JP2019071842A

JP2019071842A - 細胞の集合構造体の作製装置

Info

Publication number: JP2019071842A
Application number: JP2017201345A
Authority: JP
Inventors: 健二米田; Kenji Yoneda; 一朗越田; Ichiro Koshida; 寛之永井; Hiroyuki Nagai
Original assignee: Shibuya Kogyo Co Ltd
Current assignee: Shibuya Corp
Priority date: 2017-10-17
Filing date: 2017-10-17
Publication date: 2019-05-16
Anticipated expiration: 2037-10-17
Also published as: JP7037038B2

Abstract

【課題】細胞の集合構造体の作製装置の提供。【解決手段】培養容器３の内部に複数のピン２３（棒状部材）を立設し、ピン２３によって複数の細胞凝集塊を保持することで癒合パッド（集合構造体）４を作製する。ピン２３が貫通可能な貫通孔が形成された下方進退部材１３及び上方進退部材１４と、下方進退部材１３及び上方進退部材１４を昇降させる下方駆動手段１５及び上方駆動手段１６とを備え、下方進退部材１３及び上方進退部材１４を細胞凝集塊に接近離隔させるように上下に進退動させて、細胞凝集塊の下方及び上方で培養液を流動させる。複数の棒状部材に保持された細胞凝集塊の近傍に新たな培養液を流通させることができる。【選択図】図６

Description

本発明は細胞の集合構造体の作製装置に関し、詳しくは、立設させた複数の棒状部材によって複数の細胞凝集塊を保持させて培養することで、上記細胞凝集塊が相互に融合した集合構造体を作製する細胞の集合構造体の作製装置に関する。

従来、器官や臓器の再生を目的とする再生医療や、その他試験等に用いることを目的として、複数の細胞凝集塊（スフェロイド）を立体的に組み合わせて細胞の立体構造体を製造する細胞の集合構造体の作製装置が知られている。
このような細胞の集合構造体の作製装置として、培養液を収容した培養容器の内部に複数の棒状部材を立設し、当該棒状部材によって複数の細胞凝集塊を保持させて培養することにより、相互に融合した集合構造体を作製する装置が知られている（特許文献１）。
またこの特許文献１では、上記保持した当該細胞凝集塊の下方に隙間を形成するとともに、上記隙間に培養液を排出する配管を設け、細胞凝集塊の近傍に新たな培養液を流通させることが提案されている。

特開２０１７−７９７１９号公報

ここで、立設させた複数の棒状部材によって複数の細胞凝集塊を保持する構成の場合、棒状部材と棒状部材とによって形成された空間は培養液が流れにくく、新たな培養液を十分に細胞凝集塊の近傍に流通させることができず、培養不良が生じやすいという問題がある。
そこで上記特許文献１のような構成が提案されたが、棒状部材と棒状部材との間隔は実際には極めて狭いことから、細胞凝集塊の下方に配管を挿入する構成を実現することは困難であった。
このような問題に鑑み、本発明は立設させた複数の棒状部材に保持された複数の細胞凝集塊の近傍に、新たな培養液を効果的に流通させることが可能な細胞の集合構造体の作製装置を提供するものである。

すなわち、請求項１の発明にかかる細胞の集合構造体の作製装置は、培養液を収容した培養容器の内部に複数の棒状部材を立設し、上記棒状部材によって複数の細胞凝集塊を保持させて培養することで、上記細胞凝集塊が相互に融合した集合構造体を作製する細胞の集合構造体の作製装置において、
上記培養容器内に保持された細胞凝集塊の周囲に配置される進退部材と、当該進退部材を細胞凝集塊に向けて進退動させる駆動手段とを備え、
上記細胞凝集塊を培養容器内で培養する間に、上記駆動手段によって上記進退部材を細胞凝集塊に向けて進退動させて、上記細胞凝集塊の周囲で培養液を流動させることを特徴としている。

本発明によれば、立設させた複数の棒状部材により保持された複数の細胞凝集塊の周囲に進退部材を配置し、当該進退部材を細胞凝集塊に向けて進退動させることで、細胞凝集塊の近傍で培養液を流動させることができ、細胞凝集塊の近傍で新たな培養液を効果的に流通させることができる。

細胞の集合構造体の作製装置の外観図。細胞凝集塊の移載装置の構成図。細胞凝集塊の収容容器および吸引ノズルの構成図。細胞凝集塊を保持した培養容器の平面図。進退部材の平面図。培養液の流動装置の構成図。進退部材の動作説明図。下方進退部材および上方進退部材による進退動作を示す図。

