を、ブフナー漏斗、ろ紙（ＪＩＳ、種類：５Ｃ）およびアスピレータ（東京理化器械株式会社（ＥＹＥＬＡ）製、型式：Ａ−３Ｓ）を用いて吸引ろ過し、固形物をシャーレに入れ、温度５０℃に設定したプログラム定温乾燥器（アズワン株式会社製、型式：ＤＯＶ−４５０Ａ）で２４時間乾燥させた。得られた試料をメノウ乳鉢で乾式粉砕し、ＤＣＰＤを得た。

（３）リン酸水素カルシウム（ＤＣＰＡ）の調製
電子天秤を用いて秤量したリン酸水素カルシウム（ＣａＨＰＯ₄、ＭＷ１３６．０６、太平化学工業株式会社製）５．００ｇ（０．１１ｍｏｌ）を用いて、（２）と同様にして４８時間湿式粉砕して、ＤＣＰＡを得た。

（４）セメント粉の混合
電子天秤を用いて、（１）で得られた生成ＴＴＣＰ（ＣａＨＰＯ₄、ＭＷ３６６．２６）６．８０ｇ（０．０１９ｍｏｌ）および（２）で得られたＤＣＰＤ３．２０ｇ（０．０１９ｍｏｌ）をそれぞれ秤量した。それらを容量５０ｍＬのマルエム目盛付試験管ねじ口（アズワン株式会社製、型式：ＮＸ−５０）に入れ、振とう機（アズワン株式会社製、型式：ＭＡＬＴＩ ＳＨＡＫＥＲ ＭＳ−３００）に設置し、回転数１３００ｒｐｍで１００分間振とう混合を行った。得られた混合物をメノウ乳鉢で５分間乾式混合し、セメント粉１を得た。
生成ＴＴＣＰ７．３３ｇ（０．０２０ｍｏｌ）および（３）で得られたＤＣＰＡ２．７２ｇ（０．０２０ｍｏｌ）、市販されているＴＴＣＰ（太平化学工業株式会社製、市販ＴＴＣＰ）６．８０ｇ（０．０１９ｍｏｌ）およびＤＣＰＤ３．２０ｇ（０．０１９ｍｏｌ）、ならびに市販ＴＴＣＰ（太平化学工業株式会社製）７．３３ｇ（０．０２０ｍｏｌ）およびＤＣＰＡ２．７２ｇｇ（０．０２０ｍｏｌ）をそれぞれ用いること以外は上記と同様にして、セメント粉２、３および４を得た（表１−１）。

［硬化液の調製］
（１）キトサン含有酸性硬化液の調製
メスシリンダーで計量した１０ｍＬの水を容量５０ｍＬビーカーに加え、そこに電子天秤（前記と同様）で秤量したキトサン（(Ｃ₆Ｈ₁₁ＮＯ₄)_n、アルドリッチ社製、中分子量（medium molecular weight）５０，０００〜１９０，０００、脱アセチル化度：約８１．３％）１．２５ｇ加えた。次いで、リンゴ酸（Ｃ₄Ｈ₆Ｏ₅（ＨＯＯＣ-ＣＨ(ＯＨ)-ＣＨ₂-ＣＯＯＨ）、和光純薬工業株式会社（現：富士フィルム和光純薬株式会社）製、等級：特級）１．２５ｇを加え、撹拌し溶解させて、キトサン含有酸性硬化液（「Liquid１」ともいう）を得た。

（２）キトサン含有中性硬化液の調製
メスシリンダーで計量した５ｍＬの水を容量５０ｍＬビーカーに加え、そこに電子天秤で秤量したキトサン（前記と同様）０．１３ｇを加え、ホットスターラー（アズワン株式会社製、型式：ＲＳＨＪ−１ＤＮ）および撹拌子を用いて、回転数５００ｒｐｍで撹拌することで懸濁液を得た。そこに、クエン酸（Ｃ₆Ｈ₈Ｏ₇（Ｃ(ＯＨ)(ＣＨ₂ＣＯＯＨ)₂ＣＯＯＨ）、和光純薬工業株式会社（現：富士フィルム和光純薬株式会社）製、等級：特級）０．１７ｇを加え、均一に溶解するまで撹拌した。また、メスシリンダーで計量した５ｍＬの水を容量５０ｍＬビーカーに加え、そこに電子天秤で秤量したデキストラン硫酸ナトリウム（(Ｃ₆Ｈ₇Ｎａ₃Ｏ₁₄Ｓ₃)_n、和光純薬工業株式会社（現：富士フィルム和光純薬株式会社）製、等級：特級）０．２１ｇを加え、撹拌した。前者に後者を加え、撹拌・混合し、さらに塩化ナトリウム（ＮａＣｌ、キシダ化学株式会社製、等級：特級）１．０ｇを加え、塩析により凝固物を生成させた。

さらに３時間撹拌し、生成した凝固物を遠心分離し、上澄みを除去した。得られた凝固物に水１０ｍＬを加えて洗浄し、これを計３回繰り返した。洗浄した凝固物に水１０ｍＬを加えて懸濁させ、低温恒温水槽を用いて温度−３０℃に冷却し、凍結乾燥機（アズワン株式会社製、型式：ＦＤＵ−１２ＡＳ）で乾燥させた。乾燥後、メノウ乳鉢で粉砕してキトサン含有粉末を得た。
メスシリンダーで計量した１０ｍＬの水を容量５０ｍＬビーカーに加え、そこに電子天秤で秤量したキトサン含有粉末０．１６ｇ、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ₃、キシダ化学株式会社製、等級：特級）０．４０ｇおよびリン酸水素二カリウム（Ｋ₂ＨＰＯ₄、キシダ化学株式会社製、等級：特級）０．５０ｇを加え、撹拌して、キトサン含有中性硬化液（「Liquid２」ともいう）を得た。

（３）ポリオール−キトサン含有硬化液の調製
メスシリンダーで計量した塩酸（ＨＣｌ、ＭＷ３６．４６、３５％含有、ｄ＝１．１８ｇ／ｃｍ³、キシダ化学株式会社製、等級：特級）８．８ｍＬ（０．１０ｍｏｌ）を、容量１０００ｍＬのメスフラスコに入れ、水を加えて１０００ｍＬとして０．１Ｍ−ＨＣｌ溶液を得た。
メスシリンダーで計量した０．１Ｍ−ＨＣｌ溶液９ｍＬを容量５０ｍＬビーカーに加え、そこに電子天秤で秤量したキトサン（前記と同様）０．２０ｇを加えて溶解させ、さらに撹拌することでキトサン溶液を得た。次いで、メスシリンダーで計量した１ｍＬの水を容量５０ｍＬビーカーに加え、そこにβ−グリセロリン酸二ナトリウム四水和物（Ｃ₃Ｈ₇Ｎａ₂Ｏ₆Ｐ・４Ｈ₂Ｏ、ＭＷ２１６．０４、東京化成工業株式会社製）０．５６ｇ（０．０２５９ｍｏｌ）を加え、攪拌し溶解させてβ−グリセロリン酸二ナトリウム溶液を得た。キトサン溶液の撹拌下に、メスピペットを用いてβ−グリセロリン酸二ナトリウム溶液を滴下し、撹拌・混合して、ポリオール−キトサン含有硬化液（「Liquid３」ともいう）を得た。

［硬化液の評価］
（１）透過率測定
紫外可視分光光度計（日本分光株式会社製、型式：Ｖ−５００）を用い、下記の測定条件で、調製した硬化液（Liquid１〜３）のスペクトルおよび固定波長を測定し、各硬化液の透過率を調べた。
（測定条件）
・使用セル：角型石英セル（１０ｍｍ、日本分光株式会社製）
・バンド幅：１．０ｎｍ
・走査速度：２００ｎｍ／ｍｉｎ
・測定波長：３８０〜７８０ｎｍ
・固定波長：５５０ｎｍ

（２）ｐＨ測定
作製した硬化液のｐＨ測定を行った。
ｐＨメーター（株式会社掘場製作所製、型式：Ｄ−５１）を用いて、調製した硬化液（Liquid１〜３）のｐＨを測定した。測定にあたり、ｐＨ標準液（ｐＨ４．０１、６．８６および９．１８、和光純薬工業株式会社（現：富士フィルム和光純薬株式会社）製）を用いて、３点校正を行った。

［ＣＰＣ硬化試験］
（１）ＣＰＣペーストの調製
以下、ＪＩＳ Ｔ０３３０−４に準拠して行った。
設定した粉液比（粉体Ｐと中性水溶液Ｌとの配合割合Ｐ／Ｌ）になるように、電子天秤を用いて、調製したセメント粉１〜４を秤量した。硬化液は練和に用いるシャーレに入れた状態で、電子天秤を用いて秤量した。
図１−１に示すように、（ａ）シャーレにセメント粉を入れ、ＯＨＰシートを適宜切断して作成したヘラ（図面左下）を用いて塊を潰すように伸ばした。次いで、ヘラとステンレス製の（ｂ）薬さじを用いて、セメント粉と硬化液とを混ぜ合わせた。具体的には、大気中（温度２５℃）で、セメント粉を３等分し、まず始めに１／３量のセメント粉と硬化液とを２０秒間練和し、次いで１／３量のセメント粉を加えて３０秒間練和し、最後に１／３量のセメント粉を加えて４０秒間練和し、合計９０秒間練和することにより、ＣＰＣペーストを得た。

（２）ＣＰＣの作製
（１）で得られたＣＰＣペーストを直ちに、図１−２に示す（ａ）テフロン割型（穴の内径φ６ｍｍ×長さ１２ｍｍ）に、ステンレス製薬さじ（図示せず）およびガラス棒（外径φ５．６ｍｍ、図示せず）を用いて充填した。具体的には、（ａ）テフロン製割型を１枚の（ｂ）プラスチック板（厚さ２ｍｍ）の上に載置し、薬さじを用いて（ａ）テフロン製割型の穴にＣＰＣペースト詰め、気泡が入らないように適宜ガラス棒で上から抑えた。詰めた後、テフロン製割型の上面をもう１枚の（ｂ）プラスチック板（厚さ２ｍｍ）で押さえ、さらに（ｃ）クリップを用いて上下の（ｂ）プラスチック板を留めた。
図１−３は、ＣＰＣの作製に用いた器具、（ａ）テフロン割型、（ｂ）テフロン型固定板（３０ｍｍ×１２ｍｍ×２．３ｍｍ、中央の穴の内径φ５ｍｍ）、（ｃ）平頭ネジ（Ｍ５×３３ｍｍ）、（ｄ）ナットおよび（ｅ）組立図を示す

次いで、容量約１００ｍＬの密閉容器（保存容器）の底に水を浸み込ませたスポンジを敷き、練和物を詰め、上下を（ｂ）プラスチック板と（ｃ）クリップで挟んだ（ａ）テフロン製割型をその上に載置した。この状態で湿度１００％とし、保存容器ごと、クールインキュベーター（アズワン株式会社製、型式：ＣＮ−４０Ａ）に設置し、温度３７℃で１時間保持して初期硬化をさせた。
その後、図１−４に示すように、メスシリンダーで秤量し（１００ｍＬ）、予め温度３７℃に保温した水中に（ａ）テフロン製割型のまま練和物を浸漬させた。さらに、クールインキュベーター中、温度３７℃で保温し浸漬させ、その後脱型してＣＰＣ硬化体の試料を得た。
セメント粉と硬化液との組み合わせを表１−２に示す。なお。セメント粉１とLiquid１〜３それぞれを練和して得られた硬化体をＣＰＣ１〜３ともいう。

（３）初期硬化時間測定
ＪＩＳ Ｔ０３３０−４に準拠して、ビガー針試験機（株式会社日本メック、型式：試験機Ａ−００４）を用いて、ＣＰＣペーストの初期硬化時間を測定した。
具体的には、図１−５に示すように、ＣＰＣペーストを練和開始から９０秒後に、テフロン型シリンジ（φ１０ｍｍ×５ｍｍ）に入れ、ＣＰＣの表面にビガー針（重量（荷重）３００ｇ、先端断面積２ｍｍ²）を試料表面真上から静かに落とし、表面に圧痕が残らなくなった時間を記録した。１条件につき３回測定し、その平均値を初期硬化時間（分）とした。
測定期間中、測定時以外のビガー針を、（２）の条件、底に水を浸み込ませたスポンジを敷いた保存容器に中に入れ、クールインキュベーター中、温度３７℃で保存した。

