JP2019201605A - 新規有機土壌 - Google Patents
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項2.更に土及び/又は有機資材を含有する、項1に記載の乾燥有機土壌。
項3.前記有機資材が、大豆かす、油かす、籾殻、魚粉、米ぬか、おから、ココナッツファイバー、ピートモス、稲ワラ、水苔、水草、おが屑、チップ、わら、落ち葉、刈草、バーク、骨粉、ペプチド、クロレラ、及び竹チップからなる群から選択される少なくとも1種の未発酵資材である、項2に記載の乾燥有機土壌。
項4.前記堆肥が、バーク堆肥、馬糞堆肥、鶏糞堆肥、牛糞堆肥、豚糞堆肥、海藻堆肥、及び生ごみ堆肥からなる群から選択される少なくとも1種の堆肥である、項1〜3のいずれか一項に記載の乾燥有機土壌。
項5.全炭素量が18,000〜35,000 mg/kg、全窒素量が1,000〜1,500 mg/kg、C/N比が16〜20、総リン量が800〜1,400 mg/kg、且つ総カリウム量が1,000〜1,500 mg/kgである、項1〜4のいずれか一項に記載の乾燥有機土壌。
項6.乾燥有機土壌の製造方法であって、
乾燥有機土壌中における、全炭素量が18,000〜35,000 mg/kg、全窒素量が1,000〜1,500 mg/kg、C/N比が16〜20、総リン量が800〜1,400 mg/kg、且つ総カリウム量が1,000〜1,500 mg/kgの範囲を満たすように、乾燥した堆肥を添加する工程
を含む、方法。
項7.項1〜5のいずれか一項に記載の乾燥有機土壌を使用することを特徴とする植物の栽培方法。
●総炭素量(TK):18,000〜35,000 mg/kg、最適値:28,000〜32,000 mg/kg
●総窒素量(TN):1,000〜1,500 mg/kg、最適値:1,700〜1,800 mg/kg
●C/N:16〜20
●総リン量(TP):800〜1,400 mg/kg、最適値:1,500〜1,600 mg/kg
●総カリウム量(TK):1,000〜1,500 mg/kg、最適値:1,700〜1,800 mg/kg
全炭素(TC)の定量
1 gの土壌を固体試料燃焼装置SSM-5000A (株式会社島津製作所、京都)の中に入れた。二酸化炭素を除去した後、土壌を900℃に加熱し、土壌中の有機物を熱により二酸化炭素として、放出させた。放出した二酸化炭素はTOC-V (株式会社島津製作所、京都)で測定し、土壌1 gあたりの全有機炭素濃度(%)を測定した。測定値を10,000倍して土壌中の全炭素量TC (mg/kg-soil)を定量した。
500 ml容試験管に土壌0.5 gと硫酸銅(II)五水和物0.5 gを加えた後、5 mLの硫酸と過酸化水素を加えた。試験管をケルダール分解装置ケルダーム(ゲルハルトジャパン株式会社、東京)に入れ、420℃で1時間加熱した。15分間放冷した後、蒸留水を加えて試験管内の溶液を希釈し、その希釈溶液をろ紙でろ過した。ろ液を蒸留水で100 mLに希釈し、全分解溶液とした。
全分解溶液中のアンモニウムイオン濃度をインドフェノール法で定量した。全分解溶液1.0 mLにフェノールニトロプルシッド溶液(表1) 400μLを加え静かに混和し、次亜塩素酸ナトリウム溶液(表2) 600μLを加え撹拌し45分間静置した。静置後、分光光度計(U-1900、株式会社日立ハイテクノロジーズ、東京)で、吸光度635 nmを測定し、アンモニア態窒素濃度を定量した。
試験管に全分解溶液1.0 mLを入れ、モリブデン酸アンモニウム-アスコルビン酸混合溶液(5 : 1)(表3及び表4) 100μL加え、撹拌後、30℃で30分間静置した。その後、分光光度計U-1900 (株式会社日立ハイテクノロジーズ、東京)で吸光度710 nmを測定し、水溶性リン酸の定量を行った。
全分解溶液を適宜希釈し、原子吸光光度計(Z-2300、株式会社日立ハイテクノロジーズ、東京)を用いて測定した。測定条件は、表5の様に、燃料ガスとしてアセチレンを、助燃ガスとして空気を用い、圧力はともに0.5 MPaで測定した。
