JP2019045625A - Ｓｈｇ顕微鏡及びｓｈｇ光を観察する方法 - Google Patents

Abstract

【課題】小型軽量で、高いＳ／Ｎ比でＳＨＧ光を観察できるＳＨＧ顕微鏡及びＳＨＧ光の観察方法を提供する。【解決手段】フェムト秒パルスレーザを照明光とする。照明光を偏光子１４とバンドパスフィルタ１３を通過させて、斜め方向から試料３０に照射する。照明光ＬＡの正反射光ＬＢが対物レンズ２１に入射しないように光路を設定する。試料３０が発するＳＨＧ光を対物レンズ２１で集光する。集光したＳＨＧ光をバンドパスフィルタ２３を通過させ、自然光等のノイズ光成分を減衰する。さらに、ＳＨＧ光を、検光子２４を通過させ、偏光子１４を通過して偏光している照明光の成分を除去する。バンドパスフィルタ２３と検光子２４とを通過した光を接眼レンズ２２で集光して撮像素子２０に結像させる。【選択図】図１

Description

本発明は、光第二高調波発生（Ｓｅｃｏｎｄ Ｈａｒｍｏｎｉｃ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ＳＨＧ）を観察するためのＳＨＧ顕微鏡及びＳＨＧ光を観察する方法に関する。

特定の特性を持った物質に光を照射すると、もとの光の周波数の２倍の周波数の光が発生する光第二高調波発生（以降、ＳＨＧと略記する）という現象が起きる。この現象は物質中の中心対称性をもたない分子や構成単位によって引き起こされるものである。

ＳＨＧは、所謂ＳＨＧ顕微鏡により観察される。特許文献１には、１台でＳＨＧを含む複数の現象を観察できる顕微鏡が開示されている。特許文献２には、ＳＨＧを含む非線形現象を観察できる顕微鏡及び観察方法が開示されている。

特開２００６―０２３３８７号公報 特開２０１３―１４２８５４号公報

特許文献１及び２に開示された顕微鏡は、複数の非線形光学現象を観察するために、複数の照明手段と検出手段と、それらを切り替える機構とを備える。このため、特許文献１及び２に開示された顕微鏡は、大型化し、多くの光学素子同士の厳密な位置調整を維持するために高い強度が求められ、必然的に重量が大きくなる。

またＳＨＧ光は極めて微弱な光である。このため、ＳＨＧ光を観察するためには、照明光、自然光等のノイズ光の影響を抑え、高いＳ／Ｎ（Ｓｉｇｎａｌ ｔｏ Ｎｏｉｓｅ）比を得る必要がある。しかし、特許文献１及び２は、ノイズ光の影響を低減するための工夫を開示していない。このため、特許文献１及び２に開示された顕微鏡は、高いＳ／Ｎ比でＳＨＧ光を観察することが困難である。

本発明は、上記実状に鑑みてなされたものであり、小型軽量で、高いＳ／Ｎ比でＳＨＧ光を観察できるＳＨＧ顕微鏡及びＳＨＧ光を観察する方法を提供することを目的とする。

上記目的を達成するため本発明の第１の観点に係るＳＨＧ顕微鏡は、
単一の波長成分を有するパルス光を試料に照射する照射手段と、
前記パルス光の光路上に配置された偏光子と、
前記試料から発した光が入射する対物レンズと、
前記対物レンズに対向して配置された接眼レンズと、
前記対物レンズと前記接眼レンズの間の光路上に配置された検光子と、
を有し、
前記対物レンズと前記検光子と前記接眼レンズとは、前記パルス光の試料表面での正反射光が入射する位置とは異なる位置に配置されている。

前記照射手段は、４００ｎｍから５６０ｎｍの単一の波長成分を有するパルス光を試料に照射することが望ましい。

前記偏光子と前記検光子の少なくとも一方は、光軸の方向を調整可能に配置されていることが望ましい。

前記対物レンズと前記接眼レンズの間の光路上に、前記パルス光の波長の二分の一の波長の光を選択的に通過させるフィルタをさらに有することが望ましい。

前記パルス光の光路上に、前記パルス光の波長近傍の光を選択的に通過させるフィルタをさらに有することが望ましい。

試料配置部を有するハウジングをさらに備え、
前記照射手段は、前記ハウジングに配置され、前記試料配置部に向けてパルス光を照射し、
前記対物レンズは前記ハウジングに装着されて、前記試料配置部に指向していることが望ましい。

