JP2019168355A - Pretreatment agent, pretreatment kit, antigen test kit, and antigen test method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、前処理剤、前処理キット、抗原検査キット及び抗原検査方法に関する。 The present invention relates to a pretreatment agent, a pretreatment kit, an antigen test kit, and an antigen test method.
従来より結核の検査においては、被験者から採取した喀痰をスライドガラスに塗抹し、染色した後に顕微鏡で観察して結核菌が属する抗酸菌が存在するかどうかを確認する塗抹検査が広く行われている。しかし、この方法では抗酸菌の存在が確認できてもそれが結核菌であるか否かの判別ができない。また、塗抹検査で安定的で正確な結果を得るためには、スライドガラスへの喀痰の塗抹や染色を行うための技術の習得が必要である。そこで、喀痰中の結核菌が存在するかどうかを直接的に判別することができ、かつ検査者の技術の習熟度に左右されずに検査結果が得られる方法として、免疫学的手法であるイムノクロマト法によって結核菌群に特異的な抗原であるＭＰＴ６４を検出する方法が検討されている（例えば、特許文献１及び特許文献２参照）。 Conventionally, in tuberculosis testing, smears collected from test subjects are smeared on a glass slide, stained, and then observed under a microscope to check for the presence of mycobacteria to which tuberculosis belongs. Yes. However, even if the presence of acid-fast bacteria can be confirmed by this method, it cannot be determined whether or not it is tuberculosis. In addition, in order to obtain a stable and accurate result in the smear inspection, it is necessary to acquire a technique for smearing and staining the wrinkles on the slide glass. Therefore, immunochromatography, an immunological technique, can be used to directly determine whether tuberculosis bacteria in sputum are present and to obtain test results regardless of the skill level of the examiner. A method for detecting MPT64, which is an antigen specific to the Mycobacterium tuberculosis group, has been studied (for example, see Patent Document 1 and Patent Document 2).
イムノクロマト法によって抗原を検出する方法では、試験片に喀痰を浸透させ、抗体が固定化されている検出ラインまで十分量を展開する必要がある。しかしながら、喀痰は粘性が高くそのままでは展開することができないため、ＮＡＬＣ（Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン）等のチオール基を有する化合物を添加して粘性を低下させるための前処理が行われている。しかしながら、チオール基を有する化合物を添加した検体は、充分な検出感度が得られない場合がある。 In the method of detecting an antigen by immunochromatography, it is necessary to allow a sputum to penetrate the test piece and to develop a sufficient amount to the detection line where the antibody is immobilized. However, since soot has a high viscosity and cannot be developed as it is, a pretreatment for reducing the viscosity by adding a compound having a thiol group such as NALC (N-acetyl-L-cysteine) is performed. . However, a sample to which a compound having a thiol group is added may not have sufficient detection sensitivity.
本発明は上記事情に鑑み、抗原の検出感度に優れる検体の前処理剤、前処理キット及び抗原検査キットを提供することを課題とする。本発明はまた、抗原の検出感度に優れる抗原検査方法を提供することを課題とする。 In view of the above circumstances, an object of the present invention is to provide a specimen pretreatment agent, a pretreatment kit, and an antigen test kit that are excellent in antigen detection sensitivity. Another object of the present invention is to provide an antigen testing method that is excellent in antigen detection sensitivity.
上記課題を解決するための手段には、以下の実施態様が含まれる。
＜１＞チオール基のアルキル化剤を含み、免疫学的手法による検査においてチオール基を有する化合物を添加した検体の前処理に用いられる、前処理剤。
＜２＞前記アルキル化剤が、ハロカルボン酸、ハロカルボン酸の誘導体及び活性二重結合を有する化合物からなる群より選択される少なくとも１種を含む、＜１＞に記載の前処理剤。
＜３＞前記ハロカルボン酸又は前記ハロカルボン酸の誘導体がモノハロ酢酸又はモノハロ酢酸アミドである、＜２＞に記載の前処理剤。
＜４＞前記モノハロ酢酸又は前記モノハロ酢酸アミドがヨード酢酸ナトリウム又はヨードアセトアミドである、＜３＞に記載の前処理剤。
＜５＞前記活性二重結合を有する化合物がマレイミド化合物である、＜２＞に記載の前処理剤。
＜６＞前記マレイミド化合物がＮ−メチルマレイミド及びＮ−エチルマレイミドの少なくともいずれかである、＜５＞に記載の前処理剤。
＜７＞前記チオール基を有する化合物がＮ−アセチル−Ｌ−システインを含む、＜１＞〜＜６＞のいずれか１項に記載の前処理剤。
＜８＞前記免疫学的手法がイムノクロマト法である、＜１＞〜＜７＞のいずれか１項に記載の前処理剤。
＜９＞前記検査が結核菌に特異的な抗原の有無の検査である、＜１＞〜＜８＞のいずれか１項に記載の前処理剤。
＜１０＞前記抗原がＭＰＴ６４である、＜９＞に記載の前処理剤。
＜１１＞＜１＞〜＜１０＞のいずれか１項に記載の前処理剤と、チオール基を有する化合物と、を備える前処理キット。
＜１２＞＜１＞〜＜１０＞のいずれか１項に記載の前処理剤又は＜１１＞に記載の前処理キットと、抗原検査デバイスと、を備える抗原検査キット。
＜１３＞検体にチオール基を有する化合物を添加する工程と、前記チオール基を有する化合物を添加した前記検体に＜１＞〜＜１０＞のいずれか１項に記載の前処理剤を添加する工程と、前記前処理剤を添加した前記検体が抗原を含むか否かを免疫学的手法で検査する工程と、を備える抗原検査方法。
Means for solving the above problems include the following embodiments.
<1> A pretreatment agent comprising a thiol group alkylating agent and used for pretreatment of a specimen to which a compound having a thiol group is added in an immunological technique.
<2> The pretreatment agent according to <1>, wherein the alkylating agent includes at least one selected from the group consisting of a halocarboxylic acid, a derivative of a halocarboxylic acid, and a compound having an active double bond.
<3> The pretreatment agent according to <2>, wherein the halocarboxylic acid or the derivative of the halocarboxylic acid is monohaloacetic acid or monohaloacetic acid amide.
<4> The pretreatment agent according to <3>, wherein the monohaloacetic acid or the monohaloacetic acid amide is sodium iodoacetate or iodoacetamide.
<5> The pretreatment agent according to <2>, wherein the compound having an active double bond is a maleimide compound.
<6> The pretreatment agent according to <5>, wherein the maleimide compound is at least one of N-methylmaleimide and N-ethylmaleimide.
<7> The pretreatment agent according to any one of <1> to <6>, wherein the compound having a thiol group includes N-acetyl-L-cysteine.
<8> The pretreatment agent according to any one of <1> to <7>, wherein the immunological technique is an immunochromatography method.
