JP2019103523A - デジタル生物学的コンバータ - Google Patents

Abstract

【課題】生物学的配列情報を受け取り生物学的実体の合成を活性化する為のシステムの提供を課題とする。【解決手段】本発明は生物学的配列情報を受け取り生物学的実体の合成を活性化する為のシステムを提供する。システムは、送信ユニットから伝達される生物学的配列情報をコードするシグナルを受け取る為の受信ユニットを有する。システムは、受信ユニットに接続されたアセンブリーユニットを有し、アセンブリーユニットは、生物学的実体を生物学的配列情報に従って構築する。本発明に従って、生物学的配列情報は離れた位置にデジタル的に伝達され、この情報は受信ユニットによって受信されると直ちに、かつ情報の受信のためにシステムを準備した後にさらなるヒトの介入なく、生物学的実体、例えばワクチンとして有用なタンパク質に変換できる。本発明は、例えば特定の場所に特異的なウイルス及びその他の生物学的脅威に迅速に応答する為に有用である。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
この出願は、２０１２年８月１６日に出願された米国仮出願第６１／６８４，０７６号の利益を主張し、これは、全ての表、図および請求項を含むその全体が参照により本明細書に援用される。

発明の分野
本発明は、関心対象の生物学的配列などの生物情報の最終生物学的実体への自動化された変換に属する。また、本発明は、たとえば、生物学的脅威への迅速な応答のために提供することに属する。

配列表の組み込み
添付の配列表における要素は、参照により本明細書によって本出願に援用される。添付の配列表テキストファイル、名称ＳＧＩ１６００＿１ＷＯ＿ＰＣＴ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５は、２０１３年８月１６日に作成され、１５ＫＢである。ファイルは、Ｗｉｎｄｏｗｓ ＯＳを使用するコンピュータ上でＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｏｒｄを使用して評価することができる。

発明の背景
本発明の背景の以下の記述は、本発明を理解する際の支援を提供するが、本発明に対する従来技術であるとは、またはそれを記述するものとは認められない。

遺伝情報は、ＤＮＡ分子を形成するヌクレオチドの配列の形態で貯蔵されており、これはこのように全ての細胞プロセスのために必要なタンパク質およびペプチドの生物学的合成のために必要な情報をコードする。デジタル技術は、数秒で莫大な距離を越えてデジタル情報の伝達ができる。この情報は、デジタル情報を有用な機能に変換する多くのプロセスのために有用である。非常に大きな距離を越えてデジタル形式で生物情報の伝達をし、次いでそのデジタル情報を広く多様な生物学的実体のいずれかへ変換できるシステムを有することは、望ましいだろう。次いで、このような生物学的実体は、たとえば、共同体に対する生物学的脅威に対する応答などの、広く多様な生物学的機能の遂行のために有用だろう。また、望ましいシステムにより、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、タンパク質、ウイルスおよびファージ粒子の合成、ワクチンおよび合成細胞のための生物情報の使用が可能であろう。

生物学的脅威に応答することに関し、１つの重要な側面は、脅威に対して十分な数の集団のメンバーに接種するために十分な量のワクチンの供給であり得る。ワクチンを製造するために必要な情報の決定的な項目は、生物学的脅威と関連する生物学的配列情報である。生物学的脅威がウイルスであるとき、その配列情報は、ウイルス試料から配列情報を引き出すことによって得ることができる。一旦配列が決定されたら、ワクチンを製造することができる。これは、多様な形式をとることができ、その１つは、ウイルス脅威のタンパク質膜もしくはその一部またはこの生物学的脅威の別の抗原成分を製造することであり、生物学的脅威に対する接種された個体における応答を刺激するための抗原を提供するだろう。

したがって、たとえば、抗原をコードする核酸配列を合成することができる。これは、オリゴヌクレオチドの合成を調整するために数日までの研究を含み得、次いで、最終的な核酸配列を形成するように構築することができる。また、これは、いくつかの研究室の関与を含み得る。次いで、最終的な核酸が得られた後に配列が翻訳され、インビトロであってもインビボであっても、抗原タンパク質を合成することができる。

生物学的脅威に対する応答において、時間は最も重要なものであり得、応答計画を実行する、または直接感染者と仕事をするだろう医療対応チームのメンバーは接種を受けて脅威から免疫を得、疾病の脅威によって妨げられずに自身の任務を実施し続けるために対応することができる。また、ワクチン調製における遅延は、決定的な時にワクチンが十分な量準備できないということでもあり、これもまた生物学的脅威に応答する際の重要な限定要因である。

さらにまた、ウイルスまたはその他の生物学的脅威の特質はたいてい、場所ごとに異なる。したがって、１つの場所において最大限に有効かもしれないワクチンは、迅速なウイルス突然変異が原因で、別の場所において有効でないかもしれない。

したがって、デジタル形式で生物情報を伝達すること、および多様な生物学的最終産物へそのデジタル情報の変換を可能にすることができるシステムの必要性がある。また、自動化されたシステムを有することは、非常にこれらの目標の達成に寄与するだろう。このようなシステムは、時間が重要であろうウイルスおよびその他の生物学的脅威に迅速に、および効率的に応答するなどの種々の生物学的課題を満たすだろう。また、種々の場所に存在する特異的脅威に対処するために場所ごとに目的に合わせた応答を可能にするだろう。

本発明は、離れた位置から生物学的配列情報を受け取る、生物学的配列情報に基づいた生物学的実体の自動化された合成のためのシステムおよび方法を提供する。本システムおよび方法は、特定の場所に対して特異的であるウイルスおよびその他の生物学的脅威への迅速な応答を可能にする。また、本発明のシステムで方法を実行するための材料および試薬を含むキットを提供する。システムは、自動化された様式で生物学的配列情報からＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、タンパク質またはペプチドなどの生物学的実体を産生することができ、さらにまた、自動化された様式でインビボでウイルス粒子を産生することができる。したがって、システムは、インフルエンザワクチンなどのワクチン産生において有用である。

第１の側面において、本発明は、生物学的配列情報を受け取り、機能的生物学的実体の合成を活性化するためのシステムを提供する。システムは、送信ユニットから伝達された生物学的配列情報をコードするシグナルを受け取るための受信ユニットを有し、送信ユニットは、受信ユニットから離れた位置に存在する。また、システムは、生物学的配列情報に従って生物学的実体を構築するために、受信ユニットに接続されたアセンブリーユニットを有する。アセンブリーユニットは、生物学的ビルディングブロック分子および／またはすでに合成されたオリゴヌクレオチドを含む試薬容器を有しているか、または接続されており、さらにまた、システム中の試薬を輸送するための、および機能的生物学的実体を合成するための自動化された方法における工程を実行するための、構成要素を有する。システムの受信ユニットは、生物学的配列情報を受け取り、それをアセンブリーユニットに提供する。

一つの態様において、送信ユニットおよび受信ユニットは、コンピュータネットワークの一部であるコンピュータである。生物学的ビルディングブロック分子は、ｄＮＴＰまたはヌクレオシドホスホラミダイトであることができる。また、システムは、生物学的配列情報に従ってｄＮＴＰまたはヌクレオシドホスホラミダイトをオリゴヌクレオチドのセットへと構築するためのプログラミング命令を有することができる。また、それは、オリゴヌクレオチドのセットをＤＮＡ分子へと構築するためのプログラミング命令を有することができる。一つの態様において、機能的生物学的実体は、ＤＮＡ分子である。また、オリゴヌクレオチドは、すでに合成された発明のシステムまたは方法に提供されることができ、システムまたは方法は、オリゴヌクレオチドをＤＮＡ分子へと構築するためのものである。

一つの態様におけるシステムは、機能的ＤＮＡ分子を生物学的産物へ転写および／または翻訳するための試薬を含む１つまたは複数の容器を有する。生物学的配列情報は、少なくともウイルス粒子またはバクテリオファージの一部をコードする核酸をコードすることができる。また、アセンブリーユニットは、生物学的実体を生物学的産物に変換することができ、いくつかの態様において、生物学的産物は、ウイルス粒子もしくはウイルス粒子の一部またはファージまたは細胞であることができる。ウイルス粒子またはウイルス粒子の一部は、タンパク質抗原であることができる。いくつかの態様において、アセンブリーユニットはまた、宿主細胞を含む１つまたは複数の容器を有するか、または接続されている。また、本発明のシステムは、ＲＮＡ分子へのＤＮＡ分子の転写のための、および／または機能的ペプチドまたはタンパク質へのＲＮＡ分子の翻訳のための１つまたは複数の容器および試薬を有することができ、この翻訳はインビトロでまたはインビボですることができる。また、システムは、反応容器の異なる反応区画において自動化された方法の工程を行うためのプログラミング命令を有することができる。

もう一つの側面において、本発明は、機能的生物学的実体を合成する方法を提供する。方法は、機能的生物学的実体を合成するシステムにおける送信ユニットから生物学的配列情報を受け取ることを含む。方法のシステムは、本明細書において記述される本発明のシステムである。さらに、方法は、自動化された方法において機能的生物学的実体を合成することを含む。

方法において、アセンブリーユニットは、生物学的配列情報を受け取る前に、機能的生物学的実体の構築のために調製されうる。調製は、システムの反応容器にｄＮＴＰまたはヌクレオシドホスホラミダイトなどの生物学的ビルディングブロックまたはビルディングブロック重合体を、またはすでに合成されたオリゴヌクレオチドまたはペプチドを装填することを含み得る。本発明のいくつかの方法において、生物学的配列情報は、少なくともウイルス粒子の一部をコードする核酸分子をコードする。機能的タンパク質またはペプチドを産生する方法において、それは、ウイルスのタンパク質またはペプチドであることができる。また、機能的生物学的実体は、５ｋｂより大きなＤＮＡ分子であることができる。

方法の一つの態様において、ビルディングブロック分子は、ビルディングブロック重合体を形成するようにインビトロ反応で連結される。ビルディングブロック分子は、ヌクレオチドまたはヌクレオシドホスホラミダイトであることができ、ビルディングブロック重合体は、オリゴヌクレオチドもしくはペプチドもしくはリボヌクレオチドまたはいずれかの誘導体であることもできる。

いくつかの態様において、方法は、反応容器の第１の区画から反応容器の第２の区画までオリゴヌクレオチドを輸送することを含む。また、方法は、反応容器の第１の反応区画において方法の１つの工程および反応容器の第２の反応区画において方法の第２の工程を行うことを含むことができる。一つの態様において、第１の工程は、ＤＮＡ分子の構築であり、第２の工程は、ＤＮＡ分子のＲＮＡへの転写である。また、方法は、反応容器の第３の反応区画において行われる第３の工程を有することができ、第３の工程は、インビボでのウイルス粒子の産生を含む。その他の態様において、生物学的実体を合成することは、ＤＮＡ構築工程を含む。また、方法の工程は、複数のレベルの生物学的構築を含むことができる。したがって、方法は、ＤＮＡ構築工程およびＲＮＡ転写工程を有することができる。ＤＮＡ構築工程は、反応容器の第１の反応区画において行うことができ、ＲＮＡ転写工程は、反応容器の第２の反応区画において行うことができる。また、方法は、反応容器の第３の反応区画におけるインビボでのウイルス粒子の産生を含む工程を有することができる。

