JP4199606B2

JP4199606B2 - Sample pretreatment liquid for immunochromatography test, immunochromatography test method and immunochromatography test kit

Info

Publication number: JP4199606B2
Application number: JP2003188065A
Authority: JP
Inventors: 毅一口
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 2003-06-30
Filing date: 2003-06-30
Publication date: 2008-12-17
Anticipated expiration: 2023-06-30
Also published as: JP2005024323A

Description

【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は免疫クロマトグラフィー検査用検体の前処理液に関する。より詳しくは、鼻汁、痰及び咽頭ぬぐい液から選択される検体が混和されることにより免疫クロマトグラフィー検査ストリップ用の検査試料を調製するための検体前処理液に関する。
【０００２】
【従来の技術】
インフルエンザウイルスは、直径80〜120nmのRNAウイルスであり、外皮を有し、HA（赤血球凝集素）とNA（ノイラミニダーゼ）の２種の酵素タンパク質の突起で覆われている。HAは血球凝集性の抗原で、ヒトの細胞に吸着・侵入する際に細胞表面にあるシアル酸と結合して、ウイルス粒子が細胞内に取り込まれるときの重要な役割を果たしている。一方、NAは、ウイルス粒子が感染後期で細胞表面から離れる際にシアル酸を切断する働きを示し、感染性を獲得するのに役立っている。抗原性は、HAとNAの組合せで決まり、Ａ、Ｂ、Ｃの３型に大別される。Ａ型はさらに香港型などの亜種が知られている。Ａ型では10余年の周期で異なった亜型が登場し不連続変異大流行を起こしている。また、同じ亜型でも毎年少しずつ抗原性が変異する。このため、インフルエンザウイルスを検査する場合には、インフルエンザ抗原の変異の有無に関わらず、共通して検査可能な部位を検出することが必要である。
【０００３】
また、インフルエンザは罹患してから数日で治癒することが多いため、インフルエンザの的確な診断及び治療方法を提供するためには、迅速に検査結果が得られることが望ましい。現在では抗原検出のために組織培養を行う方法や、抗体検査として赤血球凝集阻止(HI)、補体結合試験(CF)及び間接蛍光抗体法(IFA)などの検査方法が実用化されている。
【０００４】
従来から、抗原抗体反応を簡便に利用する方法が数多く報告されている。例えば、特許文献１、２等に開示されている免疫クロマトグラフィーを利用した測定方法は、採取した検体を、目的とする抗体を含む検査器具に染み込ませるだけで、抗原の有無や量を知ることができる。この方法は、ニトロセルロースなどの多孔質膜の一端に、目的とする特定の抗原に対する特異抗体を含み、多孔質膜の中程には同様に特定の抗原のみに結合する別の特異抗体が帯状に多孔質膜に固定されているものを使用する。一端に含む特異抗体は、予め着色されており、その特異抗体が存在している多孔質膜の一端上にサンプル液を染み込ませるとサンプル液中に特異抗体と反応する抗原があれば、その抗原は特異抗体と結び付いて着色粒子を付けた状態で多孔質膜を毛細管現象によってサンプル液を染み込ませた側と反対の片端へ向かって移動する。移動の途中で帯状に固定されている別の特異抗体の個所を通過する際に、抗原は多孔質膜上の特異抗体に捕捉され、多孔質膜上に帯状の染みが現れる。このことにより目的の抗原がサンプル中に存在していること及びその量を知ることができる。
【０００５】
このような技術を応用すれば、インフルエンザの検査を迅速に行うことができ、有用である。インフルエンザの検査は、通常鼻汁、痰又は咽頭ぬぐい液を検体として行われる。上記免疫クロマトグラフィーの手法を利用できる検体は、原理上、多孔質膜中を毛細管現象によって通過できなければならない。しかし、鼻汁や咽頭ぬぐい液は、これらに存在する高粘性物質であるムチンが多孔質膜の孔を塞ぎ、またムチンは生体から剥がれ落ちた上皮付着細胞を凝集させるため、これらの物質により多孔質膜の孔が塞がれて検査を行うことができない。
【０００６】
例えば、ヒト唾液試料中のミュータンス連鎖球菌を免疫クロマトグラフィーによって同定・定量する際に、水酸化ナトリウムを含有する水溶液、酒石酸及び／又はクエン酸を含有するトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液と、非イオン性界面活性剤及び／又は両性界面活性剤とから構成され、界面活性剤が水溶液及び／又は緩衝液に予め混合されているか、又は水溶液及び緩衝液とは別になっている唾液の前処理用キットを用いることが既に開示されている（特許文献３）。しかしながら、インフルエンザの検査については全く開示されていない。
【０００７】
一方、インフルエンザの検査用試料の前処理方法として、界面活性剤、還元性物質から選ばれた少なくとも１種と有機酸もしくはその塩を含む検体前処理液による処理については特許文献４に開示されている。
【０００８】
【先行文献】
【特許文献１】
特開昭61-145459号公開公報
【特許文献２】
特開平6-160388号公開公報
【特許文献３】
特開2002-357599号公開公報
【特許文献４】
国際公開 WO 02/10744号パンフレット