サンプル1 gを50 mL遠心管へ測り取り、DNA抽出緩衝液(表6) 8.0 mL及び20%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)溶液1.0 mLを加えた。撹拌機に遠心管をセットし、攪拌(1,500 rpm, 20 min, 室温)した。遠心管からサンプル混合液1.5 mLを2.0 mLチューブに分取し、遠心分離機(KUBOTA 3700、久保田商事株式会社、東京)で遠心分離(8,000 rpm, 20℃, 10 min)した。水層700μLを有機溶媒耐性のある1.7 mLチューブに分取し、クロロホルム・イソアミルアルコール(24:1, v/v) 700μLを加えて緩やかに攪拌した後、遠心分離(14,000 rpm, 20℃, 10 min)した。水層500μLを1.5 mLチューブに分取し、2-プロパノールを300μL加えて緩やかに攪拌した後、遠心分離(14,000 rpm, 20℃, 20 min)した。水層を除去し、70%(v/v)エタノール1.0 mLを加え、遠心分離(14,000 rpm, 20℃, 5 min)した。水層を除去し、アスピレーター(AS-01, AS ONE, 大阪)で30分間減圧乾燥した。10:1 TE緩衝液(表7)を50μL加えて懸濁させ、これをeDNA抽出液とした。
蒸留水にアガロース1%(w/v)、50×TAE緩衝液2%(v/v)(表8)を加えて加熱して溶解させ、1%アガロースゲルを作製した。Smart Ladder (株式会社ニッポンジーン、富山) 1.5μL及びeDNA溶液10μLとLoading Dye (東洋紡株式会社、大阪) 2μLを混合したものを、アガロースゲルのウェルにアプライした。泳動用緩衝液には1×TAE緩衝液を用いて、電気泳動装置(Mupid-exU, Mupid-2plus, ADVANCE, 東京)でアガロースゲル電気泳動(100 V, 30 min)を行った。アガロースゲルをエチジウムブロマイド溶液の20,000倍希釈液に15分間浸して染色し、蒸留水に5分間浸して洗浄を行った。
eDNA抽出液を適宜希釈し、表の組成(表9及び表10)と条件(表11)でPCRによる16S rRNA遺伝子の増幅を行った。ここで、化学土壌由来のeDNA抽出液はPCRの増幅効率が悪かったため、有機土壌由来のeDNA抽出液は35サイクル、化学土壌由来のeDNA抽出液は40サイクルとした。増幅後、1.5%アガロースゲルを用いて100 bp DNA Ladder H3 RTU (Gene DireX)とPCR産物を電気泳動し、増幅したDNA断片の有無と長さを確認した。
DCode System (Bio-Rad、カリフォルニア州)を用いて、PCR-DGGE分析を行った。40%アクリルアミド(表12)、尿素、ホルムアミド、50×TAE緩衝液を用いて変性剤濃度勾配27.5%〜67.5%のアクリルアミドゲル(表13)を作製した。アクリルアミドのウェルに1×TAE緩衝液を入れた後、上記16S rRNA遺伝子のPCR産物23μLとLoading Dye (東洋紡株式会社、大阪) 10μLを混合した溶液をアプライした。ゲルのゆがみや異なる泳動間でバンドの比較を行うため、ゲルの両端にはDGGE Marker II (NIPPON GENE、東京)を5μLずつアプライした。7.0 Lの1×TAE緩衝液を電気泳動用タンクに入れ、電気泳動温度制御モジュール(Bio-Rad、カリフォルニア州)を被せて水温を60℃にした。
PCR-DGGEにより検出したバンドパターンをFPQuest Software (Bio-Rad、カリフォルニア州)を用いて、細菌叢の相同性(0.0%〜100.0%)を算出した。相同性の解析には、Pearsonの相関係数を用いて算出し、値が高いほどバンドパターンが類似していることを示す。異なる泳動間のゲルは、マーカーを基準としてソフトウェア上でゲル間のずれを補正し、バンドパターンの解析を行った。
小松菜(Brassica rapa var. perviridis、タキイ種苗株式会社、京都)、クローバー(Trifolium repens、タキイ種苗株式会社、京都)、及びシュンギク(Glebionis coronaria、タキイ種苗株式会社、京都)の栽培は、土壌2 kgをワグネルポットに入れ、苗5株を定植した。実験は、3連で行い、計15株を栽培した。なお、苗は播種後10日生育させたものを用いた。定植後、植物育成室(明条件 : 16 h、22℃ 暗条件 : 8 h、18℃)で4週間生育させた。その後、背丈、湿重量を測定した。水は、保水量が30%程度になるように行った。
