JP2019162111A - 福山型筋ジストロフィー治療用アンチセンス核酸 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
Description
[1]配列番号1で示される塩基配列の第115937位〜第115981位の範囲を標的配列とし9〜24塩基からなることを特徴とするアンチセンス核酸。
[2]配列番号6〜70から選択される塩基配列からなることを特徴とする前記[1]に記載のアンチセンス核酸。
[3]生理食塩水に50mg/mL以上溶解することを特徴とする前記[1]または[2]に記載のアンチセンス核酸。
[4]配列番号18、19、26、27、32、33、37、43、53、55、58、59、60、61、63、64、65、66、67、68、69および70から選択される塩基配列からなることを特徴とする前記[1]〜[3]のいずれかに記載のアンチセンス核酸。
[5]投与用量60mg/kgのアンチセンス核酸をマウスに投与したときに、AST値、ALT値、BUN値およびクレアチニン値のいずれにも異常値がみられないことを特徴とする前記[1]または[2]に記載のアンチセンス核酸。
[6]配列番号32、50、51、60、62、64、65、66および67から選択される塩基配列からなることを特徴とする前記[1]、[2]または[5]のいずれかに記載のアンチセンス核酸。
[7]生理食塩水に50mg/mL以上溶解し、かつ、投与用量60mg/kgのアンチセンス核酸をマウスに投与したときに、AST値、ALT値、BUN値およびクレアチニン値のいずれにも異常値がみられないことを特徴とする前記[1]または[2]に記載のアンチセンス核酸。
[8]配列番号32、60、64、65、66および67から選択される塩基配列からなることを特徴とする前記[1]、[2]または[7]のいずれかに記載のアンチセンス核酸。
[9]アンチセンス核酸の3’末端および/または5’末端が非修飾であることを特徴とする前記[1]〜[8]のいずれかに記載のアンチセンス核酸。
[10]アンチセンス核酸の3’末端および/または5’末端が修飾されていることを特徴とする前記[1]〜[8]のいずれかに記載のアンチセンス核酸。
[11]アンチセンス核酸の3’末端および/または5’末端がトリエチレングリコール(TEG)修飾、ヘキサエチレングリコール(HEG)修飾およびドデカエチレングリコール(DODEG)修飾からなる群から選択される1種または2種の修飾がされていることを特徴とする前記[10]に記載のアンチセンス核酸。
[12]オリゴデオキシリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、モルホリノオリゴマーまたはこれらのキメラオリゴヌクレオチドである前記[1]〜[11]のいずれかに記載のアンチセンス核酸。
[13]モルホリノオリゴマーである前記[12]に記載のアンチセンス核酸。
[14]ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーである前記[13]に記載のアンチセンス核酸。
[15]フクチン遺伝子におけるSVA型レトロトランスポゾンの挿入変異に起因する疾患を治療するための医薬組成物であって、前記[1]〜[14]のいずれかに記載のアンチセンス核酸の1種または2種以上を有効成分として含有することを特徴とする医薬組成物。
[16]フクチン遺伝子におけるSVA型レトロトランスポゾンの挿入変異に起因する疾患が、福山型筋ジストロフィー、成人発症の拡張型心筋症、またはWalker−Warburg症候群様の重症型先天性筋ジストロフィーである前記[15]に記載の医薬組成物。
本発明は、SVA型レトロトランスポゾンの挿入変異を有するフクチン遺伝子の転写段階において、配列番号1の第111177位のグアニンの3’側のスプライシング供与部位および第115943位のチミンの5’側のスプライシング受容部位を用いる異常スプライシングを抑制するアンチセンス核酸を提供する。
異常フクチンmRNAの塩基配列を配列番号2に、異常フクチンタンパク質のアミノ酸配列を配列番号3に、正常フクチンmRNAの塩基配列を配列番号4に、正常フクチンタンパク質のアミノ酸配列を配列番号5にそれぞれ示す。