<9> The pretreatment agent according to any one of <1> to <8>, wherein the test is a test for the presence or absence of an antigen specific for Mycobacterium tuberculosis.
<10> The pretreatment agent according to <9>, wherein the antigen is MPT64.
<11> A pretreatment kit comprising the pretreatment agent according to any one of <1> to <10> and a compound having a thiol group.
<12> An antigen test kit comprising the pretreatment agent according to any one of <1> to <10> or the pretreatment kit according to <11> and an antigen test device.
<13> A step of adding a compound having a thiol group to the specimen, and a step of adding the pretreatment agent according to any one of <1> to <10> to the specimen to which the compound having the thiol group is added. And an immunological method for examining whether or not the specimen to which the pretreatment agent has been added contains an antigen.
本発明によれば、抗原の検出感度に優れる検体の前処理剤、前処理キット及び抗原検査キットが提供される。また本発明によれば、抗原の検出感度に優れる抗原検査方法が提供される。 According to the present invention, a sample pretreatment agent, a pretreatment kit and an antigen test kit excellent in antigen detection sensitivity are provided. In addition, according to the present invention, an antigen test method excellent in antigen detection sensitivity is provided.
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の目的が達成されれば、本用語に含まれる。また本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。 Hereinafter, embodiments for carrying out the present invention will be described in detail. In this specification, the term “process” is not limited to an independent process, and is included in this term if the purpose of the process is achieved even when it cannot be clearly distinguished from other processes. In the present specification, a numerical range indicated by using “to” indicates a range including the numerical values described before and after “to” as the minimum value and the maximum value, respectively.
＜前処理剤＞
本開示の前処理剤は、チオール基のアルキル化剤を含み、免疫学的手法による検査においてチオール基を有する化合物（以下、チオール化合物とも称する）を添加した検体の前処理に用いられる、前処理剤である。
<Pretreatment agent>
The pretreatment agent of the present disclosure includes a thiol group alkylating agent, and is used for pretreatment of a specimen to which a compound having a thiol group (hereinafter also referred to as a thiol compound) is added in an examination by an immunological technique. It is an agent.
本発明者らの検討の結果、上記前処理剤を含む検体は、上記前処理剤を含まない検体に比べ、検体中の抗原の有無を検査する際の検出精度に優れていることがわかった。その理由は、例えば、以下のように考えることができる。 As a result of the study by the present inventors, it was found that the specimen containing the pretreatment agent was superior in detection accuracy when examining the presence or absence of the antigen in the specimen as compared with the specimen not containing the pretreatment agent. . The reason can be considered as follows, for example.
ＮＡＬＣ等のチオール化合物を喀痰等の粘稠性の検体に添加すると、粘稠性の原因であるタンパク質分子間のジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）とチオール化合物のチオール基との交換反応が生じ、タンパク質分子間のジスルフィド結合が切断されて、粘性が低下する。しかしながら一方で、チオール化合物は検体の抗原抗体反応（酵素標識抗体を使用している場合は抗体抗原反応）及び酵素反応を阻害するように作用する。この阻害作用は、検体中に未反応のまま残存したり、チオール化合物とジスルフィド結合との反応過程で新たに生じたチオール基が原因となって起きると考えられ、検出感度が低下する要因となっている。 When a thiol compound such as NALC is added to a viscous specimen such as sputum, an exchange reaction occurs between the disulfide bond (-SS-) between protein molecules that is the cause of the viscosity and the thiol group of the thiol compound. , The disulfide bond between protein molecules is broken, and the viscosity decreases. However, on the other hand, the thiol compound acts to inhibit the antigen-antibody reaction (antibody antigen reaction when an enzyme-labeled antibody is used) and the enzyme reaction. This inhibitory action is considered to be caused by unreacted residues in the sample or a new thiol group generated in the reaction process between the thiol compound and the disulfide bond, which decreases the detection sensitivity. ing.
ここで、チオール化合物を添加した検体にチオール基のアルキル化剤を含む前処理剤を添加すると、チオール基のアルキル化剤により検体中のチオール基のアルキル化が生じて検体中のチオール基量が減少する。その結果、チオール基に起因する検出感度の低下が抑制され、良好な検出感度が維持されると考えられる。 Here, when a pretreatment agent containing a thiol group alkylating agent is added to a sample to which a thiol compound is added, the thiol group alkylating agent causes alkylation of the thiol group in the sample, and the amount of thiol groups in the sample is reduced. Decrease. As a result, it is considered that a decrease in detection sensitivity due to the thiol group is suppressed and good detection sensitivity is maintained.
チオール化合物を添加した検体中のチオール基量を減少させる方法としては、検体をバッファで希釈してチオール基の濃度を下げる方法も考えられるが、この場合は検出対象である抗原の濃度もあわせて低下するため、充分な検出感度が得られないおそれがある。本開示の前処理剤によれば、抗原の濃度を低下させずに検出感度の低下を抑制でき、良好な検出感度を維持することができる。 As a method of reducing the amount of thiol groups in a sample to which a thiol compound is added, a method of lowering the concentration of thiol groups by diluting the sample with a buffer is also conceivable. As a result, the detection sensitivity may not be sufficient. According to the pretreatment agent of the present disclosure, it is possible to suppress a decrease in detection sensitivity without decreasing the concentration of the antigen, and maintain a good detection sensitivity.
また、本発明者らの検討の結果、上記前処理剤をチオール化合物を添加した検体に添加しても、チオール化合物により低下した検体の粘性は変化しないことがわかった。その理由は、例えば、以下のように考えることができる。 Further, as a result of the study by the present inventors, it was found that even when the pretreatment agent was added to the specimen to which the thiol compound was added, the viscosity of the specimen lowered by the thiol compound did not change. The reason can be considered as follows, for example.
チオール化合物を粘性のある検体に添加すると、上述のように粘性が低下する。ここにチオール基のアルキル化剤を添加すると、検体中に未反応のまま残存したり、チオール化合物とジスルフィド結合との反応過程で新たに生じたチオール基とアルキル化剤とが結合（アルキル化）する。しかしそれによって、タンパク質分子間のジスルフィド結合やその他の高次構造は生じず、粘性は低い状態に維持されると考えられる。 When a thiol compound is added to a viscous specimen, the viscosity decreases as described above. If an alkylating agent for thiol groups is added here, it will remain unreacted in the sample, or a newly generated thiol group and alkylating agent will be bonded (alkylation) during the reaction between the thiol compound and disulfide bond. To do. However, this does not cause disulfide bonds or other higher-order structures between protein molecules, and the viscosity is considered to be kept low.
さらに、前処理剤を添加することで、チオール化合物との反応により切断されたタンパク質分子間のジスルフィド結合が酸化により再度形成され、粘性が回復するのを抑制する効果も期待できる。 Furthermore, by adding a pretreatment agent, it can be expected that disulfide bonds between protein molecules cleaved by reaction with a thiol compound are re-formed by oxidation and the viscosity is restored.