[本発明1001]
生物学的配列情報を受け取り、機能的生物学的実体の合成を活性化するためのシステムであって：
受信ユニットから離れた位置に存在する送信ユニットから伝達された、生物学的配列情報をコードするシグナルを受け取るための受信ユニット；
生物学的配列情報に従って生物学的実体を構築するための、受信ユニットに接続されたアセンブリーユニットであって、生物学的ビルディングブロック分子を含有する容器を含むか、またはそれに接続され、かつ、システム中の試薬を輸送するための、および機能的生物学的実体を合成するために自動化された方法における工程を実行するための構成要素を含有する、アセンブリーユニット；
を含み、受信ユニットが、生物学的配列情報を受け取り、アセンブリーユニットにそれを提供する、システム。
[本発明1002]
送信ユニットおよび受信ユニットが、コンピュータネットワークの一部であるコンピュータである、本発明1001のシステム。
[本発明1003]
生物学的ビルディングブロックが、ｄＮＴＰまたはヌクレオシドホスホラミダイトである、本発明1001のシステム。
[本発明1004]
生物学的配列情報に従ってｄＮＴＰまたはヌクレオシドホスホラミダイトをオリゴヌクレオチドのセットに構築するためのプログラミング命令をさらに含む、本発明1003のシステム。
[本発明1005]
オリゴヌクレオチドのセットをＤＮＡ分子に構築するためのプログラミング命令をさらに含む、本発明1003のシステム。
[本発明1006]
機能的生物学的実体がＤＮＡ分子である、本発明1003のシステム。
[本発明1007]
生物学的産物への機能的ＤＮＡ分子の転写および／または翻訳のための試薬を含有する1つまたは複数の容器をさらに含む、本発明1005のシステム。
[本発明1008]
生物学的配列情報が、ウイルス粒子またはバクテリオファージの少なくとも一部をコードする核酸をコードする、本発明1003のシステム。
[本発明1009]
アセンブリーユニットが、生物学的実体を生物学的産物にさらに変換する、本発明1006のシステム。
[本発明1010]
生物学的産物が、ウイルス粒子またはウイルス粒子の一部である、本発明1009のシステム。
[本発明1011]
ウイルス粒子またはウイルス粒子の一部がタンパク質抗原を含む、本発明1010のシステム。
[本発明1012]
アセンブリーユニットがさらに、宿主細胞を含む容器を含むか、またはそれに接続されている、本発明1009のシステム。
[本発明1013]
反応容器の異なる区画において自動化された方法の工程を行うためのプログラミング命令をさらに含む、本発明1001のシステム。
[本発明1014]
以下の段階を含む、機能的生物学的実体を合成する方法：
機能的生物学的実体を合成するためのシステムにおいて送信ユニットから生物学的配列情報を受け取る段階であって、システムが、
送信ユニットから伝達された生物学的配列情報をコードするシグナルを受け取るための、送信ユニットから離れた位置に存在する受信ユニット；
生物学的配列情報に従って機能的生物学的実体を構築するための、受信ユニットに接続されたアセンブリーユニットであって、生物学的ビルディングブロック分子、および、生物学的ビルディングブロック分子から機能的生物学的実体を合成する反応を行うための試薬を含有する容器を含むか、またはそれに接続された、アセンブリーユニット；
を含み、アセンブリーユニットが、生物学的配列情報に従って生物学的実体を構築するように構成されている、段階；ならびに、
自動化された方法において機能的生物学的実体を合成する段階。
[本発明1015]
送信ユニットおよび受信ユニットが、コンピュータネットワークの一部であるコンピュータである、本発明1014の方法。
[本発明1016]
アセンブリーユニットが、生物学的配列情報を受け取る前に、機能的生物学的実体の構築のために調製されている、本発明1014の方法。
[本発明1017]
生物学的ビルディングブロックが、ｄＮＴＰまたはヌクレオシドホスホラミダイトである、本発明1014の方法。
[本発明1018]
システムが、生物学的配列情報に従ってｄＮＴＰまたはヌクレオシドホスホラミダイトをオリゴヌクレオチドのセットに構築するためのプログラミング命令をさらに含む、本発明1017の方法。
[本発明1019]
システムが、オリゴヌクレオチドのセットをＤＮＡ分子に構築するためのプログラミング命令をさらに含む、本発明1018の方法。
[本発明1020]
機能的生物学的実体がＤＮＡ分子である、本発明1014の方法。
[本発明1021]
システムが、ＲＮＡ分子へのＤＮＡ分子の転写のための1つまたは複数の容器および試薬を含む、本発明1019の方法。
[本発明1022]
システムが、機能的なタンパク質またはペプチドへのＲＮＡ分子のインビトロ翻訳のための1つまたは複数の容器および試薬をさらに含む、本発明1021の方法。
[本発明1023]
生物学的配列情報が、ウイルス粒子の少なくとも一部をコードする核酸分子をコードする、本発明1014の方法。
[本発明1024]
機能的なタンパク質またはペプチドがウイルスのタンパク質またはペプチドである、本発明1022の方法。
[本発明1025]
ＤＮＡ分子が5ｋｂより大きい、本発明1020の方法。
[本発明1026]
ビルディングブロック分子が、ビルディングブロック重合体を形成するようにインビトロ反応で連結される、本発明1014の方法。
[本発明1027]
ビルディングブロック分子がヌクレオチドまたはヌクレオシドホスホラミダイトであり、ビルディングブロック重合体がオリゴヌクレオチドである、本発明1026の方法。
[本発明1028]
反応容器の第1の区画から反応容器の第2の区画までオリゴヌクレオチドを輸送することをさらに含む、本発明1027の方法。
[本発明1029]
反応容器の第1の区画において方法の1つの工程を、および反応容器の第2の区画において方法の第2の工程を行うことをさらに含む、本発明1027の方法。
[本発明1030]
生物学的実体を合成する段階がＤＮＡ構築工程を含む、本発明1027の方法。
[本発明1031]
方法の工程が、複数のレベルの生物学的構築を含む、本発明1030の方法。
[本発明1032]
ＤＮＡ構築工程およびＲＮＡ転写工程を含む、本発明1031の方法。
[本発明1033]
ＤＮＡ構築工程が反応容器の第1の反応区画において行われ、かつＲＮＡ転写工程が反応容器の第2の反応区画において行われる、本発明1032の方法。
[本発明1034]
反応容器の第3の反応区画におけるインビボでのウイルス粒子の産生を含む工程をさらに含む、本発明1032の方法。
[本発明1035]
以下を含む、提供された生物学的配列情報に従った機能的生物学的実体の合成のための自動化されたシステム：
提供された生物学的配列情報に従って生物学的実体を構築するためのアセンブリーユニットであって、生物学的ビルディングブロック分子を含有する容器を含むか、またはそれに接続され、かつ、システム中の試薬を輸送するための、および機能的生物学的実体を合成するために自動化された方法における工程を実行するための構成要素を含有する、アセンブリーユニット。
上で記述した本発明の概要は限定的でなく、本発明のその他の特徴および利点は、以下の発明の詳細な説明および請求項から明らかだろう。

図１は、本発明の使用の図式的な説明を提供し、大まかに生物情報の伝達および有用な生物学的実体へのその変換を描写する。 図２は、種々のインフルエンザウイルス株からの核酸構築物ＨＡ（Ｈ）およびＮＡ（Ｎ）の構築を示す０．８％プレキャストアガロースゲルを図示し、それぞれは本発明の方法を使用して本発明のシステムにおいて９６のプールされたオリゴヌクレオチドから構築された。構築物ＨＡおよびＮＡは両方とも、およそ３ｋｂである。図２ａ−レーン１：Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２０１０（Ｈ１Ｎ１）＿ＨＡ；レーン２：Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２０１０（Ｈ１Ｎ１）＿ＮＡ；レーン３：Ｘ１７９Ａ＿ＴＤ（Ｈ１Ｎ１）＿ＨＡ；レーン４：Ｘ１７９Ａ（Ｈ１Ｎ１）＿ＮＡ；レーン５：Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１＿ＣＤＣ／ Ｅ３（Ｈ３Ｎ２）＿ＨＡ；レーン６：Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１（Ｈ３Ｎ２）＿ＮＡ；レーン７：Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／２５６／２０１１＿Ｐ２／Ｅ３（Ｈ３Ｎ２）＿ＨＡ；レーン８：Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／２５６／２０１１＿Ｐ２／Ｅ３（Ｈ３Ｎ２）＿ＮＡ；標準レーン。図２ｂ−標準レーン；レーン１：Ｂ／Ｔｅｘａｓ／０６／２０１１＿ＢＸ−４５＿ＨＡ；レーン２：Ｂ／Ｔｅｘａｓ／０６／２０１１＿ＢＸ−４９＿ＮＡ；レーン３：Ｂ／Ｎｅｗ＿Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ／１／２０１２＿ＨＡ；レーン４：Ｂ／Ｎｅｗ＿Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ／１／２０１２＿ＮＡ；レーン５：Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８＿ＨＡ；レーン６：Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８＿ＮＡ；レーン７：Ｂ／Ｎｅｖａｄａ／０３／２０１１＿ｖ２＿ＨＡ；レーン８：Ｂ／Ｎｅｖａｄａ／０３／２０１１＿ｖ２＿ＮＡ。

発明の詳細な説明
本発明は、大きな距離を越えてデジタル形式で生物情報を伝達するためのシステムと、その情報のその後の迅速な最終生物学的実体への変換を提供する。生物学的配列情報は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、タンパク質またはペプチド、ウイルスおよび／またはファージ粒子、ワクチン、合成細胞または任意の生物学的実体の合成のために必要なその情報であることができる。生物学的実体は、生物学的実体を構築または合成しようとする特定の場所に位置する本発明のシステムによって合成することができる。

本発明は、生物学的脅威に迅速に応答することに関して多数の利点を提供する。一つの態様において、生物学的脅威は、ウイルスの脅威である。本発明は、生物学的配列情報を生物学的脅威下の位置、たとえば離れた位置に迅速に伝達し、適切な応答に必要なワクチンまたはその他の材料を調製するためのプロセスにおいて即時に使用することができる。脅威は、インフルエンザまたはその他のウイルスの脅威であることができる。

一つの態様において、生物学的配列情報は、ウイルスに対するワクチンの製剤に必要な配列情報、すなわち１つまたは複数の変化するウイルス粒子の領域の配列である。したがって、本発明は、本発明のシステムを必要な試薬と共に事前にセットアップおよび調製し、システムが生物学的配列情報を受け取り、即時におよび自動化された様式でワクチンまたはその他の適切な生物学的応答を準備し始め、配列情報を受け取ると即時に脅威に対処することができる。したがって、脅威下のコミュニティーは、集団を生物学的脅威に対して接種するために短い時間枠の範囲内で利用できるだろうワクチンの供給を最大にするために、配列情報を受け取るように準備された複数のまたは大規模なシステムを有することができる。本発明は使用範囲が広く、ワクチンを特定の場所における特異的ウイルスの脅威に対処するようにカスタマイズすることを可能にする。したがって、ウイルスの異なる株が異なる場所に影響を及ぼす場合、それぞれの場所は、最も正確におよび効率的に脅威に応答するために、その場所に影響を及ぼしている特定の株にワクチンの応答を合わせることができる。ワクチンの調製を始める前に経過する時間数を減少または無くすことにより、および目的の場所に最も有効なワクチンを調製することにより、生物学的脅威に対する応答の有効性が非常に改善される。

また、本発明は、応答の迅速性および正確性が応答に決定的なおよび救命有効性を与え得るバイオテロリズムに関連した生物学的脅威に応答することにも適用性を有する。したがって、このような脅威に直面する場所は、最速で最も正確な応答を取り付けることができるように本明細書において開示したシステムをセットアップすることによって準備することができ、したがって、最小の損傷で脅威を覆す最も大きな可能性を有する。

本発明のシステムは、試料を操作することができる複数の反応領域を含む任意の反応容器で方法を行うことができるように、デザインすることができる。反応領域は規定されても（すなわち、容器の物理的な境界によって）、規定されなくても（すなわち、試料によって占められるスペースによってのみ規定される）もよい。一つの態様において、反応容器は、標準的な９６ウェルプレートであり、操作される試料を収容する複数の小さな反応領域、すなわちプレートのそれぞれのウェルを含む。本発明のシステムおよび方法において使用されるサーモサイクラーは典型的には９６ウェルプレートを収納するようにデザインされているので、これは便利である。しかしまた、操作される試料を含む複数の反応領域を収納する反応容器の任意のタイプが本発明において機能するだろうことは、理解されるだろう。たとえば、９６ウェル以外を有する反応プレートは、方法における適切な反応容器であるだろうし、または試料を操作することができる複数の反応領域を有するシャーレは、反応領域が物理的な境界によって規定されない場合であっても適切である。バイオチップでさえ、チップ上に複数の反応領域を有するので、反応容器であり得る。

反応容器上の反応区画を規定して利用することにより、オリゴヌクレオチドを合成することからタンパク質またはワクチンの産生までのマルチレベルのプロセスおよびさらなる方法を自動化された方法において行うことができるように、システムをデザインすることができることを発見した。これは、反応容器上の特異的反応区画に位置する反応領域において特定の工程を行うことによって達成される。

本発明においてロボット工学を使用することにより、試料を反応容器の特定の反応区画からその他の反応区画へと輸送することができ、自動化された方法を１つの反応容器において行うことができる。次の工程が生じるであろう反応区画にシステムが試料を移動する前に、反応容器上でその後の工程のために適した条件を確立することができるため、同じ反応容器におけるプロセスにおけるその後の工程を実施するための条件（たとえば、温度）によって試料が害されたり破壊されたりすることはない。したがって、反応試料は、それぞれのその後の工程が行われ当該その後の工程のための条件が反応容器上で作製されるにしたがって、反応容器を横切って新たな区画に移動されることができ、全プロセスは、同じ反応容器における自動化された方法において完了することができる。したがって、いくつかの態様において、本発明のシステムは自動化された方法を行う。

自動化された方法は、方法が開始された後にヒトの介入が必要でないものであり、方法は、ヒトの何らの行為を必要とすることなく、その位置から完了へと進み、この方法は、機能的生物学的実体を産生する。たとえば、一つの態様において、自動化された方法は、配列命令を本発明のシステムが受け取った後にヒトの介入が生じない方法であり、システムは、機能的核酸分子を産生するための方法を実行する。ヒトの介入は、方法を完了まで進ませるために人によって行われる任意の行為である。ヒトの介入は、１つの位置からもう１つの位置までの試料または反応容器の手動の移動を含み、試料または試薬の調製または移動、試薬または反応物の供給または再供給、システムの任意の成分のオンオフ、方法の実行を完了するのに必要な任意のその他の行為を含むが、限定されない。一つの例において、自動化された方法は、送信ユニットから生物学的配列情報を受け取ることにより開始される。方法は、ＤＮＡ分子の産生を生じるように自動化された方法として進行することができ、一つの態様において、複数のレベルの生物学的構築を有し得、ＤＮＡを転写してｍＲＮＡを産生し、また、さらにｍＲＮＡのタンパク質生物学的産物への翻訳に進行し得る。

