JP2019146516A - Rnaアプタマーのスクリーニング方法 - Google Patents
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項1. 下記(A)工程から(C)工程を含む、RNAアプタマーのスクリーニング方法:
(A)RNAアプタマー候補の鋳型配列を含むタグ付鋳型二本鎖DNAのクローンを、前記RNAアプタマー候補の鋳型配列に応じて複数種含む固定化鋳型二重鎖DNAライブラリであって;前記タグ付鋳型二本鎖DNAが、一方端から他方端へ向かって、RNAポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列の相補配列、捕捉用配列、及び前記RNAアプタマー候補の鋳型配列を含む一本鎖DNAと、その相補鎖DNAとで構成される二本鎖DNAと、前記相補鎖DNAの前記一方端に結合した、リンカー及び前記捕捉用配列を含む捕捉用タグ(Pt)とを含み、前記他方端で固相担体に固定されており;且つ、前記タグ付鋳型二本鎖DNAのクローンごとに前記固相担体の特定の微小表面に固定化されている、固定化鋳型二重鎖DNAライブラリ(LA)を準備する工程と、
(B)前記鋳型二重鎖DNAライブラリ(LA)を転写反応に供し、前記捕捉用配列の相補配列が付加された前記RNAアプタマー候補を合成するとともに前記RNAアプタマー候補を前記捕捉用タグ(Pt)に捕捉させることによって、固定化RNA/DNA複合体ライブラリ(LB)を調製する工程と、
(C)前記固定化RNA/DNA複合体ライブラリ(LB)を標的物質と接触させ、前記標的物質と結合した前記RNAアプタマー候補を有するRNA/DNA複合体のクローンが固定化された前記微小表面を選別する工程。
項2. 前記(A)工程が、以下の工程を含む、項1に記載の方法:
(A1)前記一本鎖DNAのクローンを、前記RNAアプタマー候補の鋳型配列に応じて複数種含むDNAライブラリであって、前記一本鎖DNAのクローンごとに前記固相担体の特定の微小表面に固定化されている固定化一本鎖DNAライブラリ(L0)を準備する工程、及び
(A2)前記固定化一本鎖DNAライブラリ(L0)を、前記捕捉用配列及びリンカーを有する捕捉用タグ(Pt)と前記プロモータ配列とを含むプライマー(P)を用いたプライマー伸長反応に供し、前記固定化鋳型二重鎖DNAライブラリ(LA)を得る工程。
項3. 前記(A1)工程において、前記一本鎖DNA、その相補鎖DNA、又は、前記一本鎖DNAと前記相補鎖DNAとで構成される二本鎖DNAを、前記固相担体の存在下で、プライマーを用いた単分子PCRに供することによって、前記固定化一本鎖DNAライブラリ(L0)を得る、項2に記載の方法。
項4. 前記(A)工程が、以下の工程を含む、項1に記載の方法:
(A11)前記一本鎖DNA、その相補鎖DNA、又は、前記一本鎖DNAと前記相補鎖DNAとで構成される二本鎖DNAを、前記固相担体の存在下で、前記捕捉用配列及びリンカーを有する捕捉用タグ(Pt)と前記プロモータ配列とを含むプライマー(P)を用いた単分子PCRに供し、前記固定化鋳型二重鎖DNAライブラリ(LA)を得る工程。
項5. 前記固相担体が微粒子担体であり、前記微小表面が前記微粒子担体の表面であり、且つ、前記(C)工程において、前記標的物質と結合した前記RNAアプタマー候補を有するRNA/DNA複合体のクローンが固定化された微粒子担体の分取を行う、項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
項6. 前記(C)工程における分取をセルソータによって行う、項5に記載の方法。
項7. 前記固相担体が基板担体であり、前記微小表面が前記基板担体の表面上の特定の微小領域であり、且つ、前記(C)工程において、前記標的物質と結合した前記RNAアプタマー候補を有するRNA/DNA複合体のクローンが固定化された微小領域の特定を行う、項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
項8. 前記(B)工程の転写反応における一の条件及び前記(C)工程の標的物質との接触における一の条件あたり、前記(A)工程から前記(C)工程を1回のみ行う、項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