以下、図示実施例について説明すると、図１〜図６は細胞の集合構造体の作製装置１を説明するものであって、複数の細胞凝集塊２（スフェロイド：図３参照）を培養容器３の内部に保持させて培養することにより、細胞凝集塊２が相互に融合した細胞の集合構造体としての癒合パッド４（図６参照）を作製するものとなっている。
上記細胞凝集塊２は、例えば特許第４５１７１２５号に開示される方法で作製することができる。すなわち、内面が非接着性の容器に細胞を播種して培養すると、細胞は足場を求めて互いに接着し合うことで凝集して細胞凝集塊２が形成され、これらがさらに融合することで外径寸法が５００μｍ程度の略球状の細胞凝集塊２が形成される。
より効率的には、ウエルプレートの非接着性のウエル（略半球状の収容部）で培養することにより容易に細胞凝集塊２を得ることができる。なお、細胞凝集塊２の作製方法はこれに限らず、旋回している培養液中に細胞懸濁液を入れる旋回培養法、試験管に細胞懸濁液を入れて遠心分離器で沈殿させる方法、あるいはアルギン酸ビーズを用いて培養する方法など公知の様々な方法で作製することができる。
このように、細胞凝集塊２とは、細胞同士が集合し凝集化した１００〜５００μｍ程度の外径寸法を有した略球状の細胞集合体を指し、これらの細胞凝集塊２を平面的または立体的に接触または接近させて配置すると、各細胞凝集塊２の細胞が増殖して隣接する細胞凝集塊２と融合し、平面的または立体的な細胞の集合構造体が得られるようになっている。
本実施例で作製する癒合パッド４は、欠損した患部に移植するために用いることができ、複数の細胞凝集塊２を平面的に配置して融合させたものとなっている。厚さは用いる細胞凝集塊２の寸法に応じて１００〜５００μｍ程度のものを作製することが可能で、平面的なサイズは整列させる細胞凝集塊２の個数によって調節可能となっている。
このように作製される上記癒合パッド４は、細胞懸濁液を平面的に培養することで細胞単体をシート状に培養して得られる細胞シートとは異なるものである。

本実施例の作製装置１は、図１に示す内部が無菌状態に維持されたアイソレータ５と、当該アイソレータ５に接続可能に設けられたインキュベータ６とを備え、上記アイソレータ５には搬入物を除染するためのパスボックス５ａが設けられている。
図２は上記アイソレータ５の内部に設けられた細胞凝集塊２の移載装置Ｍの構成を示し、細胞凝集塊２を収容する収容容器７を支持する収容容器支持部８と、上記培養容器３を支持する培養容器支持部９と、上記細胞凝集塊２を保持する複数の吸引ノズル１０と、上記吸引ノズル１０を上記収容容器７および培養容器３に対して相対的に移動させるノズル移動手段１１とを備えている。
一方、図６は上記インキュベータ６の内部に設けられた培養液の流動装置Ｆの構成を示し、培養容器３を載置させる載置台１２と、培養容器３の内部に設けられた下方進退部材１３および上方進退部材１４と、これら下方進退部材１３および上方進退部材１４を進退動させる下方駆動手段１５および上方駆動手段１６と、上記下方進退部材１３と下方駆動手段１５を連結する下方連結手段１７と、上記上方進退部材１４と上方駆動手段１６を連結する上方連結手段１８とを備えている。本実施例においては、下方進退部材１３および上方進退部材１４は薄い平板状に形成されている。
そして、上記アイソレータ５および内部に設けられた移動装置Ｍの動作は、コンピュータからなる制御手段Ｃ１によって制御され、これと同様インキュベータ６および内部に設けられた流動装置Ｆの動作も、コンピュータからなる制御手段Ｃ２により制御される。
また上記インキュベータ６には、培養容器３に新鮮な培養液を供給する培養液供給手段を備えてもよい。
なお、以下の説明において、図２における図示左右方向をＸ方向、前後方向をＹ方向、上下方向をＺ方向とし、図４、図５では図示左右方向をＸ方向、上下方向をＹ方向とする。

上記アイソレータ５は内部が無菌環境に維持され、また無菌エア供給手段によって上方から下方へと向かう無菌エアによる一方向流が形成されるようになっている。
またアイソレータ５の正面には作業者が装着可能なグローブ５ｂが設けられており、各種の作業を行うことが可能となっている。なお、アイソレータ５の内部にロボットや所要の構成を有した移送手段を設けて、各種作業を自動的に行うようにすることもできる。
次に、上記インキュベータ６は、内部が無菌環境に維持されるとともに、癒合パッド４の培養に適した所定の温度および湿度に維持され、細胞凝集塊２が融合して癒合パッド４へと形成される間、上記インキュベータ６を上記アイソレータ５より分離して、当該アイソレータ５より離れた場所に保管することが可能となっている。
そのため、上記アイソレータ５とインキュベータ６とは接続手段６ａによって接続されており、例えば特許第４６５６４８５号公報に記載されるような、インキュベータ６とアイソレータ５とを無菌状態を維持したまま接離させる接続手段を使用することができる。