本発明のシステムは、複数のレベルの生物学的構築を有することができ、その結果、たとえば、合成されたＤＮＡ分子をＲＮＡ分子に転写することができ、ＲＮＡ分子をさらに関心対象のタンパク質またはペプチドに翻訳し、または細胞培養と組み合わせて薬物産物の産生またはワクチン全体の合成をもたらすことができる。翻訳されたタンパク質は、またさらにシステムによって加工して、たとえばウイルス粒子もしくはワクチンまたはこれらの一部を産生することができる。構築のレベルは以下を含む：１）ヌクレオチドまたはヌクレオシドホスホラミダイトを連結することによるｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡ分子の合成；２）オリゴヌクレオチドを連結することによるｄｓＤＮＡ分子の構築（ＤＮＡ構築工程）；３）ＤＮＡ分子に従ったＲＮＡ分子の合成／転写（転写工程）；４）アミノ酸を連結することによるタンパク質もしくはペプチドの合成またはペプチドを連結することによるタンパク質の合成；５）ＲＮＡ分子の配列に従ったタンパク質またはペプチドの合成／翻訳（翻訳工程）；６）２つ以上のタンパク質（またはタンパク質サブユニット）の四次（ｑｕａｒｔｅｎａｒｙ）構造を有するタンパク質への構築（たとえば、ウイルス粒子またはその一部）。本発明のシステムおよび方法は、これらのレベルの構築のいずれかを行うことができる。これらのレベルの合成の少なくとも２つを行うシステムまたは方法は、複数のレベルの生物学的構築を有するシステムまたは方法であるが、システムおよび方法はまた、少なくとも３つのレベルまたは少なくとも４つのレベルまたは少なくとも５つのレベルの生物学的構築を有するようにすることもできる。一つの態様において、本発明のシステムおよび方法は、ヌクレオチド（誘導体を含む）またはヌクレオシドホスホラミダイト（誘導体を含む）からｄｓＤＮＡ分子を合成する。もう一つの態様において、本発明のシステムおよび方法は、オリゴヌクレオチドからｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡ分子を合成する。もう一つの態様において、本発明のシステムおよび方法は、アミノ酸からタンパク質またはペプチドを合成する。また、本発明のオリゴヌクレオチドまたはペプチドは、本明細書において記述されるように修飾、誘導体化または標識することができる。

図１に本発明の一態様を示す。送信ユニット１は、ある位置から、送信ユニット１から離れた位置に位置する本発明の種々のシステムの受信ユニット２まで、生物学的配列情報３を伝達する。受信ユニット２は、生物学的配列情報３をコードするシグナルを受け取り、生物学的配列情報をアセンブリーユニットに提供する。アセンブリーユニットは、生物学的実体４を構築し、これはこの態様においてＤＮＡ分子である。この態様において、アセンブリーユニットは、生物学的実体を、ウイルスコートもしくはその一部５ａまたはウイルス５ｂまたはタンパク質抗原５ｃであることができる生物学的産物５にさらに変換する。生物学的産物は、ワクチン６として有用である。

受信ユニット
受信ユニットは、生物学的配列情報をコードするシグナルを受け取る。一つの態様において、受信ユニットは、送信ユニットからデジタルコード化された生物学的配列情報を受け取るコンピュータである。したがって、受信ユニットは、インターネットに接続することができ、および／またはそうでなければ、コンピュータネットワークに接続することができ、ネットワークに接続するコンピュータ間で情報を交換することを可能にする。また、インターネットは、本明細書に使用される用語として、コンピュータネットワークである。一つの態様において、送信ユニットは、受信ユニットから離れた位置、たとえば別の都市または別の国または国家に位置する。受信ユニットは、地球から離れた場所または地球の大気外、たとえば軌道に乗って回っている宇宙ステーションまたは月の上でさえ、または地球以外の惑星上などに位置することさえできる。いくつかの態様において、送信ユニットは、受信ユニットから少なくとも１０マイルまたは少なくとも２５マイルまたは少なくとも５０マイルまたは少なくとも１００マイルまたは少なくとも２５０マイルまたは少なくとも１０００マイル離れた位置に位置する。いくつかの態様において、受信ユニットは、生物学的配列情報を受け取り、アセンブリーユニットが生物学的配列の構築のためのプログラミング命令に変換することができる形態でアセンブリーユニットにそれを提供する。したがって、一つの態様において、受信ユニットは、コンピュータネットワークを介して送信ユニットに接続する。また、受信ユニットは、アセンブリーユニットに接続する。種々の態様において、また、受信ユニットは、コンピュータまたは回路基板またはアセンブリーユニットまたはアセンブリーユニットのサブユニットに組み込まれたコンピュータの一部であることができる。受信ユニットと送信ユニット間の接続は、間接的であることができる、すなわち、１つまたは複数のさらなるコンピュータ、ルータまたはこれらの間に挿入されたその他の電子装置を介する。また、接続は、無線またはサテライト接続を介することができる。また、接続は、コンピュータネットワークを介した送信ユニットと受信ユニットと間の直接接続のように、直接であることができる。どのようにしろ、受信ユニットは、送信ユニットによって伝達されたシグナルを受け取るだろう。一つの態様において、受信ユニットは、電磁波の形態で生物学的配列を受け取り、生物学的実体または生物学的産物の構築のために、アセンブリーユニットに配列を提供する。

送信ユニット
送信ユニットは、システムの受信ユニットに生物学的配列情報を伝達する。デジタルシグナルは、一連のビットの形態で情報を表すことができる。当業者は、実質的に生物学的配列情報を含む任意の種類の情報をデジタルシグナルとして容易に伝達することができることを理解する。これらの種類の情報は、コンピュータネットワークを介して容易に伝達され、これは地球にまたがることができる。本発明の一つの態様において、送信ユニットは、情報を１つのコンピュータから別のコンピュータまで伝達すること、またはネットワーク（たとえば、インターネット）に接続されたコンピュータ間で交換することを可能にするコンピュータネットワークに接続するコンピュータである。したがって、一つの態様において、送信ユニットおよび受信ユニットは、コンピュータネットワークの一部であるコンピュータであり、送信ユニットは、デジタル形式に配列情報を取得または変換する、およびたとえば、コンピュータネットワークを介して配列情報を受信ユニットに伝達するためのハードウェアおよび／またはソフトウェアを有する。その他の態様において、送信ユニットは、電話またはキーボードであり、オペレータは、生物学的配列情報を手動で入力することができる。また、送信ユニットは、任意の形式（たとえば、ＨＴＭＬ）で受信ユニットにメッセージを送る電子装置であることができる。データのコード化および伝達の形式は、受信ユニットによって生物学的配列の合成のための命令へ変換することができる任意の便利な形式であることができる。送信ユニットは、情報を入力する人から情報を得ることができ、または配列を決定する機器から自動化された様式でそれを得ることができる。生物学的配列情報の供与源は、ウイルスまたはその他の生物学的実体の試料であることができる。

生物学的配列情報は、一連のヌクレオチド、ホスホラミダイト（たとえば、ヌクレオシドホスホラミダイト）、アミノ酸または任意の配列であることができ、生物学的実体の一次構造を合成するのに必要な情報を提供する。また、生物学的配列情報を、生物学的実体の一次構造を合成するのに必要な情報に達するように解読することができるコードとして提供することができる。

生物学的実体（たとえば、ウイルス）の配列は、当該技術分野において特別な専門知識を伴う科学的施設にて解読されるだろうことが多い。ＤＮＡシーケンシング技術は、当該技術分野において広く公知であり、ＤＮＡを単離してシーケンシングを行う種々の方法が利用可能である。したがって、配列は、たとえば合成によるシーケンシング、ジデオキシまたは鎖終結（サンガー）法、化学的分解法、熱サイクルシーケンシング、ピロシーケンスまたはハイブリダイゼーションによるシーケンシングなどの標準的な公知の技術を使用して解読することができる。これらは、ＤＮＡシーケンシング法のほんのいくつかの例であり、当業者は多数のさらなる方法を心得ている。シーケンシングの正確な方法は重要でなく、生物学的実体の配列が、送信ユニットから受信ユニットへの伝達のために送信ユニットによって取得されるのみである。配列は解読することができ、また、予測された配列であることができ、予測された配列は、傾向または年々のウイルスにおける変化に由来する情報に基づくことができる。たとえば、年々のウイルスにおける変化は、少なくとも２年または少なくとも３年または少なくとも５年または少なくとも１０年の期間にわたる変化でありうる。

一つの態様において、また、送信ユニットは、ＤＮＡ配列決定装置を含むか、もしくは関連することができ、またはＤＮＡ配列決定能力を有することができる。したがって、送信ユニットは、生物または生物学的試料のＤＮＡ配列を決定し、離れた位置の受信ユニットに生物学的配列情報を伝達する能力を有することができる。したがって、本発明のシステムおよび方法は、月またはその他の惑星などの地球の大気外の位置を含む離れた位置から試料を戻す能力を有することができる。

アセンブリーユニット
アセンブリーユニットは、送信ユニットから受信ユニットが受け取った情報に従って、生物学的配列を合成する。本発明のシステムにおいて配備されるアセンブリーユニットは、受信ユニットに接続することができる。その他のシステム構成要素と同様に、接続は、ユニット間の直接接続または１つまたは複数のさらなるコンピュータ、ルータまたはユニット間に挿入されたその他の電子装置を介する間接的な接続のいずれかであることができる。アセンブリーユニットは受信ユニットと通信することができ、その結果、受信ユニットが送信ユニットから生物学的配列情報を含むシグナルを受け取るとき、情報をアセンブリーユニットに提供し、即時に自動化された方法において配列を合成し始めることができる。アセンブリーユニットは、１つまたは複数の核酸分子の合成、核酸分子の増幅および転写ならびに／またはペプチドもしくはタンパク質への核酸分子の翻訳を含む種々の機能を有することができるが、限定されない。

いくつかの態様において、アセンブリーユニットは、第２（または第３または第４）レベルの生物学的構築、たとえばより大きな生物学的実体へと産生された生物学的実体の構築を行う能力を有する。したがって、一つの態様において、アセンブリーユニットは、自動化された方法においてオリゴヌクレオチドを合成することができ、次いでその後、オリゴヌクレオチドをより大きなｄｓＤＮＡ分子へと構築する。一つの態様において、合成されたオリゴヌクレオチドは、関心対象のＤＮＡ分子の断片または関心対象のＤＮＡ分子の一部または変異体であることができる。オリゴヌクレオチドは、要望に応じて順次または同時のいずれかで、コンビナトリアル様式で構築することができる。典型的なオリゴヌクレオチドは、４０〜１００ヌクレオチドまたは３０〜１１０ヌクレオチドまたは５０〜９０ヌクレオチドまたは約６０ヌクレオチドであることができる。しかし、種々のその他の態様において、アセンブリーユニットによって産生されるＤＮＡ分子は、１００ｂｐより大きく、または２００ｂｐより大きく、または３００ｂｐより大きく、または４００ｂｐより大きく、または５００ｂｐより大きく、または６００ｂｐより大きく、または７００ｂｐより大きく、または８００ｂｐより大きく、または９００ｂｐより大きく、または１０００ｂｐより大きく、または１００〜１０００ｂｐまたは２００〜１０００ｂｐまたは３００〜１０００ｂｐまたは４００〜１０００ｂｐまたは５００〜１０００ｂｐまたは６００〜１０００ｂｐまたは７００〜１０００ｂｐであることができる。列挙した長さは、一本鎖のオーバーハング（すなわち、「付着端」）を伴う、または伴わない長さであることができる。

種々の態様において、アセンブリーユニットは、核酸合成機、タンパク質およびペプチド合成機、ＰＣＲサーモサイクラーの１つまたは複数のサブユニット、ならびに試料上でのインビトロでの転写および／または翻訳を行う１つまたは複数のサブユニットを含む。別のサブユニットを、細胞培養における生物学的実体の培養のため、および／または細胞培養における細胞の維持のために提供することができる。

サブユニットの任意の１つもしくは任意の組み合わせ、またはアセンブリーユニットのサブユニットの全てを、自動化することができる。本発明のシステムは、自動化された核酸および／またはアミノ酸合成機を含むことができる。本発明のアセンブリーユニットは、核酸またはタンパク質およびペプチド合成を行うのに必要な化学物質、試薬、生物学的ビルディングブロックまたはビルディングブロック重合体を有する複数の容器または入れ物、および試薬の流れを可能にするまたは制限するのに必要な弁、並びに一定の化学反応を行うための容器を含むことができる。また、これらは、これらへのアセンブリーユニットアクセスを提供する通路を伴ってアセンブリーユニットの外側に存在することができる。たとえば、生物学的ビルディングブロック分子は、所望の生物学的配列の合成に必要なアミノ酸、ｄＮＴＰおよび／またはヌクレオシドホスホラミダイトであることができる。また、生物学的ビルディングブロックは、単糖類、二糖類または多糖類を含むことができる。生物学的実体または生物学的産物が、複数のタイプの分子、たとえば糖タンパク質を含むとき、生物学的ビルディングブロックは、要望に応じてアミノ酸および単、二または多糖類を含むだろう。また、オリゴヌクレオチドまたはすでに構築されたその他のビルディングブロック重合体は、容器または入れ物において提供することができる。