前記ハウジングは３つ以上の装着部を備え、
１つの装着部に前記照射手段が装着され、
他の１つの装着部にモジュール化された前記対物レンズが装着され、
前記照射手段とモジュール化された前記対物レンズの装着機構は互換性を有し、装着位置の変更が可能に構成されていることが望ましい。

前記ハウジングは、その内面に、前記正反射光を減衰する手段を備えることが望ましい。

また、本発明の第２の観点に係るＳＨＧ光を観察する方法は、
単一波長成分を有し、直線偏光のパルス光を試料に照射し、
試料が発する光のうち前記パルス光の正反射光を除いた光を集光し、
集光した光のうち、前記単一波長の二分の一の波長近傍の波長を有し且つ特定方向の偏光方向成分のみを観察する。

本発明によれば、小型軽量で、高いＳ／Ｎ比でＳＨＧ光を観測できるＳＨＧ顕微鏡及びＳＨＧ光を観測する方法を提供できる。

本願発明の実施の形態に係る、ＳＨＧ顕微鏡の構成図である。 本願発明の実施の形態に係る、ＳＨＧ顕微鏡の機械的構成を示す斜視図である。 本願発明の実施の形態に係る、ＳＨＧ顕微鏡の光の反射を説明する図である。 本願発明の実施の形態に係る、ＳＨＧ顕微鏡の光の偏光方向を説明する図である。 図２に示す顕微鏡の照明器ホルダと観測器ホルダの配置を変更した斜視図である。 本願発明の実施の形態に係るＳＨＧ顕微鏡において、小型の試料を観察する手法を説明する斜視図である。 本願発明の実施の形態に係るＳＨＧ顕微鏡の変形例を示す底面図である。 （ａ）〜（ｃ）は、本願発明の実施例に係るＳＨＧ顕微鏡で観察した画像を示す図である。

本願発明の実施の形態を説明する前に、光第二高調波発生（Ｓｅｃｏｎｄ Ｈａｒｍｏｎｉｃ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：以降、ＳＨＧ）について説明する。ＳＨＧは、物質に、周波数ωの光を照射すると周波数２ωの光が発生する現象のことである。物質がＳＨＧ発生を起こす性質をＳＨＧ特性と呼ぶ。ＳＨＧによって発生する光（以降、ＳＨＧ光）を観察することができる顕微鏡（以降、ＳＨＧ顕微鏡）を用いることで、物質中の非中心対称構造を持つ微視的部分を選択的に観察することが出来る。

ＳＨＧを引き起こすため物質に照射する光としては、レーザ光が適切である。レーザ光の波長は、発明者の実験の結果、効率等の観点からは、４００ｎｍから１１００ｎｍであることが好ましいという結果を得ている。このため、観察するＳＨＧ光の波長は２００ｎｍから５５０ｎｍということになる。しかしながら屋外での使用を考慮すると、地球の地表付近にほとんど存在しないＵＶ−Ｃと呼ばれる波長である２００ｎｍ〜２８０ｎｍをＳＨＧ光に設定すると、その波長の自然光によるノイズ光レベルを低くできる。この場合照射するレーザ光の波長は、ＳＨＧ光の２倍の４００ｎｍから５６０ｎｍとなる。そこで以下の実施の形態では、一例として、レーザ光の波長を５２２ｎｍ（緑色）とした。このレーザ光を、ＳＨＧ特性をもつ物質に照射することで発生するＳＨＧ光の波長は２６１ｎｍとなる。

本実施の形態に係る、ＳＨＧ顕微鏡を説明する。
（実施の形態）
本実施の形態のＳＨＧ顕微鏡は、図１の構成図で示すように、パルスレーザ発振器１０、光ファイバ１１、偏光子１４、バンドパスフィルタ１３、集光レンズ１２を備える照明系と、対物レンズ２１、バンドパスフィルタ２３、検光子２４、接眼レンズ２２、撮像素子２０を備える観測系と、撮像素子２０からの信号を処理／表示するコンピュータ４０を備える。

照明系を構成するパルスレーザ発振器１０は、半導体レーザ等の小型軽量で省電力型のレーザ発振器を備え、波長５２２ｎｍで、パルス幅が２５０ｆｓｅｃのパルス光を発振し、出力する。ＳＨＧの強度はパルス光のピークエネルギーに依存する。また、パルス幅は長すぎると試料にダメージを与えてしまう。このため、パルス光はデルタ関数に近似することが望ましい。