本開示においてチオール基のアルキル化剤とは、チオール基と反応してチオール基のアルキル化を生じる化合物を意味する。前処理剤に含まれるチオール基のアルキル化剤の種類は、特に制限されない。また、前処理剤に含まれるチオール基のアルキル化剤は、１種でも２種以上であってもよい。チオール基のアルキル化剤は、ナトリウム塩等の塩の状態であってもよい。 In the present disclosure, the thiol group alkylating agent means a compound that reacts with the thiol group to cause alkylation of the thiol group. The type of the thiol group alkylating agent contained in the pretreatment agent is not particularly limited. Further, the thiol group alkylating agent contained in the pretreatment agent may be one type or two or more types. The alkylating agent for the thiol group may be in the form of a salt such as a sodium salt.
チオール基のアルキル化剤としては、チオール基にアルキル基のみを導入する化合物の他、リンカーを介してアルキル基を導入するものも含む。また、ヨード酢酸、α−ヨードプロピオン酸等のように、チオール基に−ＣｎＨ２ｎ−を導入するものも含む。 Examples of the alkylating agent for the thiol group include compounds that introduce only an alkyl group into the thiol group and those that introduce an alkyl group via a linker. Further, iodoacetic acid, as such α- iodopropionic acid, -C n H 2n to a thiol group - including those which introduce.
チオール化合物のアルキル化剤の中でも、ハロカルボン酸、ハロカルボン酸の誘導体、及び活性二重結合を有する化合物が好ましい。 Among alkylating agents for thiol compounds, halocarboxylic acids, halocarboxylic acid derivatives, and compounds having active double bonds are preferred.
ハロカルボン酸は、ハロゲン原子を含有するカルボン酸化合物であれば特に制限されない。ハロカルボン酸の誘導体としては、例えば、ハロカルボン酸のアミド化合物が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えば、ヨウ素、臭素、塩素が挙げられる。 The halocarboxylic acid is not particularly limited as long as it is a carboxylic acid compound containing a halogen atom. Examples of halocarboxylic acid derivatives include amide compounds of halocarboxylic acids. Examples of the halogen atom include iodine, bromine, and chlorine.
ハロカルボン酸としては、ハロゲン原子を１個含有するカルボン酸化合物（モノハロカルボン酸）が挙げられる。具体的には、例えば、ヨード酢酸、ブロモ酢酸、クロロ酢酸等のモノハロ酢酸（ハロゲン原子を１個含有する酢酸化合物）、α−ヨードプロピオン酸、α−ブロモプロピオン酸、α−クロロプロピオン酸等のモノハロプロピオン酸（ハロゲン原子を１個含有するプロピオン酸化合物）などが挙げられる。ハロカルボン酸の誘導体としては、例えば、ヨードアセトアミド、ブロモアセトアミド、クロロアセトアミド等のモノハロカルボン酸のアミド化合物が挙げられる。 Examples of the halocarboxylic acid include carboxylic acid compounds containing one halogen atom (monohalocarboxylic acid). Specifically, for example, monohaloacetic acid (acetic acid compound containing one halogen atom) such as iodoacetic acid, bromoacetic acid, chloroacetic acid, α-iodopropionic acid, α-bromopropionic acid, α-chloropropionic acid, etc. And monohalopropionic acid (propionic acid compound containing one halogen atom). Examples of the halocarboxylic acid derivatives include amide compounds of monohalocarboxylic acids such as iodoacetamide, bromoacetamide, and chloroacetamide.
活性二重結合を有する化合物は、分極したり、あるいは容易に分極可能な二重結合を持つ化合物であれば特に制限されない。活性二重結合を有する化合物としては、例えば、Ｎ−メチルマレイミド、Ｎ−エチルマレイミド、Ｎ−フェニルマレイミド等のマレイミド化合物（マレイミド骨格を有する化合物）、アクリロニトリル、アクリルアミド、アクリル酸エチル、アクロレイン、無水マレイン酸、ビニルスルフォン、２−メチル−１，４−ナフトキノン等が挙げられる。 The compound having an active double bond is not particularly limited as long as it is a compound having a double bond that is polarized or easily polarizable. Examples of the compound having an active double bond include maleimide compounds (compounds having a maleimide skeleton) such as N-methylmaleimide, N-ethylmaleimide, and N-phenylmaleimide, acrylonitrile, acrylamide, ethyl acrylate, acrolein, and maleic anhydride. Examples include acid, vinyl sulfone, 2-methyl-1,4-naphthoquinone and the like.
ハロカルボン酸、ハロカルボン酸の誘導体、及び活性二重結合を有する化合物に該当しないチオール基のアルキル化剤としては、例えば、ヨウ化メチル、β−ヨードエチルアミン、β−ブロモエチルアミン、β−クロロエチルアミン、クロロアセトフェノン、エチレンイミン、エチレンオキシド、Ｏ−メチルイソ尿素、メチル−ｐ−ニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム、１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼン、１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン、２，４，６−トリニトロベンゼン−１−スルホン酸等が挙げられる。 Examples of alkylating agents for thiol groups not applicable to halocarboxylic acids, derivatives of halocarboxylic acids, and compounds having active double bonds include methyl iodide, β-iodoethylamine, β-bromoethylamine, β-chloroethylamine, chloro Acetophenone, ethyleneimine, ethylene oxide, O-methylisourea, sodium methyl-p-nitrobenzenesulfonate, 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene, 1-chloro-2,4-dinitrobenzene, 2,4,6-tri And nitrobenzene-1-sulfonic acid.
前処理剤は、チオール基のアルキル化剤のみからなってもよく、チオール基のアルキル化剤以外の成分を含んでいてもよい。例えば、バッファ等の溶媒、ｐＨ調整剤等を含んでいてもよい。前処理剤は、固体の状態であっても液体の状態であってもよい。 The pretreatment agent may be composed of only a thiol group alkylating agent or may contain components other than the thiol group alkylating agent. For example, a solvent such as a buffer, a pH adjusting agent, and the like may be included. The pretreatment agent may be in a solid state or a liquid state.
チオール化合物を含む検体への前処理剤の添加量は特に制限されず、検体に含まれるチオール基の量や、減少させたいチオール基の量に応じて調節できる。
具体的には、例えば、チオール基のアルキル化剤の量が検体に含まれるチオール基１モルに対して０．８モル以上となる添加量が好ましく、１モル以上となる添加量がより好ましく、１．５モル以上となる添加量がさらに好ましい。
The amount of the pretreatment agent added to the specimen containing the thiol compound is not particularly limited, and can be adjusted according to the amount of thiol groups contained in the specimen or the amount of thiol groups to be reduced.
Specifically, for example, the amount of the thiol group alkylating agent is preferably 0.8 mol or more with respect to 1 mol of the thiol group contained in the specimen, more preferably 1 mol or more. An addition amount of 1.5 mol or more is more preferable.