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、鼻汁、痰及び咽頭ぬぐい液から選択される検体を、免疫クロマトグラフィーにより正確かつ簡便に検査を行うための免疫クロマトグラフィー検査用検体前処理液、免疫クロマトグラフィー検査方法及び免疫クロマトグラフィー検査キットを提供するものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、界面活性剤がウイルス膜を破壊する点に着目し、鋭意検討を重ねた結果、免疫クロマトグラフィーによりインフルエンザの検査を行う場合において、生体からの検体を少なくとも非イオン性界面活性剤及び0.3Ｍ以上のアルカリ金属イオンを含む前処理液で処理すると、より簡便かつ正確にインフルエンザの検査が可能となることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
即ち本発明は、以下よりなる。
１．鼻汁、痰及び咽頭ぬぐい液から選択される検体が混和されることにより免疫クロマトグラフィー検査ストリップ用の検査試料を調製するための検体前処理液であって、非イオン性界面活性剤及び少なくとも０．３Ｍのアルカリ金属イオンを含むことを特徴とする検体前処理液。
２．前記非イオン性界面活性体が、ポリオキシエチレン系界面活性剤である前項１に記載の前処理液。
３．前記ポリオキシエチレン系界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル及びポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレン共重合体から選択される前項２に記載の前処理液。
４．非イオン性界面活性剤の濃度が０．０５〜２（ｖ／ｖ）％である前項１に記載の前処理液。
５．前記検体が、ウイルス検査に用いられる検体である、前項１〜４のいずれか１に記載の前処理液。
６．前記ウイルスが、インフルエンザウイルスである、前項５に記載の前処理液。
７．５〜９のｐＨを有する前項１〜６の何れか１に記載の前処理液。
８．前記検査試料が、検体と検体処理液との混和物をろ過することにより調製される前項１〜７の何れか１に記載の前処理液。
９．鼻汁、痰及び咽頭ぬぐい液から選択される検体と、非イオン性界面活性剤及び少なくとも０．３Ｍのアルカリ金属イオンを含有する検体前処理液とを混和する工程、及び
得られた混和物を免疫クロマトグラフィー検査ストリップによって検査する工程、からなることを特徴とする、免疫クロマトグラフィー検査方法。
１０．検体と検体処理液との混和物をろ過する工程を備え、ろ過された混和物を免疫クロマトグラフィー検査ストリップによって検査する前項９に記載の免疫クロマトグラフィー検査方法。
１１．非イオン性界面活性剤及び少なくとも０．３Ｍのアルカリ金属イオンを含む検体前処理液と、免疫クロマトグラフィー検査ストリップとを備える免疫クロマトグラフィー検査キット。
１２．前記免疫クロマトグラフィー検査ストリップが、試料添加部材、標識部材、及びクロマト用膜担体を備える、前項１１に記載のキット。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明において測定の対象となるインフルエンザウイルスは、一般的に定義されているものであれば良く、特に限定されない。具体的には、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型のいずれであっても良い。また、インフルエンザウイルスに属するウイルスであれば、変異されたウイルス又は将来出現する変異ウイルスであっても良い。
【００１３】
（検体）
本発明において、測定対象物となる検体は生体から取得でき、インフルエンザウイルスを混入しうるものであれば良く特に限定されないが、好ましくは鼻汁、痰及び／又は咽頭ぬぐい液などが挙げられる。こららの検体を採取する方法は、特に限定されず、公知の方法を採用することができる。具体的には、綿棒を用いて、鼻汁、痰及び／又は咽頭ぬぐい液を採取することができる。
【００１４】
（検体前処理液）
本発明の検体前処理液に含まれる非イオン性界面活性剤は、特に限定されないが、好ましくはポリオキシエチレン系のものを使用することができより好ましくはエーテル型のものを使用することができる。具体的には、ポリオキシエチレン(9)オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン(9)ノニルフェニルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレン共重合体、ポリオキシエチレンアルキルエーテルからなる群より選ばれる一種又は二種以上の混合物が好ましく用いられる。
【００１５】
非イオン性界面活性剤は、0.05〜2(v/v)％、好ましくは0.1〜0.5(v/v)％、より好ましくは0.3(v/v)％付近の濃度で前処理液に含ませることができる。
【００１６】
本発明の検体前処理液に含まれるアルカリ金属イオンは、リチウム⁺(Li⁺)、ナトリウム⁺(Na⁺)、カリウム⁺(K⁺)、ルビジウム⁺(Rb⁺)、セシウム⁺(Cs⁺)、フランシウム⁺(Fr⁺)等が例示されるが、好ましくはナトリウム、カリウムを使用することができる。又アルカリ金属イオンは一種又は二種以上使用することができる。このようなアルカリ金属イオンを生じうる化合物は特に限定されないが、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、ＥＤＴＡナトリウム塩、アジ化ナトリウムからなる群より選ばれる一種又は二種以上の混合物を使用することができる。本発明の検体前処理液には、アルカリ金属イオンは、少なくとも0.3Ｍ含まれていることが必要であり、好ましくは0.4Ｍ、より好ましくは0.45Ｍ以上含まれてていれば良い。一方、2Ｍ以上のアルカリ金属イオンを加えると、免疫クロマトグラフィーの感度に悪影響を及ぼすおそれがある。好ましくは1.5Ｍ以下、より好ましくは1.0Ｍ以下の濃度が適用される。
