JP2019122369A

JP2019122369A - 低グルタミン酸トマト

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Publication number: JP2019122369A
Application number: JP2018236652A
Authority: JP
Inventors: 美穂吉田; Yoshio Yoshida
Original assignee: Kagome Co Ltd
Current assignee: Kagome Co Ltd
Priority date: 2018-01-15
Filing date: 2018-12-18
Publication date: 2019-07-25
Anticipated expiration: 2038-12-18
Also published as: JP7057746B2

Abstract

【課題】その果実のグルタミン酸含有量が低減したソラナム・リコペルシカム及びその製造方法を提供する。【解決手段】ソラナム・リコペルシカムの第４染色体上にグルタミン酸代謝関連遺伝子をホモ接合型で含み、前記グルタミン酸代謝関連遺伝子は、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統の第４染色体の６０,７０９,８４１ｂｐ〜６１,１７０,５８１ｂｐの遺伝子領域に含まれ、好ましくは同６０,７０９,８４１ｂｐ〜６１，０６８，８１１ｂｐの遺伝子領域に含まれる。【選択図】なし

Description

本発明は、果実中のグルタミン酸含有量が低減したトマト植物（ソラナム・リコペルシカム）に関する。

トマト果実はグルタミン酸を含有しており、グルタミン酸は一般的にうま味に寄与することが知られている。うま味は、調味料等の加工食品ではその価値を高める効果がある一方で、飲料やデザート類、また生の状態で食べる際には、甘味をマスキングする等のネガティブな味覚である。そのため、グルタミン酸含有量が低減したトマト果実の需要がある。

これまでに、トマト果実中のグルタミン酸含有量を積極的に低減させる技術については特に知られていなかったが、トマト等の植物体においてＧＡＢＡを高含有させるため、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）をコードするポリヌクレオチドを用いて該酵素活性を増強させた、形質転換植物が開示されている（特許文献１）。また、人為的にグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）の発現を抑制した形質転換体を作出ところ、葉や未熟果では変化が見られなかったが、熟した果実ではグルタミン酸含有量が低下することも報告されている（非特許文献１）。