前処理剤を添加する対象である検体の種類は、特に制限されない。例えば、喀痰、唾液、鼻汁、胸水等の生体から採取した物質が挙げられる。生体はヒトであっても、ヒト以外の動物であってもよい。 There are no particular restrictions on the type of specimen to which the pretreatment agent is added. For example, substances collected from living organisms such as sputum, saliva, nasal discharge and pleural effusion are listed. The living body may be a human or a non-human animal.
前処理剤は、これを添加する検体中の抗原の有無を検査するために好適に用いられるが、その他の目的に用いるものであってもよい。したがって、前処理剤が添加される検体は抗原を含むものであっても抗原を含まないものであってもよい。 The pretreatment agent is suitably used for examining the presence or absence of an antigen in the specimen to which it is added, but may be used for other purposes. Therefore, the specimen to which the pretreatment agent is added may contain an antigen or may not contain an antigen.
＜前処理キット＞
本開示の前処理キットは、上述した前処理剤と、チオール化合物と、を備える。
前処理キットの具体的な構成は特に制限されない。例えば、前処理剤を収容した容器と、チオール基を有する化合物を収容した容器との組合せであってよい。この場合、前処理剤を収容した容器と、チオール基を有する化合物を収容した容器とは分離していても一体化していてもよい。
<Pretreatment kit>
The pretreatment kit of the present disclosure includes the pretreatment agent described above and a thiol compound.
The specific configuration of the pretreatment kit is not particularly limited. For example, it may be a combination of a container containing a pretreatment agent and a container containing a compound having a thiol group. In this case, the container containing the pretreatment agent and the container containing the compound having a thiol group may be separated or integrated.
ある実施態様では、前処理キットは、前処理剤を収容する収容部と、チオール化合物を収容する収容部と、をそれぞれ備え、使用時に前処理剤とチオール化合物を検体にそれぞれ添加できるような構成（前処理デバイス）であってもよい。 In one embodiment, the pretreatment kit includes a storage unit that stores the pretreatment agent and a storage unit that stores the thiol compound, and is configured to be able to add the pretreatment agent and the thiol compound to the specimen at the time of use. (Pre-processing device).
前処理キットに含まれるチオール化合物の種類は、特に制限されない。例えば、ＮＡＬＣ、システイン、２−メルカプトエタノール、メルカプトエタノールアミン、ジチオトレイトール、チオグリコール酸、アセチルシステイン、システアミン、チオグリセリン等が挙げられる。前処理キットに含まれるチオール化合物は、１種でも２種以上であってもよい。前処理キットに含まれるチオール化合物は、固体の状態であっても液体の状態であってもよい。 The kind of thiol compound contained in the pretreatment kit is not particularly limited. For example, NALC, cysteine, 2-mercaptoethanol, mercaptoethanolamine, dithiothreitol, thioglycolic acid, acetylcysteine, cysteamine, thioglycerin and the like can be mentioned. The thiol compound contained in the pretreatment kit may be one type or two or more types. The thiol compound contained in the pretreatment kit may be in a solid state or a liquid state.
＜抗原検査キット＞
本開示の抗原検査キットは、上述した前処理剤又は前処理キットと、抗原検査デバイスと、を備える。
抗原検査デバイスの具体的な構成は特に制限されないが、免疫学的手法による検査に用いるものであることが好ましい。例えば、イムノクロマト法による検査に一般的に使用される試験片であってもよく、その他の構成を有するデバイスであってもよい。
<Antigen test kit>
The antigen test kit of the present disclosure includes the above-described pretreatment agent or pretreatment kit and an antigen test device.
The specific configuration of the antigen testing device is not particularly limited, but is preferably used for testing by an immunological technique. For example, it may be a test piece generally used for an inspection by an immunochromatography method, or may be a device having another configuration.
抗原検査キットの具体的な構成は、特に制限されない。例えば、前処理剤又は前処理キットと抗原検査デバイスとが分離した状態であっても、前処理剤又は前処理キットと抗原検出デバイスとが一体化した状態であってもよい。 The specific configuration of the antigen test kit is not particularly limited. For example, the pretreatment agent or pretreatment kit and the antigen testing device may be separated, or the pretreatment agent or pretreatment kit and the antigen detection device may be integrated.
前処理剤又は前処理キットと抗原検出デバイスとが一体化した状態の具体的な構成としては、抗原検出デバイスに前処理剤が含まれた構成（例えば、試験片の一部に前処理剤が仕込まれている）が挙げられる。 As a specific configuration in which the pretreatment agent or the pretreatment kit and the antigen detection device are integrated, a configuration in which the pretreatment agent is included in the antigen detection device (for example, the pretreatment agent is included in a part of the test piece). Prepared).
＜抗原検査方法＞
本開示の抗原検査方法は、検体にチオール化合物を添加する工程と、前記チオール化合物を添加した前記検体に上述した前処理剤を添加する工程と、前記前処理剤を添加した前記検体が抗原を含むか否かを免疫学的手法で検査する工程と、を備える。
<Antigen testing method>
The antigen testing method of the present disclosure includes a step of adding a thiol compound to a specimen, a step of adding the pretreatment agent described above to the specimen to which the thiol compound is added, and the specimen to which the pretreatment agent is added And a step of examining whether or not it is included by an immunological technique.
本開示の抗原検査方法では、チオール化合物以外の検体の粘性を低下させる物質をチオール化合物と併用してもよい。このような物質としては、ＮａＯＨ等のアルカリ性物質、界面活性剤、糖、プロテアーゼ等が挙げられる。これらの中でもアルカリ性物質が好ましく、ＮａＯＨがより好ましい。 In the antigen testing method of the present disclosure, a substance other than the thiol compound that reduces the viscosity of the specimen may be used in combination with the thiol compound. Examples of such substances include alkaline substances such as NaOH, surfactants, sugars, proteases, and the like. Among these, an alkaline substance is preferable, and NaOH is more preferable.
チオール化合物を添加した検体に前処理剤を添加するときの検体の液性は特に制限されないが、チオール基との反応性の観点からは、前処理剤を添加するときの検体は中性又はアルカリ性であることが好ましく、アルカリ性（例えば、ｐＨ７〜１４）であることがより好ましい。 The liquid property of the sample when adding a pretreatment agent to a sample to which a thiol compound is added is not particularly limited, but from the viewpoint of reactivity with a thiol group, the sample when adding a pretreatment agent is neutral or alkaline. It is preferable that it is alkaline (for example, pH 7-14).