【００１７】
本発明の検体前処理液には、上記非イオン性界面活性剤及びアルカリ金属イオンの他、一般的に当業者が使用しうる成分を含ませることができる。具体的には、反応に至適なpHである5〜9に保持うる緩衝液を構成する成分や、その他の適切な有機酸などを含ませることができる。検体の処理は、通常の方法に従えば良く、例えば検体前処理液0.5〜1.0mLに対して検体を0.1〜0.2mLを加え、よく振り混ぜて混和することにより行うことができる。同様に鼻汁などの検体を採取した綿棒を検体前処理液に浸し、検体前処理液と検体をよく混和することにより行うことができる。本明細書では検体を前処理液で処理したものを、便宜上「試料」という。
【００１８】
本発明に係る検体前処理液及び処理方法によって処理して得られた試料について、従来の免疫クロマトグラフィーを用いた抗原抗体反応によりインフルエンザの同定・定量等の検査が可能である。
【００１９】
（免疫クロマトグラフィー）
免疫クロマトグラフィーの手法は既に公知であるが、その原理を模式的に図１に示す。
図１の標識部材(2)に抗インフルエンザ抗体標識着色粒子を保持させ、インフルエンザウイルス検出部位(4)に抗インフルエンザ抗体を固定する。
図１の試料添加部材(1)に上記の処理した検体を試料として滴下し、クロマト膜担体(3)を介して吸収部材(5)の方向に試料を展開させる。検体中に対象とするインフルエンザウイルスが混入している場合には、インフルエンザウイルスと抗インフルエンザ抗体標識着色ラテックス粒子が反応し、これらの複合体が、抗インフルエンザ抗体を固定したインフルエンザウイルス検出部位(4)に補足され、着色のバンドが現れる。(4)に現れたバンドの色調等により、検体中に含まれるインフルエンザウイルスの量を概略的に把握することができる。
【００２０】
標識部材(2)及びインフルエンザウイルス検出部位(4)に使用する抗体は、インフルエンザの異なる部位を認識する抗体であれば良い。これらの抗体は、通常用いられる方法によって得ることができる。例えば、KohlerとMilstein（Kohler G, C. Milstein,Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature, 256:495-497. 1975）による細胞融合によるハイブリドーマの樹立法によっても良く、単に抗原を動物に免疫してその血清を精製したものであっても良い。標識部材(2)の標識着色粒子として、免疫クロマトグラフィーに使用される公知のものを使用することができる。例えば、金コロイドや着色ラテックス粒子が挙げられる。クロマト用膜担体(3)は、免疫クロマトグラフィーにおいて一般的に使用される膜であればよく、通常多孔質膜であり、具体的にはニトロセルロース膜を使用することができる。
【００２１】
（キット）
また、本発明は、上記前前処理液を含むインフルエンザ検出のための免疫クロマトグラフィー用検出キットにも及ぶものである。具体的には、前処理液、免疫クロマトグラフィー用デバイス、各種抗体等が含まれるもの等が挙げられる。
【００２２】
【実施例】
本発明の理解のために、以下に実施例を示して説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２３】
（実施例１）非イオン界面活性剤（NP40）の効果
本実施例は、検体前処理液中の各濃度の非イオン界面活性剤（NP40）のクロマト膜担体上のバックグランドに及ぼす効果を確認することを目的として行った。
【００２４】
1) 検体前処理液の組成
100mMクエン酸-0.4M NaCl、10mMジチオスレイトールを含有する溶液(pH6.0)に、ノニデットP-40(NP40)（ポリオキシエチレン(9)オクチルフェニールエーテルの商品名）の濃度が0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4及び0.8(v/v)％の各濃度となるように加え、検体前処理液とした。
【００２５】
2) 検体及びその処理
鼻汁を綿棒にて採取したもの検体とした。
綿棒に含ませた鼻汁を、上記前処理液約0.8mLを含む容器内に浸し、検体前処理液と混和したものを試料とした。その後、静置した試料液をメンブレンフィルター（孔径1μm）でろ過し、測定用試料とした。鼻汁検体は、MDCK細胞による培養法（J. Clin. Microb.28(6) 1308-1313 (1990)によりインフルエンザＡ及びＢが陽性と判定されたものを用いた。
【００２６】
3) 免疫クロマトグラフィー
免疫クロマトグラフィー用ストリップ（図１）の材料として、試料添加用部材(1)はガラス繊維ろ紙、標識保持部材(2)は、市販の抗インフルエンザ抗体を感作し、青色に着色したラテックスを保持したポリビニル処理ガラス繊維ろ紙、クロマト用膜担体(3)はニトロセルロース膜、吸収部材(5)はガラス繊維とセルロースの混合ろ紙を使用した。また検出部位(4)には、市販の抗インフルエンザ抗体を感作した。培養法によりインフルエンザ陽性と確認された検体について、通常の方法で前処理したものを免疫クロマトグラフィー用デバイスに滴下し、クロマトグラフィーを行った。
各濃度のNP40を含む検体前処理液で前処理した測定用試料液を0.20mLを免疫クロマトグラフィー用デバイスに滴下し、免疫クロマトグラフィーを20分行った。
【００２７】
その結果を表１に示した。NP40を全く含まない場合は、クロマト用膜担体が、ラテックス粒子の青色に染まった状態でバックグラウンドが不適合であるため、免疫クロマトグラフィーによるインフルエンザＡ及びＢについて判定することはできなかった。一方、NP40を0.05(v/v)％以上含む検体前処理液で処理した場合には、クロマト用膜担体が着色しておらず、バックグラウンドが良好であり、インフルエンザＡ及びＢについて容易に判定することができた。
【００２８】
【表１】