（４）圧縮強度試験
ＪＩＳ Ｔ０３３０−４に準拠して、ＣＰＣ硬化体の圧縮強度を測定した。
（２）の手順により、各浸漬条件ごとにＣＰＣ硬化体の圧縮試験片を各５個作製した。作製にあたり、突出部分に応力が集中して本来より低い測定値が得られないように、ＣＰＣ硬化体の上面と下面が平行になるよう留意した。浸漬後、ＣＰＣ硬化体の表面の水を拭い、試験に供した。
圧縮強度測定には、図１−６に示すような、引張方向を圧縮方向に転換する引張−圧縮変換器を用いた５ｋＮロードセル（株式会社島津製作所製、型式：８７３９４）を備えた万能試験機（株式会社島津製作所製、型式：ＡＵＴＧＲＡＰＨ ＡＧ−１０）を用いた。引張−圧縮変換器と試料の間に水で濡らした濾紙を挟み、荷重が１Ｎかかった時点で変位を０ｍｍとし、ゼロ点を合わせた。試験途中に微小破壊による圧縮強度の急激な減少があっても試験を中断せず、変位が２ｍｍになるまで連続して行った。測定条件は、ヘッドスピード０．５００ｍｍ／ｓｅｃ、サンプリング間隔１００ｍｓｅｃで、制御・解析ソフト（株式会社島津製作所、Tranpezium）を用いて計測を行った。

（５）静的崩壊率測定
ＪＩＳ Ｔ０３３０−４に準拠して、ＣＰＣの静的崩壊率を測定した。
図１−７に示すように、φ９ｍｍの先端を５ｍｍ切り落とし、（ｂ）分離膜（シート、φ１０ｍｍ）を挿入したプラスチック製の（ａ）ＣＰＣ計量用シリンジに、（１）の手順により得られたＣＰＣペースト（練和物）０．５ｍＬを、練和開始から３分以内に充填した。気泡の混入を防ぐために、押出棒を先端近くに位置させ、少しずつ押出棒を引きながらＣＰＣペーストを先端から充填した。
予め、図１−８に示すような（ａ）プラスチック容器（内径φ７０ｍｍ×深さ４０ｍｍ）に生理食塩水８０ｍＬを入れ、温度３７℃に設定したクールインキュベーター内で加温しておいた。生理食塩水は、電子天秤で秤量した塩化ナトリウム（ＮａＣｌ、和光純薬工業株式会社（現：富士フィルム和光純薬株式会社）製、等級：特級）９．００ｇを、容量１０００ｍＬのメスフラスコに入れ、水を加えて１０００ｍＬとして調製した。
練和開始から５分後に、図１−８に示すような（ｂ）ステンレス金網台（５０ｍｍ×５０ｍｍ、２ｍｍ×２ｍｍメッシュ）上に、シリンジからＣＰＣペーストを静かに押し出した。試料を載せた（ｂ）ステンレス金網台を、生理食塩水を入れ加温していた（ａ）プラスチック容器に静かに入れて生理食塩水に水没させた。これにより崩壊したＣＰＣ（残渣）は（ｂ）ステンレス金網台から落下する。その後、（ａ）プラスチック容器の蓋を閉め、温度３７℃のクールインキュベーター中で７２時間静置して硬化させた。

静置後、（ａ）プラスチック容器からＣＰＣと共に（ｂ）ステンレス金網台を取り出し、別のプラスチック容器に移した。（ａ）プラスチック容器の底の残渣が流出しないように、スポイトを使用して（ａ）プラスチック容器内の生理食塩水を破棄し、分離シートを除去した。試料と金網台、崩壊したＣＰＣの入った（ａ）プラスチック容器を温度５０℃の定温乾燥器内で２４時間乾燥させ、電子天秤を用いて下記のａ〜ｄの重量を測定し、下式により崩壊率を求めた。
崩壊率(％)＝［(ｃ−ｄ)／((ａ−ｂ)＋(ｃ−ｄ))］×１００
ａ：乾燥させたＣＰＣとステンレス金網台の重量（ｇ）
ｂ：ＣＰＣを除去し、洗浄・乾燥させたステンレス金網台の重量（ｇ）
ｃ：乾燥させた残渣とプラスチック容器の重量（ｇ）
ｄ：残渣を除去し、洗浄・乾燥させたプラスチック容器の重量（ｇ）

（６）インビボ試験
図１−９に示すように、ニュージーランド産家兎（雄、体重：３．０〜３．５ｋｇ）の前足部の皮膚を切開し、大腿骨関節丘に直径４．２ｍｍ、深さ５．０ｍｍの孔を作製した。その孔に（１）の手順により得られたＣＰＣペースト（練和物）を充填して縫合した。ＣＰＣペースト試料の埋入から３週間後に家兎を麻酔死処分し、充填した骨を取り出したものを試料とした。
得られた試料を、マイクロＸ線ＣＴ（株式会社島津製作所製、型式：ｉｎｓｐｅＸｉｏ ＳＭＸ−９０ＣＴ Ｐｌｕｓ）を用いて、下記の条件で撮影し、観察した。
（撮影条件）
・管電圧：９０ｋＶ
・管電流：１１０μＡ
・ビュー数：６００
・アベレージ数：２
得られた画像を、三次元画像解析ソフトウェア（日本ビジュアルサイエンス株式会社、製品名：ＥｘＦａｃｔ ＶＲ）を用いて解析した。
ＣＰＣペーストの調製には、セメント粉にセメント粉１を、硬化液に水、Liquid１(キトサン含有酸性硬化液)、Liquid２（キトサン含有中性硬化液）を用い、粉液比を３とした。

［試料の分析］
（１）粉末Ｘ線回折による試料の同定
Ｘ線回折装置（株式会社リガク製、型式：ｒｉｎｔ２２００）、解析ソフト（株式会社リガク製、製品名：JADE6）およびＸ線発生の封入管（ターゲットＣｏ、２ｋＷ、波長：１．７９０Å）を用い、下記の測定条件で、生成ＴＴＣＰ、湿式粉砕前後のＤＣＰＤおよびＤＣＰＡの粉末Ｘ線回折を行い、試料の結晶相のピークを調べた。
（測定条件）
・測定角度：１０〜５０°
・サンプリング角度：０．０２°
・スキャン速度：１．０°（ｍｉｎ^-1）
・管電圧：４０ｋＶ
・管電流：２０ｍＡ
・スリット：ＤＳ＝１°、ｓｓ＝１°、ＲＳ＝０．３ｍｍ

（２）粒度分布測定
レーザー回折／錯乱式測定装置（株式会社掘場製作所製、型式：ＬＡ９２０）を用いて、合成し７５μｍ以下に分級した生成ＴＴＣＰ、湿式粉砕後のＤＣＰＤおよびＤＣＰＡならびに市販ＴＴＣＰの粒度分布を測定した。
分散媒には超純水を用い、分散剤には界面活性剤が含まれている台所用合成洗剤（Ｐ＆Ｇ社製)を１滴用いた。また、測定直前に分散液を１０分間の超音波処理に付し、試料を分散させた状態にした。水に対するリン酸カルシウムの屈折率を１．２４とした。

（３）比表面積測定
図１−１０に示すように、細孔分布測定装置（ユアサアイオニクス株式会社（現：スペクトリス株式会社）製、型式：ＡＵＴＯＳＯＲＢ−１）を用いて、合成し７５μｍ以下に分級した生成ＴＴＣＰ、湿式粉砕後のＤＣＰＤおよびＤＣＰＡならびに市販ＴＴＣＰの比表面積を測定した。
吸着ガスに窒素ガスを用い、測定により得られた吸脱着等温線から比表面積を算出した。
測定前に重量を測定した空のセルに、秤量した約３００ｍｇの試料を入れ、セルを測定装置にセットし、セルの周囲をマントルヒータで覆った。次いで、真空脱気し、温度約３００℃で１時間保持することで試料表面の付着分子等を除去した。その前処理終了後、試料の入ったセルを室温まで冷却し重量を測定した。この重量から最初に測定した空のセルの重量を差し引き、試料の重量とした。
その後、再度試料の入ったセルを測定装置にセットし、セルの周囲を液体窒素で覆うことで測定中セル内の温度を一定（液体窒素温度−１９６℃）に保持した。そして、セル内を真空状態から徐々に窒素ガスを吹き込み測定した。吸着平衡圧ｐと飽和平衡圧ｐ₀との相対圧ｐ／ｐ₀が１になるまで吸着量を測定した。次いで、相対圧が１に達した後、相対圧が０になるまで圧力を下げ、試料に吸着した窒素ガス分子を脱着させた。なお、測定点数を７９点とした。

（４）粉末Ｘ線回折によるＣＰＣ硬化体の結晶相の考察
（１）粉末Ｘ線回折による試料の同定と同様にして、作製したＣＰＣ硬化体を乾燥させ、メノウ乳鉢で粉砕した測定試料の粉末Ｘ線回折を行い、試料の結晶相のピークを調べた。

（５）ＦＥ−ＳＥＭによる試料の観察
電界放射型走査型顕微鏡（日本電子株式会社製、型式：ＦＥ−ＳＥＭ ＪＳＭ−６５００Ｆ）を用いて、合成し７５μｍ以下に分級した生成ＴＴＣＰ、湿式粉砕後のＤＣＰＤおよびＤＣＰＡならびに市販ＴＴＣＰを観察した。
導電性テープを用いて各粉末試料をアルミウム板に固定し、エアダスターを用いて固定されなかった粉末を除去した。次いで、オスミウムプラズマコーター（日本電子株式会社製、型式：ＯＰＣ６０Ａ Ｆｉｌｇｅｎ）を用いて、ＯｓＯ₄を１２ｎｍコーティングしてＳＥＭ試料とした。観察時の加速電圧を１５ｋＶ、真空度を５．００×１０^-4Ｐａ以下とした。

［セメント粉の分析］
（１）粉末Ｘ線回折による試料の同定
図２−１は、（ａ）生成ＴＴＣＰおよび（ｂ）市販ＴＴＣＰの回折図形ならびに（ｃ）ＴＴＣＰの回折線図（ＩＣＤＤ ＰＤＦ Ｎｏ．２５−１１３７）である。
図２−１によれば、（ａ）生成ＴＴＣＰの回折図形と（ｃ）ＴＴＣＰの回折線図とのピーク位置および強度はほぼ一致し、これら以外に特にピークが観察されず、したがって生成ＴＴＣＰはＴＴＣＰの単一相であると考えられる。また、（ａ）生成ＴＴＣＰの回折図形と（ｂ）と市販ＴＴＣＰの回折図形とを比較しても明白な差異は観察されない。

図２−２は、（ａ）湿式粉砕前のＤＣＰＤおよび（ｂ）湿式粉砕後のＤＣＰＤの回折図形ならびに（ｃ）ＤＣＰＤの回折線図（ＩＣＤＤ ＰＤＦ Ｎｏ．１１−０２９３）である。
図２−２によれば、（ｂ）湿式粉砕後のＤＣＰＤの各ピークの強度が低下し、半値幅が大きくなっている。前者はアモルファス化、後者は結晶子径の低下によるものと考えられる。また、（０２０）および（０４０）面の強度が大きく低下している。これは、ＤＣＰＤでは｛０１０｝面が最も成長して板状晶を示すが、その成長面が粉砕されて均質化したためと考えられる。

図２−３は、（ａ）湿式粉砕前のＤＣＰＡおよび（ｂ）湿式粉砕後のＤＣＰＡの回折図形ならびに（ｃ）ＤＣＰＡの回折線図（ＩＣＤＤ ＰＤＦ Ｎｏ．０９−００８０）である。
図２−３によれば、（ｂ）湿式粉砕後のＤＣＰＡの各ピークの強度が低下し、半値幅が大きくなっている。しかし、回折ピーク強度の相対的関係においては、ＤＣＰＤのような変化は観察されない。

（２）粒度分布
図２−４は、（ａ）生成ＴＴＣＰ、（ｂ）市販ＴＴＣＰ、（ｃ）湿式粉砕後のＤＣＰＤおよび（ｄ）湿式粉砕後のＤＣＰＡの粒度分布を示す図であり、表２−１は、（ａ）〜（ｄ）の算術平均径およびメジアン径を示す。
図２−４によれば、（ａ）生成ＴＴＣＰは、粒径が１μｍ未満から７０μｍ程度の範囲にある左右非対称の粒度分布を有している。これは、粉砕により微細化した部分と微細化されていない部分を含むことによるものと考えられる。
一方、（ｂ）市販ＴＴＣＰは、粒径６．７２μｍをピークとするシャープな粒度分布を有している。（ｃ）湿式粉砕後のＤＣＰＤは、粒径２．９８μｍをピークとする粒度分布を有し、略１μｍ以下の粒径に分布を有するが、１μｍ以上の粒子が多少存在している。（ｄ）湿式粉砕後のＤＣＰＡは、粒径０．７７μｍをピークとする粒度分布を有し、（ｃ）湿式粉砕後のＤＣＰＤほどシャープではないが、略１μｍ以下の粒径に分布している。