本発明者らは、表1に示したアンチセンス核酸のうち、22種類の塩基配列からなるアンチセンス核酸は生理食塩水に対する溶解性が50mg/mL以上であることを見出した。具体的には、配列番号18、19、26、27、32、33、37、43、53、55、58、59、60、61、63、64、65、66、67、68、69および70である。したがって、本発明のアンチセンス核酸としては、配列番号18、19、26、27、32、33、37、43、53、55、58、59、60、61、63、64、65、66、67、68、69および70から選択される塩基配列からなるアンチセンス核酸が特に好ましい。
本発明者らは、表1に示したアンチセンス核酸のうち、9種類の塩基配列からなるアンチセンス核酸は非常に安全性の高い配列であることを見出した。具体的には、配列番号32、50、51、60、62、64、65、66および67である。したがって、本発明のアンチセンス核酸としては、配列番号32、50、51、60、62、64、65、66および67から選択される塩基配列からなるアンチセンス核酸が特に好ましい。
本発明は、フクチン遺伝子におけるSVA型レトロトランスポゾンの挿入変異に起因する疾患を治療するための医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、上記本発明のアンチセンス核酸の1種または2種以上を有効成分として含有する。本発明のアンチセンス核酸は、挿入変異型フクチン遺伝子(配列番号1)の第111177位のグアニンの3’側のスプライシング供与部位および第115943位のチミンの5’側のスプライシング受容部位を用いる異常スプライシングを抑制し、正常スプライシングに基づく正常フクチンmRNAの発現を回復させ、正常フクチンタンパク質の生成を回復させることにより、フクチン遺伝子におけるSVA型レトロトランスポゾンの挿入変異に起因する疾患を治療することができる。
(i)フクチン遺伝子におけるSVA型レトロトランスポゾンの挿入変異に起因する疾患の治療方法であって、当該疾患患者に対して、上記本発明のアンチセンス核酸の有効量を投与することを特徴とする治療方法。
(ii)フクチン遺伝子におけるSVA型レトロトランスポゾンの挿入変異に起因する疾患の治療薬を製造するための、上記本発明のアンチセンス核酸の使用。
(iii)フクチン遺伝子におけるSVA型レトロトランスポゾンの挿入変異に起因する疾患の治療に使用するための、上記本発明のアンチセンス核酸。
国際公開公報WO2013/100190に記載の方法に従い、表2のPMO No.1〜58、60〜66に示す各種ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー(PMO)を合成した。
工程1 スペーサー化合物の合成
3−(メチルアミノ)プロパン−1−オール(2g,22.44mmol)、トリエチルアミン(33.65mmol)をジメチルホルムアミド(20mL)に溶解し、氷冷下トリフェニルメチルクロリド(26.92mmol)を加え室温で3時間撹拌した。再度氷冷し、水(40ml)を加えて10分撹拌した後、酢酸エチルで抽出した。有機層を白濁のまま水洗し、エバポレーターにて濃縮後、再度酢酸エチル(50ml)希釈して不溶物をろ過して除いた。ろ液を濃縮してそのままシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製した。得られた3−[メチル(トリチル)アミノ]プロパン−1−オール(4.8g,14mmol)をテトラヒドロフラン(40mL)に溶解し氷冷下1−メチルイミダゾール(36mmol)、N−エチルモルホリン(14mmol)、N,N−ジメチルホスホルアミドジクロリデート(29mmol)を加え室温で3時間撹拌した。酢酸エチルと1Mりん酸二水素ナトリウム水溶液にて分液操作を行い、有機層を飽和食塩水にて洗浄、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、図6(D)に示すスペーサー化合物8(4.6g)を得た。
国際公開公報WO2013/100190に記載の方法に従い、PMO No.59を合成した。
なお、PMO No.59は、図6(E)に示すスペーサー9の5’末端側に塩基配列がCTCGからなるPMOが結合し、配列番号71の塩基配列からなるPMOがスペーサーの3’末端側に結合したアンチセンス核酸である。