また、生物学的ビルディングブロックは、修飾、誘導体化または標識することができる。たとえば、生物学的ビルディングブロックは、ヌクレオシドホスホラミダイトもしくはヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）またはいずれかの誘導体であることができる。種々の態様において、修飾、誘導体化または標識されたビルディングブロックは、アミノアリル、ビオチンまたは２'フルオロ修飾または標識されたＮＴＰまたはホスホラミダイトであることができる。さらなる修飾、誘導体化または標識されたビルディングブロックは、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、５−ブロモデオキシウリジン、逆位ｄＴ（望まれない５'ライゲーションを防ぐ）、ジデオキシシチジン、５−メチルｄＣ、デオキシイノシン、５−ニトロインドール、ヒドロキシメチルｄＣ、イソｄＣおよびイソｄＧまたは望ましい場合に安定性を改善するためのロックド核酸を含む。アセンブリーユニットは、化学物質、試薬または生物学的ビルディングブロックを含む容器を含むことができ、または容器は、アセンブリーユニットの外側にあることができ、たとえば、材料を運ぶチューブまたはその他の経路を介してアセンブリーユニットに接続することができる。典型的に、機器は、機器を制御し自動化された様式で核酸またはタンパク質／ペプチドを合成するのに必要なソフトウェアプログラミング命令を含む。したがって、ソフトウェアプログラミング命令は、生物学的配列情報に従って、オリゴヌクレオチドのセットを生物学的ビルディングブロック（たとえば、ｄＮＴＰまたはヌクレオシドホスホラミダイト）から合成するためのアセンブリーユニットの一部の操作を指示する命令であることができ、および／またはオリゴヌクレオチドをより大きなＤＮＡ分子に構築するための命令を含むことができ、およびさらに、ＤＮＡ分子をＲＮＡに転写するためのおよびＲＮＡをタンパク質分子に翻訳するための命令を含むことができ、およびさらに、タンパク質分子をより大きなタンパク質構造に構築するための命令を含むことができる。一つの態様において、命令は、オリゴヌクレオチドをＤＮＡまたはＲＮＡ分子に構築するためにある。一つの態様において、命令は、タンパク質分子をウイルスまたはウイルスの一部に構築するためにある。もう一つの態様において、システムは、反応容器の異なる区画における自動化された方法の工程を行うためのプログラミング命令を含む。

アセンブリーユニットは、単一の一体的ユニットであることができ、または異なる機能を実行する種々のサブユニットを有することができる。したがって、一つの態様において、アセンブリーユニットのサブユニットは、たとえばオリゴヌクレオチド合成機で、オリゴヌクレオチド合成を行う。合成機からサーモサイクリング能力を伴う液体ハンドラまで反応容器（たとえば、９６ウェルプレート）の転送を行うために、ロボットアームを含むことができる。また、合成されたオリゴヌクレオチドを、もう一つの反応容器または同じ反応容器のもう一つの区画または増幅および／または構築のためのアセンブリーユニットのもう一つのサブユニット、たとえばＰＣＲサーモサイクラー、に提供することができる。一つの態様において、システムは、すでに合成されたオリゴヌクレオチドを提供され、オリゴヌクレオチドを１つまたは複数のＤＮＡ分子に構築する。１つまたは複数のその他のサブユニットは、自動化されたインビトロでの翻訳システムなどの、合成された核酸のタンパク質産物への転写および／または翻訳を行うことができ、またはこれらの機能も、同じ反応容器のもう一つの区画において行うことができる。それぞれの場合において、サブユニットは、自動化された様式で機能を実行する必要な試薬、化学物質および生物学的ビルディングブロックで調製される。したがって、アセンブリーユニットは、受信ユニットから生物学的配列情報が提供されると、即時に１つまたは全ての機能を実行し始めることができる。

アセンブリーユニットは、送信ユニットから受信ユニットが受け取った情報に従って、またはアセンブリーユニットに別途提供された配列情報に従って、生物学的配列を合成する。したがって、アセンブリーユニットは、自動化された様式で所望の生物学的実体の合成を指示することができる。アセンブリーユニットを含むシステムにおける全てのユニットは、必要なソフトウェアで準備し、必要とされた容器に必要な試薬および化学物質であらかじめ装填することができ、その結果、生物学的配列情報を受信ユニットが受け取ることができ、すぐに、アセンブリーユニットは、所望の生物学的実体を合成することを始めることができる。したがって、アセンブリーユニットは、生物学的配列情報を受け取る前に、生物学的実体の構築または合成の準備をすることができる。

また、オリゴヌクレオチドまたはペプチド合成後、アセンブリーユニットは、それぞれ、オリゴヌクレオチドをより大きな核酸分子に、またペプチドをポリペプチドおよびタンパク質に構築する能力を有することができる。また、システムおよび方法は、オリゴヌクレオチドからＤＮＡ分子を構築することができる。したがって、核酸分子またはタンパク質またはペプチドは、一連の応答を介して構築することができる。核酸分子のための一つの態様において、ＧＩＢＳＯＮ ＡＳＳＥＭＢＬＹ（登録商標）（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）反応を、核酸を構築するために使用するが、その他の態様において、オリゴヌクレオチド（またはペプチド）をより大きな核酸（またはポリペプチド）に構築する任意の適切な方法を使用することができる。また、オリゴヌクレオチドは、二本鎖の核酸分子に構築することができる。また、当業者は、ペプチドをポリペプチドおよびタンパク質に構築する方法を心得ており、また、本発明において適用することができる。

アセンブリーユニットまたはそのサブユニットは、１つまたは複数の容器を含み、アセンブリーユニットまたはそのサブユニットの機能を実行するのに有用な、試薬、化学物質、生物学的ビルディングブロックまたはビルディングブロック重合体を含む。容器は、ガラスまたは別の適切な材料でできた容器であることができ、送信ユニットから受信ユニットが生物学的配列情報を受け取る前に、使用者によってあらかじめ充填することができる。したがって、アセンブリーユニットをセットアップすることができ、送信ユニットから生物学的配列情報を受け取るために待機することができる。いくつかの態様において、アセンブリーユニットまたはそのサブセットの機能は、種々の容器から材料の組み合わせを指示するだろう適切なソフトウェアによって、管理および組織化されるだろう。アセンブリーユニットのそれぞれのサブユニットは、必要とされた情報を受け取るとそれ自体のソフトウェアから作動することができ、またはアセンブリーユニットは、アセンブリーユニットを含んでいてもよい種々のサブユニットを指示する１つのプログラムを有することができる。

インビトロおよび／またはインビボにおける転写および翻訳は、当業者に公知の多様な方法を使用して行うことができる。異なるプロトコルでは、ウサギ網状赤血球の抽出物、コムギ胚、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、並びにヒト細胞可溶化液をタンパク質合成において使用する。ヒトインビトロ翻訳システムは、生物学的実体がヒト病原体に対する使用のためのワクチンであるとき、有用であり得る。抽出物は、調製されることができ、および細胞の翻訳機構の必須成分、たとえばリボソーム、ｔＲＮＡ、アミノアシル‐ｔＲＮＡシンセターゼ、開始、伸長および終結因子、ＡＴＰなどのエネルギー源、必要な補助因子およびその他のタンパク質などを含むことができる。インビトロでの転写および翻訳反応は、優れた速度にて、およびマイクロリットルまたはナノリットルレベルにて行うことができる。また、多様な市販のキットを便利なセットアップに使用することができ、うまく使用されてきているが、必須成分は、一般的に構築することができる。キットまたは一般的な材料が使用されようとなかろうと、いくつかの態様において、細胞の翻訳機構の必須成分を含む無細胞溶液を利用する。

一つのインビトロでの翻訳方法では、不死化ヒト株化細胞の抽出物を使用してリボソーム、開始および伸長因子、ｔＲＮＡおよびタンパク質合成のために必要とされるその他の基本成分を提供する。いくつかのシステムは、ＤＮＡ鋳型からの標的タンパク質の合成を持続するために、独自のアクセサリタンパク質、ＡＴＰおよびエネルギー再生システムを利用する。抽出物を調製して、アセンブリーユニットの容器にあらかじめ装填することができ、必要なときに、合成された核酸の翻訳を行うために利用することができる。アセンブリーユニットは、必要な温度にてこれらの抽出物を維持することができ、これらの有効寿命を延長する。また、転写および／または翻訳を行うための容器または容器類は、ＤＮＡが合成され、およびＰＣＲを使用して増幅され、および次いでＲＮＡに転写されるだろう容器に連結することができる。ＲＮＡを転写時に、反応の一部を、翻訳を行うための容器に移すことができ、または転写および翻訳反応を単一の容器において行うことができる。いくつかの態様において、生物学的実体は、グリコシル化された残基、リフォールディング工程または酵素の修飾などのタンパク質修飾を必要とし、これは生物学的実体が活性または完全な活性を有する前に生じなければならない。試薬およびプログラミングプロトコルを、この目的のためにも、アセンブリーユニット中に含むことができる。

これらの反応の全ては、特定の反応領域または区画内で反応容器自体において行うことができる。また、本発明のシステムは、生物学的産物の精製のためのサブユニット、反応領域または反応区画を含むことができる。

一つの側面において、本発明は、提供された生物学的配列情報に従った機能的生物学的実体の合成のためのシステムを提供する。システムは、提供された生物学的配列情報に従って生物学的実体を構築するためのアセンブリーユニットを有する。アセンブリーユニットは、生物学的ビルディングブロック分子またはビルディングブロック重合体を含む容器を含むか、または接続され、システム中の試薬を輸送するための、および機能的生物学的実体を合成するために本発明の自動化された方法における工程を実行するための構成要素を有する。また、これらのシステムは、本明細書において記述した構成要素または特徴のいずれを有することもできる。生物学的実体は、本明細書において記述したとおりのいずれであることもできる（たとえば、ＤＮＡ分子）。システムは、生物学的配列情報を有するシグナルまたはデータを受け取るための受信ユニットを有することができる。生物学的配列情報は、電子インターフェースを介して配列を手動で入力することによって、または本明細書において記述したように送信ユニットから受信ユニットに配列を伝達することによって提供することができる。

生物学的実体
生物学的実体は、ポリヌクレオチドもしくはＤＮＡ分子またはポリリボヌクレオチドもしくはＲＮＡ分子またはペプチドもしくはポリペプチドもしくはタンパク質である。いくつかの態様において、生物学的実体は、核酸またはＤＮＡ分子である。生物学的実体がＤＮＡまたはＲＮＡ分子であるとき、それは生物学的産物に転換可能であることができる。ＤＮＡまたはＲＮＡは、一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡまたは二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡであることができる。生物学的実体がＤＮＡ分子であるとき、それは機能的ＤＮＡ分子であることができ、つまり、これを機能的タンパク質またはペプチドに翻訳させることができるＲＮＡに転写することができ、またはＤＮＡ分子として（たとえば、ＤＮＡワクチンとして）直接有用であることを意味する。機能的ＲＮＡ分子は、機能的タンパク質またはペプチドに翻訳することができる。機能的タンパク質またはペプチドは、疾患または障害の治療において臨床的用途を有するものであり、またはいくつかの生物学的状況において直接有用である（たとえば、構造タンパク質としてまたは酵素として有用である）。種々の態様において、機能的タンパク質またはペプチドは、タンパク質のドメイン、結合サブユニット、酵素または酵素活性を有する酵素サブユニット、ワクチンの生成において有用である抗原性活性を有するタンパク質またはペプチド、ウイルスタンパク質またはそのサブユニット、ウイルスコートタンパク質（たとえば、ＨＡまたはＮＡタンパク質）、またはインビトロで組み合わされるとき、もしくは宿主細胞においてインビトロで組み合わされるときにウイルス粒子を形成する複数のタンパク質またはペプチドであることができる。したがって、臨床的用途は、抗原性応答の発生またはタンパク質またはペプチドの特異的結合分子または受容体に対する結合であることができ、しかし、一つの態様において、抗原性応答は、疾患または障害の治療（たとえば、インフルエンザに対するワクチンの産生）を進めるものであり、またはエピトープの存在を同定するアッセイにおける使用を見いだす。また、機能的タンパク質またはペプチドは、望ましい特性、たとえば望ましい味、感触、臭いまたは別の特性などを提供することができる。一つの態様において、機能的タンパク質またはペプチドは、免疫または抗原性応答の発生以外の機能を有する。

生物学的実体は、任意のサイズであることができる。約２００ｂｐまでのオリゴヌクレオチドを構築することができるが、より大きな精度は、たいていより小さなオリゴヌクレオチドを合成することによって達成することができる。種々の態様において、生物学的実体は、長さが１００塩基対より大きい、または２００ｂｐより大きい、または３００ｂｐより大きい、または４００ｂｐより大きい、または５００ｂｐより大きい、または１ｋｂより大きい、または２．５ｋｂより大きい、または３ｋｂより大きい、または４ｋｂより大きい、または５ｋｂより大きい、または６ｋｂより大きい、または７ｋｂより大きい、または８ｋｂより大きい、または９ｋｂより大きい、または１〜１０ｋｂまたは１〜９ｋｂまたは１〜８ｋｂまたは２〜１０ｋｂまたは２〜９ｋｂまたは２〜８ｋｂの一本鎖または二本鎖ＤＮＡ分子である。さらなる技術を使用することによって、本開示を用いる当業者は、オリゴヌクレオチドとして合成されるＤＮＡ配列はまた、本明細書において記述する方法を使用して、１ｋｂより大きい、または２ｋｂより大きい、または３ｋｂより大きい、または５ｋｂより大きい、または６ｋｂより大きい、または７ｋｂより大きいＤＮＡ分子を構築するために連結することができることを理解するだろう。その他の態様において、本発明のシステムおよび方法は、１００ｋｂより大きい、または２００ｋｂより大きい、または２００ｋｂより小さい、または３００ｋｂより大きい、または３００ｋｂより小さい、または５００ｋｂより大きい、または８００ｋｂより大きい、または１メガベースより大きい、または１メガベースより小さいＤＮＡ分子を構築するために使用することができる。

生物学的配列情報は、生物学的実体、たとえば核酸、ペプチドまたはタンパク質の合成に必要なその配列情報である。いくつかの態様において、生物学的配列情報は、ヌクレオチド、アミノ酸または生物学的実体である核酸またはペプチドまたはタンパク質の一次構造を含むその他のビルディングブロックの配列（または順序）である。異なる態様において、この情報は、バイナリ形式において、または別のコード化された形態において受信ユニットに提供してもよい。