（３）ＳＥＭ像
図２−５は、（ａ）生成ＴＴＣＰ、（ｂ）市販ＴＴＣＰ、（ｃ）湿式粉砕前のＤＣＰＤ、（ｄ）湿式粉砕後のＤＣＰＤ、（ｅ）湿式粉砕前のＤＣＰＡおよび（ｆ）湿式粉砕後のＤＣＰＡのＳＥＭ像を示す図である。各図の右下のスケールバーは、（ａ）〜（ｅ）では１０μｍを、（ｆ）では１μｍを示す。
図２−５によれば、（ａ）生成ＴＴＣＰは、１〜１０数μｍ程度の凝集粒子であり、（ｂ）市販ＴＴＣＰは、均一で微細な粒子であることがわかる。また、（ｃ）湿式粉砕前のＤＣＰＤは、比較的大きな板状晶であるが、（ｄ）湿式粉砕後のＤＣＰＤは、微細化されていることがわかる。同様に、（ｅ）湿式粉砕前のＤＣＰＡは、板状でお互いに絡み合ったような形態であるが、（ｄ）湿式粉砕後のＤＣＰＤは、粒径が１μｍ以下に微細化されていることがわかる。

（４）表面積測定
図２−６〜図２−９は、それぞれ生成ＴＴＣＰ、市販ＴＴＣＰ、湿式粉砕前のＤＣＰＤおよび湿式粉砕後のＤＣＰＤのガス吸着量測定による（ａ）吸脱着等温線および（ｂ）ＢＥＴプロットを示す図である。
また、ＢＥＴプロットから得られたＢＥＴ式の傾き(Ｃ−１)／Ｃν_mと切片１／Ｃν_m、それらから算出される定数Ｃと単分子層吸着量ν_m、さらに下式から算出される比表面積Ａ_sを表２−２に示す。
Ａ_s＝ν_m×(ｎ／ｍ)×ａ_m［ｍ²/ｇ］
Ｎ：アボガドロ定数（＝６．０２２×１０²³）
Ｍ：窒素のモル質量（＝２８．０１３４［ｇ／ｍｏｌ］）
ａ_m：窒素１分子の吸着占有面積（＝０．１６２［ｎｍ²］

表２−１のように、生成ＴＴＣＰの算術平均径は２１．４１μｍであり、市販ＴＴＣＰの６．１４μｍに比べて３倍以上大きいが、その比表面積は０．８９ｍ²／ｇであり、市販ＴＴＣＰの０．８７ｍ²／ｇと差異がない。
また、湿式粉砕前後のＤＣＰＤの表面積は、それぞれ１６．８ｍ²／ｇおよび２７．８ｍ²／ｇであり、比較的大きい。また、これらの吸脱着等温線では、相対圧が０．４を超えたあたりからヒステリシスが起きている。このようなヒステリシスは、通常メソ細孔を有する場合にみられるが、測定したＤＣＰＤでは、粒子間の隙間がくさび形の細孔であり、その細孔がヒステリシスとして現れたものと考えられる。

［硬化液の分析］
（１）硬化液の特性
キトサン含有酸性硬化液（Liquid１）、キトサン含有中性硬化液（Liquid２）およびポリオール−キトサン含有硬化液（Liquid３）の組成を表２−３に示す。
表中、Liquid４は、Liquid３の調製に用いたキトサン溶液であり、ポリオールの配合による影響を調べるための比較とした。
また、図２−１０は、（Ｌ１）キトサン含有酸性硬化液（Liquid１）、（Ｌ２）キトサン含有中性硬化液（Liquid２）、（Ｌ３）ポリオール−キトサン含有硬化液（Liquid３）および（Ｌ４）キトサン溶液（Liquid４）の状態を示す図である。
図２−１０に示される各液体の観察によれば、Liquid１はゲル状で流動性に乏しく、Liquid２〜４はゾル状で流動性はあるものの、やや粘性を有していた。

（２）硬化液の透光性
図２−１１は、（Ｌ２）キトサン含有中性硬化液（Liquid２）、（Ｌ３）ポリオール−キトサン含有硬化液（Liquid３）および（Ｌ４）キトサン溶液（Liquid４）の可視光透過スペクトルを示す図である。
また、表２−４に、キトサン含有酸性硬化液（Liquid１）、キトサン含有中性硬化液（Liquid２）、ポリオール−キトサン含有硬化液（Liquid３）およびキトサン溶液（Liquid４）のｐＨ、透過率およびキトサン含有量を示す。

キトサン含有酸性硬化液（Liquid１）は、キトサン含有量が多い一方で、強い酸性を示し、ゲル状で粘度が高いために、透過率測定用セルに空気を混入させずに充填することが困難で、透過率測定ができなかった。また、目視でキトサンの溶け残りが観察され、すべての溶液の中で一番透明度が低かった。
キトサン含有中性硬化液（Liquid２）は、体液に近い弱塩基性を示す一方で、キトサン含有量が最も少なかった。また、目視観察ではキトサンの溶け残りが確認できないが、透過率は１３．４８％であった。
本発明のポリオール−キトサン含有硬化液（Liquid３）は、略中性を示し、そのキトサン含有量がLiquid２の４．６倍であった。また、Liquid３の調製に用いたキトサン溶液（Liquid４）がｐＨ２．０５の強酸であるのに対して、ｐＨ６．７１の中性であり、Liquid４の透過率が２４．９％であるのに対して、４３．７％で透過率が高く、キトサンの溶け残りが殆ど観察されなかった。
Liquid１、２および４では、長波長側で錯乱を受け難くなるためか、低波長から高波長になるにつれて透過率が上昇しているのに対して、本発明のLiquid３では、波長３８０〜７８０ｎｍの可視光領域のすべてにおいて透過率が高い。

［ポリオール−キトサン含有硬化液の調製］
中性硬化液のうち、ポリオール−キトサン含有硬化液（Liquid３）は、高い透過率を示す一方で、キトサン含有量が低く、キトサン含有量では、キトサン含有酸性硬化液（Liquid１）が最も多く、硬化体の機械的特性に優れていた。
そこで、キトサン含有量の向上を目的として、０．１Ｍ−ＨＣｌ溶液以外の酸とポリオールを用い、様々な量のキトサンを溶解させ、ＣＰＣのＰ／Ｌ＝３として、硬化液Liquid３−１〜Liquid３−４を調製した。Liquid３および各硬化液の組成およびｐＨを表２−５に示す。
また、図２−１２は、（Ｌ３）および（Ｌ３−１）〜（Ｌ３−４）ポリオール−キトサン含有硬化液（Liquid３およびLiquid３−１〜Liquid３−４）の状態を示す図である。

Liquid３−１、Liquid３−２およびLiquid３−４の結果から、１Ｍ−ＨＣｌまたは１Ｍ−酢酸を用いることで、Liquid３に比べて、キトサン含有量を増加させることが可能であることがわかる。しかし、酸性が強まり、Liquid３と同量のポリオールを添加しても強酸を示している。
キトサン含有量がキトサン含有酸性硬化液（Liquid１）と同量の２．５ｗｔ％になるようにキトサンを加えたLiquid３−３はゲル状になった。これは、硬化液の成分に対する過剰なキトサンの添加によるものと考えられる。
Liquid３−１、Liquid３−２およびLiquid３−３を比較すると、キトサン含有量の増加に伴い、ｐＨが中性にシフトしている。これは、キトサンが有するアミノ基によると考えられる。

後述するように、ポリオール−キトサン含有硬化液（Liquid３）を硬化液として用いたＣＰＣペーストの初期硬化時間は長い。
そこで、ＣＰＣペーストの初期硬化時間の短縮を目的として、酸性であるリン酸二水素カリウム（ＫＨ₂ＰＯ₄）と弱塩基性であるリン酸水素二カリウム（Ｋ₂ＨＰＯ₄）を、Liquid３に適宜添加して硬化液Liquid３−５〜Liquid３−９を調製した。
具体的には、Liquid３−５〜Liquid３−８の調製では、Liquid３を調製した後にリン酸塩を添加した。また、Liquid３−９の調製では、Liquid３の調製過程のポリオール溶液にリン酸塩を溶解させて添加した。
硬化液の他の配合成分は、キトサン０．２０ｇ、水１．０ｇ、ポリオール０．５６ｇおよび０．１Ｍ−ＨＣｌ溶液９．０ｇであり、ＣＰＣのＰ／Ｌ＝３とした。
各硬化液の組成およびｐＨを表２−６に示す。
また、図２−１３は、（Ｌ３）および（Ｌ３−５）〜（Ｌ３−９）ポリオール−キトサン含有硬化液（Liquid３およびLiquid３−５〜Liquid３−９）の状態を示す図である。

すべての硬化液でｐＨが中性から大きく外れることはなかった。
Liquid３−５は、添加したＫ₂ＨＰＯ₄がそのまま白い沈殿となり溶解しなかった。その後、ＮａＨＣＯ₃を加えたものがLiquid３−６であるが、Ｋ₂ＨＰＯ₄とＮａＨＣＯ₃の両者とも溶解しなかった。また、Liquid３−７も添加したＫＨ₂ＰＯ₄により硬化液が白濁した。その後、ＮａＨＣＯ₃を加えたものがLiquid３−８であるが、ＫＨ₂ＰＯ₄とＮａＨＣＯ₃が反応して発泡した。これは、ＫＨ₂ＰＯ₄が酸性でＮａＨＣＯ₃が弱塩基性であるために中和反応が起きたものと考えられる。
一方、Liquid３−９では、溶け残りがない透明な硬化液が得られた。溶液の表面に練和の際に混入した気泡が見られた。β−グリセロリン酸二ナトリウム溶液にＫ₂ＨＰＯ₄とＫＨ₂ＰＯ₄を加えた際にも反応は起こらず、透明なままであった。
これらの結果から、Liquid３−９がリン酸塩を加えつつも、最も中性で高い透明度を示す硬化液であることがわかった。

［硬化体の分析］
（１）インビボ試験
図２−１４は、硬化液として（ａ）水、（ｂ）キトサン含有酸性硬化液（Liquid１）および（ｃ）キトサン含有中性硬化液（Liquid２）をそれぞれ用いたＣＴＣペーストでのインビボ試験（動物埋入試験）の試料のマイクロＸ線ＣＴ画像である。Ｐ／Ｌ＝３としてＣＴＣペーストを調製した。
硬化液として（ｂ）キトサン含有酸性硬化液（Liquid１）を用いた場合にのみ、ＣＰＣと生体骨の境界部において骨溶解らしき状態が観察された。これは、Liquid１のｐＨが３．０６であることから、ＣＰＣと接触する境界部の生体骨が溶解した可能性が高いと考えられる。
硬化液として（ｃ）キトサン含有中性硬化液（Liquid２）を用いた場合には、骨溶解は観察されないが、ＣＰＣ周辺に線維状組織の析出が観察された。これは、硬化液中のキトサンの溶け残りがセメント粉の硬化に伴って硬化体周囲に吐き出されてＣＰＣの周囲を覆ったものと考えられる。
比較として硬化成分を含む硬化液の代わりに（ａ）水を用いた場合には、骨細胞が硬化体に直接接触する様子が観察された。これは、ＣＰＣの骨伝導性のためと考えられる。
これらの結果から、生体内でＣＰＣが吸収されて生体骨に置換されるためには、キトサンの溶け残りのない透明な中性硬化液が必要であると考えられる。

（２）硬化時間
図２−１５は、硬化体ＣＰＣ１、ＣＰＣ２およびＣＰＣ３のビガー針試験の結果を示す図である。試験の検体数ｎは５である。図中、「ｐ＜０．０１」は、有意差があるのは１％未満であることを意味する。
また、各硬化体の初期硬化時間を、ＣＰＣペーストの調製に用いたセメント粉および硬化液と共に表２−７に示す。表中、セメント粉１は、生成ＴＴＣＰとＤＣＰＤのモル比１：１の混合物であり、Ｐ／Ｌ＝３としてＣＴＣペーストを調製した。

硬化液としてLiquid３を用いた本発明のＣＰＣ３の初期硬化時間は４７．７分であり、硬化液としてLiquid１およびLiquid２を用いた従来のＣＰＣ１およびＣＰＣ２と比較して長くなった。これは、ポリオールとしてのβ−グリセロリン酸二ナトリウムが吸湿性を有するために、硬化液の水分が硬化反応場に提供されるのを遅延させたためと考えられる。
ＣＰＣペーストの初期硬化時間は、セメント粉と硬化液との混練から椎体内への注入（補填）までの操作を行うための時間を確保する必要があるため、通常８〜１５分程度が望ましい。これらの試験結果からみれば、ＣＰＣ１の初期硬化時間はやや短く、ＣＰＣ２の初期硬化時間はほぼ望ましい。ＣＰＣ１では、硬化液Liquid１がジカルボン酸でキレート効果を有するリンゴ酸を含有するために、硬化時間が短縮されたと考えられ、ＣＰＣ２では、硬化液Liquid２がリン酸塩を含有するために、硬化の反応場にリン酸イオンが供給されて早期硬化されたと考えられる。しかしながら、Liquid２を用いた場合には、図２−１４のように、ＣＰＣ周辺に線維状組織が析出するという問題がある。