PMO No.59に含まれるスペーサーは、工程1で得られたスペーサー化合物を用いて導入した。
PMO No.59: CTCG−(スペーサー)−CATCAGAGGGAGACC
ESI−TOF−MS 計算値:6466.28
測定値:6465.23
工程1 N−トリチルピペラジンの合成
ピペラジン(150g,1741mmol)をトルエン(650mL)/メタノール(130mL)混合液に溶解し、氷冷下[クロロ(ジフェニル)メチル]ベンゼン(48.5g,174mmol)のトルエン(244mL)溶液を滴下して加え、室温で終夜撹拌した。反応液を水洗し、トルエン層をコハク酸(22.8g,193mmol)/水(300mL)溶液に添加し氷冷下撹拌した。析出した結晶をろ取し、アセトンで洗浄後、50℃にて減圧乾燥し、N−トリチルピペラジン/コハク酸塩71.7gを得た。得られた化合物(50g,64.5mmol)をジクロロメタンに溶解し、炭酸カリウム(322.6mmol)水溶液で洗浄した。ジクロロメタン層を水洗、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧乾固し、図6(A)に示す標記化合物1(40g)を得た。
トリエチレングリコール(370.03mmol)をピリジン(500mL)に溶解し、氷冷下1,1’−カルボニルジイミダゾール(20g,123.34mmol)を加え、室温で30分、40℃で2時間撹拌した。次いで、工程1で得た化合物1(40g,121.8mmol)を加え、60℃で4時間撹拌した。反応液を減圧濃縮して酢酸エチルと1Mリン酸二水素ナトリウム水溶液で分液操作を行い、有機層を飽和食塩水で洗浄、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、図6(A)に示す化合物2(43.3g)を得た。得られた化合物2と4−ジメチルアミノピリジン(127.8mmol)をジクロロメタン(500mL)に溶解し無水コハク酸(127.8mmol)を加えて室温で1時間撹拌した。反応液を1Mリン酸二水素ナトリウム水溶液で分液し、有機層を飽和食塩水で洗浄、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮し図6(A)に示す標記化合物3(51.6g)を得た。
工程2で得た化合物3(43.50mmol)、アミノメチルポリスチレン樹脂(21.75mmol)、4−ジメチルアミノピリジン(54.38mmol)、1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミドヒドロクロリド(217.5mmol)をフィルター付きナスフラスコに入れ、ピリジン(420mL)、次いでトリエチルアミン(268.6mmol)を加え室温で3日間振とうした。反応液をろ過し、ピリジン、メタノール、ジクロロメタンで順次洗浄後、15分減圧乾燥をした。テトラヒドロフラン(312mL)、2,6−ルチジン(77.5mL)、無水酢酸(65mL)を加えて室温で3時間振とうした。フィルターろ過後、ピリジン、メタノール、ジクロロメタンで順次洗浄し、減圧乾燥後に図6(A)に示す標記樹脂(化合物4)を得た(ローディング:310μmol/g)。
工程3で得た樹脂(化合物4)を用い、国際公開公報WO2013/100190に記載の方法に従い5’末端エチレングリコール修飾体PMO No.70を合成した。
ESI−TOF−MS 計算値:6994.47
測定値:6994.79
実施例3と同様の方法にて5’末端エチレングリコール修飾体PMO No.68を合成した。
ESI−TOF−MS 計算値:6034.14
測定値:6034.74
工程1 トリエチレングリコール(TEG)誘導体 2−[2−[2−[ビス(4−メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ]エトキシ]エトキシ]エチルジメチルホスホルアミドクロリデートの合成