図３は上記収容容器７の断面図を示し、上述したウエルプレートを使用することができる。収容容器７は平面視において縦横に複数の収容凹部７ａを備え、各収容凹部７ａの内部には培養液とともに略球状の細胞凝集塊２が一個ずつ収容されている。
上記収容容器７の収容凹部７ａは、平面視におけるＸ方向およびＹ方向にそれぞれ所定個数ずつ整列しており、本実施例では培養容器３において作製する癒合パッド４を構成する細胞凝集塊２のＸ方向およびＹ方向の個数と同数、すなわちＸ方向に５個、Ｙ方向に５個それぞれ設けられている。

上記収容容器７を支持する収容容器支持部８は、位置決め片８ｂによってその上面で上記収容容器７を位置決めするとともに、上記ノズル移動手段１１を構成するＹ方向テーブル８ａによって構成されている。
後述するように、本実施例の吸引ノズル１０はＸ方向に５個設けられ、またＸ方向およびＺ方向にのみ移動可能となっていることから、上記Ｙ方向テーブル８ａが収容容器７をＹ方向に移動させることで、吸引ノズル１０と収容容器７とをＸＹＺの各方向で相対的に移動させることができる。
具体的に説明すると、最初に上記Ｙ方向テーブル８ａが収容容器７の１列目の収容凹部７ａを吸引ノズル１０の下方に位置させて、当該一列目の収容凹部７ａから吸引ノズル１０が細胞凝集塊２を吸着保持すると、Ｙ方向テーブル８ａが１列分だけＹ方向に収容容器７を移動させて、２列目の収容凹部７ａを吸引ノズル１０の下方に位置させるようになっている。

図４は上記培養容器３の平面図を示し、当該培養容器３を流動装置Ｆを構成する載置台１２に載置させた状態を示している。上記培養容器３を上記移載装置Ｍで取り扱う際には、上記培養容器３だけを上記培養容器支持部９に載置し、培養容器３の内部に所定個数の細胞培養塊２を保持させた後、アイソレータ５内に配置した上記載置台１２に移動させるようになっている。
図４および図６にも示すように、上記培養容器３は有底箱状を有しており、内部には所定の深さで培養液が収容されるとともに、底面に設置された底面プレート２１と、当該底面プレート２１の中央に設置された台座２２と、当該台座２２に立設された棒状部材としての複数のピン２３とが収容されている。
上記底面プレート２１は培養容器３の底面と略同形を有しており、底面プレート２１が培養容器３の内部で移動しないように位置決めされている。また底面プレート２１における上記台座２２を設置する位置には凹部２１ａが形成され、さらに当該凹部２１ａを挟んで対向した位置にはＺ方向に向けて２本のガイドロッド２４が設けられている。

上記台座２２は直方体形状を有しており、上記ピン２３は当該台座２２の上面に所定の配列で立設され、各ピン２３は培養容器３の内部において完全に培養液中に水没するようになっている。
図４に示すように、本実施例では上記複数のピン２３によってＸ方向およびＹ方向にそれぞれ５個の細胞凝集塊２を相互に接触した状態で平面的に整列させるようになっている。
平面視において４本のピン２３が四隅に位置した略正方形の区画を細胞凝集塊２の保持部Ｈとし、当該保持部Ｈを構成する４本のピン２３のうち、各対角位置の２本のピン２３の間隙は、保持する細胞凝集塊２の直径よりも短くなるように配置されている。
換言すると、細胞凝集塊２を作製する際に、各対角位置の２本のピン２３の間隙よりも直径が大きくなるようにすることで、複数のピン２３とピン２３との間に細胞凝集塊２を差し込むと、当該細胞凝集塊２を上記ピン２３の先端と根元との間の上下中間部分に位置させることができる。
そして複数の隣接する保持部Ｈに細胞凝集塊２を保持させることで、各保持部Ｈの細胞凝集塊２同士を相互に接触させた状態で培養でき、これにより細胞凝集塊２同士が融合して癒合パッド４が得られることとなる。

培養容器支持部９は、上記ノズル移動手段１１を構成するＹ方向テーブル９ａによって構成され、位置決め片９ｂにより上記培養容器３を位置決めするようになっている。
培養容器支持部９も、上記収容容器支持部８を構成するＹ方向テーブル８ａと同様、吸引ノズル１０に吸着保持された細胞凝集塊２が上記培養容器３の内部の保持部Ｈに供給されるたびに、培養容器３をＹ方向に細胞凝集塊２一列分ずつ移動させるものとなっている。