そこで、ＣＰＣ３の初期硬化時間短縮を目的として、硬化液Liquid３にリン酸塩を添加した硬化液Liquid３−９を用いて作製した硬化体ＣＰＣ４としてビガー針試験実施した。
得られた結果を、比較としてＣＰＣ３の結果と共に図２−１６に示す。図中、「ｐ＜０．０１」は、有意差があるのは１％未満であることを意味する。
また、硬化体の初期硬化時間を、ＣＰＣペーストの調製に用いたセメント粉および硬化液と共に表２−８に示す。表中、セメント粉１は、生成ＴＴＣＰとＤＣＰＤのモル比１：１の混合物であり、Ｐ／Ｌ＝３としてＣＴＣペーストを調製した。
得られた結果によれば、ＣＰＣ４の初期硬化時間は１５．７分であり、ＣＰＣ３と比較して大幅な短縮と、混練から補填までの操作に必要な時間として適性であることが確認された。

（３）圧縮強度
図２−１７は、硬化体ＣＰＣ１、ＣＰＣ２およびＣＰＣ３の各浸漬時間（左：１日浸漬、中央：３日浸漬および右：７日浸漬）における圧縮強度を示す図である。図中、「ｐ＜０．０１」は、有意差があるのは１％未満であることを意味する。
また、硬化体ＣＰＣ１、ＣＰＣ２およびＣＰＣ３の各浸漬時間（１日浸漬、３日浸漬および７日浸漬）における圧縮強度を、キトサン含有量と共に、表２−９に示す。

ＣＰＣ１は、圧縮強度が最も高く、１日浸漬で３０ＭＰａに近い強度を発揮した。このようにＣＰＣ１は、硬化時間が短く、高い圧縮強度を発揮する反面、酸性を示すため、インビボ試験の結果のように、骨溶解が起こる可能性があり、好ましくない。
ＣＰＣ２およびＣＰＣ３は、ＣＰＣ１に比べて低く、ばらつきがあるものの、１０ＭＰａ程度、すなわち生体材料であり不均質で異方性が強いためにばらつきが強い、海綿骨程度の強度を発揮した。また、ＣＰＣ２およびＣＰＣ３では、経時的な強度の低下がみられた。これは、浸漬により硬化した後、リン酸カルシウムが溶解したことによるものと考えられる。
ＣＰＣ３の圧縮強度は、ＣＰＣ２に比べて高い傾向にある。これは、キトサン含有量の差によるものと考えられ、キトサン含有量の増加により、さらなる圧縮強度の向上が期待できる。

図２−１８は、硬化体ＣＰＣ３、ＣＰＣ５、ＣＰＣ６およびＣＰＣ７ならびにＰＡのセメント粉の各成分の粒径比と圧縮強度との関係を示す図である。
すなわち、硬化液Liquid３とセメント粉１〜４のいずれか１つを用い、Ｐ／Ｌ＝３で練和し、１日浸漬させて得られた硬化体ＣＰＣ３、ＣＰＣ５、ＣＰＣ６およびＣＰＣ７の圧縮強度を測定し、各セメント粉のＴＴＣＰとＤＣＰＤまたはＤＣＰＡとの粒子比との関係を調べた。得られた結果を表２−１０に示す。
図中、ＰＡは、参考として、K. Ishikawa、「Bioactive Ceramics: Cements」、Comprehensive Biomaterials、2011年、第1巻、p.267-283に記載の文献値である。
表２−１０に示されるように、硬化体ＣＰＣ３、ＣＰＣ５、ＣＰＣ６およびＣＰＣ７の圧縮強度は、１３．０〜２０．２ＭＰａの海綿骨程度の強度を示した。

（４）粉末Ｘ線回折による結晶相の分析
図２−１９は、セメント粉１と硬化液Liquid３を用いて作製した硬化体ＣＰＣ３の各浸漬時間（１日浸漬、３日浸漬および７日浸漬）における粉末Ｘ線回折図形である。
すべての回折図形においてハイドロキシアパタイト（Ｈａｐ、図中「Ｈ」）のピークが確認でき、ＨＡｐが析出し硬化したことが確認できた。同様にすべての回折図形において原料のセメント粉１のＴＴＣＰ（図中「Ｔ」）のピーク、すなわちＴＴＣＰの残存が確認できた。
セメント粉の原料であるＤＣＰＤとＴＴＣＰとの溶解速度を合わせるために、溶解度の小さいＤＣＰＤを湿式粉砕して粒径を小さくすることで表面積を増やし溶解速度を上げることを試みたが、ＤＣＰＤの溶解速度がＴＴＣＰの溶解速度を上回り、ＤＣＰＤが先にすべて消費され、ＴＴＣＰが残存する結果になったものと考えられる。

図２−２０は、セメント粉１〜４と硬化液Liquid３を用いて作製した硬化体ＣＰＣ３、ＣＰＣ５、ＣＰＣ６およびＣＰＣ７の１日浸漬における粉末Ｘ線回折図形である。
ＣＰＣ３とＣＰＣ５とを比較すると、出現ピークに殆ど差異はなく、セメント粉の原料であるＴＴＣＰと析出物であるＨＡｐのピークが確認できた。ＴＴＣＰの特徴的な（０３２）面および（０４０）面のピークをみると、ＣＰＣ５がＣＰＣ３より強い。
ＤＣＰＡがＤＣＰＤよりも溶解度が高く溶解し易いため、よりＤＣＰＡが消費されＴＴＣＰの残存量が増加しピークが強く出たものと考えられる。
ＣＰＣ６とＣＰＣ７とを比較すると、出現ピークに殆ど差異はなく、両者をＣＰＣ３およびＣＰＣ５の回折図形と比較すると、ＴＴＣＰの最強以外のピークはほとんど消失し、ＨＡｐのピークが大きく出現している。これらは、ＴＴＣＰの粒径が減少したためＴＴＣＰの消費も進み、ＨＡｐへの転化が進んだことに因るものと考えられる。また、ＣＰＣ６およびＣＰＣ７のＨＡｐのピークは、ＣＰＣ３およびＣＰＣ５と比較して幅が広いため、結晶性が低くかつＣＰＣ３およびＣＰＣ５と比較して低結晶性のＨＡｐ相が析出しているものと考えられる。

図２−２１は、本発明の基準となる化合物、ＴＴＣＰ、ＤＣＰＤ、ＤＣＰＡおよびＨＡｐの回折線図（それぞれＩＣＤＤ ＰＤＦ Ｎｏ．２５−１１３７、Ｎｏ．１１−０２９３、Ｎｏ．０９−００８０およびＮｏ．７４−０５６６）である。

（５）静的崩壊率
セメント粉としてセメント粉１、硬化液としてLiquid３を用いて作製した硬化体ＣＰＣ３について、前記条件および方法により静的崩壊率を測定した。
図２−２２は、硬化体ＣＰＣ３の静的崩壊率測定の様子を示す図である。
得られた結果、５回の測定における各測定値とそれらから算出した崩壊率およびそれらの平均値を表２−１１に示す。
ＣＰＣ３は、崩壊率が０．３７８±０．１０８％であり、殆ど崩壊しないことが確認できた。すなわち、Liquid３はＣＰＣに非崩壊性を付与し、ＣＰＣの硬化液として有用であることがわかる。

ポリオール含有の中性透明キトサン含有硬化液（ｐＨ６．７１、透過率４３．７３％）を用いた、本発明のセメントペーストは、初期硬化時間の短縮化を実現し、その硬化体では、殆ど溶解しないといえる静的崩壊率を実現し、かつ酸性硬化液での骨溶解現象および硬化体周辺での線維性組織生成の問題を解消することができる。

［実施形態２］
対比のため、一部、実施形態１を含む。
以下に記載の略号等は、本実施形態２内のみで有効とする。
［セメント粉の調製］
（１）リン酸四カルシウム（ＴＴＣＰ）の調製
市販の水酸化カルシウム（Ｃａ(ＯＨ)₂、ＭＷ７４．０９２７、等級：特級、ナカライテスク株式会社製）と正リン酸（Ｈ₃ＰＯ₄、ＭＷ９８．００、含有率８５％、等級：特級、和光純薬工業株式会社製）を原料に用いた。Ｃａ／Ｐ比が２になるようにＣａ(ＯＨ)₂を３１．３２ｇ（０．４ｍｏｌ）、Ｈ₃ＰＯ₄を２３．０６ｇ（０．２ｍｏｌ）、分析天秤（型式：ｓｅｆｉ ＩＢＡ−２００、アズワン株式会社製）で秤量し、前者をメスシリンダーで秤量した４００ｍＬの水が入った５００ｍＬビーカー、後者を５０ｍＬが入った１００ｍＬビーカーにそれぞれ加え、撹拌子を用い回転数２００ｒｐｍに設定したホットスターラー（型式：ＲＳＨ−１ＤＮ、アズワン株式会社製）で撹拌し、Ｃａ(ＯＨ)₂溶液とＨ₃ＰＯ₄溶液を得た。
得られたＣａ(ＯＨ)₂溶液にＨ₃ＰＯ₄溶液を、ガラスコック付きビュレット（アズワン株式会社製）を用い、一定量ずつ２時間をかけて滴下し、トルネード（型式：ＰＭ−２０３、アズワン株式会社製）を用いて撹拌した。その際、撹拌により溶液が軽く渦を生じる程度に回転数を適宜調節した。低温恒温水槽（型式：ＬＴＢ−１２５Ａ、アズワン株式会社製）から温度５℃の水をウォータージャケットに循環させ、Ｃａ(ＯＨ)₂溶液の入った５００ｍＬビーカーをウォータージャケット中で温度１０℃以下に保持した。滴下後、２４時間室温で保持し、熟成させた。

その後、遠心分離機（型式：Ｓｕｐｒｅｍａ２１、株式会社トミー精工製）を用い回転数５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄み液を取り除き、さらに回転数５０００ｒｐｍで７分間遠心分離した。分離した沈殿物をシャーレに入れプログラム定温乾燥機（型式：ＤＯＶ−４５０Ｐ、アズワン株式会社製）内、温度１１０℃で２４時間乾燥させた。乾燥させた試料をアルミナ製ボート（型式：ＳＳＡ−Ｈ２Ｂ、株式会社ニッカトー製）に入れ、炉床昇降式電気炉（型式：Ｓｕｐｅｒ Ｂｏｙ、丸祥電器株式会社製）で、大気中、温度１５００℃、５時間焼成した。昇降温速度は１０℃／ｍｉｎとした。
焼成後、試料を電気炉から取り出し、ミニブレンダー（型式：セレクトグラインドＣＧ−II、メリタジャパン株式会社製）で５分間粉砕し、さらにメノウ乳鉢で１時間或いは１．５時間乾式粉砕した。さらに、ミニふるい振とう機（型式：ＭＶＡ−１、アズワン株式会社製）とステンレスふるい（サイズφ７５μｍ）を用い、回転数２５００ｒｐｍで７５μｍ以下に分級したものを生成物Ａとした。

市販ＴＴＣＰ（Ｃａ₄(ＰＯ₄)₂Ｏ、ＭＷ３６６．２６、社内規格品、太平化学産業株式会社製）をハイスピードミル（型式：ＨＳ−１５、ラボネクト株式会社製）で粉砕し、２０ｗｔ％スラリーとなるよう２−プロパノール（イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）、等級：特級、和光純薬工業株式会社製）をメスシリンダーで、直径３ｍｍのジルコニアボール（型式：ＹＴＺ−３、直径３ｍｍ、株式会社ニッカトー製）９００ｇをパーソナル電子天秤（型式：ＥＫ６００ｉ、アズワン株式会社製）で秤取り、共にポットミル（型式：ＨＤ−Ｂ−１０４、株式会社ニッカトー製）に加えた。室温、回転数４９０ｒｐｍで５時間、卓上型ポットミル回転台（ユニバーサルボールミル、型式：ＵＢＭ−２、増田理化工業株式会社製）にて湿式粉砕した。得られた生成物を、プログラム定温乾燥機（型式：ＤＯＶ−４５０Ｐ、アズワン株式会社製）内、温度５０℃で４８時間乾燥させ、メノウ乳鉢で乾式粉砕し、市販ＴＴＣＰ(2)を得た。