項9. 前記プロモータ配列がT7プロモータ配列である、項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
項10. 前記リンカーがポリアルキレングリコール鎖である、項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
項11. RNAポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列の相補配列と、捕捉用配列とを含む前記一本鎖DNA、その相補鎖DNA、又は、前記一本鎖DNAと前記相補鎖DNAとで構成される二本鎖DNAと、
前記捕捉用配列及びリンカーを有する捕捉用タグ(Pt)と、前記プロモータ配列を含むプライマー(P)と、
を含む、RNAアプタマーのスクリーニングキット。
項12. RNAアプタマー候補の鋳型配列を含むタグ付鋳型二本鎖DNAのクローンを、前記RNAアプタマー候補の鋳型配列に応じて複数種含むライブラリであって、
前記タグ付鋳型二本鎖DNAが、一方端から他方端へ向かって、RNAポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列の相補配列、捕捉用配列、及びRNAアプタマー候補の鋳型配列を含む一本鎖DNAと、その相補鎖DNAとで構成される二本鎖DNAと、前記相補鎖DNAの前記一方端に結合した、リンカー及び前記捕捉用配列を含む捕捉用タグ(Pt)を含み、前記他方端で固相担体に固定されており、且つ、
前記タグ付鋳型二本鎖DNAのクローンごとに前記固相担体の特定の微小表面に固定化されている、RNAアプタマーのスクリーニング用ライブラリ。
項13. 前記タグ付鋳型二本鎖DNAから転写された、前記捕捉用配列の相補配列が付加された前記RNAアプタマー候補が、前記捕捉用タグ(Pt)に相補結合することでRNA/DNA複合体を構成している、項12に記載のRNAアプタマーのスクリーニング用ライブラリ。
項14. 前記固相担体が微粒子担体であり、前記微小表面が前記微粒子担体の表面である、項12又は13に記載のRNAアプタマーのスクリーニング用ライブラリ。
項15. 前記固相担体が基板担体であり、前記微小表面が前記基板担体の表面上の特定の微小領域である、項12又は13に記載のRNAアプタマーのスクリーニング用ライブラリ。
本発明のRNAアプタマーのスクリーニング方法は、固定化鋳型二重鎖DNAライブラリ(LA)を準備する工程(A)と、固定化RNA/DNA複合体ライブラリ(LB)を調製する工程(B)と、RNAアプタマー候補を選別する工程(C)と、を含む。図1に本発明のRNAアプタマーのスクリーニング方法の一例を模式的に示す。図1に示すように、工程(A)で準備された固定化鋳型二重鎖DNAライブラリ(LA)は、工程(B)で転写に供されることにより、RNAアプタマー候補が固定化された固定化RNA/DNA複合体ライブラリ(LB)へ調製され、工程(C)で標的物質との接触に供されることにより、標的物質と結合したRNAアプタマー候補を有するRNA/DNA複合体のクローンが選別(図1の例では分取)される。
工程(A)では、固定化鋳型二重鎖DNAライブラリ(LA)を準備する。図1に示すように、固定化鋳型二重鎖DNAライブラリ(LA)は、固相担体の微小表面に固定化されたタグ付鋳型二本鎖DNAのクローンの多数のコピーを含む。図示された態様では、固相担体は微粒子担体である。この場合、固相担体の微小表面は、微粒子担体の表面全体を構成する。タグ付鋳型二本鎖DNAは、図2に示すように、3’−5’方向に、RNAポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列の相補配列と、捕捉用配列X’と、RNAアプタマー候補の鋳型配列とをこの順番で含む一本鎖DNAと、その相補鎖DNAとから構成される二本鎖DNAと、相補鎖DNAの一方端に結合した捕捉用タグ(Pt)とを含む。固相担体(図2において図示省略)はタグ付鋳型二本鎖DNAの他方端を固定している。
固定化鋳型二重鎖DNAライブラリ(LA)を調製する工程(A)は、固定化一本鎖DNAライブラリ(L0)を準備する工程(A1)と、固定化一本鎖DNAライブラリ(L0)をプライマー(P)を用いたプライマー伸長反応に供する工程(A2)とによって行うことができる。図3に、工程(A1)及び工程(A2)の一例を模式的に示す。また、工程(A2)の詳細について、図5に模式的に示す。