一方、抗原の検出精度の観点からは、検体が抗原を含むか否かを検査する工程を実施するときの検体は中性又は中性に近い状態（例えば、ｐＨ６〜１０）であることが好ましい。このため、前処理剤を検体に添加した後の検体がアルカリ性である場合は、検体に中和剤を添加して中和することが好ましい。中和剤の種類は特に制限されないが、ＮａＨ２ＰＯ４等の抗原抗体反応に及ぼす影響が小さい物質を用いることが好ましい。 On the other hand, from the viewpoint of detection accuracy of the antigen, it is preferable that the sample when performing the step of examining whether or not the sample contains the antigen is in a neutral or nearly neutral state (for example, pH 6 to 10). . For this reason, when the sample after adding the pretreatment agent to the sample is alkaline, it is preferable to neutralize the sample by adding a neutralizing agent. The type of the neutralizing agent is not particularly limited, but it is preferable to use a substance having a small influence on the antigen-antibody reaction such as NaH 2 PO 4 .
検体にチオール化合物を添加する工程と、チオール化合物を添加した検体に前処理剤を添加する工程とは、同時に行っても順次行ってもよいが、検出精度の観点からは検体にチオール化合物を添加する工程と、チオール化合物を添加した検体に前処理剤を添加する工程をこの順に行うことが好ましい。 The step of adding the thiol compound to the sample and the step of adding the pretreatment agent to the sample to which the thiol compound has been added may be performed simultaneously or sequentially, but from the viewpoint of detection accuracy, the thiol compound is added to the sample. And the step of adding the pretreatment agent to the sample to which the thiol compound has been added are preferably performed in this order.
検体にチオール化合物を添加する工程と、前処理剤を検体に添加する工程を実施する手法は、特に制限されない。例えば、検体にチオール化合物又は前処理剤を添加してもよく、チオール化合物又は前処理剤に検体を添加してもよい。添加はピペット、分注装置等を用いて行ってもよい。 The technique for performing the step of adding the thiol compound to the sample and the step of adding the pretreatment agent to the sample is not particularly limited. For example, a thiol compound or a pretreatment agent may be added to the specimen, and a specimen may be added to the thiol compound or the pretreatment agent. The addition may be performed using a pipette, a dispensing device or the like.
検体にチオール化合物を添加する工程と、検体に前処理剤を添加する工程では、必要に応じて撹拌、遠心分離、ろ過等の処理を実施してもよい。 In the step of adding a thiol compound to the sample and the step of adding a pretreatment agent to the sample, treatments such as stirring, centrifugation, and filtration may be performed as necessary.
前処理剤を添加した検体が抗原を含むか否かを検査するための免疫学的手法は、特に制限されない。例えば、イムノクロマト法であってもよい。イムノクロマト法による検査は、一般的に使用される試験片を用いて行ってもよく、その他の構成を有するデバイスを用いて行ってもよい。 The immunological technique for examining whether or not the specimen to which the pretreatment agent has been added contains an antigen is not particularly limited. For example, immunochromatography may be used. The inspection by the immunochromatography method may be performed using a generally used test piece, or may be performed using a device having another configuration.
一般的なイムノクロマト法では、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）等で標識された抗体（標識抗体）を仕込んだニトロセルロース膜等の試験片に検体を供給する。検体の供給は、浸漬、滴下等により行うことができる。試験片は、検出対象の抗原と反応する抗体（キャプチャー抗体）を仕込んだ部位（検出ライン）を備えている。試験片に供給した検体は、毛細管現象によって試験片内を移動する。検体が抗原を含む場合は、検体が検出ラインに達すると、抗原がキャプチャー抗体と結合して標識抗体とともに検出ラインに捕捉される。 In a general immunochromatography method, a specimen is supplied to a test piece such as a nitrocellulose membrane charged with an antibody (labeled antibody) labeled with alkaline phosphatase (ALP) or the like. The specimen can be supplied by dipping, dropping, or the like. The test piece has a site (detection line) in which an antibody (capture antibody) that reacts with the antigen to be detected is charged. The specimen supplied to the test piece moves in the test piece by capillary action. When the sample contains an antigen, when the sample reaches the detection line, the antigen binds to the capture antibody and is captured by the detection line together with the labeled antibody.
次いで、抗体の標識に用いた物質の発色基質を試験片に供給する。抗体をＡＬＰで標識した場合の発色基質としては、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルりん酸ナトリウム（ＢＣＩＰ）等）が挙げられる。検体が検出対象の抗原を含む場合は、発色基質が検出ラインに到達すると発色する。例えば、ＢＣＩＰが検出ラインに到達すると標識抗体のＡＬＰにより加水分解されて不溶化し、青色に発色する。この発色の有無により、検体が抗原を含むか否かを判別することができる。発色の有無の判別は目視で行っても、イムノクロマトリーダー等の装置を用いて行ってもよい。 Next, a coloring substrate of the substance used for labeling the antibody is supplied to the test piece. Examples of the chromogenic substrate when the antibody is labeled with ALP include sodium 5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate (BCIP). When the specimen contains the antigen to be detected, the color develops when the chromogenic substrate reaches the detection line. For example, when BCIP reaches the detection line, it is hydrolyzed and insolubilized by ALP of the labeled antibody and colored blue. Whether or not the specimen contains an antigen can be determined based on the presence or absence of the color development. The determination of the presence or absence of color development may be made visually or using an apparatus such as an immunochromatography reader.
本開示の抗原検査方法において検出対象とする抗原の種類は、特に制限されない。例えば、ＭＰＴ６４等の結核菌群に特異的な抗原を検出するものであってもよく、他の抗原を検出対象とするものであってもよい。 The type of antigen to be detected in the antigen testing method of the present disclosure is not particularly limited. For example, an antigen specific for M. tuberculosis group such as MPT64 may be detected, or another antigen may be detected.
以下、実施例を参照して本開示の実施態様をさらに具体的に説明する。ただし、本開示はこれらの実施例に制限されない。 Hereinafter, embodiments of the present disclosure will be described more specifically with reference to examples. However, the present disclosure is not limited to these examples.
＜比較例１＞
抗酸菌が含まれていないことを確認した健常人の喀痰に、ＭＰＴ６４抗原（１６０ｎｇ／ｍＬ）を添加して検体を作製した。この検体（３０μＬ）に、０．５％（ｗ／ｖ）のＮＡＬＣと、５０ｍＭのクエン酸ナトリウムと、０．１Ｍ ＮａＯＨとを含む水溶液（７５μＬ）を加え、ボルテックスミキサーで数秒間混合し、５分間静置した。このときの検体のｐＨは１２であった。その後、検体にＮａＨ２ＰＯ４（１．６８Ｍ）を加えてｐＨが７．２となるように中和し、遠心分離して上清を得た。
<Comparative Example 1>
A sample was prepared by adding MPT64 antigen (160 ng / mL) to the cocoon of a healthy person who was confirmed to contain no acid-fast bacteria. To this sample (30 μL), an aqueous solution (75 μL) containing 0.5% (w / v) NALC, 50 mM sodium citrate, and 0.1 M NaOH is added, and mixed for several seconds with a vortex mixer. Let stand for a minute. The pH of the sample at this time was 12. Thereafter, NaH 2 PO 4 (1.68M) was added to the sample to neutralize it to pH 7.2, and centrifuged to obtain a supernatant.