（２）リン酸水素カルシウム（ＤＣＰＡ）の調製
リン酸水素カルシウム無水和物（ＣａＨＰＯ₄、ＭＷ１３６．０６、太平化学工業株式会社製）を１５．００ｇ（０．１１ｍｏｌ）、分析天秤で秤量し、メスシリンダーでエタノール（Ｃ₂Ｈ₅ＯＨ、等級：特級、キシダ化学株式会社製）を１８０ｍＬ、パーソナル電子天秤（型式：ＥＫ６００ｉ、アズワン株式会社製）で直径１０ｍｍのジルコニアボール（型式：ＹＴＺ−１０、直径１０ｍｍ、株式会社ニッカトー製）を５００ｇ秤取り、共にポットミル（型式：ＨＤ−Ａ−３、株式会社ニッカトー製）に加えた。室温、回転数１１０ｒｐｍで３０時間、４８時間、９６時間に分け、卓上型ポットミル回転台（型式：ＡＮＺ−５１Ｓ、アズワン株式会社製）にて湿式粉砕した。得られた湿式粉砕生成物を、ろ紙（５Ｃ、アズワン株式会社製）とブフナー漏斗、アスピレータ（型式：Ａ−３Ｓ、EYELA東京理化器械株式会社製）を用いて吸引濾過し、シャーレに入れ、プログラム定温乾燥機内、温度５０℃で２４時間乾燥した。さらにメノウ乳鉢で乾式粉砕した。後述するように粉砕時間を変えても粒径は変わらないので、この方法で得られたものを以降、ＤＣＰＡと称す。

（３）セメント粉の混合
セメント粉末は以下の通り調製した。ＴＴＣＰ６．００ｇ（０．０１６４ｍｏｌ）とＤＣＰＡ２．２３ｇ（０．０１６４ｍｏｌ）を分析天秤で秤量した。５０ｍＬマルエム目盛付試験管ねじ口（型式：ＮＸ−５０、アズワン株式会社製）に入れ、振とう機（型式：ＭＡＬＴＩ ＳＨＡＫＥＲ ＭＳ−３００、アズワン株式会社製）に設置し、回転数１６００ｒｐｍ、１００分間振とう混合を行った。得られた混合物をメノウ乳鉢で１０分間乾式混合し、セメント粉とした。
後述するように生成物Ａ、市販ＴＴＣＰはＴＴＣＰ単一相で、市販ＴＴＣＰ(2)もほぼＴＴＣＰ単一相であった。また、後述するように、メノウ乳鉢の乾式粉砕時間１時間と１時間半での生成物Ａの平均粒径は、各々２５−３０μｍと１０−１５μｍ、市販ＴＴＣＰ、市販ＴＴＣＰ(2)は各々７．２μｍ、２．０μｍであった。それぞれ粒径で区別するため、メノウ乳鉢での乾式粉砕時間１時間と１時間半で得られた生成物ＡをＴＴＣＰ（２５-３０）、ＴＴＣＰ（１０-１５）、市販ＴＴＣＰ、市販ＴＴＣＰ(2)をＴＴＣＰ（７．２）、ＴＴＣＰ（２．０）とし、各々の組合せのセメント粉を、以降、表３−１の通りに称す。

［硬化液の調製］
（１）アルギン酸ナトリウム含有硬化液の調製
メスシリンダーで秤量した水１０ｍＬを５０ｍＬビーカーに入れ、中分子量アルギン酸ナトリウム（(ＮａＣ₆Ｈ₇Ｏ₆)_n、等級：一級、８０〜１２０ｍＰａ・ｓ、和光純薬工業株式会社製）を０．２０ｇ、リン酸水素二カリウム（Ｋ₂ＨＰＯ₄、ＭＷ１３６．０８６、等級：特級、キシダ化学株式会社製）を０．２０ｇ、リン酸二水素カリウム（ＫＨ₂ＰＯ₄、ＭＷ１７４．２、等級：特級、キシダ化学株式会社製）を０．１０ｇ、分析天秤で秤量して加えた。この溶液をLiquidＡ１とする．また、中分子量アルギン酸ナトリウム０．２０ｇの代わりに、低分子量アルギン酸ナトリウム（(ＮａＣ₆Ｈ₇Ｏ₆)_n、２０〜５０ｍＰａ・ｓ、キミカ株式会社製）を分析天秤で１．０ｇ、１．５ｇ、２．０ｇを秤量して加えた溶液をそれぞれLiquidＡ２、Ａ３、Ａ４とする。溶液混合は、撹拌子とホットスターラー（型式：ＲＥＸＩＭ ＲＳＨ−１ＤＮ、アズワン株式会社製）を用い、室温、回転数３００ｒｐｍで１５分撹拌して均一に溶解した。

（２）ポリオール−キトサン含有硬化液の調製
塩酸（ＨＣｌ、ＭＷ３６．４６、等級：特級、３５％含有、ｄ＝１．１８ｇ／ｃｍ³、キシダ化学株式会社製）をメスシリンダーで８．８２８ｍＬ（０．１０ｍｏｌ）秤量し、１Ｌメスシリンダーを用い、水を加え１０００ｍＬとし０．１Ｍ−ＨＣｌ溶液を作製した。作製した０．１Ｍ−ＨＣｌをメスシリンダーで９ｍＬ秤量し、分析天秤で秤量した低分子量キトサン０．２０ｇ加え、ガラス棒で撹拌することでキトサン溶液を得た。
次に、メスシリンダーで秤量した１ｍＬの水にβ-グリセロリン酸二ナトリウム四水和物（Ｃ₃Ｈ₇Ｎａ₂Ｏ₆Ｐ・４Ｈ₂Ｏ、ＭＷ２１６．０４、ＴＣＩ東京化成工業株式会社製）を分析天秤で０．５６ｇ（０．０２５９ｍｏｌ）秤量して加え、ガラス棒で撹拌し溶解させ、さらにリン酸二水素カリウム（ＫＨ₂ＰＯ₄、ＭＷ１３６．０８６、和光純薬工業株式会社製）と弱塩基性であるリン酸水素二カリウム（Ｋ₂ＨＰＯ₄、ＭＷ１７４．２、和光純薬工業株式会社製）を添加し、β-グリセロリン酸二ナトリウム溶液を得た。キトサン溶液にβ−グリセロリン酸二ナトリウム溶液１ｍＬを、メスピペットで一滴ずつ加え撹拌し得られた溶液をポリオール−キトサン含有硬化液とした。これを以後、LiquidＣ１と称す。

［硬化液の評価］
（１）透過率測定
紫外可視分光光度計（型式：Ｖ-５００、日本分光株式会社製）を用いてスペクトル測定と固定波長測定を行い、作製した硬化液の透過率を調べた。測定条件を以下の表３−２に示す。作製した硬化液を角型石英セル（１０ｍｍ、日本分光株式会社製）に入れ測定を行った。

（２）ｐＨ測定
作製した硬化液のｐＨ測定を、ｐＨメーター（型式：Ｄ−５１、株式会社製掘場製作所）を用いて行った。使用前には、ほう酸塩緩ｐＨ標準液（ｐＨ９．１８）、中性リン酸塩ｐＨ標準液（ｐＨ６．８６）、フタル酸塩ｐＨ標準液（ｐＨ４．０１）（すべて和光純薬工業株式会社製）を用いて３点校正した。

（３）アルギン酸ナトリウムの評価
アルギン酸の粘度測定を行った。破骨細胞はプロトンと塩素イオンを産生し、体内で骨を溶解するが、塩素イオン濃度の異なる生理食塩水、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ水溶液、擬似体液（ＳＢＦ）中に浸漬し、アルギン酸の分子量変化を粘度から推定した。
生理食塩水は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ、ＭＷ５８．４４、等級：特級、和光純薬工業株式会社製）９．０００ｇを分析天秤で秤量し、１Lメスフラスコに入れ、水を加えて定容した。ＳＢＦ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ水溶液の作製に先立ち、１Ｎ−ＨＣｌ溶液を、塩酸（ＨＣｌ、３５．０〜３７．０ｍａｓｓ／ｍａｓｓ％、等級：特級、和光純薬工業株式会社製）をメスシリンダーで用いて秤量し、水を加えて１２倍に希釈することで得た。

ＳＢＦは、S. B. Cho、K. Nakanishi、T. Kokubo、N. Soga、C. Ohtsuki、T. Nakamura、T. Kitsugi、T. Yamamuro、J. Am. Ceram. Soc.、第78巻、第7号、p.1769-1774（1995）に従い、以下の通り調製した。２Ｌポリ瓶中にメスシリンダーで水７００ｍＬを秤量して入れ、撹拌子とホットスターラーを用い、回転数５００ｒｐｍで撹拌しながら、表３−３の試薬（等級：特級、和光純薬工業株式会社製）を、順に分析天秤で精秤して加え、溶解したら、次の試薬を同様に精秤、溶解を行った。ホットスターラーで、温度３６．５±０．５℃となるように調整し、アルコール温度計で確認した。顆粒状のＣａＣｌ₂は、一粒ずつ逐次添加し投入の一粒が溶けてから次の一粒を加えた。Ｎａ₂ＳＯ₄を加えた時点でｐＨメーターの電極を溶液に浸した。水をさらに２００ｍＬ加えて液量を９００ｍＬとしたのち、ｐＨメーターを見ながらｐＨ７．４５以下の範囲でｔｒｉｓ（トリス−ヒドロキシメチルアミノメタン）を添加し、ｐＨが７．４５まで上昇したら、１Ｍ−ＨＣｌ溶液を滴下し、ｐＨを７．４２まで下げた。次いで、ｔｒｉｓを加え、ｐＨ７．４５まで上昇したら１Ｍ−ＨＣｌ溶液を加える操作はｔｒｉｓを使い切るまで繰り返し、最終的にｐＨ７．４０に調整した。調整後の水溶液を１０００ ｍＬメスフラスコに移し水冷、液温が温度２０℃以下になったあと、水を加え定容した。ＳＢＦは調製後１カ月以内に使用した。ＳＢＦの塩素濃度は、１４８．８ｍｍｏｌである。ｐＨ測定をｐＨメーター（型式：Ｄ−５１、株式会社製掘場製作所）を用いて行った。

Ｔｒｉｓ−ＨＣｌは以下の通り調製した。メスシリンダーで秤取った水９００ｍＬを、撹拌子とホットスターラーを用いて温度３６．５±０．５℃に調整した。１．０Ｍ−ＨＣｌをメスシリンダーで３９ｍＬ秤量して加え、ｐＨメーター電極を浸した。分析天秤で秤量したＴｒｉｓを入れ、ｐＨ７．４５まで上昇したら１．０Ｍ−ＨＣｌ溶液を加え、Ｔｒｉｓ６．１１８ｇを使い切るまで繰り返し、最終的にｐＨ７．４０に調整した。調整後の水溶液を１０００ｍＬのメスフラスコに移し水冷、液温が温度２０℃以下になるまで静置した。その後、水で定容した。
生理食塩水、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、擬似体液（ＳＢＦ）、それぞれの塩素濃度は、１４５ｍＭ、５０ｍＭ、１７０ｍＭである。それぞれメスシリンダーで秤量し２００ｍＬをビーカーに入れ、分析天秤で秤量したアルギン酸ナトリウム（等級：特級、和光純薬工業株式会社製）粉末２．００ｇを加え、２４時間、室温で静置した。粘度測定にはＢ型回転粘度計（型式：ブルックフィールドＤＶ−Ｉ Ｐｒｉｍｅ、英弘精機株式会社製）を用いた。回転数は６０ｒｐｍとし、回転子は６２番（φ１９×７ｍｍ）を用いた。また測定は、二重管式反応容器（φ１５０×１００ｍｍ、株式会社三商製）に水を入れ、低温恒温水槽（型式：ＬＴＢ−４００Ａ、アズワン株式会社製）から循環し、温度２０℃（室温）に保持した。データは、表示された数値を読取り記録した。

［ＣＰＣ硬化試験］
（１）ＣＰＣペーストの調製
ＣＰＣの調製は、ＪＩＳ Ｔ０３３０−４に準拠して行った。設定した粉液比になるように、セメント粉１〜４を分析天秤で秤量した。硬化液は練和に用いるシャーレに入れた状態で、分析天秤で秤量した。練和は、図３−１の治具を用いて行った。シャーレにセメント粉を硬化液に触れないように入れ、もし塊があれば練和前にプラスチック板（図３−１、(a)）で押さえて潰した。セメント粉は３回に分け、プラスチック板とステンレス製薬サジ（図３−１、（ｂ））を用い、硬化液（図中は、LiquidＣ２）と合わせ練和した。大気中（温度２５℃）で７０秒間練和し、練和物を得た。