【００２９】
（実施例２）各種の非イオン界面活性剤の効果（バックグラウンド）
本実施例は、検体前処理液中の各種非イオン界面活性剤のクロマト膜担体上のバックグランドに及ぼす効果を確認することを目的として行った。
【００３０】
検体前処理液は、100mMクエン酸-0.4M NaCl、10mMジチオスレイトールを含有する溶液(pH6.0)に、表２に示す各種非イオン界面活性剤を0.1(v/v)％となるように加え、検体前処理液とした。
検体及びその処理、免疫クロマトグラフィーは実施例１と同様に行った。
【００３１】
その結果、表２に示す各種の非イオン性界面活性剤を使用するとバックグランドの発色が低減化され、正確に判定することができた。
【００３２】
【表２】

【００３３】
（実施例３）各種の非イオン界面活性剤の効果（インフルエンザ測定）
本実施例は、実施例２と同様に、検体前処理液中の各種非イオン界面活性剤の免疫クロマトグラフィーに及ぼす効果を確認することを目的として行った。
検体前処理液は、検体及びその処理、免疫クロマトグラフィー用ストリップの使用並びに免疫クロマトグラフィーは実施例２と同様に行った。
【００３４】
その結果、表３に示す各種の非イオン性界面活性剤を使用すると、すべての界面活性剤において陽性と判定された。
【００３５】
【表３】

【００３６】
（実施例４）各濃度のNaClを加えたときの効果（インフルエンザＡ及びＢ測定）本実施例は、検体前処理液中の各濃度の塩化ナトリウム(NaCl)のクロマトグラフィーに及ぼす効果を確認することを目的として行った。
【００３７】
1) 検体前処理液の組成
0.1(v/v)％NP40、100mMクエン酸、10mMジチオトレイトール及び10mM EDTAを含む液(pH6.0)に、NaCl濃度が表４に示す各濃度となるように加え、検体前処理液とした。
2) 検体及びその処理
検体は、培養法においてインフルエンザＡ及びＢ陰性と判定された３検体の鼻腔吸引液を実施例１に記載の方法で前処理した。
3) 免疫クロマトグラフィー用ストリップについては、実施例１と同様行った。
【００３８】
その結果を表４及び５に示した。NaClを全く含まない場合は陰性試料であっても陽性と判定されたが、NaClの添加により非特異反応が抑制されることが確認された。
【００３９】
【表４】