特表２００５−５０６０３４号公報

Journal of Experimental Botany. 2015 vol.66, No.11, pp.3381-3389

本発明は、その果実のグルタミン酸含有量が低減したソラナム・リコペルシカム及びその製造方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意研究の末、ソラナム・ハブロカイテス（Solanum habrochaites）ＬＡ１７７７系統の第４染色体上の特定の遺伝子領域に、果実中のグルタミン酸含有量を低減させる原因遺伝子が存在することを見出した。そして、該原因遺伝子を第４染色体上にホモ接合型で含むソラナム・リコペルシカム（Solanum lycopersicum）の果実においては、該原因遺伝子を含まない又はヘテロ接合型で含むソラナム・リコペルシカムの果実に比べて、グルタミン酸含有量が有意に少ないことに想到し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］ソラナム・リコペルシカムであって、
第４染色体上にグルタミン酸代謝関連遺伝子をホモ接合型で含み、
前記グルタミン代謝関連遺伝子は、ソラナム・ハブロカイテス（Solanum habrochaites）ＬＡ１７７７系統の第４染色体の６０,７０９,８４１ｂｐ〜６１,１７０,５８１ｂｐの遺伝子領域に含まれるものである、ソラナム・リコペルシカム。
［２］前記グルタミン代謝関連遺伝子が、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統の第４染色体の６０,７０９,８４１ｂｐ〜６１，０６８，８１１ｂｐの遺伝子領域に含まれるものである、[１]に記載のソラナム・リコペルシカム。
［３］ソラナム・リコペルシカムであって、
配列番号１１の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１２の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１３の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１４の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１５の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１６の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１７の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１８の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１９の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２０の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号２１の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２２の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、又は配列番号２３の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２４の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセットを用いるＰＣＲによって、第４染色体上にホモ接合型で存在するグルタミン酸代謝関連遺伝子を含む遺伝子領域が検出される、ソラナム・リコペルシカム。
［４］配列番号１１の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１２の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１３の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１４の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１５の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１６の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１７の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１８の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、又は配列番号１９の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２０の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセットを用いるＰＣＲによって、第４染色体上にホモ接合型で存在するグルタミン酸代謝関連遺伝子が検出される、［３］に記載のソラナム・リコペルシカム。
［５］その果実のグルタミン酸含有量が、野生型又は非改変系統のソラナム・リコペルシカムと比較して低い、［１］〜［４］のいずれかに記載のソラナム・リコペルシカム。
［６］ソラナム・リコペルシカムの製造方法であって、
第４染色体上にグルタミン酸代謝関連遺伝子を含む第一の親品種と、任意の第二の親品種とを交配してＦ１世代を得る工程、
得られたＦ１世代又はその後代において、第４染色体上に前記グルタミン酸代謝関連遺伝子をホモ接合型で含むソラナム・リコペルシカムを選抜する工程、を含み、
前記グルタミン代謝関連遺伝子は、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統の第４染色体の６０,７０９,８４１ｂｐ〜６１,１７０,５８１ｂｐの遺伝子領域に含まれるものである、製造方法。
［７］前記選抜工程は、配列番号１１の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１２の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１３の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１４の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１５の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１６の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１７の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１８の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１９の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２０の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号２１の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２２の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、又は配列番号２３の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２４の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセットを用いるＰＣＲにより行われる、［６］に記載の製造方法。
［８］前記グルタミン代謝関連遺伝子が、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統の第４染色体の６０,７０９,８４１ｂｐ〜６１，０６８，８１１ｂｐの遺伝子領域に含まれるものである、［６］に記載の製造方法。
［９］前記選抜工程は、配列番号１１の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１２の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１３の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１４の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１５の塩基
配列を有するＤＮＡ及び配列番号１６の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１７の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１８の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、又は配列番号１９の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２０の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセットを用いるＰＣＲにより行われる、［８］に記載の製造方法。
［１０］製造されるソラナム・リコペルシカムの果実のグルタミン酸含有量が、野生型又は非改変系統のソラナム・リコペルシカムと比較して低い、［６］〜［９］のいずれかに記載の製造方法。
［１１］ソラナム・リコペルシカムを鑑別する方法であって、
ソラナム・リコペルシカムの第４染色体上のグルタミン酸代謝関連遺伝子を含む遺伝子領域を検出する工程を含み、
前記検出工程は、配列番号１１の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１２の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１３の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１４の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１５の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１６の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１７の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１８の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１９の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２０の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号２１の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２２の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、又は配列番号２３の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２４の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセットを用いるＰＣＲにより行われる、方法。
［１２］前記検出工程が、配列番号１１の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１２の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１３の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１４の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１５の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１６の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１７の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１８の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、又は配列番号１９の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２０の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセットを用いるＰＣＲにより行われる、［１１］に記載の方法。

本発明によれば、その果実のグルタミン酸含有量が低減したソラナム・リコペルシカム及びその製造方法が提供される。グルタミン酸含有量が低減したトマト果実では、甘味のマスキングが抑制されるため、飲料やデザート等のトマト加工食品又は生食用トマトとして好適である。

本発明のソラナム・リコペルシカムは、第４染色体上に、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統の第４染色体の６０,７０９,８４１ｂｐ〜６１,１７０,５８１ｂｐの遺伝子領域に含まれるグルタミン酸代謝関連遺伝子をホモ接合型で含む。前記グルタミン酸代謝関連遺伝子は、好ましくはソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統の第４染色体の６０,７０９,８４１ｂｐ〜６１，０６８，８１１ｂｐの遺伝子領域に含まれる。
本発明者らは、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統は、その果実におけるグルタミン酸含有量が小さいという形質を有することに着目し、第４染色体の上記遺伝子領域に１又は複数のグルタミン酸代謝関連遺伝子が存在し得ることに想到した。