トリエチレングリコール(50g,332.96mmol)をピリジン(100mL,1236mmol)に加え、アルゴン雰囲気下ジメトキシトリチルクロリド(38g,112.2mmol)を少しずつ加えて数時間攪拌した。エバポレーターにてピリジンを減圧留去後、濃縮残渣をジクロロメタンに溶解し、水を加え分液操作を行った。有機層を回収し硫酸マグネシウムにて乾燥した。エバポレーターにてジクロロメタンを減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、2−[2−[2−[ビス(4−メトキシフェニル)−フェニル−メトキシ]エトキシ]エトキシ]エタノール(35g)を得た。得られた化合物(6g,13.25mmol)をテトラヒドロフラン(60mL)に溶解し、氷冷下1−メチルイミダゾール(33.146mml)、N−エチルモルホリン(13.25mmol)、N,N−ジメチルホスホルアミドジクロリデート(26.51mmol)をこの順で加えた。室温で2時間撹拌し、1Mリン酸二水素ナトリウム水溶液でクエンチ後、酢酸エチルにて抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄、硫酸マグネシウムにて乾燥後、エバポレーターで濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、図6(B)に示す標記誘導体(化合物5)6.1gを得た。
PMO No.27(38.38μmol)を15mLファルコンチューブに入れ、ジメチルスルホキシド(1.2mL)に溶解させた。これに工程1で得た化合物5(55mg,95.1μmol)、トリエチルアミン(55μL,394.6μmol)のTHF(220μL)混合溶液を加え、水浴40℃で2時間反応させた。氷冷後、反応液を20mMトリエチルアミン−酢酸緩衝液/アセトニトリル(4/1、18mL)で希釈し、逆相カラム精製(LiChroprep_RP18)を行い濃縮した。得られた残渣を20%アセトニトリル水溶液に溶解し、0.1M塩酸水溶液を加えた。pH試験紙でpHが2になったことを確認後1時間静置した。反応液に1M水酸化ナトリウム水溶液を加えて中和し、pH試験紙でpHが7になったことを確認した。反応液をメンブレンフィルター(PVDF,0.22μm)でろ過した。逆相カラム(YMC_GEL_TMS_HG)で脱塩および精製を行い、凍結乾燥後、3’末端エチレングリコール修飾体PMO No.69(237.6mg)を得た。
ESI−TOF−MS 計算値:6882.40
測定値:6882.10
実施例5と同様の方法にて3’末端エチレングリコール修飾体PMO No.67を合成した。ただし、工程2のPMOとしてPMO No.39を使用した。
ESI−TOF−MS 計算値:5922.08
測定値:5922.25
工程1 ヘキサエチレングリコール(HEG)誘導体の合成
ヘキサエチレングリコールを原料として、実施例5の工程1と同様の方法で図6(C)に示す標記誘導体(化合物6)を合成した。
実施例5と同様の方法にて3’末端エチレングリコール修飾体PMO No.71を合成した。ただし、工程2のエチレングリコール誘導体として、化合物5に代えて工程1で得た化合物6を用いた。
ESI−TOF−MS 計算値:7014.49
測定値:7014.98
実施例5と同様の方法にて3’末端エチレングリコール修飾体PMO No.73を合成した。ただし、工程2のPMOとしてPMO No.66を使用した。
ESI−TOF−MS 計算値:6659.37
測定値:6659.85
工程1 ドデカエチレングリコール(DODEG)誘導体の合成
ドデカエチレングリコールを原料として、実施例5の工程1と同様の方法で図6(C)に示す標記誘導体(化合物7)を合成した。
実施例5と同様の方法にて標記化合物を合成した。ただし、工程2のエチレングリコール誘導体として、化合物5に換えて工程1で得た化合物7を用いた。
ESI−TOF−MS 計算値:7278.64
測定値:7279.00
(1)使用細胞
FCMD患者筋芽細胞(SVA型レトロトランスポゾンの挿入変異ホモ接合体)を用いた。この細胞は、神戸大学大学院医学研究科の医学倫理審査委員会の承認を受けて使用した。
(2)アンチセンス核酸
実施例1〜9で合成したPMO No.1〜73を試験物質としてスクリーニングに供した。