【００４０】
【表５】

【００４１】
【発明の効果】
以上詳述したように、本発明の検体前処理液によれば、鼻汁、痰及び咽頭ぬぐい液から選択される検体を、免疫クロマトグラフィーにより正確かつ簡便に検査することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】免疫クロマトグラフィー用ストリップの概略を示す図である。
【符号の説明】
１試料添加部材
２標識部材（抗インフルエンザ抗体標識着色粒子保持部）
３クロマト用膜担体
４検出部位（抗インフルエンザ抗体固定部）
５吸収部材[0001]
[Technical field to which the invention belongs]
The present invention relates to a pretreatment liquid for a sample for immunochromatography examination. More particularly, the present invention relates to a specimen pretreatment liquid for preparing a test sample for an immunochromatographic test strip by mixing a specimen selected from nasal discharge, sputum and throat swab .
[0002]
[Prior art]
Influenza virus is an RNA virus with a diameter of 80 to 120 nm, has an outer coat, and is covered with protrusions of two enzyme proteins, HA (hemagglutinin) and NA (neuraminidase). HA is a hemagglutinating antigen and plays an important role when viral particles are taken into cells by binding to sialic acid on the cell surface when adsorbing and entering human cells. On the other hand, NA shows a function of cleaving sialic acid when virus particles leave the cell surface in the late stage of infection, and helps to acquire infectivity. Antigenicity is determined by the combination of HA and NA, and is roughly classified into three types, A, B and C. Subtypes such as Hong Kong type are further known for Type A. In type A, different subtypes appear in a cycle of more than 10 years, causing a discontinuous mutation epidemic. In addition, even in the same subtype, antigenicity changes little by little every year. For this reason, when testing for influenza viruses, it is necessary to detect a site that can be tested in common regardless of the presence or absence of influenza antigen mutations.
[0003]
In addition, since influenza is often cured within a few days after being afflicted, it is desirable to obtain test results quickly in order to provide an accurate diagnosis and treatment method for influenza. At present, methods such as tissue culture for antigen detection and testing methods such as hemagglutination inhibition (HI), complement binding test (CF) and indirect fluorescent antibody method (IFA) are put into practical use as antibody tests.
[0004]
Conventionally, a number of methods for simply using an antigen-antibody reaction have been reported. For example, the measurement method using immunochromatography disclosed in