本明細書において「グルタミン酸代謝関連遺伝子」とは、果実中のグルタミン酸含有量の増減の直接的な又は間接的な原因となる遺伝子をいい、グルタミン酸生合成に関与する遺伝子、グルタミン酸分解に関与する遺伝子等であると考えられる。ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統が上記形質を示すことから、該系統の第４染色体上の上記領域に
含まれるグルタミン酸代謝関連遺伝子では、ソラナム・リコペルシカムの野生型遺伝子と比較して、グルタミン酸生合成促進に関与する遺伝子の活性を欠失又は減弱化する変異、グルタミン酸生合成抑制に関与する遺伝子の活性を増強する変異、グルタミン酸分解促進に関与する遺伝子の活性を増強する変異、グルタミン酸分解促進に関与する遺伝子の活性を欠失又は減弱化する変異等が生じているものと推測される。
以降、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統の第４染色体の上記遺伝子領域に含まれる、果実中のグルタミン酸含有量を低減させる原因となるグルタミン酸代謝関連遺伝子を、「ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７由来の原因遺伝子」とも記す。

なお、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統の第４染色体の６０,７０９,８４１ｂｐ〜６１,１７０,５８１ｂｐの遺伝子領域に、既知のグルタミン代謝関連酵素であるグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、及びグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）は座上していないことは、本発明者らにより確認されている。

本発明のソラナム・リコペルシカムにおいて、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７由来の原因遺伝子は、ホモ接合型で第４染色体上に含まれる。ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７由来の上記形質は劣勢形質であると考えられることから、ヘテロ接合型ではグルタミン酸含有量が低減した果実が得られない。

また、本発明のソラナム・リコペルシカムにおいて、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７由来の原因遺伝子は、前記形質が損なわれない限りにおいて、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７の該遺伝子の塩基配列と９０％以上の同一性を有するものであってもよく、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の同一性を有するものであってもよい。

また、本発明のソラナム・リコペルシカムは、第４染色体上にソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７由来の原因遺伝子を含み、前記形質が損なわれない限りにおいて、第４染色体上にソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統の第４染色体の６０,７０９,８４１ｂｐ〜６１,１７０,５８１ｂｐの、又は同６０,７０９,８４１ｂｐ〜６１，０６８，８１１ｂｐの遺伝子領域の一部または全部を含んでもよい。

本発明のソラナム・リコペルシカムの果実のグルタミン酸含有量は、野生型又は非改変系統のソラナム・リコペルシカムと比較して低いという特徴を有し、好ましくは野生型又は非改変系統のソラナム・リコペルシカムの果実のグルタミン酸含有量の５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下である。なお、「非改変」とは第４染色体上にソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７由来の原因遺伝子をホモ接合で座上させる改変を行っていないことをいう。また、ここでいう果実は赤く熟した状態の果実をいう。
果実中のグルタミン酸含有量は、常法により測定することができ、例えば、後述の実施例のように破砕により得た果汁に対してバイオケミストリーアナライザー（２９００型、ＹＳＩ社製）等を用いて測定することができる。この方法で測定する場合、第４染色体上にソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７由来の原因遺伝子をホモ接合で有しないソラナム・リコペルシカムの果実のグルタミン酸濃度は２００ｍｇ％程度であるところ、本発明のソラナム・リコペルシカムの果実のグルタミン酸濃度は好ましくは１００ｍｇ％以下、より好ましくは６０ｍｇ％以下、さらに好ましくは４０ｍｇ％以下である。

また、本発明のソラナム・リコペルシカムの果実においては、糖質含有量にグルタミン酸含有量が低減する形質の発現が影響しない。

本発明のソラナム・リコペルシカムは、遺伝子工学的手法により製造することができる
。遺伝子工学的手法としては、例えば公知のゲノム編集技術が挙げられ、具体的にはＣＲＩＳＰＲ法、ＺＦＮ法、ＴＡＬＥＮ法等によって、ソラナム・リコペルシカムのゲノムが前記原因遺伝子を含むように操作することが挙げられる。また、その他に、以下の製造方法によっても取得することができる。
まず、第一の親品種として第４染色体上に、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統の第４染色体の６０,７０９,８４１ｂｐ〜６１,１７０,５８１ｂｐの遺伝子領域に含まれるグルタミン酸代謝関連遺伝子、好ましくは同６０,７０９,８４１ｂｐ〜６１，０６８，８１１ｂｐの遺伝子領域に含まれるグルタミン酸代謝関連遺伝子を含む第一の親品種を用意する。かかる第一の親品種としては、ソラナム・リコペルシカムを好ましく用いることができ、また、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統でもよいし、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統と他の栽培種との交配種でもよい。
第二の親品種としては、任意のものを用意すればよく、好ましくはソラナム・リコペルシカムを用いる。また、第二の親品種は、前記遺伝子又は遺伝子領域を含まないものであってよい。