FCMD患者筋芽細胞を増殖培地(20% Fetal bovine serum (FBS, Invitrogen)、2.5 ng/mL basic fibroblast growth factor(SIGMA)、0.5% Antibiotic Antimycotic Solution (100×), Stabilized (SIGMA)含有Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)- high glucose(SIGMA))で継代培養し、1cm2当たり30,000細胞になるように細胞培養ディッシュに播種して1日培養した。
翌日、分化培地(2% FBS含有DMEM-high glucose)に交換し、3μMとなるようPMOを添加した。陰性対照にはランダム化配列またはジストロフィン遺伝子を標的としたPMOを用いた。培地1mL当たり6μLのEndo−Porter(Gene-Tools)を用いてトランスフェクションを行った。2日後、RNeasy Mini Kit(Qiagen)によりトータルRNAを回収した。トータルRNAからPrimeScript RT−PCR Kit(タカラバイオ)を用いて、ランダムプライマーによりcDNA合成を行った。得られたcDNAを鋳型として異常スプライシングによる異常フクチンmRNAおよび正常スプライシングによる正常フクチンmRNAをPCRにより検出した。各mRNAを検出するためのプライマーの位置を図1に示した。PCRの条件は(94℃30秒、65℃30秒、72℃60秒)×32サイクルとし、反応終了後4℃に冷却した。PCR反応サンプル1μLを用いて、Agilent DNA 1000 kit(Agilent Technologies)および2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies)によりPCR増幅断片のサイズと濃度の測定を行った。219bp付近に検出される正常スプライシングに由来するバンドの定量値[A](nmol/L)および265bp付近に検出される異常スプライシングに由来するバンドの定量値[B](nmol/L)から正常スプライシング率を以下の計算式で算出した。
正常スプライシング率=[A]/([A]+[B])
正常フクチンとSVA型レトロトランスポゾンの挿入変異ヘテロ接合体(保因者)は筋機能および脳に異常は見られず、αジストログリカン糖鎖量も健常人と変わらない。すなわち、正常mRNAを50%回復させることができればFCMDが治療可能であると考えられる。そこで、核酸濃度3μMでトランスフェクションしたFCMD患者筋芽細胞において50%以上に正常スプライシングが回復できることを本スクリーニングにおけるFCMD治療用アンチセンス核酸の選択条件とした。
スクリーニングの結果、表2および表3に示した73種のアンチセンス核酸は、核酸濃度3μMにおいて50%以上に正常スプライシングを回復した。これら73種のアンチセンス核酸は、いずれもSVA挿入フクチン遺伝子の異常スプライシングに用いられるスプライシング受容部位の周辺配列を標的配列とするアンチセンス核酸である。具体的には、SVA挿入フクチン遺伝子の塩基配列(配列番号1)の第115937位〜第115981位の範囲を標的配列とするものである。
(1)実験材料および方法
実施例1と同じFCMD患者筋芽細胞(SVA型レトロトランスポゾンの挿入変異ホモ接合体)を用いた。増殖培地(実施例10参照)で継代培養した細胞に対して、Nucleofector(Lonza)を用いて電気穿孔法によりPMOを導入し、分化培地(実施例10参照)で培養した。PMOとしてPMO No.1、9、27、39および45の5種類のPMOを用いた。陰性対照にはジストロフィン遺伝子を標的としたPMOを用いた。
結果を図2に示した。図2中、α−DGはαジストログリカン、β−DGはβジストログリカン、HSMMはヒト骨格筋筋芽細胞、RDはヒト胎児横紋筋肉腫を表す。上段が抗αジストログリカンラットモノクローナル抗体を用いた結果、中段が抗糖鎖修飾αジストログリカンマウスモノクローナル抗体IIH6を用いた結果、下段が抗βジストログリカンマウスモノクローナル抗体8D5を用いた結果である。
FCMD患者細胞はαジストログリカンの糖鎖が欠損しており、αジストログリカンは低分子量の位置に検出された(図2のwater参照)。一方、PMOを導入したFCMD患者細胞では、いずれのPMOを導入した場合でも濃度依存的にαジストログリカンの糖鎖が回復していることが確認できた。陰性対照のジストロフィン遺伝子を標的としたPMOを導入したFCMD患者細胞では、αジストログリカンの糖鎖が回復しなかった。