Patent Documents

1 and 2 and the like knows the presence and amount of an antigen simply by soaking a collected specimen into a test instrument containing a target antibody. Can do. This method includes a specific antibody against a specific target antigen at one end of a porous membrane such as nitrocellulose, and another specific antibody that binds only to the specific antigen is in the middle of the porous membrane. The one fixed to the porous membrane is used. The specific antibody contained at one end is pre-colored, and if there is an antigen that reacts with the specific antibody in the sample solution when the sample solution is soaked on one end of the porous membrane where the specific antibody exists, the antigen Moves to the opposite end of the porous membrane in a state where the sample solution is impregnated by capillary action in a state where the colored particles are attached to the specific antibody. When passing through the location of another specific antibody fixed in a band shape during the movement, the antigen is captured by the specific antibody on the porous membrane, and a band-like stain appears on the porous membrane. This makes it possible to know that the target antigen is present in the sample and its amount.
[0005]
If such a technique is applied, the influenza test can be performed quickly, which is useful. Influenza tests are usually performed using nasal discharge, sputum or throat swabs as specimens. In principle, a specimen that can use the immunochromatographic technique must be able to pass through the porous membrane by capillary action. However, in nasal discharge and pharyngeal wiping fluid, mucin, which is a highly viscous substance present in them, blocks pores in the porous membrane, and mucin aggregates epithelial adherent cells that have been detached from the living body. The membrane pores are blocked and inspection cannot be performed.
[0006]
For example, when identifying and quantifying Streptococcus mutans in human saliva samples by immunochromatography, an aqueous solution containing sodium hydroxide, a tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer containing tartaric acid and / or citric acid and Before saliva, which is composed of a nonionic surfactant and / or an amphoteric surfactant, and the surfactant is premixed in an aqueous solution and / or buffer solution or separate from the aqueous solution and buffer solution The use of a treatment kit has already been disclosed (Patent Document 3). However, there is no disclosure about influenza testing.
[0007]
On the other hand, as a pretreatment method for a sample for testing influenza, a treatment with a sample pretreatment liquid containing at least one selected from a surfactant and a reducing substance and an organic acid or a salt thereof is disclosed in Patent Document 4. Yes.
[0008]
[Prior literature]
[Patent Document 1]
Japanese Patent Laid-Open No. 61-145459 [Patent Document 2]
Japanese Patent Laid-Open No. 6-160388 [Patent Document 3]
JP 2002-357599 A [Patent Document 4]
International publication WO 02/10744 pamphlet [0009]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention, rhinorrhea, an analyte selected from sputum and throat swab, immunochromatography test specimen pretreatment liquid for RiTadashi performing accurately and conveniently inspected by the immunochromatography, the immunochromatography test method and An immunochromatographic test kit is provided.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors paid attention to the fact that surfactants destroy virus membranes, and as a result of intensive studies, in the case of examining influenza by immunochromatography, at least non-ionic surfactants are used for specimens from living organisms. The present inventors have found that influenza can be tested more easily and accurately when treated with an agent and a pretreatment liquid containing 0.3 M or more alkali metal ions.
[0011]
That is, this invention consists of the following.
1. A specimen pretreatment liquid for preparing a test sample for an immunochromatographic test strip by mixing a specimen selected from nasal discharge, sputum and throat swab , comprising a nonionic surfactant and at least 0. A specimen pretreatment liquid comprising 3M alkali metal ions.
2. 2. The pretreatment liquid according to item 1, wherein the nonionic surfactant is a polyoxyethylene surfactant.
3. The polyoxyethylene surfactant is selected from the group consisting of polyoxyethylene alkylphenyl ether, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester and polyoxyethylene / polyoxypropylene copolymer. Treatment liquid.
4). 2. The pretreatment liquid according to item 1, wherein the concentration of the nonionic surfactant is 0.05 to 2 (v / v)%.
5. Before dangerous body, a specimen used for virus checking, the pretreatment solution according to any one of the preceding 1-4.
6). 6. The pretreatment liquid according to item 5, wherein the virus is an influenza virus.
7). The pretreatment liquid according to any one of items 1 to 6, which has a pH of 5 to 9.
8). 8. The pretreatment liquid according to any one of items 1 to 7, wherein the test sample is prepared by filtering a mixture of a specimen and a specimen treatment liquid.
9 . Mixing a specimen selected from nasal discharge, sputum and throat swab with a specimen pretreatment liquid containing a nonionic surfactant and at least 0.3 M alkali metal ions ; and
An immunochromatographic test method comprising the step of testing the obtained mixture with an immunochromatographic test strip .
10. 10. The immunochromatography test method according to item 9, further comprising a step of filtering a mixture of the sample and the sample treatment solution, and testing the filtered mixture with an immunochromatography test strip.
11 . An immunochromatographic test kit comprising a sample pretreatment liquid containing a nonionic surfactant and at least 0.3 M alkali metal ions , and an immunochromatographic test strip .
12 . 12. The kit according to item 11 , wherein the immunochromatographic test strip includes a sample addition member, a labeling member, and a chromatographic membrane carrier.
[0012]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The influenza virus to be measured in the present invention is not particularly limited as long as it is generally defined. Specifically, any of A type, B type, and C type may be used. Moreover, as long as it belongs to influenza virus, it may be a mutated virus or a mutant virus that appears in the future.
[0013]
(Sample)
In the present invention, the sample to be measured is not particularly limited as long as it can be obtained from a living body and can be mixed with influenza virus, and preferably includes nasal discharge, sputum and / or throat swab. The method for collecting these samples is not particularly limited, and a known method can be employed. Specifically, nasal discharge, sputum and / or throat swab can be collected using a cotton swab.
[0014]
(Sample pretreatment solution)
The nonionic surfactant contained in the sample pretreatment liquid of the present invention is not particularly limited, but preferably a polyoxyethylene-based one can be used, and more preferably an ether-type one can be used. . Specifically, polyoxyethylene (9) octyl phenyl ether, polyoxyethylene (10) octyl phenyl ether, polyoxyethylene alkyl phenyl ether such as polyoxyethylene (9) nonyl phenyl ether, polyoxyethylene sorbitan monolaurate One or a mixture of two or more selected from the group consisting of polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters such as polyoxyethylene sorbitan monooleate, polyoxyethylene / polyoxypropylene copolymers, and polyoxyethylene alkyl ethers are preferably used. .