メロン(Reticulatus Group、株式会社萩原農場、奈良)は、温室で栽培した。土壌10Lに苗を定植し、3か月栽培した。水は、保水量が30%程度になるように行った。
本発明の乾燥有機土壌の作製
有機土壌を用いた実験の再現性を得るため、5,000検体を超えるSOFIXデータベースに基づいた生物性・化学性・物理性においてバランスの取れた標準土壌の作製を行った。土壌製造は、市販の資材を乾燥させ、SOFIX (土壌肥沃度指標)分析、MQI (堆肥品質指標)分析、OQI (有機資材品質指標)分析を行い、下記に示す最適値になるように資材を混合して作製した。
●総炭素量(TC):18,000〜35,000 mg/kg、最適値:28,000〜32,000 mg/kg
●総窒素量(TN):1,000〜1,500 mg/kg、最適値:1,700〜1,800 mg/kg
●C/N:16〜20
●総リン量(TP):800〜1,400 mg/kg、最適値:1,500〜1,600 mg/kg
●総カリウム量(TK):1,000〜1,500 mg/kg、最適値:1,700〜1,800 mg/kg
作製した本発明の乾燥有機土壌を用い、小松菜を栽培した。栽培は、植物工場(22℃:12時間、18℃:12時間、湿度60%)で1か月間栽培した。実験は、ワグネルポット(1/5000 1アール)を用い、各ポットに5株定植し、3ポットで行った(合計15株)。対照区として、市販土壌(花ちゃん培養土、株式会社花ごころ、名古屋)を用いた。図1に生育の様子を示す。また、それぞれの生育結果を表14に示す。生育結果において、統計学的有意差が認められた。
有機土壌の作製は経験に基づく要因が多く、再現性に課題がある。特に、重要な微生物叢の再現性が不安定である。そこで本発明の乾燥有機土壌の微生物安定性を調べるため、菌叢を解析した。具体的には、7ロットの化学土壌と本発明の乾燥有機土壌を作製した。各土壌のベース土壌は同じものを用い、肥料成分だけが異なるように調製した。土壌作製ロットごとに、最大保水容量の30%になるように水を投入、良く撹拌し、室温で1週間放置した(水は、蒸発分を補った)。その後、PCR-DGGEの手法により、菌叢を解析した(図3及び4)。
本発明の乾燥有機土壌と化学土壌において、植物栽培による菌叢の変化について解析した。植物は、小松菜、クローバー、及びシュンギクを用いた。各2週間及び4週間栽培後の菌叢解析を行った(図5及び6)。
Claims (7)
- 堆肥を含有する乾燥有機土壌。
- 更に土及び/又は有機資材を含有する、請求項1に記載の乾燥有機土壌。
- 前記有機資材が、大豆かす、油かす、籾殻、魚粉、米ぬか、おから、ココナッツファイバー、ピートモス、稲ワラ、水苔、水草、おが屑、チップ、わら、落ち葉、刈草、バーク、骨粉、ペプチド、クロレラ、及び竹チップからなる群から選択される少なくとも1種の未発酵資材である、請求項2に記載の乾燥有機土壌。
- 前記堆肥が、バーク堆肥、馬糞堆肥、鶏糞堆肥、牛糞堆肥、豚糞堆肥、海藻堆肥、及び生ごみ堆肥からなる群から選択される少なくとも1種の堆肥である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の乾燥有機土壌。
- 全炭素量が18,000〜35,000 mg/kg、全窒素量が1,000〜1,500 mg/kg、C/N比が16〜20、総リン量が800〜1,400 mg/kg、且つ総カリウム量が1,000〜1,500 mg/kgである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の乾燥有機土壌。
- 乾燥有機土壌の製造方法であって、
乾燥有機土壌中における、全炭素量が18,000〜35,000 mg/kg、全窒素量が1,000〜1,500 mg/kg、C/N比が16〜20、総リン量が800〜1,400 mg/kg、且つ総カリウム量が1,000〜1,500 mg/kgの範囲を満たすように、乾燥した堆肥を添加する工程を含む、方法。 - 請求項1〜5のいずれか一項に記載の乾燥有機土壌を使用することを特徴とする植物の栽培方法。
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