そして、第一の親品種と第二の親品種とを交配してＦ１世代を得る工程、得られたＦ１世代又はその後代において、第４染色体上に、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統の第４染色体の６０,７０９,８４１ｂｐ〜６１,１７０,５８１ｂｐの遺伝子領域に含まれるグルタミン酸代謝関連遺伝子、好ましくは同６０,７０９,８４１ｂｐ〜６１，０６８，８１１ｂｐの遺伝子領域に含まれるグルタミン酸代謝関連遺伝子をホモ接合型で含むソラナム・リコペルシカムを選抜する工程、を行うことにより、果実のグルタミン酸含有量が低減したソラナム・リコペルシカムを製造することができる。得られたＦ１世代の後代は、Ｆ１世代を自殖させてＦ２世代を得る工程、Ｆ１世代と第一の親品種又は第二の親品種とを戻し交配（バッククロス）する工程、又はＦ１世代と任意のソラナム・リコペルシカムとを交配する工程等によって取得することができる。また、本製造方法において、これらの後代を得る工程及び選抜する工程は複数回繰り返してもよい。

所望のソラナム・リコペルシカムを選抜する工程は、第４染色体上のソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統由来の原因遺伝子を含む遺伝子領域を、任意のマーカーで検出することにより行うことができる。
例えば、配列番号１１の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１２の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセットを用いるＰＣＲにより、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統の第４染色体の６０，７４８，３２０ｂｐのマーカーを検出する。配列番号１３の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１４の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセットを用いるＰＣＲにより、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統の第４染色体の６０，８０９，１２６ｂｐのマーカーを検出する。配列番号１５の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１６の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセットを用いるＰＣＲにより、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統の第４染色体の６０，８１８，３９４ｂｐのマーカーを検出する。配列番号１７の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１８の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセットを用いるＰＣＲにより、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統の第４染色体の６０，８２７，００１ｂｐのマーカーを検出する。配列番号１９の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２０の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセットを用いるＰＣＲにより、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統の第４染色体の６０，８８６，１２２ｂｐのマーカーを検出する。配列番号２１の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２２の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセットを用いるＰＣＲにより、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統の第４染色体の６１，０６８，８１１ｂｐのマーカーを検出する。配列番号２３の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２４の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセットを用いるＰＣＲにより、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統の第４染色体の６１，１２５，３８２ｂｐのマーカーを検出する。

好ましい態様では、前記選抜する工程は、配列番号１１の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１２の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１３の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１４の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１５の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１６の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、列番号１７の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１８の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１９の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２０の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号２１の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２２の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、又は配列番号２３の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２４の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセットを用いるＰＣＲを行うことで行われる。そして、前記プライマーセットにより検出されるマーカーが、第４染色体上にソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７由来の原因遺伝子及び／又はこれを含む遺伝子領域がホモ接合で存在することを示すソラナム・リコペルシカムを選択する。

より好ましい態様では、前記選抜する工程は、配列番号１１の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１２の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１３の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１４の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１５の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１６の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、列番号１７の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１８の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、又は配列番号１９の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２０の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセットを用いるＰＣＲを行うことで行われる。そして、前記プライマーセットにより検出されるマーカーが、第４染色体上にソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７由来の原因遺伝子及び／又はこれを含む遺伝子領域がホモ接合で存在することを示すソラナム・リコペルシカムを選択する。

前記選抜する工程において、選択されるソラナム・リコペルシカムにおいて検出される、第４染色体上にソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７由来の原因遺伝子がホモ接合で存在することを示すマーカーは、１つでもよく、２つ以上でもよい。
好ましくは、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統の第４染色体の、６０，７４８，３２０ｂｐのマーカー、６０，８０９，１２６ｂｐのマーカー、６０，８１８，３９４ｂｐのマーカー、６０，８２７，００１ｂｐのマーカー、６０，８８６，１２２ｂｐのマーカー、６１，０６８，８１１ｂｐのマーカー、及び６１，１２５，３８２ｂｐのマーカー、からなる群から選択される１以上のマーカーが検出される。
好ましくは、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統の第４染色体の、６０，７４８，３２０ｂｐのマーカー、６０，８０９，１２６ｂｐのマーカー、６０，８１８，３９４ｂｐのマーカー、６０，８２７，００１ｂｐのマーカー、及び６０，８８６，１２２ｂｐのマーカーからなる群から選択される１以上のマーカーが検出される。