練和物は、練和後直ちに、プラスチック板一枚の上に載せたφ６×１２ｍｍのテフロン（登録商標）製割型（図３−２、（ａ））にステンレス製薬さじとガラス棒（φ５．６ｍｍ）を用いて詰込んだ。その際、気泡が入らないように、ステンレス製薬さじでテフロン製割型の中央の穴に押し込み、適宜ガラス棒で上から抑えることを繰り返す。さらに、両側をプラスチック板（図３−２、（ｂ））とクリップ（図３−２、（ｃ））で留めた。型の構成を図３−２に示す。
予め温度３７℃に保持したクールインキュベーター（型式：ＣＮ−４０Ａ、三菱電機エンジニアリング株式会社製）中に、水を含ませたスポンジを入れた容器およびメスシリンダーで秤量した水５０ｍＬを入れた栓付スクリュー管瓶を入れた。練和物をテフロン製割型ごと、スポンジの上に載せ、容器に蓋をして１時間保持し、初期硬化体を得た。その後、予め温度３７℃に保温した水中に割型のまま練和物を浸漬した。クールインキュベーター中、温度３７℃で保温し浸漬させ、その後脱型し得られたＣＰＣ硬化体を試料とした。
図３−３は、テフロン製割型、（ａ）テフロン型、（ｂ）テフロン型固定板（３０ｍｍ×１２ｍｍ×２．３ｍｍ、中央の穴径φ５ｍｍ）、（ｃ）平頭ネジ（５Ｍ×３３ｍｍ）、（ｄ）ナットおよび（ｅ）組立図を示す図である。
図３−４は、ＣＰＣの初期硬化に用いる容器を示す図である。

（２）圧縮強度試験
圧縮強度試験は、ＪＩＳ Ｔ０３３０−４に準拠して行った。上記の通り調製したＣＰＣ硬化体を各浸漬条件ごとに５個作製した。ＣＰＣ硬化体の上面と下面が平行になるよう留意した。平行でなく突出した部分があると応力が集中し、本来より低い値が得られるからである。浸漬後、表面の水を拭い、試験に供した。圧縮強度測定には、万能試験機（型式：ＡＵＴＯＧＲＡＰＨ ＡＧＩ−２０ｋＮ、株式会社島津製作所製）、５ｋＮロードセル（型式：８７３９４、株式会社島津製作所製）を用い、また引張方向を圧縮方向に転換する引張−圧縮変換器（図３−５）を用いた。引張−圧縮変換器と試料の間に水で濡らした濾紙を挟み、荷重が１Ｎかかった時点で変位を０ｍｍとし、ゼロ点を合わせた。試験途中に微小破壊による圧縮強度の急激な減少があっても試験を中断せず、変位が２ｍｍになるまで連続して行った。測定条件は、ヘッドスピード０．５００ｍｍ／ｓｅｃ、サンプリング間隔１００ｍｓｅｃで、制御・解析ソフト（Tranpezium、株式会社島津製作所製）を用いて計測を行った。

（３）初期硬化時間測定
初期硬化時間測定は、ＪＩＳ Ｔ０３３０−４に準拠し行った。上記の要領で練和したＣＰＣペーストを練和開始後９０秒以内にテフロン製型（φ１０×５ｍｍ）に入れ、初期硬化体の調製と同様、温度３７℃に保持したクールインキュベーター中の水を含んだスポンジを入れた容器中に置き、ビガー針試験機（型式：Ａ−００４、株式会社日本メック製）を用い、ビガー針（３００ｇ、先端面積２ｍｍ²）を真上から静かに落とし、圧痕を確認後、圧痕が残れば容器内に戻すということを繰り返し、圧痕を示さなくなった時間を初期硬化時間とした。試験の様子を図３−６に示す。１条件につき３回行い、その平均値を初期硬化時間とした。

（４）静的崩壊率測定
静的崩壊率測定は、ＪＩＳ Ｔ０３３０−４に準拠し行った。メスシリンダーで秤量した水に分析天秤で秤量した塩化ナトリウム（ＮａＣｌ、等級：特級、キシダ化学株式会社製）を用いて生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ水溶液）を調製した。プラスチック容器（図３−７（ａ）、φ４０×３０ｍｍ）の中にステンレス金網台（図３−７（ｂ）、３０×３０ｍｍ）と上記のように調整し、メスシリンダーで秤量した生理食塩水４５ ｍＬを入れ、予めクールインキュベーター内で温度３７℃に加温した。上記の手順により得られたＣＰＣペーストをシリンジ（φ１０ｍｍ、４０ｍＬ）に１ｍＬ充填し、プラスチック容器の中にあるステンレス金網台上に静かに押し出した。練和開始５分後に容器の蓋を閉めて、クールインキュベーター中で、温度３７℃で７２時間静置した。７２時間後、容器内の生理食塩水を慎重に取り除き、金網台ごとプラスチック容器をプログラム定温乾燥機内、温度３７℃で２４時間乾燥し、分析天秤を用いて秤量し、以下の式より崩壊率を求めた。
崩壊率（％）＝［(ｃ−ｄ)／((ａ−ｂ)＋(ｃ−ｄ))］×１００
ａ：硬化した試料と金網台の重量（ｇ）
ｂ：硬化した試料を除去し、乾燥させた金網台の重量（ｇ）
ｃ：崩壊した試料とプラスチック容器の重量（ｇ）
ｄ：崩壊した試料を除去し、乾燥させたプラスチック容器の重量（ｇ）

（５）押出力測定
ＣＰＣペーストの注入のし易さ（Injectability）を評価するため、ＪＩＳ Ｔ０３３０−４の稠度試験の代わりに、以下の測定を行った。
ＣＰＣを７０秒間練和し、９０秒以内にＣＰＣ計量用シリンジ（図３−８、φ４．６ｍｍ）を用いて０．２ｍＬを計量した。１２０秒後、図３−９のように電子天秤（型式：ＥＫ−４１００ｉ、株式会社エーアンドデイ製）上で筒先側を上にし、外筒を手で持って鉛直下方向に荷重を加えていき、シリンジが筒先から完全に出るまでにかかった最大荷重を測定した。なお、荷重測定時は電子天秤の液晶部を動画撮影し、動画にて最大荷重を確認した。測定は３回繰り返し、それらの平均値と標準偏差を得た。

［試料の分析］
（１）粉末Ｘ線回折による結晶相同定
上記により作製した生成物Ａ、市販ＴＴＣＰ、市販ＴＴＣＰ(2)、ＤＣＰＡおよび作製したＣＰＣ硬化体（シャーレに入れ、プログラム定温乾燥機内、温度５０℃で乾燥した）の粉末Ｘ線回折を行った。Ｘ線回折装置（型式：ＲＩＮＴ２２００、リガク株式会社製）、解析ソフト（ＪＡＤＥ６、リガク株式会社製）、Ｘ線発生には封入管（ターゲットＣｏ、２ｋＷ）を用いた。測定条件は以下の通りである。測定角度１０°〜７０°、サンプリング角度０．０２°、スキャン速度２．０°ｍｉｎ^-1、管電圧４０ｋＶ、管電流２０ｍＡ、スリットＤＳ＝１°、ＳＳ＝１°、ＲＳ＝０．３ｍｍ、Ｃｏ−Ｋαの波長は１．７９０Åである。

（２）粒度分布測定
合成し分級したＴＴＣＰ（生成物Ａ）の粒度分布を測定した。レーザー回折／錯乱式測定装置（型式：ＬＡ９２０、株式会社堀場製作所製）で行った。分散媒は超純水、分散剤は使用しなかった。試料ごとに超音波洗浄機で分散後、測定した。水に対するリン酸カルシウムの屈折率は１．２４とした。

（３）吸収性インビトロ試験
ＪＩＳ Ｔ０３３０−３:２０１２に準拠して溶解性試験を行った。破骨細胞が作り出す環境下であるｐＨ５．５の溶液中にて、試料からのカルシウムイオン溶出量、質量減少量の測定を行った。試料は上記と同様に練和後、温度３７℃で初期硬化させ、温度３７℃の生理食塩水５０ｍＬ中、７日浸漬後、プログラム定温乾燥機（型式：ＤＯＶ−４５０Ｐ、アズワン株式会社製）を用い、温度５０℃で２４時間乾燥した試料を吸収性試験試料とした。

酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）の調製
酢酸４．８０４ｇ（０．０８ｍＬ、ＣＨ₃ＣＯＯＨ、ＭＷ６０．０５、等級：特級、キシダ化学株式会社製）を分析天秤で秤量し、１Ｌメスフラスコに入れ、水を加えて１Ｌに定容し、０．０８ｍｏｌ／Ｌ酢酸溶液を作製した。
酢酸ナトリウム６．５６２ｇ（０．０８ｍｏｌ、ＣＨ₃ＣＯＯＮａ、ＭＷ８２．０３４３、等級：特級、キシダ化学株式会社製）を同様に秤量し、１Ｌメスフラスコと水を用いて同様に、０．０８ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム溶液とした。この作業を２回繰り返し、０．０８ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウムを２Ｌ作製した。
メスシリンダーで秤量した０．０８ｍｏｌ／Ｌ酢酸溶液２０．０ｍＬに０．０８ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム溶液を加え、ｐＨメーター（型式：Ｄ−５１、株式会社堀場エステック製）を用いて、ｐＨ５．５０±０．０２に調整した。０．０８ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム溶液１４２ｍＬでｐＨ５．４９〜５．５０となった。よって、０．０８ｍｏｌ／Ｌ酢酸溶液と０．０８ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム溶液を混合比１：７で混合してｐＨ５．５０±０．０２の酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液を調製した。

校正用１ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ Ｃａ標準液の調製
１０００ｐｐｍ Ｃａ²⁺標準液を以下の手順で作製した。
硝酸９．１３２ｇ（０．１ｍｏｌ、ＨＮＯ₃、６９〜７０ ｍａｓｓ／ｍａｓｓ％、等級：特級、キシダ化学株式会社製）を分析天秤で秤量し、１Ｌメスフラスコに入れ、水を加えて１０００ｍＬに定容し、０．１ｍｏｌ／Ｌ硝酸溶液を作製した。
炭酸カルシウム（ＣａＣＯ₃、ＭＷ１００．０８６９、等級：特級、和光純薬工業株式会社製）２．５０２ｇを分析天秤で秤量し、１Ｌメスフラスコに入れ、０．１ｍｏｌ／Ｌ硝酸溶液を加えて１０００ｍＬに定容し、１０００ｐｐｍ Ｃａ²⁺標準溶液とした。
１０００ｐｐｍ Ｃａ²⁺標準液を、１００ｍＬメスフラスコと１０ｍＬホールピペットを用いて段階希釈し、１００ｐｐｍ Ｃａ²⁺標準液、１０ｐｐｍ Ｃａ²⁺標準液を作製した。それぞれの Ｃａ²⁺標準液１０ｍＬと０．８ｍｏｌ／Ｌ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液１０ｍＬを１０ｍＬホールピペットで秤取り、１００ｍＬメスフラスコに入れ、さらに水を加えて１００ｍＬに定容し、０．０８ｍｏｌ／Ｌ酢酸−酢酸ナトリウム−１００ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ Ｃａ²⁺標準液を調製した。

（３）Ｃａイオン溶出量測定
Ｃａイオン電極（型式：ＣＨ−９１０１、メトロームジャパン株式会社製）を測定前に以下の通り、コンディショニングを行なった。
水中に２時間浸漬し、次いで０．０８ｍｏｌ／Ｌ酢酸‐酢酸ナトリウム緩衝液中で撹拌子とホットスターラー（型式：ＲＥＸＩＭ ＲＳＨ−１ＤＮ、アズワン株式会社製）を用い、回転数４３０ｒｐｍで３０分、室温で撹拌しながら浸漬した。
検量線は、上記で作製した校正用Ｃａ標準液を用いて作成した。撹拌子とホットスターラー（型式：ＲＥＸＩＭ ＲＳＨ−１ＤＮ、アズワン株式会社製）を用い、回転数４３０ｒｐｍで、室温で撹拌し浸漬しながら、１、１０、１００ｍｇ／Ｌ Ｃａ²⁺標準液の順にＣａイオン電極を浸漬し、イオン濃度を測定した。

図３−１０に示すように、樹脂製の撹拌子台（研究室自作）の下に試験片を置き、上に撹拌子を載せ、Ｃａイオン電極をセットし、０．０８ｍｏｌ／Ｌ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液１００ｍＬを容器に投入し、撹拌子、ホットスターラー（型式：ＲＥＸＩＭ ＲＳＨ−１ＤＮ、アズワン株式会社製）を用いて回転数４３０ｒｐｍで撹拌してイオン濃度を測定した。酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液を入れてから１分以内に測定を開始した。測定開始２０分後までは２分おき、３０〜１５０分後までは１５分おき、その後３０分おきに測定し、３００分後に終了した。測定後、緩衝液のｐＨを測定し、ｐＨ５．５０であることを確認した。それぞれの条件について３回測定し、それらの平均を実験結果とした。また、生理食塩水に浸漬していた試料を取り出して乾燥、溶解性試験後の試料を、温度５０℃で２４時間乾燥した後、デシケーター（真空ポリカデシケーター、型式：２４０Ｇ型、アズワン株式会社製）中で２時間放冷後、重量を分析天秤で秤量し、その差を質量減少量とした。