(1)使用動物
全ての動物実験は神戸大学大学院医学研究科の実験動物倫理審査委員会の承認を受けた。FCMDノックインマウスおよびその命名については文献(Kanagawa, M. et al. residual laminin-binding acivity and enhanced dystroglycan glycosylated by LARGE in novel model mice to dystroglycanopathy. Hum. Mol. Genet. 18, 621-31(2009))に記載されている。フクチン遺伝子の正常ヒトエクソン10およびSVA挿入ヒトエクソン10を有するトランスジェニックアレルをそれぞれHnおよびHpと命名した。Hp/HpはSVA挿入ヒトエクソン10アレルのホモ接合体であり、Hn/Hnは正常ヒトエクソン10アレルのホモ接合体であり、Hp/−はSVA挿入ヒトエクソン10アレルとマウスフクチン遺伝子ノックアウトアレルの複合ヘテロ接合体である。実験に用いたマウスは8〜14週齢である。
PMOとしてPMO No.9、27、39および45の4種類のPMOを用いた。
Hp/−マウスにカルジオトキシン10μM(SIGMA)を経皮的に前脛骨筋肉内(0.4nmol)、腓腹筋(2nmol)および大腿四頭筋(1nmol)の3か所に投与した。PMOの投与用量毎に2匹のマウスを用いた。カルジオトキシン投与日を0日目とし、3日目に5%マンニトールに溶解したPMO(20, 60, 200mg/kg)を尾静脈内投与した。23日目にマウスを安楽死させ、フクチンタンパク質、αジストログリカン糖鎖を解析するために各組織を回収した。
抗フクチンウサギポリクローナル抗体RY213は、ペプチドCLKIESKDPRLDGIDS(配列番号72)を認識し、抗フクチンヤギポリクローナル抗体106G2はN末端の疎水性ドメインを欠失している全長フクチンを認識する。フクチンは、筋組織15〜30mgから10倍量の溶解バッファー(1% Nonidet P-40, 0.5% deoxycholate, 0.1% SDS, 20mM Tris-HCl および150mM NaCl)を用いて得た組織溶解液から106G2を用いた免疫沈降法により検出し、続いてアフィニティー精製したRY213を用いるウエスタンブロット分析に供した。
筋組織に10倍量の溶解バッファー(1% Triton TBS)を加えて組織溶解液を得た。溶解液9μLを、実施例2と同じ3種類の抗体(抗αジストログリカンラットモノクローナル抗体、抗糖鎖修飾αジストログリカンマウスモノクローナル抗体IIH6、抗βジストログリカンマウスモノクローナル抗体8D5)を用いたウエスタンブロット分析に供した。
PMO No.9のアンチセンス核酸の結果を図3に、PMO No.27のアンチセンス核酸の結果を図4に、PMO No.39のアンチセンス核酸の結果およびPMO No.45のアンチセンス核酸の結果を図5にそれぞれ示した。いずれも大腿四頭筋におけるジストログリカンおよびフクチンタンパク質の結果である。図3、図4および図5から明らかなように、4種類のアンチセンス核酸のいずれを投与した場合においても、アンチセンス核酸の濃度依存的にαジストログリカンの糖鎖および正常フクチンタンパク質が回復していることが確認できた。
(1)実験方法
PMO5.0mgの入った2.2mLサンプル瓶(透明)に注射用水80.0μLを加え、超音波とボルテックスを使って溶解させた後、5倍濃度生理食塩水20.0μLを加え、ボルテックスを使って撹拌し50mg/mLの生理食塩水溶液とした。室温で24時間放置し、沈殿が生じないものを溶解性が高い配列と評価した。
PMO No.13、14、21、22、27、28、32、38、48、50、53〜56、58〜66、69〜73は、生理食塩水に対して50mg/mL以上の溶解性を示した。生理食塩水に対する溶解性の高いこれら28種類のPMOは、医薬として利用価値が高いアンチセンス核酸であると考えられた。
(1)実験方法