マーカーの検出により、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統由来の原因遺伝子及び／又はこれを含む遺伝子領域が、第４染色体上にホモ接合型で存在することが示された場合、かかるソラナム・リコペルシカムはグルタミン酸含有量が低減した果実を産生する系統であると判断される。

別の観点では、本発明のソラナム・リコペルシカムは、上記いずれかのプライマーセットを用いるＰＣＲにより、第４染色体上にソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統由来の原因遺伝子及び／又はこれを含む遺伝子領域がホモ接合型で存在することが検出されるソラナム・リコペルシカムであるともいえる。

また、本発明の別の態様としては、上記いずれかのプライマーセットを用いるＰＣＲを
行うことにより、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統由来の原因遺伝子及び／又はこれを含む遺伝子領域を検出する工程を含む、ソラナム・リコペルシカムを鑑別する方法である。この鑑別方法において、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統由来の原因遺伝子及び／又はこれを含む遺伝子領域が、第４染色体上にホモ接合型で存在することが示された場合、かかるソラナム・リコペルシカムはグルタミン酸含有量が低減した果実を産生する系統であると鑑別される。

次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

＜材料＞
用いたソラナム・リコペルシカムの系統を表１に示す。ＴＡ１４５９及びＴＡ１５６２は、ＵＣＤＡＶＩＳＣ.Ｍ. ＲｉｃｋＴｏｍａｔｏＧｅｎｅｔｉｃｓＲｅｓｏｕｒｃｅＣｅｎｔｅｒ（ＴＧＲＣ http://tgrc.ucdavis.edu）から入手したものであり、野生種ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統と栽培種ソラナム・リコペルシカムＥ６２０３とのイントログレッションラインである。これと、カゴメ株式会社内の圃場で育成された６系統（ＰＫ４７６、ＰＫ９８５、ＰＫ７５０、ＰＫ９９３、ＰＫ８９３、ＰＫ７３６）及びカゴメ株式会社にて収集した１系統（ＴＫ５５３９）からなる群のいずれか１系統とを交雑して、Ｆ１系統（Ｋｃ１４−９７９、Ｋｃ１４−９８０、Ｋｃ１４−９８１、Ｋｃ１４−９８２、Ｋｃ１４−９８３、Ｋｃ１４−９８４、Ｋｃ１４−９８５）を得た。さらに前記Ｆ１系統の自殖により、Ｆ２系統（Ｋｃ１４−９７９−１、Ｋｃ１４−９８０−１、Ｋｃ１４−９８１−１、Ｋｃ１４−９８２−１、Ｋｃ１４−９８３−１、Ｋｃ１４−９８４−１、Ｋｃ１４−９８５−１）を得た。
これらのソラナム・リコペルシカム植物体は、２０１５年〜２０１６年に、カゴメ株式会社内の圃場にて、育成・栽培を行った。

＜方法＞
（１）ＤＮＡマーカーの作成
公知のデータベース（ＳｏｌＧｅｎｏｍｉｃｓＮｅｔｗｏｒｋ https://solgenomics.net/）で公開されている、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統とソラナム・リコペルシカムの塩基配列情報に基づいて、野生種ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統と栽培種ソラナム・リコペルシカムとの間で多型が検出可能なＤＮＡマーカーを作成した。作成したＤＮＡマーカーの配列情報とアニーリング温度を表２に示す。公知のデータベースで公開されている塩基配列情報のマップは、バージョンＳＬ２．５０を用いた。