次に、上記吸引ノズル１０について説明すると、図３に示すように図示しない負圧発生手段に接続された本体部１０ａと、当該本体部１０ａの下端部に設けられた管状の吸着部１０ｂとを備えている。
上記吸着部１０ｂの内径は上記細胞凝集塊２より小径となっており、上記収容容器７の収容凹部７ａにおいて吸着部１０ｂの先端に細胞凝集塊２を吸着保持した際に、細胞凝集塊２が当該吸着部１０ｂの内部に吸い込まれないようになっている。
また培養容器３において複数のピン２３に細胞凝集塊２を保持させるには、上記吸着部１０ｂの中心位置をピン２３とピン２３との間に形成した保持部Ｈの略中央に位置させ、かつ細胞凝集塊２を上記ピン２３の上下中間位置に位置した状態で上記負圧発生手段による負圧を解消する。
なお細胞凝集塊２を吸着保持する吸引ノズル１０に代えて、グリッパなどによって細胞凝集塊２を保持する等の構成を有したものを用いて細胞凝集塊２を保持するようにしてもよい。

また上記吸引ノズル１０を移動させるノズル移動手段１１は、図２に示すように上記収容容器支持部８および培養容器支持部９にかけてＸ方向に設けられたＸ方向レール２５と、当該Ｘ方向レール２５に沿って吸引ノズル１０をＸ方向に移動させるＸ方向移動手段２６と、当該Ｘ方向移動手段２６に設けられてＺ方向に吸引ノズル１０を昇降させるＺ方向移動手段２７と、上記収容容器支持部８および培養容器支持部９における上記Ｙ方向テーブル８ａ、９ａとによって構成されている。
なお、ノズル移動手段１１としては、Ｙ方向テーブル８ａ、９ａに代えて、上記Ｘ方向レール２５をＹ方向に移動させる構成を有したものであってもよい。このような構成とすることで、上記吸引ノズル１０や後述するカメラ２９をＸ−Ｙ方向に移動させることができる。

また本実施例の吸引ノズル１０はＸ方向に５個整列して設けられ、これら吸引ノズル１０は間隔変更手段２８によってＸ方向にその間隔が変更されるようになっている。
具体的には、上記吸引ノズル１０が収容容器支持部８の上方に位置した際には、間隔変更手段２８は上記収容容器７におけるＸ方向に整列した収容凹部７ａと同じ間隔に上記吸引ノズル１０の間隔を変更する。
一方、吸引ノズル１０が培養容器支持部９の上方に位置した際には、間隔変更手段２８は上記培養容器３の内部のピン２３とピン２３との間に形成された保持部Ｈにおける、Ｘ方向の間隔と同じ間隔に吸引ノズル１０の間隔を変更する。

上記Ｘ方向レール２５にはＸ方向に移動するカメラ２９が設けられており、上記カメラ２９は上記吸引ノズル１０によって細胞凝集塊２が保持部Ｈに保持されると、培養容器支持部９の上方まで移動して培養容器３内の保持部Ｈを撮影するようになっている。
撮影された画像により、上記全ての保持部Ｈに細胞凝集塊２が保持されているか否かが確認され、必要に応じて細胞凝集塊２の保持されていない保持部Ｈに対して細胞凝集塊２を供給するよう、指示することができる。
またカメラ２９は、上記ノズル移動手段１１が吸引ノズル１０を培養容器支持部９の上方に位置させる際には、吸引ノズル１０との接触を避けるために培養容器支持部９の上方から退避するようになっている。

図６はインキュベータ６の内部に設けられた流動装置Ｆを示し、当該流動装置Ｆにおいて上記培養容器３は移動可能に設けられたプレート状の載置台１２に載置されるようになっている。
そして上記流動装置Ｆは、上記培養容器３の内部に、上記ピン２３によって保持された細胞凝集塊２の下方に配置される下方進退部材１３と、細胞凝集塊２の上方に配置される上方進退部材１４とを備えている。
また流動装置Ｆは、上記インキュベータ６の内部に、上記載置台１２を挟んで設けられた、上記下方進退部材１３を昇降させる下方駆動手段１５と、上記上方進退部材１４を昇降させる上方駆動手段１６とを備えている。
さらに流動装置は、上記下方進退部材１３と上記下方駆動手段１５とを連結する下方連結手段１７と、上方進退部材１４と上方駆動手段１６とを連結する上方連結手段１８とを備えている。
ここで、図４はアイソレータ５内において上記培養容器３を上記載置台１２に載置した状態を示しており、当該図４において上記上方進退部材１４は省略されている。

上記載置台１２の略中央には上記培養容器３を位置決めするための凹部１２ａが形成されており、この載置台１２ごと上記培養容器３を上記アイソレータ５とインキュベータ６との間で移送することが可能となっている。
また上記凹部１２ａに収容された培養容器３を挟んで対向した位置には、上記下方連結手段１７を支持する下方支持部材３１と、上記上方連結手段１８を支持する上方支持部材３２が設けられている。