得られた上清９０μＬに、マウス由来抗ＭＰＴ６４モノクローナル抗体のＳＨ基にＡＬＰを標識した標識抗体（１０μＬ）を加えてボルテックスミキサーで数秒混合し、１分間静置して、検体と標識抗体の混合液を得た。標識抗体は、市販のＡＬＰ標識試薬（同仁化学社製、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＳＨ）を用いて、マウス由来抗ＭＰＴ６４モノクローナル抗体のＳＨ基にＡＬＰを標識して作製した。 To 90 μL of the obtained supernatant, a labeled antibody (10 μL) labeled with ALP on the SH group of mouse-derived anti-MPT64 monoclonal antibody was added, mixed for several seconds with a vortex mixer, allowed to stand for 1 minute, and the sample and labeled antibody were mixed. A liquid was obtained. The labeled antibody was prepared by labeling ALP on the SH group of a mouse-derived anti-MPT64 monoclonal antibody using a commercially available ALP labeling reagent (Alkaline Phosphatase Labeling Kit-SH, manufactured by Dojindo).
得られた混合液の全量を９６穴プレートのウェルに加え、このウェルにイムノクロマト試験片を差し込んで１０分間静置した。１０分後、新たなウェルにＢＣＩＰ溶液を加え、混合液に浸漬したイムノクロマト試験片をこれに差し込んで１０分間静置した。ＢＣＩＰ溶液は、ＢＣＩＰ（１ｍｇ／ｍＬ）をバッファ（１００ｍＭ ＣＡＰＳＯ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ１０）に溶解して調製した。 The total amount of the obtained mixed solution was added to a well of a 96-well plate, and an immunochromatographic test piece was inserted into this well and allowed to stand for 10 minutes. After 10 minutes, a BCIP solution was added to a new well, and an immunochromatographic test piece immersed in the mixed solution was inserted into the well and allowed to stand for 10 minutes. The BCIP solution was prepared by dissolving BCIP (1 mg / mL) in a buffer (100 mM CAPSO, 1 mM MgCl2, pH 10).
その後、試験片の検出ラインの発色の度合いをイムノクロマトリーダーを用いて評価した。具体的には、イムノクロマトリーダーを用いて測定された検出ラインにおける吸光度の値が大きいほど検出ラインの発色の度合いが大きい（すなわち、抗原の検出感度が高い）と評価した。 Thereafter, the degree of color development on the detection line of the test piece was evaluated using an immunochromatographic reader. Specifically, it was evaluated that the greater the absorbance value in the detection line measured using an immunochromatography reader, the greater the degree of color development on the detection line (that is, the higher the antigen detection sensitivity).
吸光度の測定は、浜松ホトニクス社製のイムノクロマトリーダー（Ｃ１００６６−１０）を用いて実施した。具体的には、青色に発色するテストラインの吸光度を測定するため、イムノクロマト試験片に光を照射し、試験片上で反射された反射光をディテクターで検出した。試験片の検出ラインで吸光されて弱まった反射光と、検出ラインの周辺の反射光の強度をグラフ化した。検出ラインの近隣を基点にベースラインを引き、このベースラインを基に、下記式により、検出ラインにおける吸光度を計算した。下記式においてａはベースラインの反射光の強度であり、ｂは検出ラインにおける反射光の強度である。
吸光度（ＡＢＳ）＝ｌｏｇ（ａ／ｂ）
なお、１ＡＢＳは１０００ｍＡＢＳである。
The absorbance was measured using an immunochromatographic reader (C10066-10) manufactured by Hamamatsu Photonics. Specifically, in order to measure the absorbance of the test line that develops a blue color, the immunochromatographic test piece was irradiated with light, and the reflected light reflected on the test piece was detected with a detector. The reflected light that was absorbed and weakened at the detection line of the test piece and the intensity of the reflected light around the detection line were graphed. A baseline was drawn from the vicinity of the detection line as a base point, and the absorbance at the detection line was calculated from the following formula based on this baseline. In the following formula, a is the intensity of the reflected light at the baseline, and b is the intensity of the reflected light at the detection line.
Absorbance (ABS) = log (a / b)
Note that 1 ABS is 1000 mABS.
試験に用いるイムノクロマト試験片は、下記のようにして作製した。
ニトロセルロース膜（Ｉｍｍｕｎｏｐｏｒｅ ＲＰ、ＧＥヘルスケアジャパン社）を２５ｍｍ×３００ｍｍのサイズに切断した。次いで、２％（ｗ／ｖ）のスクロースを含むリン酸バッファ（ｐＨ７．４）で１．０ｍｇ／ｍＬになるように、標識抗体の作製に用いた抗体と異なるマウス由来抗ＭＰＴ６４モノクローナル抗体を希釈して、検出ライン用の抗体溶液を調製した。この抗体溶液を、ニトロセルロース膜の長辺の一端から１２ｍｍの位置に、１μＬ／ｃｍの塗布量となるように塗布して検出ラインを作製した。
The immunochromatographic test piece used for the test was prepared as follows.
A nitrocellulose membrane (Immunopore RP, GE Healthcare Japan) was cut into a size of 25 mm × 300 mm. Next, a mouse-derived anti-MPT64 monoclonal antibody different from the antibody used to produce the labeled antibody was diluted to 1.0 mg / mL with a phosphate buffer (pH 7.4) containing 2% (w / v) sucrose. Thus, an antibody solution for the detection line was prepared. This antibody solution was applied at a position of 12 mm from one end of the long side of the nitrocellulose membrane so as to have a coating amount of 1 μL / cm to prepare a detection line.
次いで、２％（ｗ／ｖ）のスクロースを含むリン酸バッファ（ｐＨ７．４）で０．５ｍｇ／ｍＬになるようにウサギ由来抗マウスポリクローナル抗体を希釈して、コントロールライン用の抗体溶液を調製した。この抗体溶液を、ニトロセルロース膜の長辺の一端から１６ｍｍの位置に、１μＬ／ｃｍの塗布量となるように塗布して検出ラインを作製した。４０℃で２０分間乾燥させた後、ニトロセルロース膜をブロッキング試薬でブロッキングした。 Next, dilute the rabbit-derived anti-mouse polyclonal antibody to 0.5 mg / mL with phosphate buffer (pH 7.4) containing 2% (w / v) sucrose to prepare an antibody solution for the control line. did. This antibody solution was applied at a position of 16 mm from one end of the long side of the nitrocellulose membrane so as to have a coating amount of 1 μL / cm to prepare a detection line. After drying at 40 ° C. for 20 minutes, the nitrocellulose membrane was blocked with a blocking reagent.