光ファイバ１１は、光を伝送するファイバ部材であり、その一端はパルスレーザ発振器１０のレーザ光放出口に連結され、他端（レーザ光放出部）は試料３０にレーザ光を照射しうる位置と向きに固定されている。光ファイバ１１は、パルスレーザ発振器１０から出射したレーザ光をレーザ光放出部から試料３０に向けて出射する。

偏光子１４は、光ファイバ１１のレーザ光放出部と試料３０の間の光路上に配置されている。偏光子１４は、光ファイバ１１から出射したレーザ光及び環境から混入した光のうち、透過軸方向に振動する成分を透過し、吸収軸方向に振動する成分を吸収する。このため、偏光子１４を通過した光は直線偏光となる。

バンドパスフィルタ１３は、光ファイバ１１のレーザ光放出部と試料３０の間の光路上であって偏光子１４の試料３０側に配置されている。バンドパスフィルタ１３は波長５２２ｎｍ近傍の光、即ち、レーザ光の波長近傍の単一波長成分を有する光を選択的に通過させ、他の波長のノイズ光成分を除去する。これにより、レーザ光に含まれる高調波成分及び低調波成分、環境からの光を減衰する。

集光レンズ１２は、光ファイバ１１のレーザ光放出部と試料３０の間の光路上であってバンドパスフィルタ１３の試料３０側に光路に直交して配置されている。集光レンズ１２は、バンドパスフィルタ１３を通過したレーザ光ＬＡを試料３０の観測箇所に集光して斜め方向から照射する照射手段として機能する。照射された光の大部分は、試料３０の表面で正反射し、正反射光ＬＢとなり、また、一部は散乱する。また、試料３０はその特性に応じてＳＨＧを起こし、ＳＨＧ光を発光する。

観測系を構成する対物レンズ２１は、試料３０の観測箇所に対向する位置であって、正反射光ＬＢが入射する位置を避けて配置されており、正反射光ＬＢが観測系に入射する事態を防いでいる。対物レンズ２１は、その光軸が観測箇所を通過し、観測箇所で発生する光を平行光にする。

バンドパスフィルタ２３は、対物レンズ２１の、試料３０とは反対側で、平行光の光路上に配置されている。バンドパスフィルタ２３は、レーザ光の波長５２２ｎｍの半分の波長２６１ｎｍ近傍の単一波長成分の光を選択的に通過させ、他の波長成分の光を減衰させる。これにより、試料３０からのＳＨＧ光のみがバンドパスフィルタ２３を通過する。

検光子２４は、バンドパスフィルタ２３の、対物レンズ２１とは反対側で、平行光の光路上に、平行光の光路に直交して配置されている。検光子２４の透過軸は、偏光子１４の透過軸と光学的に９０°の角度をなす角度、より具体的には、偏光子１４を通過し、試料３０で反射した特定方向の直線偏光をほぼ吸収できる向きに調整される。これにより、ノイズ光に相当するレーザ光及び偏光子１４を通過した自然光を減衰することができる。

接眼レンズ２２は、検光子２４の、バンドパスフィルタ２３とは反対側で、平行光の光路上に、光路に直交して配置されている。接眼レンズ２２は、平行光を撮像素子２０上に結像させる。

撮像素子２０は、ＣＣＤイメージセンサ，ＣＭＯＳイメージセンサなどを備え、接眼レンズ２２で集光した光が結像する位置に配置されている。撮像素子２０は、受信した光を画像データに変換してコンピュータ４０に送る。なお、撮像素子２０として、デジタルカメラなどを使用可能である。この場合に、カメラレンズが接眼レンズを兼ねる場合には、接眼レンズ２２を配置する必要はない。

コンピュータ４０は、撮像素子２０から送られる画像データを信号処理し、画面に表示する。

以上の光学的構成を有するＳＨＧ顕微鏡の、機械的構成の一例を、図２を参照して説明する。なお、以下の構成例は、試料３０のＳＨＧを非侵襲的に観察するための構成の例である。

図２に示すように、ＳＨＧ顕微鏡１００はハウジング５０、ハウジング５０に装着された照明器ホルダ６２及び観測器ホルダ６３と、を備える。
ハウジング５０は、照明器ホルダ６２と観測器ホルダ６３の両方を固定し、両者の位置関係を維持するとともに、観察時のノイズ光となる自然光を遮る。