上記下方進退部材１３には、上記培養容器３の内部に立設された上記ピン２３の位置に合わせて貫通孔１３ａが穿設されており、下方進退部材１３は上記貫通孔１３ａに上記ピン２３を貫通させた状態で、上記ピン２３の立設された台座２２に載置されるようになっている。
また、平面視で四角形からなる上記下方進退部材１３の図４における図示左右の対辺部分には、それぞれ上記ガイドロッド２４が上下に貫通する貫通孔１３ｃの形成されたガイド部１３ｂが設けられ、当該ガイド部材１３ｂを設けた対辺部分とは異なる図４における図示上下の対辺部分には、それぞれ上記下方連結手段１７に連結される突出片１３ｄが設けられている。

上記下方連結手段１７は、水平方向に設けられたアーム部１７ａと、当該アーム部１７ａの先端に設けられるとともに上記下方進退部材１３の一対の突出片１３ｄを支持する支持部１７ｂとから構成されている。
上記アーム部１７ａは上記載置台１２に設けられた下方支持部材３１に載置されるようになっており、その先端は上記下方進退部材１３の上方に位置して上記支持部１７ｂが取り付けられ、末端は上記載置台１２の外方に突出して、インキュベータ６の内部で上記下方駆動手段１５が連結されるようになっている。
上記支持部１７ｂは、その上端が上記アーム部１７ａの先端に固定され、その下端部は上記下方進退部材１３に設けられた２つの突出片１３ｄに向けて分岐し、さらに当該突出片１３ｄを上下から挟持するように二股状に形成されている。
このような構成により、上記アーム部１７ａが上下に移動すると、上記支持部１７ｂに上下から支持された下方進退部材１３の突出片１３ｄを介して、下方進退部材１３が培養容器３の内部で細胞凝集塊２に向かって上下に進退動するようになっている。

図５に示すように、平面視で四角形からなる上記上方進退部材１４には、上記下方進退部材１３と同様、上記ピン２３が貫通する貫通孔１４ｃが穿設され、また、図５における図示左右の対辺部分には、それぞれ上記ガイドロッド２４が上下に貫通する貫通孔１４ｃの形成されたガイド部１４ｂが設けられ、当該ガイド部１４ｂを設けた対辺部分とは異なる図５における図示上下の対辺部分には、それぞれ上記上方連結手段１８によって支持される突出片１４ｄが設けられている。
上記上方連結手段１８も、上記下方連結手段１７と同様、水平方向に設けられたアーム部１８ａと、当該アーム部１８ａの先端に設けられるとともに上記上方進退部材１４の一対の突出片１４ｄを支持する支持部１８ｂとから構成され、上記アーム部１８ａは上記載置台１２に設けられた上方支持部材３２に載置されるようになっている。
上記上方進退部材１４の各突出片１４ｄには、その上面に係合ピン１４ｅが設けられており、これに対し上記上方連結手段１８のアーム部１８ａの先端は、上記上方進退部材１４の上方に位置して上記支持部１８ｂが取り付けられ、末端は上記載置台１２の外方に突出して、インキュベータ６の内部で上記上方駆動手段１６が連結されるようになっている。
上記支持部１８ｂは、その上端が上記アーム部１８ａの先端に固定され、その下端部は上記上方進退部材１４に設けられた２つの上記係合ピン１４ｅに向けて分岐し、その先端には上記係合ピン１４ｅに係合するスリット１８ｃが形成されている。
このような構成により、上記アーム部１８ａが上下に移動すると、上記支持部１８ｂのスリット１８ｃと係合した係合ピン１４ｅおよび突出片１４を介して、上方進退部材１４が培養容器３の内部で細胞凝集塊２に向かって上下に進退動するようになっている。

上記下方駆動手段１５および上方駆動手段１６は、それぞれ進退ロッド１５ａ、１６ａを高精度に位置合わせすることが可能な電動シリンダによって構成され、これらは制御手段Ｃ２によって個別に制御されるようになっている。
上記進退ロッド１５ａには上記下方連結手段１７のアーム部１７ａの末端を着脱自在に連結させることが可能となっており、これと同様、上記進退ロッド１６ａには上記上方連結手段１８のアーム部１８ａの末端を着脱自在に連結させることが可能となっている。
上記構成により、ロボットまたは作業者が培養容器３の載置された載置台１２をインキュベータ６内に移動させた後、上記下方連結手段１７により上記下方進退部材１４を上記下方駆動手段１５に連結し、上記上方連結手段１８により上記上方進退部材１４を上方駆動手段１６に連結することができるようになっている。
そして制御手段Ｃ２は、上記下方駆動手段１５および上方駆動手段１６を個別に制御することで、上記下方連結手段１７および上方連結手段１８によって連結された下方進退部材１３および上方進退部材１４を個別に昇降させることが可能となっている。