生物学的産物
生物学的産物は、生物学的実体によって提供される配列情報を使用して合成され、または構築される生体分子である。したがって、異なる態様において、生物学的実体はＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子であり、生物学的産物は、たとえばウイルスゲノムまたはその一部、ウイルス粒子またはウイルスコートまたはいずれかの一部、バクテリオファージまたはその一部、ウイルス粒子またはウイルスのコートの抗原性一部、細菌ゲノムまたはその一部、遺伝子、核酸配列、一本鎖ＤＮＡ分子（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）、ＲＮＡ分子、アンチセンスＲＮＡ部分、ｓｉＲＮＡ部分、ＲＮＡｉ部分、二本鎖ＲＮＡ部分、タンパク質分子またはタンパク質部分、タンパク質抗原またはその一部、酵素、構造タンパク質、調節タンパク質、栄養タンパク質、結合タンパク質、輸送タンパク質、ペプチド分子、遺伝子または真菌のゲノムまたはその一部または合成細胞などのそこから作製される任意の生物学的産物であることができる。また、生物学的産物は、修飾を受けたタンパク質、ペプチドまたはポリペプチド、たとえば糖タンパク質を産生する一定のアミノ酸残基のグリコシル化または２つ以上の生物学的ビルディングブロックで形成されたもう一つの分子などであることができる。その他の態様において、生物学的産物は合成細菌またはその一部のゲノムである。特定の態様において、生物学的産物はインフルエンザウイルスであり、配列情報は、生物学的脅威に対するワクチンを調製するために使用される情報である。生物学的産物がウイルスまたはウイルス粒子であるとき、それは、弱毒ウイルスまたは不活化ウイルスまたは無害なウイルスであることができる。いくつかの態様において、生物学的実体はまた、それ自体が生物学的産物であることができる。生物学的実体が生物学的産物であるときの例はＤＮＡワクチンであり、ＤＮＡ分子それ自体がワクチンとして有用である。ＤＮＡワクチンは、病原体タンパク質をコードするＤＮＡの小片からなる。体への注射後、宿主細胞は、病原体タンパク質を合成し、免疫応答を刺激する。一つの態様において、生物学的実体は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に構築することができる複数の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）またはオリゴヌクレオチドである。分子、ウイルスまたはその他の生物学的実体の「一部」は、天然の分子または生物学的実体の少なくとも１０％または少なくとも２０％または少なくとも３０％または少なくとも４０％または少なくとも５０％または少なくとも６０％または少なくとも７０％または少なくとも８０％または少なくとも９０％であることができる。

いくつかの態様において、宿主細胞の作用を、生物学的産物に到着させるために利用することができる。宿主細胞が使用されるシステムおよび方法において、これらは、さらなるプロセシングのためにもう一つのサブユニットから生物学的実体を受け取ることができるアセンブリーユニットのサブユニット内に位置することができ、または単に反応容器の区画において維持することができる。たとえば、宿主細胞を、サブユニット内の容器において維持することができる。宿主細胞は、多様な目的のために、本発明のシステムおよび方法において有用である。インビトロでの翻訳を本発明のシステムおよび方法において使用することができる一方、また、分子サブユニットの転写、翻訳および構築を宿主細胞によって行うことができる。また、宿主細胞を、生物学的実体を受け取るために使用することができ、および生物学的産物を合成するためにそれを使用することができる。一つの態様において、宿主細胞には、アセンブリーユニットのサブユニットによって合成された生物学的実体である複数のＤＮＡをトランスフェクトする。宿主細胞は、宿主細胞中でタンパク質を作製し、および／またはタンパク質を生物学的産物、たとえばウイルス粒子もしくはその一部または複数のサブユニットを有するタンパク質もしくは酵素に構築するためにＤＮＡを使用することができる。また、宿主細胞は、感染またはトランスフェクション後、ファージまたはウイルス粒子を複製するのに使用してもよい。

方法
本発明は、機能的生物学的実体を合成する方法を提供する。本発明において、デジタルＤＮＡ配列またはコード化配列は、受け取ったＤＮＡ配列のための合成パラダイムを自動的にデザインするソフトウェアプログラムに入れることができる（たとえば、ＡＲＣＨＥＴＹＰＥ（登録商標）， Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）。たとえば、ソフトウェアは、配列を約５０〜８０塩基または約４０〜９０塩基または約３０〜１００塩基または約３０〜６０塩基または約３０〜８０塩基または２０〜１００塩基または２０〜８０塩基または１０〜１００塩基または１０〜９０塩基または１０〜８０塩基のデザインされた重複したオリゴヌクレオチドに分けることができ、これらのサイズのいずれも、本発明のオリゴヌクレオチドとして使用することができる。次いで、オリゴヌクレオチド配列を構築のためにシステムのサブユニットに伝達する。特定の態様において、ソフトウェアは、約６０ｂｐの隣接するオリゴヌクレオチド（ｓｓＤＮＡ）間に約３０ｂｐ（±５％または±１０％）の重複を含むようにオリゴヌクレオチドをデザインすることができる。また、オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ増幅後にプライマー結合ドメインを放出するために、ＰＣＲ増幅のためのユニバーサルプライマー結合ドメインおよび制限部位を有するようにデザインすることができる。また、本発明において使用されるソフトウェアは、方法において使用される特定の宿主生物に目的を合わせたコドン最適化配列内に受け取られる、または望まれる配列を修飾するための能力を有することができる。ソフトウェアは、システムの任意のユニットまたはサブユニットにおいて存在することができる。

方法は、反応容器の１つまたは複数の反応領域にある１つまたは複数の試料上で行うことができる。いくつかの態様において、反応容器は、反応プレートである。反応プレートの例は、９６ウェルプレートである、しかし、方法は、多くの反応領域を有する反応容器上で行うことができることは理解されるだろう。反応容器が反応プレートであるとき、それは、標準的な９６ウェルプレート上の９６の反応ウェルなどの任意の便利な数の反応ウェル（領域）を有することができる。いくつかの態様において、方法は、容器の１つの区画から容器の第２の区画まで試料を輸送する１つまたは複数の工程を含む。

いくつかの態様において、方法は、単一の反応容器上で完了することができる。これらの態様は、反応容器を反応区画に分けること、および１つまたは複数の試料を、方法の異なる工程を行うために反応容器の１つの区画から反応容器の第２の区画まで輸送することを含むことができるが、また、反応容器の１つまたは複数の区画が異なる環境に曝露されるように、定位置に試料の全体または一部を残すこと、および反応容器を移動することを含むことができる。たとえば、ＰＣＲを含む工程において、区画をシステムにおける位置に位置することができ、それがサーモサイクリングスケジュールに曝露される。ＤＮＡ構築工程にて、反応容器は、システムにおけるもう一つの位置に位置することができ、それがＤＮＡ構築のための適切な状態に曝露される。位置の変化は、反応容器の物理的な移動によって、または代わりにシステムの１つまたは複数のユニットの移動によって達成することができる。したがって、反応容器は、本発明のシステムに関して移動する。

反応容器の区画は、試料を収集する１つまたは複数の反応領域を含む反応容器の異なる領域である。通常、反応容器のそれぞれの区画は、反応プレートにおけるウェルなどの複数の反応領域を含むだろう。しかし、反応領域は、物理的なバリアまたは境界を必要としない。これには、異なる反応をその他の反応領域に関する反応領域において実施することができることのみが必要である。反応容器は、任意の数の区画を有することができるが、それぞれの区画は、試料を収集および保つための１つまたは複数の反応領域を有する。反応容器のそれぞれの区画は、同じ様式で処理され、または与えられた時間において同じ処理またはプロセスに供される。たとえば、区画において存在する試料は、全て反応容器のその区画上で実行されているＰＣＲサイクルの同じ温度にて循環してもよく、または反応区画における全ての反応試料は、自動化された様式で拾い上げられて、同じ反応容器上のもう一つの区画へ移動されてもよい。

したがって、方法の一つの態様において、ＰＣＲ工程を反応容器の第１の反応区画において行い、エラー修正工程を反応容器の第２の区画において行い、第２のＰＣＲ工程を反応容器の第３の反応区画において行う。また、方法は、反応容器のもう一つの反応区画において行われるＤＮＡ構築の工程、および反応容器のもう一つの反応区画において行われる転写工程、および反応容器のもう一つの反応区画において行われる翻訳工程、および反応容器のもう一つの反応区画において行われるトランスフェクション工程を有することができる。したがって、本明細書において記述した方法のいずれかのそれぞれの工程を反応容器の異なる反応区画において行うことができる。

キット
さらに、本発明は、本発明のシステムおよび方法における使用のためのキットを提供する。キットは、生物学的ビルディングブロック、ビルディングブロック重合体、緩衝液または本発明のシステムで本発明の方法を実施するためのその他の試薬の任意の組み合わせなどの生物学的産物を構築するために必要な試薬および成分を含むことができる。単独でまたは上の試薬および成分の任意の組み合わせでのどちらでも、キットはまた、本発明の方法を行うための反応容器を含むことができる。試薬または反応成分または反応容器の任意の組み合わせを、キットの部材を有する容器に提供することができる。また、試薬および試薬成分は、本発明のシステムのインターフェース上に適合する試薬の容器において提供することができる。

また、キットは、本発明のシステムのインターフェース上に適合するようデザインされた１つまたは複数の反応容器を含むことができ、反応容器は、本発明のシステムを使用して生物学的実体の合成に必要な試薬および／または生物学的ビルディングブロックおよび／またはビルディングブロック重合体を調製すること、またはあらかじめ装填することができる。また、キットは、本発明のシステムに反応容器または試薬の容器を付着するための命令および／または本発明の方法における反応容器または試薬の容器を使用するための命令を含むことができる。また、命令は、ウェブサイト上で提供することができ、キットは、ウェブサイトへのリンク、キットで提供された命令の代わりに、または加えてのどちらかを含むことができる。

また、本発明のキットのいずれも、本発明のアッセイを行うための命令および／または同じ情報または生物学的実体を合成するために本発明のシステムを調製する、および／または使用するための、および／または生物学的実体を合成するために必要な試薬、成分および／または生物学的ビルディングブロックを調製する、または容器にあらかじめ装填するための情報を提供するウェブサイトへのリンクを含むことができる。たとえば、命令は、システムおよび方法において使用される試薬のタイプおよび量についてのガイダンスを提供することができる。キットは、単一の容器において、または複数の容器において提供すること、またはパッケージすることができる。容器は、ガラス、プラスチックまたは任意の適切な材料から作製することができ、また無菌でもよい。１つまたは複数の容器は、キットを含む容器中で無菌容器において提供することができる。

システムのさらなる側面
本発明のシステムは、自動化された方法を実施することによって生物学的実体を産生することができる。生物学的実体は、任意の所望の配列であることができる。一つの態様において、本発明のシステムは、生物学的実体の一部として所望の配列または構築物を含むようにあらかじめプログラムすることができる。たとえば、本発明のシステムは、オペレータが、合成された配列のさらなる使用に望ましいプラスミドまたはその他のベクターに合成される特定の配列を追加することができるようにあらかじめプログラムすることができる。その他の態様において、システムは、要請された配列を合成すること、および制御配列またはプロモーター配列またはトランス作用性因子のための結合エレメントまたは生物学的実体の一部として要請された配列へのシグナル配列を追加することができる。したがって、配列が特定の宿主生物における後の使用のために合成されるだろうということをオペレータが知っているとき、システムは、制御配列または宿主生物に特有のその他の望ましい配列と共に要請された配列を合成することができ、したがって、さらに生物学的実体または生物学的産物の調製を単純化し、速度が上がる。本発明のシステムおよび方法によって合成されることに加えて、また、制御配列、プロモーター配列、シグナル配列およびトランス作用性因子のための結合エレメントを、所望通り使用のためのあらかじめ作られた配列として本発明の試薬の容器および／または反応容器にあらかじめ装填することができる。また、これらのあらかじめ作られた配列を本発明の任意のキットに含めることができる。

一つの態様において、本発明のシステムは、禁止された配列を同定するために、バイオセキュリティスクリーニングを行うようにプログラムされる。バイオセキュリティスクリーニングは、システムが受けた（全ての６つの読み枠において）および禁止された配列のあらかじめプログラムされたデータベースに対して合成するよう求められる配列を比較することによってなされる。禁止された配列は、病原体、生物兵器または地元政府によって合成されることが禁じられたその他のバイオセキュリティの脅威の一覧に由来することができる。禁止された配列は、１つまたは複数のＤＮＡまたはＲＮＡまたはタンパク質またはペプチドであることができる。システムが禁止された配列の一覧上で同定される配列を受けた場合、システムは無効を付与するか、またはさもなければ禁止された配列を合成しないようにプログラムすることができる。また、禁止された配列は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍから得ることができる。また、システムは、禁止された配列一覧に由来する配列をタンパク質に対してスクリーニングすることができる。