（４）断層画像撮影
卓上型マイクロフォーカスＸ線ＣＴ（型式：ＳＭＸ−９０ＣＴ Ｐｌｕｓ、ｉｎｓｐｅＸｉｏ、株式会社島津製作所製）を用いて、ＣＰＣ硬化体の断層画像撮影を行った。
試料台に試料を取り付け、管電圧９０ｋＶ、管電流１１０μＡで断層画像を撮影した。データを３次元画像処理ソフト（ExFact VR、日本ビジュアルサイエンス株式会社製）を用いて、断層画像のボリュームレンダリングにより三次元可視化を行った．ＬＵＸテーブルを調整し、試料の３Ｄ断面を観察した。

（５）ＦＥ-ＳＥＭでの試料観察
吸収性インビトロ試験後の試料にＯｓｍｉｕｍ Ｐｌａｓｍａ Ｃｏａｔｅｒ（型式：ＯＰＣ６０Ａ、フィルジェン株式会社製）を用い、ＯｓＯ₄を１２ｎｍコーティングしてＳＥＭ試料とした。電界放射型走査型顕微鏡（ＦＥ−ＳＥＭ、型式：ＪＳＭ−６５００Ｆ、日本電子株式会社製）で各試料の観察を行った。観察時の加速電圧は、１５ｋＶ、真空度５．００×１０^-4 Ｐａ以下で行った。

［セメント粉の分析］
（１）粉末Ｘ線回折（ＸＲＤ）による試料の同定
（ａ）生成物Ａ、（ｂ）市販ＴＴＣＰおよび（ｃ）市販ＴＴＣＰ(2)の回折図形ならびに（ｄ）ＴＴＣＰ（ＩＣＤＤ ＰＤＦ Ｎｏ．２５−１１３７）の回折線図を図４−１に示す。
図４−１によれば、（ａ）生成物Ａおよび（ｂ）市販ＴＴＣＰの回折図形と（ｄ）ＴＴＣＰのＩＣＣＤによる回折線図のピーク位置および強度がほぼ一致し、これら以外に特にピークはほとんど見られない。したがって、生成物Ａおよび市販ＴＴＣＰはＴＴＣＰの単一相であると考えられる。また、市販ＴＴＣＰを湿式粉砕した市販ＴＴＣＰ(2)は、最強ピーク２本の強度比が異なり、ピーク分離がやや明確でなく、低結晶性アパタイトの存在を示唆している。

（ａ）湿式粉砕前のＤＣＰＡ、（ｂ）３０時間湿式粉砕後のＤＣＰＡ、（ｃ）４８時間湿式粉砕後のＤＣＰＡおよび（ｄ）９６時間湿式粉砕後のＤＣＰＡの回折図形ならびに（ｅ）ＤＣＰＡ（ＩＣＤＤ ＰＤＦ Ｎｏ．０９−００８０）の回折線図を図４−２に示す。
図４−２によれば、最強ピーク３つに注目すると、３０時間の湿式粉砕により（１１２）面のピークが低下している。しかし、（０２０）面および（２２０）面との相対的なピーク強度は、粉砕時間を４８時間から９６時間としてもほとんど変わらない。ＤＣＰＡはエタノールに不溶であるが、エタノールに含まれる水分により若干溶解すれば、Ｃａとリン酸の割合から局所的には弱酸性になると思われる。弱酸性ではアパタイトの溶解度が最も低く安定であるが、アパタイトに相当するピークも見られない。粉砕効果により、ｃ軸方向の粉体の形態が変化し、Ｘ線回折測定のためのガラス試料板への充填の結晶方位に変化があったためと思われる。

（２）粒度分布
（Ｉ）乾式粉砕のＴＴＣＰ（粉砕時間１時間）、（II）乾式粉砕のＴＴＣＰ（粉砕時間１．５時間）、（III）市販のＴＴＣＰおよび（IV）市販ＴＴＣＰ(2)の粒度分布を図４−３に、（Ｖ）湿式粉砕のＤＣＰＡ（粉砕時間３０時間）、（VI）湿式粉砕のＤＣＰＡ（粉砕時間４８時間）および（VII）湿式粉砕のＤＣＰＡ（粉砕時間９６時間）の粒度分布を図４−４に示し、それらの算術平均系およびメジアン径を表４−１に示す。
図４−３によれば、（Ｉ）と（II）を比較すると、粉砕時間を１時間から１．５時間に
するとＴＴＣＰの粒径が小さくなっているのが明瞭である。しかしながら、（II）でも分布が左右非対称であり、数μｍ以下の分布が多くなっている。ミニブレンダーにて粉砕後、メノウ乳鉢での粉砕を行ったが、さらなる微細化の可能性を示唆している。一方、（III）と（IV）を比較すると、市販ＴＴＣＰと粉砕した市販ＴＴＣＰ(2)は、粒度分布が左右対称でシャープなピークを示し、粉砕による微細化が明瞭に見て取れる。
また、図４−４によれば、（Ｖ）〜（VII）を比較すると、粒度分布にほとんど変化が見られない。市販ＤＣＰＡはエタノールを媒体とした湿式粉砕時間を３０時間、４８時間、９６時間まで行ったが、ＸＲＤから示唆されるように湿式粉砕３０時間で結晶形態に変化が生じた後は、粉砕による微細化はあまり進まなかったと考えられる。

［硬化液の分析］
（１）硬化液の組成
調製したアルギン酸含有硬化液（LiquidＡ１、LiquidＡ２、LiquidＡ３、LiquidＡ４）の組成を表４−２に示す。
中分子量アルギン酸ナトリウム（８０〜１２０ｍＰａ・ｓ）は、水に２％まで溶解させると、それ以上中分子量アルギン酸ナトリウムを溶解させることができたが、少しゲル状で流動性が低下した。水に中分子量アルギンナトリウムを２％溶解させ、硬化液として用いると、初期硬化時間が長くなり、セメント粉のＴＴＣＰの溶解を促進するため、リン酸塩を添加した。ｐＨを調整するため酸性であるリン酸二水素カリウム（ＫＨ₂ＰＯ₄）と弱塩基性であるリン酸水素二カリウム（Ｋ₂ＨＰＯ₄）を用いた結果、LiquidＡ１では初期硬化時間が８〜１５分であった。さらにアルギン酸ナトリウムの溶解量を高めるため、LiquidＡ２、LiquidＡ３、LiquidＡ４では低分子量アルギン酸ナトリウム（２０〜５０ｍＰａ・ｓ）を用いると、２０％近くまで溶解することが可能であった。また、中分子量と比較して粘性の低下が見られた。

調製したキトサン含有硬化液（LiquidＣ１、LiquidＣ２、LiquidＣ３、LiquidＣ４）の組成を表４−３に示す。
また、用いたキトサンの種類とそれにより分類した硬化液を表４−４に示す。
キトサンはｐＨ３以下の酸性条件下でプロトン化が進み、分子量の低下と共に溶解するが、ｐＨが１程度の０．１Ｍ−ＨＣｌでは中分子量キトサンでは２％まで、脱アセチル化度が高いダイキトサンでは２％で溶け残りがあり、１％添加に止まった。ダイキトサンはフレーク状塊であり、酸の浸透が良好でなく、溶解し難い傾向が見られた。フレーク状塊をさらに解砕することで溶解性の向上が期待される。また、より高濃度の酸を用いることで、よりプロトン化も促進されると考えられる。また、硬化液を中性にするため、水酸基が多いグリセロリン酸ナトリウムを添加したが、グリセロリン酸はやや粘性が高く、グリコール酸ナトリウムを使うことで粘性の低下が可能ではないかと思われる。低分子量キトサンを用いることで、粘性の低下が見られた。

（３）硬化液の特性
調製したアルギン酸含有硬化液（LiquidＡ１、LiquidＡ２、LiquidＡ３、LiquidＡ４）およびキトサン含有硬化液（LiquidＣ１、LiquidＣ２、LiquidＣ３、LiquidＣ４）のｐＨを表４−５に示す。

また、アルギン酸含有硬化液、（ａ）LiquidＡ２、（ｂ）LiquidＡ３および（ｃ）LiquidＡ４の様子を図４−５に、それらの透過率を図４−６に示す。
図４−５によれば、（ａ）LiquidＡ２、（ｂ）LiquidＡ３、（ｃ）LiquidＡ４とアルギン酸濃度が高くなるにつれて、やや着色が見られる。しかし、硬化液を調製し、室温で２週間置いてもゲル化など変質はしなかったため、溶け残りはないと考えられる。

（４）アルギン酸ナトリウムの評価
粘性試験の結果を表４−６に示す。
水に浸漬した場合と比較して、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌではほぼ同じであり、生理食塩水、ＳＢＦの順に粘度が低く、キトサンの場合と同様の結果となった。Ｃｌイオン含有量が大きいと粘度が低くなる傾向があった。粘度低下は分子量の低下を意味しており、破骨細胞が産生する塩素イオンにより、体内でアルギン酸は分解・吸収される可能性がある。一方、アルギン酸はＣａイオンとキレート結合するため、体内の破骨細胞環境下でキトサンほど分解吸収されない可能性もある。

［硬化体の分析］
（１）硬化時間
硬化体ＣＰＣ１〜５のビガー針試験の結果を表４−７に示す。
硬化液にリン酸塩を含有させることにより、初期硬化時間を早めることができるが、骨形成の手術の現場であまりに早い硬化であれば、混練〜注入の操作が困難となるため、一定の初期硬化時間が必要である。適用部位や術者によって、好ましい初期硬化時間に差があり、適切な初期硬化時間を定め難いが、数分〜２０分程度が望ましいと考えられる。硬化体ＣＰＣ５を除き、ほぼその範囲に入っている。異なるアルギン酸ナトリウム含有量と粒径は、初期硬化時間にほとんど違いが見られなかったが、粉液比を低くしたＣＰＣ５では硬化時間が長い結果となった。
表４−７中、硬化液のLiquidＡ１、LiquidＡ２、LiquidＡ４は、それぞれ水１０ｍＬ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．２ｇ、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０．１ｇおよびアルギン酸（括弧内のｇ数）を含み、LiquidＣ２は、水１ｍＬ、０．１Ｍ−ＨＣｌ ９ｍＬ、ポリオール０．５６ｇおよびキトサン（括弧内のｇ数）を含む。

（２）圧縮強度
表４−８に圧縮試験を行った硬化体ＣＰＣの条件を、図４−７に硬化体ＣＰＣ４、ＣＰＣ７およびＣＰＣ８の２４時間浸漬における圧縮強度を示す。
表４−８中、硬化液のLiquidＡ２、LiquidＡ３、LiquidＡ４は、それぞれ水１０ｍＬ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．２ｇ、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０．１ｇおよびアルギン酸（括弧内のｇ数）を含む。

硬化体ＣＰＣ８の圧縮強度が最も高く、５０ＭＰａもの強度を発揮した。アルギン酸ナトリウムの添加率が３．２％以上の添加は圧縮強度の向上には寄与しなかったが、多糖類含有量の増加より圧縮強度が上昇する既報、山田裕貴、大阪市立大学工学研究科修士論文、2013年およびH. H.K.Xu、C. G.Simon、Biomater、第26巻第12号、p.1337-1348、2005年と一致した。硬化体ＣＰＣ７とＣＰＣ８の違いは、多糖類であるアルギン酸ナトリウム含有量の差によると考えられる。

表４−９と図４−８に硬化体ＣＰＣ４の各浸漬時間に対する圧縮強度を示す。
浸漬時間が長くなると圧縮強度が低下する傾向が見られた。後述するように、セメント粉がＣＰＣ硬化体に残存しており、水和硬化に寄与していないセメント粉が溶出し、硬化体の密度が低下したためと思われる。水ではなく、体液のようにＣａやリン酸が過飽和な場合、溶出分が補充される可能性もあるが、骨補填部では多方面から荷重がかかるため、崩壊のおそれがあり、改善が必要と思われる。また、低分子量アルギン酸により、粘性は低下し、容易に水に溶解するが、硬化に寄与しないアルギン酸は硬化体から溶出する可能性もある。