PMOを5%グルコース水溶液に溶解し、C57BL/6J雄性6週齢マウスの尾静脈内へ投与した。翌日、マウスより血清を回収し、血中アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)値、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)値、尿素窒素量(BUN)値およびクレアチニン値を測定した。媒体として使用した5%グルコース水溶液のみを投与したマウスもしくは無処置マウスの測定値を正常値とし、正常値の1.3倍を超える上昇が見られた場合、異常値と判定した。60mg/kg以下の用量においてAST値、ALT値、BUN値およびクレアチニン値のいずれにも異常値がみられない場合、安全性が高いアンチセンス核酸であると判定した。
PMO No.27、45、46、71、55、57、60、61、62、66、73について、60mg/kg以下の用量においてAST値、ALT値、BUN値およびクレアチニン値のいずれにも異常値がみられず、安全性が高いアンチセンス核酸であることを確認した。
Claims (15)
- 配列番号1で示される塩基配列の第115937位〜第115981位の範囲を標的配列とし9〜24塩基からなることを特徴とするアンチセンス核酸。
- 配列番号6〜70(ただし、配列番号32、60、64、65、66および67を除く)から選択される塩基配列からなることを特徴とする請求項1に記載のアンチセンス核酸。
- 生理食塩水に50mg/mL以上溶解することを特徴とする請求項1または2に記載のアンチセンス核酸。
- 配列番号18、19、26、27、33、37、43、53、55、58、59、61、63、68、69および70から選択される塩基配列からなることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載のアンチセンス核酸。
- 投与用量60mg/kgのアンチセンス核酸をマウスに投与したときに、AST値、ALT値、BUN値およびクレアチニン値のいずれにも異常値がみられないことを特徴とする請求項1または2に記載のアンチセンス核酸。
- 配列番号50、51および62から選択される塩基配列からなることを特徴とする請求項1、2または5のいずれかに記載のアンチセンス核酸。
- 生理食塩水に50mg/mL以上溶解し、かつ、投与用量60mg/kgのアンチセンス核酸をマウスに投与したときに、AST値、ALT値、BUN値およびクレアチニン量のいずれにも異常値がみられないことを特徴とする請求項1または2に記載のアンチセンス核酸。
- アンチセンス核酸の3’末端および/または5’末端が非修飾であることを特徴とする請求項1〜7のいずれかに記載のアンチセンス核酸。
- アンチセンス核酸の3’末端および/または5’末端が修飾されていることを特徴とする請求項1〜7のいずれかに記載のアンチセンス核酸。
- アンチセンス核酸の3’末端および/または5’末端がトリエチレングリコール(TEG)修飾、ヘキサエチレングリコール(HEG)修飾およびドデカエチレングリコール(DODEG)修飾からなる群から選択される1種または2種の修飾がされていることを特徴とする請求項9に記載のアンチセンス核酸。
- オリゴデオキシリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、モルホリノオリゴマーまたはこれらのキメラオリゴヌクレオチドである請求項1〜10のいずれかに記載のアンチセンス核酸。
- モルホリノオリゴマーである請求項11に記載のアンチセンス核酸。
- ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーである請求項12に記載のアンチセンス核酸。
- フクチン遺伝子におけるSVA型レトロトランスポゾンの挿入変異に起因する疾患を治療するための医薬組成物であって、請求項1〜13のいずれかに記載のアンチセンス核酸の1種または2種以上を有効成分として含有することを特徴とする医薬組成物。
- フクチン遺伝子におけるSVA型レトロトランスポゾンの挿入変異に起因する疾患が、福山型筋ジストロフィー、成人発症の拡張型心筋症、またはWalker−Warburg症候群様の重症型先天性筋ジストロフィーである請求項14に記載の医薬組成物。
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