片面に両面テープが貼り付けられたプラスチック製シートを５０ｍｍ×３００ｍｍのサイズに裁断した。同様に、ガラス繊維及びコットン混合のろ紙からなる吸収パッドを２９ｍｍ×３００ｍｍのサイズに切断した。プラスチック製シートの長辺側の一端と、上記で得たニトロセルロース膜の長辺側の一端とが合致するように、プラスチック製シートにニトロセルロース膜を両面テープで貼り付けた。次いで、プラスチック製シートの長辺側の他の一端と、吸収パッドの長辺側の一端とが合致するように、プラスチック製シートに吸収パッドを両面テープで貼り付けた。その後、裁断機で幅が４ｍｍとなるように裁断し、イムノクロマト試験片とした。 A plastic sheet with a double-sided tape affixed on one side was cut into a size of 50 mm × 300 mm. Similarly, an absorbent pad made of filter paper mixed with glass fiber and cotton was cut into a size of 29 mm × 300 mm. The nitrocellulose film was affixed to the plastic sheet with a double-sided tape so that one end on the long side of the plastic sheet matched with one end on the long side of the nitrocellulose film obtained above. Next, the absorbent pad was affixed to the plastic sheet with a double-sided tape so that the other end on the long side of the plastic sheet and the one end on the long side of the absorbent pad matched. Then, it cut | judged so that a width | variety might be set to 4 mm with a cutting machine, and it was set as the immunochromatography test piece.
＜実施例１＞
比較例１において、ＮＡＬＣを添加して５分間静置した後の検体にヨード酢酸ナトリウム（ナカライテスク株式会社）０．５１ｍｇを加えてさらに５分間静置したこと以外は比較例１と同様にして得た上清を用いてイムノクロマト試験を行った。
<Example 1>
Comparative Example 1 was the same as Comparative Example 1 except that 0.51 mg of sodium iodoacetate (Nacalai Tesque) was added to the sample after adding NALC and allowed to stand for 5 minutes, and then allowed to stand for another 5 minutes. An immunochromatographic test was performed using the obtained supernatant.
＜実施例２＞
比較例１において、ＮＡＬＣを添加して５分間静置した後の検体にヨードアセトアミド（和光純薬工業株式会社）０．４５ｍｇを加えてさらに５分間静置したこと以外は比較例１と同様にして得た上清を用いてイムノクロマト試験を行った。
<Example 2>
Comparative Example 1 was the same as Comparative Example 1 except that 0.45 mg of iodoacetamide (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to the sample after adding NALC and allowed to stand for 5 minutes and then allowed to stand for another 5 minutes. The immunochromatography test was performed using the supernatant obtained in this manner.
＜実施例３＞
比較例１において、ＮＡＬＣを添加して５分間静置した後の検体にＮ−メチルマレイミド（東京化成工業株式会社）０．５３ｍｇを加えてさらに５分間静置したこと以外は比較例１と同様にして得た上清を用いてイムノクロマト試験を行った。
<Example 3>
Comparative Example 1 was the same as Comparative Example 1 except that 0.53 mg of N-methylmaleimide (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) was added to the sample after adding NALC and allowed to stand for 5 minutes, and then allowed to stand for another 5 minutes. An immunochromatographic test was performed using the supernatant obtained in this manner.
＜実施例４＞
比較例１において、ＮＡＬＣを添加して５分間静置した後の検体にＮ−エチルマレイミド（東京化成工業株式会社）０．６ｍｇを加えてさらに５分間静置したこと以外は比較例１と同様にして得た上清を用いてイムノクロマト試験を行った。結果を図１に示す。
<Example 4>
Comparative Example 1 was the same as Comparative Example 1 except that 0.6 mg of N-ethylmaleimide (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) was added to the sample after adding NALC and allowed to stand for 5 minutes, and then allowed to stand for another 5 minutes. An immunochromatographic test was performed using the supernatant obtained in this manner. The results are shown in FIG.
図１に示すように、実施例１〜４は比較例１に比べて検出ラインにおける吸光度の値が大きく、発色の度合いが大きかった。このことから、チオール基のアルキル化剤を添加した検体は、チオール基のアルキル化剤を添加していない検体に比べて抗原の検出感度に優れていることがわかった。
また、実施例１〜４のいずれにおいてもＮＡＬＣの添加により低下した検体の粘性は再び上昇せず、比較例１と同程度の十分量の検体を検出ラインまで展開することができた。
As shown in FIG. 1, Examples 1 to 4 had a greater absorbance value in the detection line and a greater degree of color development than Comparative Example 1. From this, it was found that the sample to which the thiol group alkylating agent was added was superior in antigen detection sensitivity compared to the sample to which the thiol group alkylating agent was not added.
Further, in any of Examples 1 to 4, the viscosity of the specimen decreased by the addition of NALC did not rise again, and a sufficient amount of specimen comparable to that of Comparative Example 1 could be developed to the detection line.
＜比較例２＞
比較例１において、抗体のＳＨ基にＡＬＰを標識した標識抗体に替えて抗体のＮＨ２基にＡＬＰを標識したＡＬＰ標識抗体（１０μＬ）を使用したこと以外は比較例１と同様にして、検体のイムノクロマト試験を行った。ＡＬＰ標識抗体は、市販のＡＬＰ標識試薬（同仁化学社のＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２）を用いて、マウス由来抗ＭＰＴ６４モノクローナル抗体のＮＨ２基にＡＬＰを標識して作製した。
<Comparative example 2>
In the same manner as in Comparative Example 1, except that an ALP-labeled antibody (10 μL) in which ALP was labeled on the NH 2 group of the antibody was used in place of the labeled antibody in which ALP was labeled on the SH group of the antibody. An immunochromatographic test was conducted. The ALP-labeled antibody was prepared by labeling ALP on the NH 2 group of a mouse-derived anti-MPT64 monoclonal antibody using a commercially available ALP labeling reagent (Alkaline Phosphatase Labeling Kit-NH 2 manufactured by Dojindo).
＜実施例５＞
比較例２において、ＮＡＬＣを添加して５分間静置した後の検体にヨード酢酸ナトリウム（ナカライテスク株式会社）０．５１ｍｇを加えてさらに５分間静置したこと以外は比較例２と同様にして得た上清を用いてイムノクロマト試験を行った。
<Example 5>
Comparative Example 2 was the same as Comparative Example 2 except that 0.51 mg of sodium iodoacetate (Nacalai Tesque) was added to the sample after adding NALC and allowed to stand for 5 minutes, and then allowed to stand for another 5 minutes. An immunochromatographic test was performed using the obtained supernatant.
＜実施例６＞
比較例２において、ＮＡＬＣを添加して５分間静置した後の検体にヨードアセトアミド（和光純薬工業株式会社）０．４５ｍｇを加えてさらに５分間静置したこと以外は比較例２と同様にして得た上清を用いてイムノクロマト試験を行った。
<Example 6>
Comparative Example 2 was the same as Comparative Example 2 except that 0.45 mg of iodoacetamide (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to the sample after adding NALC and allowed to stand for 5 minutes, and then allowed to stand for another 5 minutes. The immunochromatography test was performed using the supernatant obtained in this manner.