[0015]
The nonionic surfactant is included in the pretreatment liquid at a concentration of 0.05 to 2 (v / v)%, preferably 0.1 to 0.5 (v / v)%, more preferably about 0.3 (v / v)%. be able to.
[0016]
Alkali metal ions contained in the sample pretreatment liquid of the present invention are lithium ⁺ (Li ⁺ ), sodium ⁺ (Na ⁺ ), potassium ⁺ (K ⁺ ), rubidium ⁺ (Rb ⁺ ), cesium ⁺ (Cs ⁺ ), Examples include francium ⁺ (Fr ⁺ ), and sodium and potassium can be preferably used. One or more alkali metal ions can be used. The compound capable of generating such an alkali metal ion is not particularly limited, but for example, one or more kinds selected from the group consisting of sodium chloride, potassium chloride, sodium hydroxide, potassium hydroxide, EDTA sodium salt, sodium azide Mixtures can be used. The specimen pretreatment liquid of the present invention needs to contain at least 0.3M alkali metal ions, preferably 0.4M, more preferably 0.45M or more. On the other hand, when alkali metal ions of 2M or more are added, the sensitivity of immunochromatography may be adversely affected. A concentration of preferably 1.5M or less, more preferably 1.0M or less is applied.
[0017]
The specimen pretreatment liquid of the present invention may contain components that can be generally used by those skilled in the art, in addition to the nonionic surfactant and alkali metal ions. Specifically, components constituting a buffer solution that can be maintained at 5 to 9, which is the optimum pH for the reaction, and other appropriate organic acids can be included. The sample may be treated by a normal method, for example, by adding 0.1 to 0.2 mL of the sample to 0.5 to 1.0 mL of the sample pretreatment solution, and well shaken and mixed. Similarly, a cotton swab from which a sample such as nasal discharge is collected is immersed in the sample pretreatment solution, and the sample pretreatment solution and the sample are mixed well. In this specification, a sample treated with a pretreatment liquid is referred to as “sample” for convenience.
[0018]
A sample obtained by processing with the sample pretreatment liquid and the processing method according to the present invention can be tested for identification and quantification of influenza by antigen-antibody reaction using conventional immunochromatography.
[0019]
(Immunochromatography)
The technique of immunochromatography is already known, and its principle is schematically shown in FIG.
The anti-influenza antibody labeled colored particles are held on the labeling member (2) of FIG. 1, and the anti-influenza antibody is immobilized on the influenza virus detection site (4).
The treated specimen is dropped as a sample on the sample addition member (1) in FIG. 1, and the sample is developed in the direction of the absorption member (5) through the chromatographic membrane carrier (3). When the target influenza virus is mixed in the sample, the influenza virus reacts with the anti-influenza antibody-labeled colored latex particles, and these complexes are detected as the influenza virus detection site with the anti-influenza antibody immobilized (4) A colored band appears. The amount of influenza virus contained in the sample can be roughly grasped by the color tone of the band appearing in (4).
[0020]
The antibody used for the labeling member (2) and the influenza virus detection site (4) may be an antibody that recognizes a different site of influenza. These antibodies can be obtained by a commonly used method. For example, a hybridoma can be established by cell fusion using Kohler and Milstein (Kohler G, C. Milstein, Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature, 256: 495-497. 1975). The serum may be purified after immunization. As the labeled colored particles of the labeling member (2), known ones used for immunochromatography can be used. For example, gold colloid and colored latex particles can be mentioned. The chromatographic membrane carrier (3) may be any membrane that is generally used in immunochromatography, and is usually a porous membrane. Specifically, a nitrocellulose membrane can be used.
[0021]
(kit)
Further, the present invention extends to an immunochromatography detection kit for detecting influenza containing the pretreatment liquid. Specific examples include pretreatment liquids, devices for immunochromatography, various antibodies and the like.
[0022]
【Example】
In order to understand the present invention, examples will be shown and described below, but the present invention is not limited to these examples.
[0023]
Example 1 Effect of Nonionic Surfactant (NP40) In this example, the effect of each concentration of nonionic surfactant (NP40) in the sample pretreatment solution on the background on the chromatographic membrane carrier was confirmed. I went for the purpose.
[0024]
1) Composition of specimen pretreatment solution
The concentration of Nonidet P-40 (NP40) (trade name of polyoxyethylene (9) octyl phenyl ether) in a solution (pH 6.0) containing 100 mM citric acid-0.4 M NaCl and 10 mM dithiothreitol is 0, 0.05 , 0.1, 0.2, 0.4, and 0.8 (v / v)%, and the sample pretreatment solution was used.
[0025]
2) A sample and its treated nasal discharge collected with a cotton swab were used as samples.
A sample was prepared by immersing the nasal discharge contained in a cotton swab in a container containing about 0.8 mL of the pretreatment liquid and mixing it with the specimen pretreatment liquid. Then, the sample liquid which stood still was filtered with the membrane filter (pore diameter 1 micrometer), and it was set as the sample for a measurement. The nasal discharge specimen used was a culture method using MDCK cells (J. Clin. Microb. 28 (6) 1308-1313 (1990) determined to be positive for influenza A and B.
[0026]
3) Immunochromatography As the material for the strip for immunochromatography (Fig. 1), the sample addition member (1) is sensitized with a glass fiber filter paper, and the label holding member (2) is sensitized with a commercially available anti-influenza antibody and turned blue. A polyvinyl-treated glass fiber filter paper holding colored latex, a nitrocellulose membrane for the chromatographic membrane carrier (3), and a mixed filter paper of glass fiber and cellulose were used for the absorbent member (5). The detection site (4) was sensitized with a commercially available anti-influenza antibody. About the sample confirmed to be influenza positive by the culture method, the sample pretreated by the usual method was dropped onto the device for immunochromatography and chromatographed.
0.20 mL of the measurement sample solution pretreated with the sample pretreatment solution containing each concentration of NP40 was added dropwise to the device for immunochromatography, and immunochromatography was performed for 20 minutes.
[0027]
The results are shown in Table 1. When NP40 was not included at all, the chromatographic membrane carrier was stained with blue latex particles and the background was incompatible. Therefore, it was impossible to determine influenza A and B by immunochromatography. On the other hand, when the sample pretreatment liquid containing 0.05 (v / v)% or more of NP40 was treated, the chromatographic membrane carrier was not colored, the background was good, and influenza A and B were easily determined We were able to.
[0028]
[Table 1]