本発明のシステムのいくつかの態様は、たとえばシステムのサブユニットにおいて合成後のＤＮＡに修飾を行う。その他の態様において、システムはまた、転写後および／または翻訳後修飾を行うことができる。一つの態様において、システムは、ＤＮＡ分子を産生し、次いで修飾されたＤＮＡ分子を産生するために修飾することができる。一つの態様において、修飾は、特定のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体でのＤＮＡのメチル化である。もう一つの態様において、本発明のサブユニットは、メチルトランスフェラーゼを含むことができ、および／または本発明の生物学的実体または生物学的産物に対してリン酸化または脱リン酸化を行う能力を有することができる。また、２'フルオロおよび２'Ｏ−メチルＮＴＰを、ＤＮＡまたはＲＮＡのインビボでの安定性を改善するシステムによって酵素的にまたは化学的に産生することができる。もう一つの態様において、システムは、要請されたＲＮＡ分子を産生し、７−メチルグアノシン残基を５'キャップとして５'末端に、またはキャップとして５'−５'リン酸結合に添加し、次いでシステムは、成熟したｍＣＡＰを形成するようにメチル化することができる。また、グアノシン−５'−三リン酸−５'グアノシンをＲＮＡキャップとして使用することができる。また、ＲＮＡ塩基を、２'Ｏ−メチル基を使用するシステムによって転写後修飾することができ、融解温度を上昇させ、安定性を増加させる。もう一つの態様において、システムは、任意の数のＡ残基をもつポリＡ末端を有する、要請されたＲＮＡ分子を産生する。その他の態様は、生物学的実体において切断シグナルまたは配列を含めること、またはＧＵ豊富な配列を含み、また、その後の手順において使用される特定の宿主細胞に合わせることができる。さらにより多くの態様において、本発明のシステムは、要請されたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列を産生する。

実施例１−機能的ＨＡおよびＮＡ ＤＮＡ分子およびタンパク質部分の合成
本実施例は、オリゴヌクレオチドプールからのＨＡおよびＮＡ遺伝子のＤＮＡ構築物の自動化された構築およびウイルス粒子を産生する宿主細胞へのこれらのトランスフェクションを例証する。インフルエンザウイルスは、中心コアをくるんだ糖タンパク質を含むウイルスエンベロープで作製される。中心コアは、ウイルスＲＮＡゲノムおよび、ＲＮＡをパックおよび保護するその他のウイルスタンパク質を含む。インフルエンザゲノムは、典型的にはそれぞれ１つまたは２つのウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含む８つの小片のＲＮＡを含む。インフルエンザＡ型の場合において、ゲノムは、８つの小片のＲＮＡ上に１１の遺伝子を含み、赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含む１１のタンパク質をコードする。その他のタンパク質は、核タンパク質（ＮＰ）、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１、ＮＳ２、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ１−Ｆ２およびＰＢ２を含む。

赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）は、ウイルス粒子の外側に存在する糖タンパク質である。これらの糖タンパク質は、宿主細胞への結合において補助することおよびウイルス粒子の再生を含む、ウイルスのライフサイクルにおける重要な機能を有する。したがって、これらのタンパク質を含む構築されたウイルスは、ワクチンの産生において有用である。

オリゴヌクレオチド合成および構築
ＨＡおよびＮＡ遺伝子のＤＮＡ構築物の配列を表す９６のオリゴヌクレオチドのプールを本発明のアセンブリーユニットに提供した。ＨＡおよびＮＡ構築物は、長さがおよそ３ｋｂであり、方法において９６のオリゴヌクレオチドから構築した。最初および最後のオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ増幅のためのプライマー結合ドメイン、および増幅後にプライマー結合ドメインを放出するためにＮｏｔＩ制限部位を含み、また、より大きな断片を構築するために必要である場合、ＤＮＡ構築のために重複する領域を曝露する。

アセンブリーユニットは、統合された熱サイクル能力をもつＢＩＯＭＥＫ（登録商標）ＮＸＰ，Ｓｐａｎ−８ラボラトリーオートメーションワークステーション（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．， Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ， ＣＡ）を利用した。

アセンブリーユニットは、プロセスにおけるいくつかの異なる工程、すなわち、１）オリゴヌクレオチドを増幅するＰＲＣ１増幅；２）ＰＣＲ１増幅されたオリゴヌクレオチド上のエラー修正工程；３）修正オリゴヌクレオチドを増幅するＰＣＲ２工程；４）純粋な増幅されたオリゴヌクレオチドを提供するＰＣＲ産物精製工程；５）オリゴヌクレオチド産物を遺伝子に構築する構築工程を行うようにプログラムした。それぞれのプロセスは、反応容器（９６ウェルプレートである）の異なる反応区画において行うことができ、反応区画は、９６ウェルプレート上の１つまたは複数のカラムであることができる。構築反応は、５０℃にて３０〜６０分間であり、反応は、温度を変え、その後１０℃にて保つ。

第１のＰＣＲおよびエラー修正
１．それぞれの構築された産物ＰＣＲについて、反応を自動化された様式で行った：
２５μｌ ２×ＰＨＵＳＩＯＮ（登録商標）Ｈｏｔ−Ｓｔａｒｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｏｙ， Ｏｙ， Ｆｌ）
２μｌ １％ ＰＥＧ ８０００
０．２５μｌ 末端プライマー１（１００μＭ）
０．２５μｌ 末端プライマー２（１００μＭ）
２０μｌ ＭＢＧ水
上のオリゴプール２．５μｌを、ＰＣＲマスターミックス（またはその後に組み合わせ）を含む反応容器の反応区画に鋳型として５０ｎＭ移した。
２．熱サイクルは、以下のパラメーターを使用して行った：
９８℃ １分間
３０×（９８℃ ３０秒間、６５℃ ６分間ただしこれを１５秒／サイクルで延長する）
７２℃ ５分間
１０℃ 際限なく
エラー修正
以下のパラメーターを使用する熱サイクルによる変性／アニーリング：
９８℃ ２分間
８５℃まで２℃／秒
８５℃ ２分間
２５℃まで０．１℃／秒
２５℃ ２分間
１０℃ 際限なく
２．７μｌを取り除き、５．３μｌ水／２μｌ ＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）ヌクレアーゼ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ， Ｉｎｃ．， Ｏｍａｈａ， ＮＥ）／１μｌ １：４０００希釈したＥｘｏ ＩＩＩを含む８．３μｌのエラー修正ミックスに添加した。
１時間４２℃にて熱サイクルし、１０℃で際限なく

第２のＰＣＲ
Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘレシピについては、上を参照されたい。
エラー修正試料２．５μｌを合計反応容積５０μｌにおいて使用した。
サーマルサイクラー条件については、上を参照されたい。
ＰＣＲ精製
ＰＣＲ産物は、ＡＭＰＵＲＥ（登録商標）ＸＰ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ， Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐ． Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）を使用して精製した。

プラスミドベクター内のＨＡおよびＮＡ遺伝子にサブアセンブリーを組み合わせるためのＧＩＢＳＯＮ ＡＳＳＥＭＢＬＹ（登録商標）（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）。
およそ３ｋｂの核酸構築物を産生した。電気泳動的ゲルを図２に示す。これらの遺伝子は、すでに哺乳動物細胞にトランスフェクション後の発現のためのプロモーター領域（ｐｏｌ Ｉおよびｐｏｌ ＩＩ）を含む。
遺伝子をベクターと共にＧＩＢＳＯＮ ＡＳＳＥＭＢＬＹ（登録商標）ミックスを使用してｐＵＣ１９にクローン化した。
以下を合わせた：
５μｌのミックス
５μｌのＤＮＡ増幅産物
ミックスをサーモサイクラー５０℃において１時間、次いで１０℃で際限なく反応容器中でインキュベートした。

宿主細胞へのプラスミドベクターＤＮＡの形質転換
次の工程は、完全なウイルスゲノムを提供するために一定のインフルエンザ遺伝子と遺伝子を組み合わせることである。次いで、遺伝子をＭＤＣＫ細胞にトランスフェクトして救出されたウイルスを産生する。次いで、細胞は、回収の準備ができているウイルス産物を産生する。

実施例２−免疫応答の発生
追実験において、配列をインフルエンザＡ型／Ｓｈａｎｇｈａｉ／２／２０１３ＨＡ遺伝子について実施例１に記載されたような様式で合成した。合成ＨＡ配列を、先に述べた自動増幅するＲＮＡワクチン技術に従って、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子、遺伝子調節因子およびＴ７ポリメラーゼプロモーターを含むＤＮＡ鋳型にクローン化した（Ｇｅａｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎｏｎｖｉｒａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｅｌｆ−ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ＲＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ， ＰＮＡＳ， Ｖｏｌ． １０９， Ｎｏ． ３６， ｐｐ． １４６０４−０９ （２０１２））。ＲＮＡのインビトロでの転写構築物の確認後、ＲＮＡのキャッピングおよびＢＨＫ細胞のＲＮＡでのトランスフェクションを実施した。転写されたＲＮＡの完全性をアガロースゲル電気泳動によって証明した（図示せず）。細胞は、ゲル電気泳動およびＨ７特異的抗体でのウェスタンブロットによって示されるとおり、Ｈ７ ＨＡを発現した。ＲＮＡを脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）送達系においてカプセル化し、ワクチンを使用してマウスを免疫した（Ｇｅａｌｌ ｅｔ ａｌ．， ａｎｄ Ｈｅｋｅｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ （２０１３） ２， ｅ５２）。最初の注射の２週後に、７匹のＨ７／ＬＮＰ免疫マウスのうちの６匹は、１：２０〜１：８０の範囲のＨ７特異的血球凝集素阻害力価で血清変換した（データ示さず）。

実施例３−機能的ファージ粒子の合成およびオリゴヌクレオチドデザイン
本発明は、ファージの産生に適用することができ、これはファージ療法において有用であり得る。一つの態様において、ファージは、バクテリオファージである。ファージ療法は、ヒト、動物および植物において病原性細菌感染の治療のために有用である。特に、ファージ療法は、対照の慣例方法に細菌が応答しない応用において有用であり得る。

５，３８６ｂｐ ＰｈｉＸ ＤＮＡ生物学的配列を、研究室にてＡＲＣＨＥＴＹＰＥ（登録商標）ソフトウェア（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を使用して本発明の送信ユニットに入れた （Ｒｅｆ． Ｓｅｑ： ＮＣ＿００１４２２， 下の配列）。ソフトウェアは、それぞれ約１．４ｋｂの４つの重複した断片に配列を分ける（ＰｈｉＸゲノム配列のサブアセンブリー）。それぞれの断片は、構築されたとき環状分子を形成するように、４０ｂｐによって次に重複する。さらに、４つの断片のそれぞれは、４３〜４５の重複したオリゴヌクレオチドに分けられる。これらのオリゴヌクレオチドは、３２ｂｐ重複を伴う長さが約６４塩基である。４つの重複した断片のそれぞれの最初および最後のオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ増幅のためのプライマー結合ドメインおよび増幅後にプライマー結合ドメインを放出するためにＮｏｔｌ制限部位を含み、ＤＮＡ構築のために重複した領域を曝露する。エントリー後、生物学的配列情報を離れた都市の研究室に位置する受信ユニットに伝達する。

オリゴヌクレオチド合成
生物学的配列情報は、この態様において、送信ユニットと同じコンピュータネットワークに接続するコンピュータである本発明の受信ユニットによって受け取られる。また、受信ユニットは、この態様において、１つのサブユニットとしてＢＩＯＡＵＴＯＭＡＴＩＯＮ（商標）１９２Ｅオリゴヌクレオチド合成機（ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ Ｃｏｒｐ．， Ｐｌａｎｏ， ＴＸ）を有するアセンブリーユニットに接続する。アセンブリーユニットの全てのサブユニットを、生物学的配列情報を受け取る前にセットアップする。セットアップは、限定されないが、必要な化学物質、試薬および生物学的ビルディングブロックで全ての容器を装填すること、並びに生物学的配列情報を受け取る前に全てのソフトウェアプログラミングを準備することを含み、その結果、配列情報を受け取ると即時に生物学的実体合成の活性化を開始することができる。方法のそれぞれの工程は、反応容器の異なる反応区画において行われる。

生物学的配列情報の受信後、アセンブリーユニット中のソフトウェアは、オリゴヌクレオチドの合成を指示し、システムに以前に提供された生物学的ビルディングブロックを使用して合成する（この場合、ヌクレオシドホスホラミダイトビルディングブロック）。この合成は、オリゴヌクレオチド合成機などのサブユニット上で行われる。

合成後、オリゴヌクレオチドを濃水酸化アンモニウムの添加によって固体支持体から切断し、５５℃にてインキュベートし、それぞれの工程をセットアップ後にさらなるヒトの介入を伴わずに自動化された様式で行った。それぞれの断片を構成するオリゴヌクレオチドを別々にプールし、ＰＯＬＹＰＡＫ（商標）パッキング（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｓｔｅｒｌｉｎｇ， ＶＡ）を含むカラムを通すことによって精製する。また、ｐＨ範囲１〜１３において安定であるその他のパッキングを用いることもできる。したがって、水で希釈した水酸化アンモニウム溶液をパッキングに直接充填する。破損配列の溶出後、支持体に結合したオリゴヌクレオチドからトリチル保護基を取り除き、洗浄する。次いで、完全に脱保護された産物を、凍結乾燥によって溶出および単離することができる。自動化のために適した脱保護手順では、たとえばエチレンジアミン（ＥＤＡ）／トルエン溶液を使用するカラム上の脱保護を使用する。また、常磁性ビーズに基づいた精製系を使用することができ、その例は、ＡＧＥＮＣＯＵＲＴ（登録商標）ＣＯＳＭＣＰＲＥＰ（登録商標）（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐ．， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）である。上の手順後、ＰｈｉＸの重複したｄｓＤＮＡ断片を産生するために必要とされる４つの断片のそれぞれを補うオリゴヌクレオチドの４つのプールを産生する。