ハウジング５０の底面５１は、長方形状であり、中央に試料３０を配置する試料穴５４が貫通している。試料穴５４を介して試料３０が照明器ホルダ６２と観測器ホルダ６３に対向する。

ハウジング５０の上面５３は、５つの平面が連なって全体として略凸円弧状に形成されている。ハウジング５０の側面５２は、底面５１と上面５３の間を塞ぐ垂直面に形成されている。なお、ハウジング５０内部の説明のため、手前側の側面５２は図示を省略してある。

上面５３を構成する各平面の中央には、照明器ホルダ６２と観測器ホルダ６３とを装着するための装着穴５６が形成されている。各装着穴５６の内面には雌螺子が形成されている。各装着穴５６は、その中心軸が試料穴５４の中心を通る位置に形成されている。装着穴５６に形成された雌螺子は共通の形状を有する。

ハウジング５０の内部は、光の反射を抑制するために、光を吸収しやすい色と表面性状を有し、例えば黒色の艶消し塗装が施してある。

照明器ホルダ６２は、円筒状の構造を有し、前述の光ファイバ１１のレーザ光放出部、偏光子１４、バンドパスフィルタ１３及び集光レンズ１２が装着されている。また、照明器ホルダ６２の他端には、光ファイバ１１の他端部（光出射部）が固定されている。

照明器ホルダ６２の中心軸と集光レンズ１２の光軸、光ファイバ１１の他端部（光出射部）の中心軸とは一致するように調整されている。

また、照明器ホルダ６２の円筒側面であって、集光レンズ１２及び光ファイバ１１とは干渉しない位置には、所定の幅を有する２つのスリットが、形成されている。各スリットは、照明器ホルダ６２の円周の二分の一程度の長さを有する。

一方のスリットを介して、照明器ホルダ６２の円筒内に、偏光子１４が挿入されている。偏光子１４は、照明器ホルダ６２の光軸に垂直に且つ円筒の中心軸を中心として略１８０°の範囲で回転可能に挿入されており、光軸の方向を調整可能である。

また、他方のスリットを介して、照明器ホルダ６２の円筒内に、バンドパスフィルタ１３が挿入されている。

バンドパスフィルタ１３及び偏光子１４には、照明器ホルダ６２に挿入した状態で、照明器ホルダ６２のスリットに突出するつまみが形成されている。

バンドパスフィルタ１３と偏光子１４とは、ほぼ同一の外形形状に形成されており、偏光子１４とバンドパスフィルタ１３とを入れ替えて照明器ホルダ６２に装着することも可能である。

このような配置により、光ファイバ１１から出射したレーザ光は、偏光子１４とバンドパスフィルタ１３とを通過して、集光レンズ１２に入射する。

また、照明器ホルダ６２の外径は、装着穴５６の内径にほぼ等しい。照明器ホルダ６２の一端部の外周面には、装着穴５６に形成された雌螺子と螺合する雄螺子が形成されている。照明器ホルダ６２は、雄螺子を装着穴５６の雌螺子と螺合することにより、いずれの装着穴５６に装着することも可能である。いずれの装着穴５６に装着された場合でも、照明器ホルダ６２の中心軸は、試料穴５４の中心を通過するように、装着穴５６と照明器ホルダ６２は形成されている。これにより、光ファイバ１１の他端から出射された光は、偏光子１４とバンドパスフィルタ１３と集光レンズ１２とを介して、試料穴５４の中心に照射される。

観測器ホルダ６３は、円筒状の構造を有し、前述の対物レンズ２１、バンドパスフィルタ２３、検光子２４、図示しない接眼レンズ２２及び撮像素子２０が装着されている。具体的には、観測器ホルダ６３の一端部に対物レンズ２１が固定されている。観測器ホルダ６３の他端部には、接眼レンズ２２が固定されている。観測器ホルダ６３の中心軸と対物レンズ２１の光軸と接眼レンズ２２の光軸とは一致するように調整されている。

また、観測器ホルダ６３の円筒側面であって、対物レンズ２１及び接眼レンズ２２とは干渉しない位置には、２つのスリットが形成されている。スリットは、観測器ホルダ６３の円周の二分の一程度の長さを有する。

一方のスリットを介して、観測器ホルダ６３の円筒内に検光子２４が挿入されている。検光子２４は、観測器ホルダ６３の光軸に垂直に且つ円筒の中心軸を中心として略１８０°の範囲で回転可能に挿入されており、光軸の方向が調整可能である。