セメント粉は２種類のリン酸塩から構成されており、四リン酸カルシウムが残存し易いので、残存を回避するため、粒径の小さなＴＴＣＰ（７．２）とＴＴＣＰ（２．０）を用いた。
表４−１０に圧縮試験を行った硬化体ＣＰＣの条件を、図４−９に硬化体ＣＰＣ４、ＣＰＣ２およびＣＰＣ９の１日および７日浸漬における圧縮強度を示す。
表４−１０中、硬化液のLiquidＡ４は、水１０ｍＬ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．２ｇ、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０．１ｇおよびアルギン酸（括弧内のｇ数）を含む。

ＴＴＣＰ（７．２）を用いたＣＰＣ２は浸漬時間を長くすると圧縮強度は逆に向上した。一方、より粒径が小さいＴＴＣＰ（２．０）を用いたＣＰＣ９は粉液比が小さいため、圧縮強度は低下した。
浸漬時間に伴い強度が向上したＣＰＣ２を１か月浸漬すると圧縮強度は２２．４８８±２．０７６ＭＰａで、７日後より低下した。後述するＸＲＤでＴＴＣＰが消失し、水和硬化反応が完了したと思われるが、アルギン酸等の溶出により圧縮強度の低下をもたらしたと思われる。

次に、表４−１１に圧縮試験を行ったキトサン含有硬化体ＣＰＣの条件を、図４−１０に硬化体ＣＰＣ１０およびＣＰＣ６の１日および７日浸漬における圧縮強度を示す。
表４−１１中、硬化液のLiquidＣ２は、水１ｍＬ、０．１Ｍ−ＨＣｌ ９ｍＬ、ポリオール０．５６ｇおよびキトサン（括弧内のｇ数）を含む。

粒径が異なるセメント粉による圧縮強度に変化は見られなかった。キトサン含有量はアルギン酸含量より低く、強度向上が低いと思われる。浸漬７日後はやや強度が低下し、１ヶ月浸漬したＣＰＣ６では８．９３５±１．５６３ＭＰａまで低下した。

（３）粉末Ｘ線回折による結晶相の分析
１日および７日浸漬した硬化体ＣＰＣ４の回折図形を図４−１１に示す。
どちらの回折図形でもＨＡｐのピークが確認できるが、セメント粉の一つであるＴＴＣＰのピークも観察された。ＴＴＣＰとＤＣＰＡの溶解度に差があるためと考えられる。

ＴＴＣＰの粒径をさらに小さくし、表面積を増加させ溶解速度を高めた硬化体ＣＰＣ２の浸漬時間ごとの回折図形を図４−１２に示す。
ＨＡｐの（３００）面および（２２１）面のピークと比較すると、ＴＴＣＰの（０４０）面および（０３２）面ピークが小さくなっている。また、１ヶ月浸漬するとＴＴＣＰのピークがほとんど消失し、水和硬化反応が完了したと考えられる。１ヶ月浸漬後のＣＰＣ２の強度が低下していたことから、アルギン酸等の溶出のためと思われる。

１日および７日浸漬した硬化体ＣＰＣ９の回折図形を図４−１３に示す。
粒径を小さくしたＴＴＣＰ（２．０）を用いたＣＰＣ９では、ＴＴＣＰのピークは見られず、ＨＡｐのピークのみが観察できた。しかし、上記のように圧縮強度が低下した。ＴＴＣＰ（２．０）の回折図形では、ピーク分離がやや明確でなく、アモルファスリン酸カルシウムの存在が示唆される。粒度が小さくなることでＴＴＣＰも反応したが、アモルファスリン酸カルシウムが生成したため、その分、水和硬化に寄与するＴＴＣＰが減少し、強度低下につながったと考えられる。

次に、キトサンを含有するＣＰＣ１０とＣＰＣ６の浸漬時間ごとの回折図形をそれぞれ図４−１４および図４−１５に示す。
強度の低下はなかったが、ＴＴＣＰが消失し、水和硬化反応が完了したと考えられる。
図４−１６は、本発明の基準となる化合物、ＴＴＣＰ、ＤＣＰＤ、ＤＣＰＡおよびＨＡｐの回折線図（それぞれＩＣＤＤ ＰＤＦ Ｎｏ．２５−１１３７、Ｎｏ．１１−０２９３、Ｎｏ．０９−００８０およびＮｏ．７４−０５６６）である。

（４）押出力
表４−１２に押出力測定を行った硬化体ＣＰＣの組み合わせと結果を示す。
硬化体ＣＰＣ２およびＣＰＣ６のそれぞれ押出力は、それぞれ１６９．５２ｋＰａおよび７７．０５ｋＰａであった。ＣＰＣ２のＰ／Ｌ比（粉液比）に応じて押出力が大きくなった。何れも片手で押出すことができる程度である。キトサンは、アルギン酸に比べて硬化液の含有量が少なく小さい値となった。ＣＰＣ６はＰ／Ｌ比を２．６〜２．８程度に上げられると思われる。
表４−１２中、硬化液のLiquidＡ２は、水１０ｍＬ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．２ｇ、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０．１ｇおよびアルギン酸（括弧内のｇ数）を含み、LiquidＣ２は、水１ｍＬ、０．１Ｍ−ＨＣｌ ９ｍＬ、ポリオール０．５６ｇおよびキトサン（括弧内のｇ数）を含む。

（５）静的崩壊率
硬化体ＣＰＣ２およびＣＰＣ６の静的崩壊性試験の結果を、それぞれ表４−１３および表４−１４に示す。
ＣＰＣ２の崩壊率は２．００３±１．２５８％であり、ＣＰＣ６の０．６２９±０．３０３％よりやや高い値となった。ＣＰＣ２はＰ／Ｌ比が高く、強度は高かったが、一方、練和が部分的に不十分だったと思われる。静的崩壊率の実験の様子を図４−１７に示す。

（６）吸収性インビトロ試験
［カルシウムイオン溶出量・質量減少量］
硬化体ＣＰＣ２とＣＰＣ６を作製し、吸収性インビトロ試験を行った。ＪＩＳ Ｔ０３３０−４に準拠し、破骨細胞が作り出す環境下であるｐＨ５．５に調製した酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液中でのＣＰＣ２とＣＰＣ６のカルシウム濃度の経時変化を、それぞれ図４−１８および図４−１９に示す。
硬化体ＣＰＣ２およびＣＰＣ６の吸収性試験後の溶液１００ｍＬあたりのカルシウムイオン溶出量とＣＰＣ質量減量とその差を、表４−１５に示す。
試験前後で溶液のｐＨに変化は見られなかった。カルシウムイオン溶出量はあまり変わらないが、ＣＰＣ２の方がＣＰＣ６よりも重量減少量が大きいという結果になった。リン酸もカルシウムに伴い溶出すると思われるので、重量減少の違いは、硬化液に添加したアルギン酸とキトサンの違いによると思われる。あまりに早く多糖類が溶出すると、硬化体ＣＰＣの強度低下をもたらすと思われる。水和硬化中の多糖類は、セメント粉同士を「のり」のように合着することが望ましく、添加量の最適化により強度向上、硬化後に一定の強度を維持したままの多孔化による骨置換という理想的なＣＰＣペーストが期待される。

［吸収試験後の試料観察］
吸収性試験後の硬化体ＣＰＣ２のマイクロフォーカスＸ線ＣＴ像（３Ｄ図）を図４−２０に示す。
マトリックスと濃淡の異なる部分が多数見られる。ＣＰＣは直径６ｍｍ×深さ１２ｍｍのテフロン型の穴に充填するが、中央部に見えるのは、テフロン型への充填の不均一による気泡の可能性もある。
硬化体ＣＰＣ２およびＣＰＣ６のＦＥ−ＳＥＭを、それぞれ図４−２１および図４−２２に示す。ＣＰＣ２およびＣＰＣ６の各図の倍率は、それぞれ５０００倍および７０倍である。
アルギン酸硬化液を用いた硬化体ＣＰＣ２に比べて、キトサン硬化液を用いた硬化体ＣＰＣ６の方が多数の微細な孔が見えるようである。

以上の結果から、次のことがわかる。
（１）低分子量アルギン酸ナトリウムを用いると、中分子量アルギン酸ナトリウムに比べて硬化液に添加できる割合が１０倍になり、ＣＰＣペーストの粘性が低下すること
（２）アルギン酸を塩素量の異なる溶液に浸漬した後、粘度測定を行ったところ、浸漬した溶液の塩素量が高いほど粘度が低下し、重合度が低下すること、および破骨細胞により多孔化が促進されて体内で吸収される可能性があること
（３）リン酸二水素カリウムとリン酸水素二カリウムをアルギン酸含有硬化液に加え、初期硬化時間を測定したところ、硬化時間にはアルギン酸の量は影響しないが、リン酸塩量が多いと初期硬化時間が短縮する傾向があること
（４）セメント粉の粒径調整を行い、作製したＣＰＣの圧縮強度を測定したところ、初期強度は劣るものの水浸漬による強度低下を防ぐこと、および体内での生体骨への置換のための日数を考えると、初期強度より経時的に強度が低下しない粒径を調節したセメント粉の方が有用であると予測できること

（５）粉末Ｘ線法で硬化体の結晶相を調べたところ、硬化後もセメント粉の原料であるＴＴＣＰのピークが残存したが、これは比較的ＤＣＰＡの溶解度が高く溶け易いためと考えられること
（６）キトサン含有ＣＰＣおよびアルギン酸ナトリウム含有ＣＰＣは、後者がアルギン酸の溶出によるものと考えられる、やや高い静的崩壊率を示すものの、全体としてほとんど崩壊せず、多糖類含有でＣＰＣに非崩壊性を付与でき、特にアルギン酸含有硬化液LiquidＡ４およびキトサン含有硬化液LiquidＣ２はＣＰＣの硬化液として有用であると考えられること
（７）キトサン含有ＣＰＣおよびアルギン酸ナトリウム含有ＣＰＣは、吸収性インビトロ試験においてアルギン酸ナトリウムやキトサンの溶出に対応する重量減少が大きいものの、ＣＰＣ硬化体からのカルシウム溶出量が少ないこと
（８）マイクロＸ線ＣＴとＳＥＭの表面観察によれば、キトサン含有ＣＰＣの方がアルギン酸含有ＣＰＣよりも微細な孔が観察されること

Claims (12)

1. セメント粉としてのリン酸水素カルシウム二水和物およびリン酸四カルシウムを含む粉体と、硬化剤としての生分解性多糖類および水を含む透明な中性水溶液との組み合わせであることを特徴とする生体活性セメントペーストおよび生体活性セメントを製造するためのキット。
2. 前記セメント粉としてのリン酸水素カルシウム二水和物およびリン酸四カルシウムを含む粉体と、前記硬化剤としてのアルギン酸またはその塩および水を含む透明な中性水溶液との組み合わせである請求項１に記載のキット。
3. 前記中性水溶液中のアルギン酸またはその塩の濃度が、０．２重量％以上２０重量％以下である請求項２に記載のキット。
4. 前記セメント粉としてのリン酸水素カルシウム二水和物およびリン酸四カルシウムを含む粉体と、前記硬化剤としてのキトサン、該キトサンの可溶化成分としてのポリオールおよび水を含む透明な中性水溶液との組み合わせである請求項１に記載のキット。
5. 前記ポリオールが、β−グリセロリン酸二ナトリウムである請求項４に記載のキット。
6. 前記中性水溶液中のキトサンおよびポリオールの濃度が、それぞれ０．５重量％以上１０重量％以下および０．５重量％以上５重量％以下である請求項４または５に記載のキット。
7. 前記リン酸水素カルシウム二水和物とリン酸四カルシウムとの配合割合が、モル比で１：１である請求項１〜６のいずれか１つに記載のキット。
8. 前記粉体Ｐと中性水溶液Ｌとの配合割合Ｐ／Ｌが、重量比で１〜４である請求項１〜７のいずれか１つに記載のキット。
9. セメント粉としてのリン酸水素カルシウム二水和物およびリン酸四カルシウムを含む粉体に、前記セメント粉が硬化するために必要な量の硬化剤としての生分解性多糖類および水を含む透明な中性水溶液を添加・混和して生体活性セメントペーストを得ることを特徴とする生体活性セメントペーストの製造方法。
10. 前記セメント粉としてのリン酸水素カルシウム二水和物およびリン酸四カルシウムを含む粉体に、前記セメント粉が硬化するために必要な量の硬化剤としてのアルギン酸またはその塩および水を含む透明な中性水溶液を添加・混和して生体活性セメントペーストを得る請求項９に記載の製造方法。
11. 前記セメント粉としてのリン酸水素カルシウム二水和物およびリン酸四カルシウムを含む粉体に、前記セメント粉が硬化するために必要な量の硬化剤としてのキトサン、該キトサンの可溶化成分としてのポリオールおよび水を含む透明な中性水溶液を添加・混和して生体活性セメントペーストを得る請求項９に記載の製造方法。
12. 請求項１〜８のいずれか１つに記載の粉体と中性水溶液との混和物である生体活性セメントペースト。