＜実施例７＞
比較例２において、ＮＡＬＣを添加して５分間静置した後の検体にＮ−メチルマレイミド（東京化成工業株式会社）０．５３ｍｇを加えてさらに５分間静置したこと以外は比較例２と同様にして得た上清を用いてイムノクロマト試験を行った。
<Example 7>
Comparative Example 2 was the same as Comparative Example 2 except that 0.53 mg of N-methylmaleimide (Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.) was added to the sample after adding NALC and allowed to stand for 5 minutes, and then allowed to stand for another 5 minutes. An immunochromatographic test was performed using the supernatant obtained in this manner.
＜実施例８＞
比較例２において、ＮＡＬＣを添加して５分間静置した後の検体にＮ−エチルマレイミド（東京化成工業株式会社）０．６ｍｇを加えてさらに５分間静置したこと以外は比較例２と同様にして得た上清を用いてイムノクロマト試験を行った。結果を図２に示す。
<Example 8>
Comparative Example 2 was the same as Comparative Example 2 except that 0.6 mg of N-ethylmaleimide (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) was added to the sample after adding NALC and allowed to stand for 5 minutes, and then allowed to stand for another 5 minutes. An immunochromatographic test was performed using the supernatant obtained in this manner. The results are shown in FIG.
図２に示すように、実施例５〜８は比較例２に比べて検出ラインにおける吸光度の値が大きく、発色の度合いが大きかった。このことから、チオール基のアルキル化剤を添加した検体は、チオール基のアルキル化剤を添加していない検体に比べて抗原の検出感度に優れていることがわかった。
また、実施例５〜８のいずれにおいてもＮＡＬＣの添加により低下した検体の粘性は再び上昇せず、比較例２と同程度の十分量の検体を検出ラインまで展開することができた。
As shown in FIG. 2, Examples 5 to 8 had a greater absorbance value in the detection line and a greater degree of color development than Comparative Example 2. From this, it was found that the sample to which the thiol group alkylating agent was added was superior in antigen detection sensitivity compared to the sample to which the thiol group alkylating agent was not added.
Further, in any of Examples 5 to 8, the viscosity of the specimen lowered by the addition of NALC did not rise again, and a sufficient amount of specimen comparable to that in Comparative Example 2 could be developed to the detection line.
＜比較例３＞
抗酸菌が含まれていないことを確認した健常人の喀痰に、ＭＰＴ６４抗原（３０ｎｇ／ｍＬ）を添加して検体を作製した。この検体（４０μＬ）に、０．５％（ｗ／ｖ）のＮＡＬＣと、５０ｍＭのクエン酸ナトリウムと、０．１Ｍ ＮａＯＨとを含む水溶液（１００μＬ）を加え、ボルテックスミキサーで数秒間混合し、５分間静置した。このときの検体のｐＨは１２であった。その後、実施例９及び実施例１０の検体と体積を等しくするためにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を１６．２μＬ添加して５分間静置した。その後、検体にＮａＨ２ＰＯ４（１．６８Ｍ）を加えてｐＨが７．２となるように中和し、遠心分離して上清を得た。得られた上清９０μＬを用いて検体を４種（検体Ａ〜Ｄ）準備し、比較例１と同様にしてイムノクロマト試験を行った。結果を図３に示す。
<Comparative Example 3>
A sample was prepared by adding MPT64 antigen (30 ng / mL) to a sputum of a healthy person who was confirmed to contain no acid-fast bacteria. To this sample (40 μL), an aqueous solution (100 μL) containing 0.5% (w / v) NALC, 50 mM sodium citrate, and 0.1 M NaOH was added, and mixed for several seconds with a vortex mixer. Let stand for a minute. The pH of the sample at this time was 12. Thereafter, 16.2 μL of phosphate buffered saline (PBS) was added in order to make the volume equal to the specimens of Example 9 and Example 10, and the mixture was allowed to stand for 5 minutes. Thereafter, NaH 2 PO 4 (1.68M) was added to the sample to neutralize it to pH 7.2, and centrifuged to obtain a supernatant. Four types of samples (samples A to D) were prepared using 90 μL of the obtained supernatant, and an immunochromatographic test was performed in the same manner as in Comparative Example 1. The results are shown in FIG.
＜実施例９＞
検体にＮａＨ２ＰＯ４を加える前に、ＰＢＳに替えて、ＰＢＳに溶解したヨード酢酸ナトリウム（２００ｍＭ、ナカライテスク株式会社）を１６．２μＬ添加（チオール基１モルに対して１モル）して５分間静置したこと以外は比較例３と同様にしてイムノクロマト試験を行った。
<Example 9>
Before adding NaH 2 PO 4 to the specimen, instead of PBS, 16.2 μL of sodium iodoacetate (200 mM, Nacalai Tesque, Inc.) dissolved in PBS was added (1 mole per 1 mole of thiol group). An immunochromatographic test was conducted in the same manner as in Comparative Example 3 except that the sample was allowed to stand for minutes.
＜実施例１０＞
検体にＮａＨ２ＰＯ４を加える前に、ＰＢＳに替えて、ＰＢＳに溶解したヨード酢酸ナトリウム（４００ｍＭ、ナカライテスク株式会社）を１６．２μＬ添加（チオール基１モルに対して２モル）して５分間静置したこと以外は比較例３と同様にしてイムノクロマト試験を行った。
<Example 10>
Before adding NaH 2 PO 4 to the specimen, instead of PBS, 16.2 μL of sodium iodoacetate (400 mM, Nacalai Tesque) dissolved in PBS was added (2 moles per mole of thiol group). An immunochromatographic test was conducted in the same manner as in Comparative Example 3 except that the sample was allowed to stand for minutes.
図３に示すように、検体Ａ〜Ｄのいずれにおいても実施例９、１０は比較例３に比べて検出ラインにおける吸光度の値が大きく、発色の度合いが大きかった。このことから、チオール基のアルキル化剤を添加した検体は、チオール基のアルキル化剤を添加していない検体に比べて抗原の検出感度に優れていることがわかった。
また、検体Ａ〜Ｄのいずれにおいても実施例９、１０でＮＡＬＣの添加により低下した検体の粘性は再び上昇せず、比較例３と同程度の十分量の検体を検出ラインまで展開することができた。
As shown in FIG. 3, in any of Samples A to D, Examples 9 and 10 had a higher absorbance value in the detection line and a higher degree of color development than Comparative Example 3. From this, it was found that the sample to which the thiol group alkylating agent was added was superior in antigen detection sensitivity compared to the sample to which the thiol group alkylating agent was not added.
Further, in any of the samples A to D, the viscosity of the sample decreased by the addition of NALC in Examples 9 and 10 does not increase again, and a sufficient amount of sample similar to that in Comparative Example 3 can be developed to the detection line. did it.
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