４つの重複するＰｈｉＸサブアセンブリーを産生するＧＩＢＳＯＮ ＡＳＳＥＭＢＬＹ（登録商標）（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）。
また、以下の工程をアセンブリーユニットによって自動化された様式で行い、これは必要な、および便利である程度に多くのサブユニットを有することができる。アセンブリーユニットのそれぞれのサブユニットには、必要に応じて試薬をあらかじめ装填して全ての工程を行う。オリゴヌクレオチド構築の後、ロボットアームを使用してオリゴ合成機から熱サイクル能力を伴う液体のハンドラへ反応容器を移す。完全に自動化された様式で、上の４つのオリゴヌクレオチドプールのそれぞれの１０μｌに、１０μｌのＰＣＲ構築試薬を添加する。ここで、約１０μＭの希釈を利用することができる。ＰＣＲ試薬の便利な形態は、２×ＨＦ ＰＨＵＳＩＯＮ（登録商標）Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｏｙ， Ｏｙ， Ｆｌ）である。プロトコルは以下に記載する。

構築反応は５０℃にて３０〜６０分間であり、その後、反応は温度を変え、１０℃にて保つ。

第１のＰＣＲおよびエラー修正
１．それぞれの構築された産物についてＰＣＲ反応を自動化された様式で行う：
２５．００μｌ ２×ＨＦ ＰＨＵＳＩＯＮ（登録商標）Ｍｉｘ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｏｙ， Ｏｙ， Ｆｌ）
０．２５μｌ 末端プライマー１（１００μＭ）
０．２５μｌ 末端プライマー２（１００μＭ）
２２μｌ 水
２．５μｌ 鋳型（上からの反応産物のＧＩＢＳＯＮ ＡＳＳＥＭＢＬＹ（登録商標）（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ））
２．熱サイクルは、以下のパラメーターを使用して行う：
９８℃ １分間
サイクル ２５×｛９８℃ １０秒間、６０℃ ３０秒間、７２℃ １．５分間）
７２℃ ５分間
９８℃ ２分間
８５℃まで２℃／秒で上昇
８５℃ ２分間
２５℃まで０．１℃／秒で低下
２５℃ ２分間
その後、１０℃にて保つ
３．Ｓ／Ｅエラー修正ミックス６．２５μｌをそれぞれの試料に添加（下のプロトコル）
４．エラー修正反応を１時間４２℃にて、次いで、その後反応は、温度を変え、１０℃にて保つ。

第２のＰＣＲ
１．また、以下の４つのＰＣＲ反応をアセンブリーユニットの熱サイクルサブユニットによって自動化された様式で行う：
２５．００μｌ 反応あたり ２×ＨＯＴＳＴＡＲＴ−ＩＴ（登録商標）Ｔａｑマスターミックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ， ＣＡ）または代替物（ＰＨＵＳＩＯＮ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｏｙ， Ｏｙ， Ｆｌ）
０．２５μｌ プライマー１（１００μＭ）
０．２５μｌ プライマー２（１００μＭ）
２２．００μｌ ＭＢＧ 水
２．５０μｌ 上からのエラー修正された鋳型

４つのサブアセンブリーをｐｈｉＸゲノムへ組み合わせるためのＧＩＢＳＯＮ ＡＳＳＥＭＢＬＹＴＭ｛Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）
以下の手順を自動化された様式で行う：
１．それぞれの４つの増幅産物２．５μｌを上の第２のＰＣＲから取り除き、９６ウェルプレートのもう一つの座標にプールする。
２．Ｎｏｔｌ制限酵素２μｌを添加し、１時間３７℃にて、次いでＮｏｔｌ酵素を不活性化するために２０分間６５℃でインキュベートする。
３．２×ＧＩＢＳＯＮ ＡＳＳＥＭＢＬＹＴＭ（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）マスターミックス１２μｌを添加し、１時間５０℃にてインキュベートする。

活性ＰｈｉＸウイルスの産生
この工程において、活性ウイルス粒子を産生する。また、これらの工程を自動化された様式で行う。上記のとおりにＤＮＡ合成および構築後、構築されたΦＸ１７４ゲノムを化学的にコンピテントな大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株Ｃまたはもう一つのΦＸ１７４感受性（ｓｅｎｓｔｉｖｅ）大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株（たとえば、ＤＨ１０）と合わせる。４２℃にて熱ショック後、細胞をＳＯＣ培地中に回収する。
１．上の構築反応５μｌを容器中で化学的にコンピテントなＤＨ１０大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）細胞５０μｌと合わせる。
２．熱サイクルを以下の条件に従って行う：
４℃ ２分間
４２℃ ３０秒間
４℃ ２分間
３．ＳＯＣ培地１５０μｌを添加し、細胞を数時間３７℃にてインキュベートする。

活性ファージ粒子を大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）から精製し、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）細胞（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ， ＰＮＡＳ ２００３）を含むＬＢ寒天プレート上にまくとき、プラークを形成する能力について試験する。

大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）細胞の形質転換の代わりのアプローチとして、無細胞系において活性ファージ粒子を形成する能力について試験することができる。この態様では、合成ゲノムを上で記述した無細胞発現キットの１つにおいて２時間インキュベートする。
試薬成分
ＧＩＢＳＯＮ ＡＳＳＥＭＢＬＹ（登録商標）（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）のための成分
１．５×等温（ＩＳＯ）反応緩衝液（２５％ ＰＥＧ−８０００、５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８．０、５０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭそれぞれの４つのｄＮＴＰおよび５ｍＭ ＮＡＤ）。これを下記のように調製する。
２．Ｔ５エキソヌクレアーゼ
３．ＰＨＵＳＩＯＮ（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｏｙ， Ｏｙ， Ｆｌ）
４．Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ

手順
１．５×ＩＳＯ緩衝液を調製する。この緩衝液６ｍｌは、以下を組み合わせることによって調製することができる：
３ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８．０
３００μｌの１Ｍ ＭｇＣｌ２
６００μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ
３００μｌの１Ｍ ＤＴＴ（１０ｍｌまでｄＨ２０中に１．５４ｇ溶解）
１．５ｇ ＰＥＧ−８０００
３００μｌの１００ｍＭ ＮＡＤ（１０ｍｌまでｄＨ２０中に０．６６ｇ溶解；加熱によって５０℃にて再懸濁、続いて連続的にボルテックスする）
水を６ｍｉまで添加する。１ｍｌを分注し、−２０℃にて保存する。
２．８０回の反応のために十分な構築マスター混合物８００μｌを調製する。これは、以下を組み合わせることによって調製することができる：
３２０μｌ ５×ＩＳＯ緩衝液
６．４μｌの１Ｕ／μｌ Ｔ５エキソ（１×Ｔ５エキソ緩衝液中の酵素ストックから、１：１０に希釈）
２０μｌの２Ｕ／μｌ ＰＨＵＳＩＯＮ（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｏｙ， Ｏｙ， Ｆｌ）
８０μｌの４０Ｕ／μｌ Ｔａｑリガーゼ
３７４μｌ ｄＨ２０
混合物を十分に混合し、−２０℃にて、または即時に使用する場合、氷上で貯蔵する。
３．構築混合物は、少なくとも１年間−２０℃にて貯蔵することができる。酵素は、少なくとも１０回の凍結融解サイクル後、活性なままである。
混合物は、２０〜１５０ｂｐ重複をもつＤＮＡ分子の構築に理想的である。
エラー修正ミックス成分− ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼ＋エキソヌクレアーゼＩＩＩ （Ｓ／Ｅ）
２５０μｌのＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）ヌクレアーゼ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ Ｉｎｃ．， Ｏｍａｈａ， ＮＥ）＋０．０３１２５μｌ エキソヌクレアーゼＩＩＩ

ＰｈｉＸゲノム配列：
配列番号：5

配列番号：１−断片＃１：

配列番号：２−断片＃２：

配列番号：３−断片＃３：

配列番号：４−断片＃４：

実施例４−機能的ＤＮＡ分子およびタンパク質部分の合成
機能的緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）および発現のための適切な制御配列をコードする核酸配列を、ＡＲＣＨＥＴＹＰＥ（登録商標）（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）または配列を約３０ｂｐ重複をもつ約６０ｂｐオリゴヌクレオチドに分ける別のソフトウェアに入力する。最初および最後のオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ増幅のためのプライマー結合ドメインおよび増幅後にプライマー結合ドメインを放出するためのＮｏｔＩ制限部位を含み、より大きな断片を構築するために必要である場合、ＤＮＡ構築のために重複した領域を曝露する。

システムは、１つのサブユニットとして統合した熱サイクル能力をもつＢＩＯＭＥＫ（登録商標）ＮＸＰ Ｓｐａｎ−８ラボラトリーオートメーションワークステーション（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．， Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ， ＣＡ）を含む。さらなるサブユニットは、タンパク質への核酸の無細胞翻訳を実施するための試薬を伴う容器を含む自動化されたインビトロでの翻訳システムを含む。送信ユニットへのエントリー後、生物学的配列情報を離れた都市の研究室に位置する受信ユニットに伝達する。

オリゴヌクレオチド合成
上に記述したものに類似の合成計画後、生物学的配列情報は実施例に記載したように、発明の受信ユニットによって受け取られる。この態様において、受信ユニットは、送信ユニットと同じコンピュータネットワークに接続されたコンピュータである。受信ユニットは、アセンブリーユニットに接続され、この態様では、１つのサブユニットとしてＢＩＯＡＵＴＯＭＡＴＩＯＮ（商標）１９２Ｅオリゴヌクレオチド合成機（ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ Ｃｏｒｐ．， Ｐｌａｎｏ， ＴＸ）を有する。アセンブリーユニットのさらなるサブユニットは、生物学的配列情報を受け取る前に、インビトロでの翻訳のためのサブユニットを含み、必要な化学物質、試薬および生物学的ビルディングブロックで全ての容器を装填すること、並びに生物学的配列情報を受け取る前に全てのソフトウェアプログラミングを調製することによって全てセットアップされ、その結果、配列情報を受け取ると即時に生物学的実体合成の活性化を開始することができる。

生物学的配列情報の受信後、アセンブリーユニット中のソフトウェアは、オリゴヌクレオチドの合成を指示し、システムに以前に提供されたｄＮＴＰまたはホスホラミダイトおよびその他の試薬を使用して合成する。この工程は、実施例において上記と同じ様式で行われ、オリゴヌクレオチドのセットを産生し、次いで、発現のために必要な適切な制御配列を伴うＧＦＰ遺伝子をコードする核酸配列を産生するために、実施例に記載されたように構築し増幅する。

インビトロおよび自動化された転写および翻訳は、その目的のために準備された反応容器の異なる反応区画において構築された核酸配列で行うことができる。種々のキットは、インビトロでの翻訳および／または無細胞タンパク質発現を行うために市販されており、び本発明において都合よく使用することができ、たとえば、ＰＩＥＲＣＥ（登録商標）（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）。ＴＨＥＲＭＯ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）から入手できるＩｎ Ｖｉｔｒｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＳｙｓｔｅｍまたはＰＲＯＭＥＧＡ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）からのＴ７ ＲｉｂｏＭＡＸ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓキット、これは、数分にてインビトロで２７ｋｂの転写物を生成することができる。別のキットは、翻訳されるタンパク質のタイプおよびサイズに応じて利用できる。反応が行われる反応容器の反応区画に、全ての必要な試薬をあらかじめ装填する。また、ＧＦＰ構築物は、コード配列の上流のＴ７または強力な大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）プロモーター、ＡＵＧ翻訳出発点の上流の５〜７ｂｐのスペーシング配列を伴うリボソーム結合部位および停止コーディングの下流の翻訳されない領域を含むようにデザインした。

合成ＰＣＲ産物を指定された反応区画におけるタンパク質発現成分に添加する。発現反応後、ブラックライトを反応混合物に保持し、翻訳されたＧＦＰの存在を緑色光の発光によって確認する。

実施例５−抗原性生物学的産物の合成
ＨＥＲ−２（ヒト上皮成長因子受容体２）は、増幅または過剰発現が一定の乳癌の進行において役割を果たすタンパク質である。タンパク質は、ＥＲＢＢ２遺伝子によってコードされる。数々の抗体療法が利用でき、ＨＥＲ−２を標的とする。ワクチンは、ＨＥＲ−２抗原を含んで作製することができ、これは、患者に投与することができ、次いでワクチンに対する抗原性応答を形成してＨＥＲ−２に対する抗体を産生するだろう。ワクチンは、癌治療において、およびＨＥＲ−２抗体の産生が有用な用途であることがわかる任意の療法において有用であり得る。

ＨＥＲ−２タンパク質の配列は、配列を、遺伝子のサブアセンブリーを表す適切な数の重複した断片に分けるソフトウェアプログラムに入力する。適切な制御配列が配列に含まれる。それぞれの断片は、遺伝子合成のために適した長さであり、適切な数の塩基対、たとえば約４０ｂｐなどによって次の断片に重なるようにデザインされる。生物学的配列情報を送信ユニットによって本発明のシステムの受信ユニットに伝達する。本明細書において説明したように、遺伝子を一連の重複したオリゴヌクレオチドとして構築することができ、アセンブリーユニットのサブユニットは、オリゴヌクレオチドを最終ｄｓＤＮＡ分子に構築し、またはｄｓＤＮＡ分子を反応容器の異なる区画において構築することができる。発現のための適切な制御配列を含める。構築された遺伝子をアセンブリーユニットのもう一つのサブユニットまたは反応容器のもう一つの区画へ移し、無細胞インビトロ転写を行い、次いで、本明細書において説明するように、ＤＮＡ配列の翻訳のためのもう一つのサブユニットまたはもう一つの区画へ移す。精製工程を必要に応じて行う。収集されたＨＥＲ−２を製剤化してもよく、抗原性ワクチンとして利用する。