図3の工程(A2)に示されるように、工程(A2)では、上述の固定化一本鎖DNAライブラリ(L0)を、所定の配列設計がされたプライマー(P)を用いたプライマー伸長反応に供する。これによって、固定化一本鎖DNAライブラリ(L0)における一本鎖DNAが二本鎖DNAとなるとともに、二本鎖DNAの端部に一本鎖の捕捉用タグ(Pt)が付加された、固定化鋳型二重鎖DNAライブラリ(LA)が調製される。
固定化鋳型二重鎖DNAライブラリ(LA)を調製する工程(A)は、上述の工程(A1)及び工程(A2)によって行う他、以下の工程(A11)によっても行うことができる。図4に、工程(A11)の一例を模式的に示す。
工程(B)では、上述の固定化鋳型二重鎖DNAライブラリ(LA)を転写反応に供し、固定化RNA/DNA複合体ライブラリ(LB)を調製する。図1に示すように、固定化RNA/DNA複合体ライブラリ(LB)は、上述の固定化鋳型二重鎖DNAライブラリ(LA)において、補足用タグ(Pt)を介してRNAアプタマー候補が結合した態様で調製される。
工程(C)では、上述の固定化RNA/DNA複合体ライブラリ(LB)を標的物質と接触させる。図1に示すように、上述の固定化RNA/DNA複合体ライブラリ(LB)に含まれる複数種のRNAアプタマー候補のクローンのうち、特定のクローンに標的物質が特異的に結合する。さらに、標的物質と結合した前記RNAアプタマー候補を有するRNA/DNA複合体のクローンが固定化された微小表面を選別することで、RNAアプタマー候補を絞り込むことができる。微小表面の選別は、固相担体が微粒子担体である場合は、標的物質と結合したクローンが固定化された微粒子担体の分取を行い、固相担体が基板担体である場合は、標的物質と結合したクローンが固定化された微小領域の特定を行う。
本発明のRNAアプタマーのスクリーニングキットは、上述のRNAアプタマーのスクリーニング方法を実施するためのキットである。したがって、本発明のRNAアプタマーのスクリーニングキットに含まれる、又は含まれてよいアイテムの構成、使用方法、作用、機能、その他の事項については、上述の「1.RNAアプタマーのスクリーニング方法」で記載した通りである。
本発明のRNAアプタマーのスクリーニング用ライブラリは、上述のRNAアプタマーのスクリーニング方法に有用なライブラリである。具体的には、上述の「1.RNAアプタマーのスクリーニング方法」の工程(B)に供される固定化鋳型二重鎖DNAライブラリ(LA)、及び、工程(C)に供される固定化RNA/DNA複合体ライブラリ(LB)が挙げられる。それぞれのイブラリの構成、使用方法、作用、機能、その他の事項については、上述の「1.RNAアプタマーのスクリーニング方法」で記載した通りである。
蛍光分子である3’5’−ジフルオロ−4−ヒドロキシベンジリデンイミダゾリノン(DFHBI)、およびその誘導体(DFHBI−1T)に結合するRNAアプタマー(Spinach RNA)を利用し、Spinach RNAにおいて、結晶構造解析から明らかになっているDFHBIの結合領域周辺の塩基を変異させたライブラリを構築し、配列最適化を試みた。ライブラリは、配列の1塩基に変異を導入しバリエーション展開したもの(実施例1)及び7塩基に変異を導入しバリエーション展開したもの(実施例2、実施例3)とを構築した。配列にバリエーションを含む鋳型二重鎖DNA断片を作製し、エマルジョンPCRにより微小担体に固定化して固定化一本鎖DNAライブラリ(L0)を作製した(工程(A1))後に、一本鎖となっているDNAから二本鎖の鋳型DNAを合成して固定化鋳型二重鎖DNAライブラリ(LA)を作製した(工程(A))。
本実施例で設計した鋳型二重鎖DNA断片の作成方法、及び固定化一本鎖DNAライブラリ(L0)から固定化鋳型二重鎖DNAライブラリ(LA)を調製する工程(工程(A))において使用したプライマー(P)の配列を図8に示す。図8では、エマルジョンPCRに必要な塩基配列領域を破線(塩基の表記は省略)で記し、プロモーター配列、捕捉用配列X’、バリエーションを展開したSpinach RNAの具体的な塩基配列(斜字体で表記)をそれぞれ記す。鋳型二重鎖DNA断片は、化学合成で作製した部分的に相補配列を有する2本のDNAを用いて、互いにDNAを伸長させる反応(プライマー伸長反応)を行う事で作製した。プライマー伸長反応では、DNAを伸長させる酵素としてTOYOBO社のKOD−Plus−Ver.2を用いた。