そして上記インキュベータ６内には、図示しないが培養容器３に培養液を供給する培養液供給手段が設けられ、両端が培養容器３の培養液中に挿入された配管により培養液の吸引および排出を行うことで、培養容器３内で培養液を循環させるようになっている。
なお上記培養液供給手段としては、培養液に対して栄養分を補給する補給手段や、古い培養液を排液するとともに新たな培養液を供給する供給手段を設けてもよい。

以下、上記構成を有する細胞の集合構造体の作製装置１を用いた癒合パッド４の作製方法を説明する。
最初に、上記パスボックス５ａを介して、上記細胞凝集塊２が収容された収容容器７や培養容器３を上記アイソレータ５内に搬入したり、培養容器３に所定量の培養液を供給する準備工程を行う。
上記培養容器３は上記培養容器支持部９に載置され、また培養容器３には上記ピン２３の立設された台座２２が収容されるとともに、上記下方進退部材１３が上記ピン２３に貫通された状態で台座２２の上面に載置されて配置されている。

上記準備工程が完了すると、上記吸引ノズル１０によって収容容器７に収容された細胞凝集塊２を上記培養容器３に供給する供給工程を行う。
具体的には、図２（ａ）に示すように、上記ノズル移動手段１１が吸引ノズル１０を移動させ、また間隔変更手段２８が吸引ノズル１０の間隔を変更して、上記収容容器支持部８において収容容器７の収容凹部７ａから細胞凝集塊２を吸着保持する。
続いて、図２（ｂ）に示すように、ノズル移動手段１１が吸引ノズル１０を培養容器支持部９へと移動させ、その間に間隔変更手段２８が上記ピン２３とピン２３との間に形成された保持部Ｈの間隔に合わせて吸引ノズル１０の間隔を変更する。
吸引ノズル１０が培養容器３の上方に位置すると、吸引ノズル１０が下降して各吸引ノズル１０に保持された細胞凝集塊２が複数のピン２３によって形成された保持部Ｈに挿入され、上記ピン２３の上下中間位置で細胞凝集塊２が保持される。
その後、上記カメラ２９が培養容器支持部９の上方に移動して培養容器３内の細胞凝集塊２を撮影し、細胞凝集塊２が全ての保持部Ｈに保持されているか否かを確認する。
予定した細胞凝集塊２を全て保持させると、ロボットもしくは作業者によって培養容器３を培養容器支持部９上から取り出して、上記準備工程においてあらかじめアイソレータ５内に搬入させていた載置台１２に載置する。
さらに、培養容器３内に収容された上記下方進退部材１３に上記下方連結手段１７を連結する。具体的には、上記下方進退部材１３の突出片１３ｄを下方連結手段１７の支持部１７ｂによって支持し、アーム部１７ａを下方支持部材３１に支持させる。
なお、この状態においては、下方進退部材１３が台座２２に載置された状態を維持するように、下方連結手段１７を支持する下方支持部材３１の高さが設定されている。

次に、図７（ａ）に示すように、上記細胞凝集塊２が収容された培養容器３の内部に上方進退部材１４を設置する上方進退部材設置工程を行う。
具体的には、上記上方進退部材１４に穿設された貫通孔１４ａに上記ピン２３を貫通させるとともに、ガイド部１４ｂの貫通孔１４ｃにガイドロッド２４を貫通させる。
その後、上方進退部材１４を下方に移動させると、上記保持部Ｈに保持された細胞凝集塊２に上方から接触してこれを下方に押し下げ、細胞凝集塊２を上記下方進退部材１３と上方進退部材１４とによって上下から挟持した状態として、培養容器３に収容された細胞凝集塊２の高さを一致させる。
続いて、上記上方進退部材１４に上記上方連結手段１８を連結する。具体的には、上記上方連結手段１８の支持部１８ｂに形成されたスリット１８ｃを、上記上方進退部材１４の突出片１４ｄに設けられた係合ピン１４ｅに係合させ、さらにアーム部１８ａを上方支持部材３２に支持させる。
ここで、上記上方連結手段１８を支持する上方支持部材３２の高さは、上方進退部材設置工程で上方支持部材３２を培養容器３の内部に設置した状態を維持し、当該上方進退部材１４によって細胞凝集塊２を押しつぶすことがないよう設定されている。

このようにして培養容器３内に細胞凝集塊２が収容され、かつ下方進退部材１３に下方連結手段１７が連結され、上方進退部材１４に上方連結手段１８が連結されて準備が終了すると、ロボットもしくは作業者によって上記培養容器３をインキュベータ６に移送する移送工程を行う。
上記培養容器３は載置台１２ごとインキュベータ６の内部に移送されるようになっており、上記載置台１２は上記流動装置Ｆを構成する下方駆動手段１５および上方駆動手段１６の間に載置されて位置決めされる。
その後、上記下方連結手段１７を上記下方駆動手段１５に連結し、上方連結手段１８を上記上方駆動手段１６にそれぞれ連結する。これにより下方進退部材１３と下方駆動手段１５とが連結され、また上方進退部材１４と上方駆動手段１６とが連結されることとなり、上記流動装置Ｆが構成されることとなる。
また、上記培養容器３の培養液中に上記培養液供給手段の配管が挿入される。