また、他方のスリットを介して、観測器ホルダ６３の円筒内に、バンドパスフィルタ２３が挿入されている。

バンドパスフィルタ２３及び検光子２４には、観測器ホルダ６３に挿入した状態で、観測器ホルダ６３のスリットに突出するつまみが形成されている。

なお、バンドパスフィルタ２３と検光子２４とは、ほぼ同一の外形形状に形成されており、バンドパスフィルタ２３と検光子２４とを入れ替えて観測器ホルダ６３に装着することも可能である。

さらに、観測器ホルダ６３の他端部には、撮像素子２０が装着される。撮像素子２０は、例えば、ＵＳＢケーブルにより、コンピュータ４０に接続可能に形成されている。また、撮像素子２０を、例えば、デジタルスチルカメラに代替し、撮像画像をコンピュータ４０との接続なく、目視で確認できるようにしてもよい。

観測器ホルダ６３の外径は、装着穴５６の内径にほぼ等しい。観測器ホルダ６３の一端部の外周面には、装着穴５６に形成された雌ねじと螺合する雄ねじが形成されている。観測器ホルダ６３は、雄ねじを装着穴５６の雌ねじと螺合することにより、いずれの装着穴５６にも装着可能である。いずれの装着穴５６に装着された場合でも、観測器ホルダ６３の中心軸は、試料穴５４の中心を通過するように、装着穴５６と照明器ホルダ６２は形成されている。換言すれば、照明器ホルダ６２と観測器ホルダ６３は互換性を有し、任意の装着穴５６に装着可能である。

なお、図２は、観測器ホルダ６３が、ハウジング５０の、試料穴５４の中心軸に直交する平面に開けられた装着穴５６に固定され、照明器ホルダ６２は、試料穴５４の中心軸線とは直交しない平面に開けられた装着穴５６に固定された状態を示している。この状態は、図３に示すように、試料３０へのレーザ光ＬＡが試料３０に照射された場合に、正反射光ＬＢが観測器ホルダ６３に入射しない状態であり、デフォルトの装着状態に相当する。なお、正反射光ＬＢは、試料３０の法線ＬＮとレーザ光ＬＡの交差角θと等しい交差角θで反射する光であり、通常、反射光のうちもっともエネルギーの大きい成分である。照明器ホルダ６２と観測器ホルダ６３の配置は、適宜変更可能である。ただし、試料３０からの正反射光ＬＢが観測器ホルダ６３に入射しないように、照明器ホルダ６２と観測器ホルダ６３の配置が選択される。

ハウジング５０の上面５３の、照明器ホルダ６２と観測器ホルダ６３のいずれも固定されていない装着穴５６には、それぞれ光を透過しないキャップ６１が、隙間から自然光がハウジング５０内部に入射しないように固定されている。また、キャップ６１の裏面は、照射された光を吸収及び減衰できるように、黒色つや消し処理等が施されている。即ち、正反射光を減衰する手段が配置されている。

なお、照明器ホルダ６２には、集光レンズ１２の焦点距離を調節する機構（図示せず）が内蔵されている。観測器ホルダ６３には、対物レンズ２１及び接眼レンズ２２の焦点距離を調節する機構（図示せず）が内蔵されている。

上述した構成は、部品点数が比較的少なく、構造も比較的簡単である。また、照明器ホルダ６２と観測器ホルダ６３とはそれぞれモジュール化されている。このため、ＳＨＧ顕微鏡１００は、小型軽量化が可能であり、また、組立ても容易である。

次に、本実施の形態のＳＨＧ顕微鏡１００で試料３０のＳＨＧ光を観察する方法について説明する。

まず、屋外で、生育中の作物などを非侵襲で観察する場合について説明する。ここでは、試料３０の平面サイズが試料穴５４のサイズより大きいものとする。

まず、図２に示すようにＳＨＧ顕微鏡１００を用意し、偏光子１４と検光子２４の透過軸が光学的に９０°となるように（偏光子１４を透過した成分のうち検光子２４に入射したものがほぼカットされるように）、予め調整しておく。

次に、観察対象の試料３０を試料穴５４に配置する。
生育中の作物を非侵襲で観察する場合、試料３０をハウジング５０内部に配置することは出来ない。そのため、試料３０の観察箇所が、試料穴５４の中心となるように、ハウジング５０を試料３０に押し当て、又は、固定したハウジング５０に試料３０を押し当て、両者の位置を設定し、固定する。