実施例６−ＤＮＡワクチンの合成
また、本発明は、ＤＮＡワクチンの産生における使用を見いだす。１つまたは複数のＨＩＶタンパク質をコードするＤＮＡ配列を、発現のための適切な制御配列をもつ適切なプラスミド（たとえば、ｐＧＡ２／ＪＳ２）のＤＮＡ配列を含む適切な長さの重複したオリゴヌクレオチド断片にＤＮＡ配列を分離するソフトウェアプログラムに入力する。

配列は、本発明の送信ユニットによって本発明のシステムの受信ユニットに伝達される。本明細書において記述したように、受信ユニットは、本発明のアセンブリーユニットに配列を提供し、アセンブリーユニットは、完全なプラスミドワクチンにアセンブリーユニットのサブユニットによって（または反応容器の異なる区画における同じサブユニットによって）構築されるだろう重複したオリゴヌクレオチドの合成を始める。次いで、ＤＮＡを製剤化およびＤＮＡワクチンとして使用してもよい。患者に注射されるとき、ＤＮＡワクチンは、１つまたは複数のＨＩＶタンパク質を作製するための命令を細胞に提供するだろうし、次いで免疫応答を引き起こすだろう。免疫を提供するように治療するために患者に注射することができるプラスミドおよびその他のベクターに組み込むことができる技術を任意のＤＮＡウイルスに適用できる。

西ナイルウイルスは、ｐｒＭおよびＥ遺伝子を使用するＤＮＡワクチンの使用を介する予防に感受性である病原体のもう一つの例である。

実施例７−タンパク質サブユニットからのワクチンの合成
サブユニットワクチンは、ウイルス粒子全部を導入する必要なく、免疫系に抗原を示す機会を提供する。１つの例は、インフルエンザウイルスに対する免疫を提供するためのＯＰＴＡＦＬＵ（登録商標）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， ＧｍｂＨ， Ｍａｒｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）ワクチンである。本発明をサブユニットワクチンの迅速な産生において適用することができる。

現在のインフルエンザウイルスのＡ／Ｈ３Ｎ２、Ａ／Ｈ１Ｎ１およびＢ株は、Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ株推奨から得られ、ウイルスの表面抗原を使用して三価ワクチンの調製において使用される。核酸配列は、適切な制御配列を含む適切なソフトウェアプログラムを使用して上記のとおり断片に分離させる。核酸の合成後、上記のとおり、核酸をインビトロでの翻訳のためのアセンブリーユニットのサブユニットへ（または反応容器のもう一つの区画に）移す。ワクチンを細胞培養が維持されているサブユニットにおいて産生することができ、このサブユニットは、適切な培地においてＭＤＣＫ細胞（イヌ腎臓細胞株）の確立された培養であらかじめ調製した。

実施例８−ウイルス様粒子ワクチンの合成
非感染性ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、構築されたウイルス粒子を示す必要なく、免疫系を活性化する能力をもつワクチンを製造するために使用することができる。ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に対するワクチンは、Ｌ１および／またはＬ２主要キャプシドタンパク質を使用して製造することができ、これが抗原として有効であるウイルス様粒子に自己組織化する。これらのＶＬＰは、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞または細菌において構築することができる。この種のワクチンの例は、ＧＡＲＤＡＳＩＬ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ．， Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ， ＮＪ）である。複数のＨＰＶ Ｌ１ウイルス様粒子を免疫の最も幅広いスペクトルについて単一のワクチンに含むことができる。

タイプ６、１１、１６、１８、３１、３５、４５、５２および５８から選択されたＨＰＶ型の組み合わせのＶＬＰが選択される。ＶＬＰは、Ｌ１またはＬ１＋Ｌ２タンパク質であり得る。これらのタンパク質をコードする核酸配列を、含まれる選ばれた細胞タイプにおける発現のために適した制御配列をもつ適切なソフトウェアを使用して、上記のとおり同定し、断片に分離する。次いで、核酸配列情報を、送信ユニットによって離れた位置に位置する本発明の受信ユニットに伝達する。受信ユニットは、システムのアセンブリーユニットに配列情報を提供し、ＶＬＰを合成する。上記のとおり、ＤＮＡ分子を重複したオリゴヌクレオチド断片から１つまたは複数の全部のｄｓＤＮＡ分子に構築することができる。

合成後、上記のとおり、ＤＮＡをシステムで維持されている確立された細胞培養におけるインビトロでの翻訳のためのアセンブリーユニットのサブユニットへ（または反応容器のもう一つの区画に）移す。ワクチンは、そのサブユニット中の細胞によって産生される。翻訳されたタンパク質は、これらがプールされ、およびＨＰＶに対するワクチンとして有用であるＶＬＰに自己組織化するシステムのもう一つのサブユニットに提供される。

実施例９−完全なウイルスワクチンの合成
もう一つの実施形態において、ウイルスワクチン全体を、逆遺伝学技術を使用して細胞培養において合成することができる。インフルエンザＡ型ゲノムは、８つのウイルスの遺伝子セグメントで構成され、ＨＡおよびＮＡセグメントを含み、ウイルスへの免疫応答において重要である。一つの態様において、アセンブリーユニットは、ウイルス産生のために、たとえばＭＤＣＫ細胞、２９３Ｔ細胞またはＶｅｒｏ細胞を維持するサブユニットを有する（また、これらの成分は、反応容器の１つまたは複数のさらなる区画において維持することができる）。複数の転写カセットを含むプラスミドを８つのウイルスの遺伝子および必要な制御配列を含んで構築することができる。８つの遺伝子は、必要に応じて複数のプラスミドまたは単一のプラスミド上に存在することができる。ＨＡおよびＮＡセグメントは、局所的脅威を示すウイルスに由来する配列に基づく。したがって、一つの態様において、６つの非変異遺伝子を事前に調製し、ＨＡおよびＮＡ遺伝子のみをシステムによって合成する。次いで、６つの非変異遺伝子は、方法において試薬として扱うことができる。しかし、もう一つの態様において、アセンブリーユニットのサブユニットは、受信ユニットから受け取った情報に基づいたプラスミドを合成する。いずれの態様においても、合成後、プラスミドを高トランスフェクション効率のための条件下でアセンブリーユニットのもう一つのサブユニットにおいて維持されている細胞培養にトランスフェクトする。トランスフェクトされた細胞は、生きている弱毒ワクチンとして、または要望に応じて、殺された、またはさらに不活性化されたワクチンとして製剤化することができるウイルス粒子全体を産生する。

様々な置換および改変を本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく本明細書において開示した本発明に対して行ってもよいことは、当業者にとって容易に明らかだろう。

本明細書において言及した全ての特許および刊行物は、本発明が属する当業者のレベルを示している。

適切に実例として本明細書において記述した本発明は、本明細書において具体的に開示されない任意の要素または要素群、限定または限定群の非存在下において実施してもよい。したがって、たとえば、本明細書におけるそれぞれの例において、いずれかの用語「含む」、「から本質的になる」および「からなる」は、その他の２つの用語のいずれかと置き換えてもよい。使用してきた用語および表現は、記述の用語として、および限定なく使用され、および示され、および記載された特徴またはその一部の任意の均等物を除外するこのような用語および表現の使用における意図はないが、しかし、種々の改変が請求した本発明の範囲内で可能であることが認識される。

加えて、本発明の特徴または側面がマーカッシュグループに関して記述される場合、当業者は、これにより本発明が、またマーカッシュグループのメンバーの任意の個々のメンバーまたはサブグループに関して記述されることを認識するであろう。たとえば、Ｘを、臭素、塩素およびヨウ素からなる群より選択されると記述した場合、Ｘが臭素であることについての請求およびＸが臭素および塩素であることについての請求が完全に記述される。

その他の態様は、以下の請求項の範囲内である。

Claims (22)

1. 提供された配列情報にしたがって機能的なＤＮＡ分子を合成するための自動化されたシステムであって、
   提供された配列情報にしたがって機能的なＤＮＡ分子を構築するための、アセンブリーユニットを含み、
   該アセンブリーユニットは、複数のオリゴヌクレオチドを含む容器を含んでいるか、またはそれらに接続されており、かつ前記システム内で試薬を輸送するための、および複数のレベルの生物学的構築を通じて前記機能的ＤＮＡ分子を構築する自動化された方法における工程を実行するための構成要素を含み、該複数のレベルの生物学的構築は、前記複数のオリゴヌクレオチドを連結することによる一つまたは複数の機能的ｄｓＤＮＡ分子の構築を含み、
   該アセンブリーユニットは更に、前記自動化された方法において前記ｄｓＤＮＡ分子を構築するための、ソフトウェアプログラミング命令を含み、
   前記自動化された方法は、前記複数のオリゴヌクレオチドを連結した後の産物を増幅するための反応中にＰＥＧが存在するＰＣＲの工程の実施と、エラー修正工程の実施とを含み、かつ、
   前記オリゴヌクレオチオドは、前記機能的ＤＮＡ分子またはその変異体の断片であり、
   かつ更に、前記アセンブリーユニットは、前記オリゴヌクレオチオドを連結することによって１００ｂｐより大きいｄｓＤＮＡ分子を合成することを含む自動化された方法で構築を実施する、
   前記自動化システム。
2. 前記オリゴヌクレオチドを、前記オリゴヌクレオチドの増幅のため前記アセンブリーユニットのサブユニットに提供する、請求項１に記載の自動化システム。
3. 前記オリゴヌクレオチドを、単一の等温反応においてＧＩＢＳＯＮ ＡＳＳＥＭＢＬＹ（登録商標）を用いて、前記大きいＤＮＡ分子に構築する、請求項１に記載の自動化システム。
4. 前記オリゴヌクレオチドが４０〜１００ヌクレオチド長である、請求項１に記載の自動化システム。
5. 前記機能的ＤＮＡオリゴヌクレオチドの断片またはその変異体が、ＤＮＡ構築のため配列の重複を含む、請求項１に記載の自動化システム。
6. 前記オリゴヌクレオチドが５０〜９０ヌクレオチド長である、請求項５に記載の自動化システム。
7. 前記構築システムが更に、自動化方法で前記オリゴヌクレオチドを合成するため核酸合成機サブユニットを用いる別のレベルの構築を含む、請求項１に記載の自動化システム。
8. 前記機能的ＤＮＡ分子の配列を、構築用の前記核酸合成機サブユニットに伝達させる重複オリゴヌクレオチド配列に分割するためのソフトウェアを更に含む、請求項７に記載の自動化システム。
9. 前記アセンブリーユニットが更に、自動化方法で前記オリゴヌクレオチドを合成するために使用されるヌクレオシドホスホラミダイトもしくはヌクレオチドを含む容器を含んでいるか、またはそれらに接続されている、請求項１に記載の自動化システム。
10. 前記機能的ＤＮＡ分子が、事前に作成された配列により合成される一つもしくは複数のさらなるＤＮＡ配列、または事前に作成された配列としてシステムに提供される一つもしくは複数のさらなるＤＮＡ配列で構築され、該一つもしくは複数のさらなるＤＮＡ配列が、プラスミド、ベクター、制御配列、プロモーター配列、トランス作用因子のための結合エレメント、シグナル配列、およびその二つまたはそれ以上の組合せのいずれかから成る群から選択される、請求項１に記載の自動化システム。
11. 前記さらなるＤＮＡ配列が、宿主細胞で使用するためのベクターであり、かつ、前記自動化システムが更に、該宿主細胞と、試薬と、該システム内で試薬を輸送するための、ならびに、前記機能的ＤＮＡ分子および前記ベクターで前記宿主細胞を形質転換させるかまたはトランスフェクトするソフトウェアプログラミング命令から自動化方法において工程を実施するための、構成要素とを含む、請求項１０に記載の自動化システム。
12. 前記形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞が、一つまたは複数のタンパク質またはタンパク質サブユニットを作製し、かつ任意で、該タンパク質を生物学的産物に構築する、請求項１１に記載の自動化システム。
13. 前記生物学的産物がファージまたはその一部のウイルス粒子である、請求項１２に記載の自動化システム。
14. 前記機能的ＤＮＡがファージまたはウイルスゲノムである、請求項１に記載の自動化システム。
15. 前記ファージまたはウイルスゲノムが、宿主細胞をトランスフェクトするために使用され、前記自動化システムが更に、該宿主細胞と、試薬と、該システム内で試薬を輸送するための、および、前記ファージまたはウイルスゲノムで前記宿主細胞を感染またはトランスフェクトするソフトウェアプログラミング命令から自動化方法で工程を実行するための、構成要素とを含む、請求項１４に記載の自動化システム。
16. 前記宿主細胞で複製されたファージまたはウイルス粒子を回収するための構成要素を更に含む、請求項１５に記載の自動化システム。
17. 複数の機能的ＤＮＡ分子を構築する、請求項１に記載の自動化システム。
18. 宿主細胞と、試薬と、システム内で試薬を輸送するための、および、前記宿主細胞を複数の機能的ＤＮＡ分子で形質転換またはトランスフェクトするソフトウェアプログラミング命令から自動化方法における工程を実行するための、構成要素とを更に含む、請求項１７に記載の自動化システム。
19. 前記機能的ＤＮＡ分子が直接的にＤＮＡワクチンまたはその構成要素である、請求項１に記載の自動化システム。
20. 送信ユニットから伝達される生物学的配列情報をコードするシグナルを受信するための受信ユニットを更に含む、請求項１に記載の自動化システム。
21. 前記送信ユニットが前記受信ユニットから離れた位置に存在する、請求項２０に記載の自動化システム。
22. 前記送信ユニットおよび前記受信ユニットが、コンピュータネットワークの一部であるコンピュータである、請求項２０に記載の自動化システム。

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