その後、インキュベータ６を上記アイソレータ５より分離して、アイソレータ５より離隔した位置に載置し、内部を所定の温度、湿度に維持するとともに、所定の炭酸ガスや酸素の濃度を維持し、さらに上記制御手段Ｃ２が上記流動装置Ｆを制御することで培養工程を開始する。
まず、図７（ａ）に示した上記上方進退部材設置工程において細胞凝集塊２を下方に位置させた状態から、当該細胞凝集塊２を上記ピン２３の上下中間位置へと上昇させる培養準備動作を行う。
図７（ａ）の状態から、図７（ｂ）に示すように上方駆動手段１６が上方進退部材１４を上昇させ、上記細胞凝集塊２の上方に隙間が形成されるように上方進退部材１４を所定距離だけ退避させる。
次に、図７（ｃ）に示すように、下方駆動手段１５が下方進退部材１３を上昇させて細胞凝集塊２を押し上げ、細胞凝集塊２を上記上方進退部材１４との間で再び保持する。
これにより、上記細胞凝集塊２は上記ピン２３における上下中間位置に位置することとなり、また上記下方進退部材１３に押し上げられることで、細胞凝集塊２の高さが一定に揃えられるようになっている。
その後、図７（ｄ）に示すように、上記上方駆動手段１６が上記上方進退部材１４をさらに上方に所定距離だけ上昇させ、細胞凝集塊２の上方部分が培養液に触れるような空間を形成する。
この培養準備作業では、上記細胞凝集塊２は互いに融合していない為、制御手段はこの状態を例えば６〜１２時間程度維持し、細胞凝集塊２同士を融合させるようになっている。

このようにして培養工程が開始され、培養準備動作によってある程度細胞凝集塊２同士が融合すると、続いて培養容器３内の培養液を流動させる進退動作を行う。この進退動作については、培養工程中は連続的に行ってもよく、また所定時間ごとに間欠的に行ってもよい。
図８（ａ）〜（ｄ）は進退動作における下方進退部材１３および上方進退部材１４の動作の一例を示したものであり、制御手段Ｃ２は下方進退部材１３および上方進退部材１４を交互に昇降させるようになっている。
具体的に、図８（ａ）は、図７（ｄ）に示した上記上方進退部材１４が上昇した状態から、当該上方進退部材１４を下降させて細胞凝集塊２に接近させた状態を示している。
そして、図８（ｂ）は図８（ａ）の状態から上記下方進退部材１３を下降させて細胞凝集塊２より離隔させた状態を、図８（ｃ）は図８（ｂ）の状態から上記上方進退部材１４を上昇させて細胞凝集塊２より離隔させた状態を、図８（ｄ）は図８（ｃ）の状態から上記下方進退部材１３を上昇させて細胞凝集塊２に接近させた状態をそれぞれ示している。

上記動作によって下方進退部材１３および上方進退部材１４が細胞凝集塊２に接近すると、ピン２３とピン２３との間に位置する古い培養液を、下方進退部材１３および上方進退部材１４と細胞凝集塊２との間から周囲に排出することができる。
一方、下方進退部材１３および上方進退部材１４が細胞凝集塊２より離隔すると、ピン２３とピン２３との間に、周囲から新たな培養液が吸い込まれ、当該新たな培養液を細胞凝集塊２の近傍に流通させることができる。
このように、下方進退部材１３および上方進退部材１４を上下動させて、細胞凝集塊２に接近および離隔させる進退動作を繰り返すことで、保持部Ｈに保持された細胞凝集塊２の上方および下方に新たな培養液を流通させることができる。
ここで、本実施例のように複数のピン２３によって細胞凝集塊２を保持した場合、当該ピン２３とピン２３との間隔が実際には狭いことから、当該ピン２３によって囲繞された空間で培養液が流れにくくなる。
特に、癒合パッド４の中央部分、すなわち最も培養液の流れにくい部分では、細胞の培養が不十分となって細胞凝集塊２の融合が行われず、癒合パッド４に不良が発生するという問題があった。
そこで本実施例では、ピン２３とピン２３とによって形成された保持部Ｈに保持された細胞凝集塊２に対して、上記下方進退部材１３および上方進退部材１４を下方および上方から接離させるように進退させるようになっている。
上記下方進退部材１３および上方進退部材１４はそれぞれ上記ピン２３が貫通する構成を有していることから、ピン２３によって囲繞された細胞凝集塊２に対して、直下および直上まで接近させることができる。
以上のことから、細胞凝集塊２の下方および上方にそれぞれ新たな培養液を流通させることができ、特に中央部に位置する細胞凝集塊２の近傍に新たな培養液を流通させることで、より確実に細胞凝集塊２を融合させることが可能となった。