[0029]
(Example 2) Effects of various nonionic surfactants (background)
The purpose of this example was to confirm the effect of various nonionic surfactants in the sample pretreatment liquid on the background on the chromatographic membrane carrier.
[0030]
The sample pretreatment solution is 0.1 (v / v)% of various nonionic surfactants shown in Table 2 in a solution (pH 6.0) containing 100 mM citric acid-0.4 M NaCl and 10 mM dithiothreitol. In addition to the sample pretreatment solution.
The specimen, its treatment, and immunochromatography were performed in the same manner as in Example 1.
[0031]
As a result, when various nonionic surfactants shown in Table 2 were used, background color development was reduced and accurate determination was possible.
[0032]
[Table 2]

[0033]
(Example 3) Effects of various nonionic surfactants (influenza measurement)
This example was performed in the same manner as in Example 2 for the purpose of confirming the effects of various nonionic surfactants in the sample pretreatment liquid on immunochromatography.
The sample pretreatment liquid was the same as in Example 2 for the sample and its treatment, use of the immunochromatographic strip, and immunochromatography.
[0034]
As a result, when various nonionic surfactants shown in Table 3 were used, all the surfactants were determined to be positive.
[0035]
[Table 3]

[0036]
(Example 4) Effect of adding various concentrations of NaCl (measurement of influenza A and B) This example confirms the effect of each concentration of sodium chloride (NaCl) in the sample pretreatment solution on chromatography. I went for that purpose.
[0037]
1) Composition of specimen pretreatment solution
To a solution (pH 6.0) containing 0.1 (v / v)% NP40, 100 mM citric acid, 10 mM dithiothreitol and 10 mM EDTA so that the NaCl concentration becomes each concentration shown in Table 4, did.
2) The specimen and its treated specimen were pretreated by the method described in Example 1 with three specimens of nasal aspirate that were determined to be negative for influenza A and B in the culture method.
3) The strip for immunochromatography was carried out in the same manner as in Example 1.
[0038]
The results are shown in Tables 4 and 5. When NaCl was not contained at all, it was determined that even a negative sample was positive, but it was confirmed that nonspecific reaction was suppressed by addition of NaCl.
[0039]
[Table 4]

[0040]
[Table 5]

[0041]
【The invention's effect】
As described above in detail, according to the specimen pretreatment liquid of the present invention, rhinorrhea, an analyte selected from sputum and throat swab can be RiTadashi certainly one convenient inspection by the immunochromatography.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic view of an immunochromatographic strip.
[Explanation of symbols]
1 Sample addition member 2 Labeling member (anti-influenza antibody labeled colored particle holding part)
3 Chromatographic membrane carrier 4 Detection site (anti-influenza antibody immobilization part)
5 Absorbing member

Claims

A specimen pretreatment liquid for preparing a test sample for an immunochromatographic test strip by mixing a specimen selected from nasal discharge, sputum and throat swab , comprising a nonionic surfactant and at least 0. A specimen pretreatment liquid comprising 3M alkali metal ions.

The pretreatment liquid according to claim 1, wherein the nonionic surfactant is a polyoxyethylene surfactant.

The polyoxyethylene-based surfactant is selected from polyoxyethylene alkylphenyl ether, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, and polyoxyethylene / polyoxypropylene copolymer. Pretreatment liquid.

The pretreatment liquid according to claim 1, wherein the concentration of the nonionic surfactant is 0.05 to 2 (v / v)%.

Before dangerous body, a specimen used for virus checking, the pretreatment solution according to any one of claims 1 to 4.

The pretreatment liquid according to claim 5, wherein the virus is an influenza virus.

The pretreatment liquid according to any one of claims 1 to 6, which has a pH of 5 to 9.

The pretreatment liquid according to any one of claims 1 to 7, wherein the test sample is prepared by filtering a mixture of a specimen and a specimen treatment liquid.

Mixing a specimen selected from nasal discharge, sputum and throat swab with a specimen pretreatment liquid containing a nonionic surfactant and at least 0.3 M alkali metal ions ; and
An immunochromatographic test method comprising the step of testing the obtained mixture with an immunochromatographic test strip .

The immunochromatographic test method according to claim 9, further comprising a step of filtering a mixture of the sample and the sample treatment solution, and testing the filtered mixture with an immunochromatography test strip.

An immunochromatographic test kit comprising a sample pretreatment liquid containing a nonionic surfactant and at least 0.3 M alkali metal ions , and an immunochromatographic test strip .

12. The kit of claim 11 , wherein the immunochromatographic test strip comprises a sample addition member, a labeling member, and a chromatographic membrane carrier.