本実施例で設計した鋳型二重鎖DNA断片の作成方法、及び固定化一本鎖DNAライブラリ(L0)から固定化鋳型二重鎖DNAライブラリ(LA)を調製する工程(工程(A))において使用したプライマー(P)の配列を図10に示す。図10では、エマルジョンPCRに必要な塩基配列領域を破線(塩基の表記は省略)で記し、プロモーター配列、捕捉用配列X’、バリエーションを展開したSpinach RNAの配列(斜字体で表記)をそれぞれ記す。鋳型二重鎖DNA断片は、実施例1と同様にプライマー伸長反応を行う事で作製した。
本発明では、鋳型二重鎖DNAライブラリ(LA)に対して異なる溶液条件で転写反応を行う、もしくは通常の転写反応で固定化RNA/DNA複合体ライブラリ(LB)を作製した後に微小担体を遠心分離しつつ溶液を交換することで、様々な溶液条件で標的分子との結合を指標にアプタマーを選別することができる。そこで、実施例2で用いた16,384種類の配列バリエーションを有する鋳型二重鎖DNAライブラリ(LA)を用いて、溶液環境の違いで異なるアプタマーが選別されてくるか否かを検討した。具体的には、鋳型二重鎖DNAライブラリ(LA)を転写反応(工程(B))に供する際に、転写反応溶液に30wt%のエチレングリコールを添加したことを除いて、実施例2と同様の工程(C)を行った。
Claims (15)
- 下記(A)工程から(C)工程を含む、RNAアプタマーのスクリーニング方法:
(A)RNAアプタマー候補の鋳型配列を含むタグ付鋳型二本鎖DNAのクローンを、前記RNAアプタマー候補の鋳型配列に応じて複数種含む固定化鋳型二重鎖DNAライブラリであって;前記タグ付鋳型二本鎖DNAが、一方端から他方端へ向かって、RNAポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列の相補配列、捕捉用配列、及び前記RNAアプタマー候補の鋳型配列を含む一本鎖DNAと、その相補鎖DNAとで構成される二本鎖DNAと、前記相補鎖DNAの前記一方端に結合した、リンカー及び前記捕捉用配列を含む捕捉用タグ(Pt)とを含み、前記他方端で固相担体に固定されており;且つ、前記タグ付鋳型二本鎖DNAのクローンごとに前記固相担体の特定の微小表面に固定化されている、固定化鋳型二重鎖DNAライブラリ(LA)を準備する工程と、
(B)前記鋳型二重鎖DNAライブラリ(LA)を転写反応に供し、前記捕捉用配列の相補配列が付加された前記RNAアプタマー候補を合成するとともに前記RNAアプタマー候補を前記捕捉用タグ(Pt)に捕捉させることによって、固定化RNA/DNA複合体ライブラリ(LB)を調製する工程と、
(C)前記固定化RNA/DNA複合体ライブラリ(LB)を標的物質と接触させ、前記標的物質と結合した前記RNAアプタマー候補を有するRNA/DNA複合体のクローンが固定化された前記微小表面を選別する工程。 - 前記(A)工程が、以下の工程を含む、請求項1に記載の方法:
(A1)前記一本鎖DNAのクローンを、前記RNAアプタマー候補の鋳型配列に応じて複数種含むDNAライブラリであって、前記一本鎖DNAのクローンごとに前記固相担体の特定の微小表面に固定化されている固定化一本鎖DNAライブラリ(L0)を準備する工程、及び
(A2)前記固定化一本鎖DNAライブラリ(L0)を、前記捕捉用配列及びリンカーを有する捕捉用タグ(Pt)と前記プロモータ配列とを含むプライマー(P)を用いたプライマー伸長反応に供し、前記固定化鋳型二重鎖DNAライブラリ(LA)を得る工程。 - 前記(A1)工程において、前記一本鎖DNA、その相補鎖DNA、又は、前記一本鎖DNAと前記相補鎖DNAとで構成される二本鎖DNAを、前記固相担体の存在下で、プライマーを用いた単分子PCRに供することによって、前記固定化一本鎖DNAライブラリ(L0)を得る、請求項2に記載の方法。
- 前記(A)工程が、以下の工程を含む、請求項1に記載の方法:
(A11)前記一本鎖DNA、その相補鎖DNA、又は、前記一本鎖DNAと前記相補鎖DNAとで構成される二本鎖DNAを、前記固相担体の存在下で、前記捕捉用配列及びリンカーを有する捕捉用タグ(Pt)と前記プロモータ配列とを含むプライマー(P)を用いた単分子PCRに供し、前記固定化鋳型二重鎖DNAライブラリ(LA)を得る工程。 - 前記固相担体が微粒子担体であり、前記微小表面が前記微粒子担体の表面であり、且つ、前記(C)工程において、前記標的物質と結合した前記RNAアプタマー候補を有するRNA/DNA複合体のクローンが固定化された微粒子担体の分取を行う、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記(C)工程における分取をセルソータによって行う、請求項5に記載の方法。
- 前記固相担体が基板担体であり、前記微小表面が前記基板担体の表面上の特定の微小領域であり、且つ、前記(C)工程において、前記標的物質と結合した前記RNAアプタマー候補を有するRNA/DNA複合体のクローンが固定化された微小領域の特定を行う、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記(B)工程の転写反応における一の条件及び前記(C)工程の標的物質との接触における一の条件あたり、前記(A)工程から前記(C)工程を1回のみ行う、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記プロモータ配列がT7プロモータ配列である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記リンカーがポリアルキレングリコール鎖である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- RNAポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列の相補配列と、捕捉用配列とを含む前記一本鎖DNA、その相補鎖DNA、又は、前記一本鎖DNAと前記相補鎖DNAとで構成される二本鎖DNAと、
前記捕捉用配列及びリンカーを有する捕捉用タグ(Pt)と、前記プロモータ配列を含むプライマー(P)と、
を含む、RNAアプタマーのスクリーニングキット。 - RNAアプタマー候補の鋳型配列を含むタグ付鋳型二本鎖DNAのクローンを、前記RNAアプタマー候補の鋳型配列に応じて複数種含むライブラリであって、
前記タグ付鋳型二本鎖DNAが、一方端から他方端へ向かって、RNAポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列の相補配列、捕捉用配列、及びRNAアプタマー候補の鋳型配列を含む一本鎖DNAと、その相補鎖DNAとで構成される二本鎖DNAと、前記相補鎖の前記一方端に結合した、リンカー及び前記捕捉用配列を含む捕捉用タグ(Pt)を含み、前記他方端で固相担体に固定されており、且つ、
前記タグ付鋳型二本鎖DNAのクローンごとに前記固相担体の特定の微小表面に固定化されている、RNAアプタマーのスクリーニング用ライブラリ。 - 前記タグ付鋳型二本鎖DNAから転写された、前記捕捉用配列の相補配列が付加された前記RNAアプタマー候補が、前記捕捉用タグ(Pt)に相補結合することでRNA/DNA複合体を構成している、請求項12に記載のRNAアプタマーのスクリーニング用ライブラリ。
- 前記固相担体が微粒子担体であり、前記微小表面が前記微粒子担体の表面である、請求項12又は13に記載のRNAアプタマーのスクリーニング用ライブラリ。
- 前記固相担体が基板担体であり、前記微小表面が前記基板担体の表面上の特定の微小領域である、請求項12又は13に記載のRNAアプタマーのスクリーニング用ライブラリ。
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"DNA display of folded RNA libraries enabling RNA-SELEX without reverse transcription", CHEMICAL COMMUNICATIONS, vol. Volume 53, Issue 19, JPN6021048142, 2017, pages 2878 - 2881, ISSN: 0004656117 * |
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