（２）ＤＮＡマーカー検定
ソラナム・リコペルシカムの各系統から抽出したＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行い、そのＰＣＲ産物についてキャピラリー電気泳動装置（ＤＮＡ／ＲＮＡ分析用マイクロチップ電気泳動装置ＭＣＥ−２０２、島津社製）で電気泳動を行うことにより、ＤＮＡマーカー検定を行った。ＰＣＲの反応条件は以下に示す。キャピラリー電気泳動は、前記装置の所定のプロトコルに従った。各ＤＮＡマーカーのバンドパターンを表３に示す。
＜ＰＣＲ反応液組成＞
テンプレートＤＮＡ 0.5μL
２×ＰＣＲバッファー（ＴＯＹＯＢＯ社製） 12.5μＬ
ｄＮＴＰＭｉｘ２ｍＭ（ＴＯＹＯＢＯ社製） 5μＬ
フォワードプライマー 1μＬ
リバースプライマー 1μＬ
KOD FX（ＴＯＹＯＢＯ社製） 0.25μＬ
超純水 4.75μＬ

（３）グルタミン酸濃度の測定
各系統において、赤く熟した果実を３回にわたって収穫し、それぞれにおいてグルタミン酸濃度を測定し、平均値を算出した。収穫した果実をミキサーで１分間破砕してビン容器に充填し、沸騰湯浴中で３０分間加熱し、ろ紙（定量濾紙Ｎｏ．５Ａ、ADVANTEC社製）でろ過したろ液を、測定サンプルとして用いた。グルタミン酸濃度は、バイオケミストリーアナライザー（２９００型、ＹＳＩ社製）を用いて測定した。グルタミン酸濃度の単位である「ｍｇ％」とは、果実１００ｇあたり何ｍｇのグルタミン酸を含むかを表したものである。

（４）糖度（ＲＩ）の測定
グルタミン酸濃度の測定と同様の方法で調製した測定サンプルについて、デジタル屈折計ＲＸ５０００ｉ（ＡＴＡＧＯ社製）を用いて糖度を測定した。測定時の品温は、２０℃とした。

＜結果＞
（１）イントログレッションラインの解析
イントログレッションラインＴＡ１４５９及びＴＡ１５６２はいずれも、第４染色体上に野生種ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統由来のＤＮＡ配列を有している。これら２系統の解析を行ったところ、バックグラウンドであるソラナム・リコペルシカムＥ６２０３に比べ、有意に果実中のグルタミン酸含量が低減していることがわかった（表４）。このことから、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統の第４染色体上には、果実中のグルタミン酸濃度を低減させる原因遺伝子が存在することが示唆された。

（２）Ｆ１系統の解析
全てのＦ１系統において、果実中のグルタミン酸濃度の低減が見られなかった（表４）。このことから、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統に由来する、果実中のグルタミン酸濃度を低減させる遺伝形質は、劣性形質であると考えられた。そのため、該遺伝形質を発現させるためには、原因遺伝子領域をホモ接合で保有させる必要があると考えられる。

（３）Ｆ２系統の解析
Ｆ２系統において、マーカー検定を行ったところ、マーカーＮｏ．１６、マーカーＮｏ．１９及びマーカーＮｏ．２３がＬＡ１７７７型ホモになっている個体において、グルタミン酸濃度が低減していることがわかった（表５）。このことから、野生種ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統由来の本遺伝形質は、どんなバックグランドの品種に導入してもグルタミン酸含量を低減させることが明らかとなった。またグルタミン酸含量をＲＩで割った値を系統間・遺伝子型間で比較するとグルタミン酸含量と同様のパターンを示すことから、グルタミン酸含量の低減に伴うＲＩへの影響は小さいものと考えられる。
さらに、マーカーＮｏ．１６、とマーカーＮｏ．２３に間にＤＮＡマーカーを複数作成し、これらを用いてＫｃ１４−９８５−１に対してマーカー検定を行った結果、マーカーＮｏ．３４からマーカーＮｏ．３３までの間がＬＡ１７７７型ホモになっている個体にお
いて、グルタミン酸濃度が低減していることが明らかとなった（表５）。

（４）Ｆ３系統の解析
Ｆ２系統を自殖して、Ｆ３系統を得た。用いた系統を表６に示す。Ｆ３系統において、マーカー検定を行った結果、マーカーＮｏ．３４からマーカーＮｏ．２６までの間がＬＡ１７７７型ホモになっている個体において、グルタミン酸濃度が低下していることが明らかとなった（表７）。