次に、試料穴５４に配置された試料３０にレーザ光を照射するために、パルスレーザ発振器１０から、波長が５２２ｎｍでパルス幅が２５０ｆｓｅｃのレーザ光を発振させる。レーザ光は、光ファイバ１１の一方の端に入射し、光ファイバ１１を経由して照明器ホルダ６２に到達する。

光ファイバ１１から出射されたレーザ光と混入している自然光は、図４の符号ＰＡに示すように、偏光子１４の透過軸方向の成分のみが通過して、所定の偏光方向の成分のみの直線偏光となる。直線偏光ＰＡとなったレーザ光は、バンドパスフィルタ１３を通過して不要成分が減衰される。

バンドパスフィルタ１３を通過したレーザ光は、図３の符号ＬＡで示すように、集光レンズ１２によって試料３０の観察箇所に所定の径となるように集光される。集光径はレーザ光のエネルギー密度やＳＨＧ特性を持つ物質の性質等によって適宜調節する。

試料３０の観察箇所にレーザ光が照射されることによって、試料３０の特性に応じて、観察箇所からＳＨＧ光ＬＤが発生する。また、試料３０の表面からレーザ光の乱反射光ＬＣと正反射光ＬＢが発生する。

デフォルトの配置では、観測器ホルダ６３に配置された対物レンズ２１は、試料３０の法線ＬＮ上に配置されている。このため、レーザ光ＬＡの入射角θと同一の出射角を有する正反射光ＬＢは対物レンズ２１に入射せず、ハウジング５０内で減衰する。

一方、ＳＨＧ光ＬＤの一部とレーザ光の乱反射光ＬＣの一部と、試料穴５４から入射した光の一部、は対物レンズ２１に入射する。対物レンズ２１は、試料３０表面で発生したＳＨＧ光ＬＤ及び乱反射光ＬＣを集光し平行光にする。なお、この段階では、レーザ光の乱反射光ＬＣの偏光方向は、図４の符号ＰＢで示すようにほぼ一定方向であり、ＳＨＧ光ＬＤと自然光については、符号ＰＧで示すように、様々な偏光成分を含んでいる。

対物レンズ２１を通過した光はバンドパスフィルタ２３に到達する。バンドパスフィルタ２３に到達する光はＳＨＧ光（波長２６１ｎｍ）ＬＤと乱反射光（波長５２２ｎｍ）ＬＣと試料穴５４から入射した自然光を含む。バンドパスフィルタ２３は、ＳＨＧ光ＬＤを通過させ、他の光（レーザ光の乱反射光ＬＣと自然光）を低減させる。なお、自然光は、波長２６１ｎｍ近傍の光をほとんど含まないため、自然光の強度はほぼ０となる。ただし、レーザ光の乱反射光ＬＣは、レーザ光ＬＡのエネルギーが大きいこと、及び、波長が通過帯域周波数の倍数に相当することから、減衰しつつも一部が通過する可能性がある。

バンドパスフィルタ２３を通過した光は検光子２４に到達し、検光子２４の透過軸に一致する偏光成分ＰＣが通過する。透過した光は、接眼レンズ２２を介して、撮像素子２０の撮像面に結像され、撮像素子２０により撮像される。撮像素子２０は撮像データをコンピュータ４０へ送る。コンピュータ４０は、受信した撮像データを、必要に応じて加工し、画面に表示する。担当者は画像データを解析すること、表示画像を確認することなどにより、ＳＨＧ光を解析する。なお、撮像のタイミングと解析或いは表示のタイミングは異なっていても良い。例えば、撮像素子２０に撮像画像を蓄積しておき、別のタイミングでこれを解析などしてもよい。

ここで、図４に模式的に示すように、検光子２４に到達する光のうち、レーザ光の乱反射光ＬＣの偏光方向は、符号ＰＢで示すようにほぼ一定方向であり、ＳＨＧ光ＬＤは符号ＰＧで示すように様々な偏光成分を含んでいる。

一方で、偏光子１４の光学軸と検光子２４の光学軸は、予め、光学的にほぼ９０°に設定されている。このため、レーザ光ＬＡの乱反射光ＬＣの偏光方向ＰＢは、検光子２４の吸収軸にほぼ一致する。このため、レーザ光の反射光ＬＣは、検光子２４でほぼ吸収され、著しく減光する。一方、ＳＨＧ光ＬＤは様々な偏光成分ＰＧを含むため、検光子２４の透過軸と同一方向の成分が、検光子２４を通過する。このため、若干（例えば、１／√２程度に）減衰するが、かなりの部分が撮像素子２０に到達する。