上記培養工程により細胞凝集塊２が培養されて癒合パッド４が作成されると、インキュベータ６をアイソレータ５に接続して、当該癒合パッド４を培養容器３から回収する回収工程を行う。
回収工程では、最初にインキュベータ６において上記流動装置Ｆの下方駆動手段１５および上方駆動手段１６からそれぞれ上記下方連結手段１７および上方連結手段１８を取り外し、その後上記載置台１２ごと培養容器３をアイソレータ５に移送する。
アイソレータ５では、最初に培養容器３から上方進退部材１４および上方連結手段１８を取り除き、その後上記下方連結手段１７を操作して上記下方進退部材１３を上昇させ、これにより癒合パッド４を上記ピン２３から離脱させ、回収することができる。
なお、上記培養工程から回収工程の間に、所定期間ごとにインキュベータ６をアイソレータ５に接続して、培養途中の癒合パッド４の培養状態を検査する検査工程を行うようにしてもよい。

なお、上記実施例における上記培養工程中の進退動作は図８に示した通りであるが、培養容器３の培養液を流動させることができるのであれば、上記下方進退部材１３および上方進退部材１４を別の順序で作動させてもよい。
また上記実施例では、複数のピン２３とピン２３とによって形成された空間を上記保持部Ｈとして、複数のピン２３によって細胞凝集塊２を挟持するようになっているが、上記ピン２３に細胞凝集塊２を突き刺すことで当該細胞凝集塊２を保持するようにしてもよい。
このような場合であっても、下方進退部材１３および上方進退部材１４を細胞凝集塊２に対して接近および離隔させることで、当該細胞凝集塊２の近傍に新たな培養液を流通させることができ、細胞凝集塊２同士の融合を効果的に行うことが可能となる。
さらに、上記下方進退部材１３、上方進退部材１４は平面に貫通孔１３ｃ、１４ｃを形成したものに限らず、平板状に構成されたメッシュや網であってもよく、この場合にはピン２３を貫通させるために貫通孔を穿設する必要がなくなる。
また上方進退部材１４については、必ずしもピン２３を貫通させる必要はなく、細胞凝集塊２の保持部Ｈをピン２３の先端近くに設定することで、ピン２３に保持された細胞凝集塊２の上方で上方進退部材１４を上下に進退動させることができる。
またさらには、上記進退部材の配置としては細胞凝集塊２の上下に限らず、細胞凝集塊２の横方向を含む全周囲に設けることが可能であり、当該位置から細胞凝集塊２に向けて進退させるように配置することができる。

１作製装置２細胞凝集塊
３培養容器４癒合パッド（集合構造体）
５アイソレータ６インキュベータ
１３下方進退部材１４上方進退部材
１５下方駆動手段１６上方駆動手段
１７下方連結手段１８上方連結手段
３１下方支持部材３２上方支持部材
２３ピンＨ保持部
Ｍ移載装置Ｆ流動装置

Claims

培養液を収容した培養容器の内部に複数の棒状部材を立設し、上記棒状部材によって複数の細胞凝集塊を保持させて培養することで、上記細胞凝集塊が相互に融合した集合構造体を作製する細胞の集合構造体の作製装置において、
上記培養容器内に保持された細胞凝集塊の周囲に配置される進退部材と、当該進退部材を細胞凝集塊に向けて進退動させる駆動手段とを備え、
上記細胞凝集塊を培養容器内で培養する間に、上記駆動手段によって上記進退部材を細胞凝集塊に向けて進退動させて、上記細胞凝集塊の周囲で培養液を流動させることを特徴とする細胞の集合構造体の作製装置。
上記進退部材を上記細胞凝集塊の上方または下方の少なくともいずれか一方に配置し、上記駆動手段によって上記進退部材を上記細胞凝集塊に向けて上下に進退動させることを特徴とする請求項１に記載の細胞の集合構造体の作製装置。
上記進退部材は平板状に形成されるとともに上記棒状部材を貫通させて配置され、上記駆動手段は上記進退部材を棒状部材に沿って上下に進退動させることを特徴とする請求項２に記載の細胞の集合構造体の作製装置。
上記進退部材は、上記棒状部材に保持される細胞凝集塊の下方に配置される下方進退部材であって、
上記下方進退部材を上記駆動手段に連結させる下方連結手段を備え、
上記下方進退部材が上記棒状部材を貫通させた状態で配置され、当該下方進退部材の上方に細胞凝集塊を保持させ、
上記細胞凝集塊を上記培養容器内で培養する際に、上記下方連結手段によって下方進退部材と上記駆動手段とを連結させることを特徴とする請求項３に記載の細胞の集合構造体の作製装置。