本発明によれば、その果実のグルタミン酸含有量が低減したソラナム・リコペルシカム及びその製造方法が提供される。グルタミン酸含有量が低減したトマト果実では、甘味のマスキングが抑制されるため、飲料やデザート等のトマト加工食品又は生食用トマトとして好適であり、産業上有用である。

Claims

ソラナム・リコペルシカム（Solanum lycopersicum）であって、
第４染色体上にグルタミン酸代謝関連遺伝子をホモ接合型で含み、
前記グルタミン代謝関連遺伝子は、ソラナム・ハブロカイテス（Solanum habrochaites）ＬＡ１７７７系統の第４染色体の６０,７０９,８４１ｂｐ〜６１,１７０,５８１ｂｐの遺伝子領域に含まれるものである、ソラナム・リコペルシカム。
前記グルタミン代謝関連遺伝子が、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統の第４染色体の６０,７０９,８４１ｂｐ〜６１，０６８，８１１ｂｐの遺伝子領域に含まれるものである、請求項１に記載のソラナム・リコペルシカム。
ソラナム・リコペルシカムであって、
配列番号１１の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１２の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１３の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１４の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１５の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１６の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１７の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１８の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１９の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２０の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号２１の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２２の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、又は配列番号２３の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２４の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセットを用いるＰＣＲによって、第４染色体上にホモ接合型で存在するグルタミン酸代謝関連遺伝子が検出される、ソラナム・リコペルシカム。
配列番号１１の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１２の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１３の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１４の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１５の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１６の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１７の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１８の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、又は配列番号１９の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２０の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセットを用いるＰＣＲによって、第４染色体上にホモ接合型で存在するグルタミン酸代謝関連遺伝子が検出される、請求項３に記載のソラナム・リコペルシカム。
その果実のグルタミン酸含有量が、野生型又は非改変系統のソラナム・リコペルシカムと比較して低い、請求項１〜４の何れか一項に記載のソラナム・リコペルシカム。
ソラナム・リコペルシカムの製造方法であって、
第４染色体上にグルタミン酸代謝関連遺伝子を含む第一の親品種と、任意の第二の親品種とを交配してＦ１世代を得る工程、
得られたＦ１世代又はその後代において、第４染色体上に前記グルタミン酸代謝関連遺伝子をホモ接合型で含むソラナム・リコペルシカムを選抜する工程、を含み、
前記グルタミン代謝関連遺伝子は、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統の第４染色体の６０,７０９,８４１ｂｐ〜６１,１７０,５８１ｂｐの遺伝子領域に含まれるものである、製造方法。
前記選抜工程は、配列番号１１の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１２の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１３の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１４の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１５の塩基配列
を有するＤＮＡ及び配列番号１６の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１７の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１８の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１９の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２０の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号２１の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２２の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、又は配列番号２３の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２４の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセットを用いるＰＣＲにより行われる、請求項６に記載の製造方法。
前記グルタミン代謝関連遺伝子が、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統の第４染色体の６０,７０９,８４１ｂｐ〜６１，０６８，８１１ｂｐの遺伝子領域に含まれるものである、請求項６に記載の製造方法。
前記選抜工程は、配列番号１１の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１２の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１３の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１４の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１５の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１６の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１７の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１８の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、又は配列番号１９の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２０の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセットを用いるＰＣＲにより行われる、請求項８に記載の製造方法。
製造されるソラナム・リコペルシカムの果実のグルタミン酸含有量が、野生型又は非改変系統のソラナム・リコペルシカムと比較して低い、請求項６〜９のいずれか一項に記載の製造方法。
ソラナム・リコペルシカムを鑑別する方法であって、
ソラナム・リコペルシカムの第４染色体上のグルタミン酸代謝関連遺伝子を含む遺伝子領域を検出する工程を含み、
前記検出工程は、配列番号１１の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１２の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１３の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１４の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１５の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１６の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１７の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１８の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１９の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２０の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号２１の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２２の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、又は配列番号２３の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２４の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセットを用いるＰＣＲにより行われる、方法。
前記検出工程が、配列番号１１の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１２の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１３の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１４の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１５の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１６の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１７の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１８の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、又は配列番号１９の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２０の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセットを用いるＰＣＲにより行われる、請求項１１に記載の方法。