このように、この実施の形態に係るＳＨＧ顕微鏡１００によれば、ＳＨＧ光以外の光は大きく減衰され、ほぼＳＨＧ光のみが撮像素子２０に到達する。従って、ＳＨＧ光を高Ｓ／Ｎ比で撮像することができる。

なお、試料３０の表面状態、試料３０に対するＳＨＧ顕微鏡１００の相対的な傾きなどにより、試料３０で反射したレーザ光ＬＣの主成分の偏光方向ＰＢと、検光子２４の吸収軸の方向とが一致しない事態が発生しうる。この場合、反射したレーザ光ＬＣの一部が検光子２４を透過し、撮像素子２０の撮像画像のＳ／Ｎ比が低下する。この場合には、偏光子１４と検光子２４の一方又は両方を回転させ、両者の光軸の角度を光学的に９０°に調整することにより、Ｓ／Ｎ比を高めることができる。

また、試料３０に含まれるＳＨＧ特性を有する物質の分子方向等によって、偏光したＳＨＧ光ＬＤが発光されるような場合には、ＳＨＧ光が最も透過するように検光子２４の向きを調整し、さらに、レーザ光によるノイズ光成分が最小となるように、偏光子１４の向きを調整すればよい。

また、上述した図２に示すデフォルトの照明器ホルダ６２と観測器ホルダ６３の配置では十分なＳ／Ｎ比のＳＨＧ光を得られない場合がある。例えば、試料３０の表面の傾斜により、レーザ光の正反射光ＬＢが観測器ホルダ６３に入射したり、正反射光ＬＢ自体が拡散して観測器ホルダ６３に入射したりすることで、ノイズ光の強度が大きくなり、ＳＨＧ光のＳ／Ｎ比が小さくなる場合である。このような場合には、観測器ホルダ６３に正反射光が入射しないように、照明器ホルダ６２と観測器ホルダ６３の位置関係を変更し、観測器ホルダ６３に入射するノイズ光の強度を弱くすればよい。

この場合、照明器ホルダ６２と観測器ホルダ６３の一方又は両方をハウジング５０から取り外し、図２とは異なる装着穴５６に取り付ける。これにより、レーザ光ＬＡの試料３０の表面への照射角θと正反射光ＬＢの反射角θと、観測器ホルダ６３の光軸の角度とを変更する。

例えば、図２の装着状態から、図５に示すように、観測器ホルダ６３を１つ左側の装着穴５６に装着し、照明器ホルダ６２の位置を１つ右側の装着穴５６に装着するように変更することも可能となる。使用者は、このようにして、装着位置の組み合わせを変更することにより、強いＳＨＧ光と弱いノイズ光を得て、Ｓ／Ｎ比の高い画像を得ることができる。

（変形例）
照明光として、波長５２２ｎｍ、パルス幅が２５０ｆｓｅｃのレーザ光を例示したが、波長及びパルス幅は任意に変更可能である。ただし、ＳＨＧ光を、地球の地表付近にほとんど存在しないＵＶ−Ｃ光とすることにより、ノイズ光の影響を抑えるためには、照明光の波長を４００ｎｍから５６０ｎｍとすることが望ましい。

前述の実施の形態では、試料３０が試料穴５４よりも大きい場合を説明した。試料３０が試料穴５４よりも小さい場合は、図６に例示するように、光を透過しない試料台７０に試料３０を固定し、試料台７０を試料穴５４に挿入することで自然光を除去しつつ試料３０を配置することも可能である。

また、試料３０のＳＨＧ光を非侵襲的に観察する例を示したが、試料３０を侵襲的に観察することにも使用可能である。この場合は、図６の場合と同様に、取得した試料３０を試料台７０に載置して観察すればよい。また、侵襲的観測専用のＳＨＧ顕微鏡１００とする場合には、試料穴５４を設けず、代わりに、試料をハウジング５０内に設けられた試料載置台に出し入れするための扉等を設けてもよい。いずれにしても、試料３０が配置される試料配置部を通過するように、集光レンズ１２と対物レンズ２１の光軸を設定し、試料３０に照明光が照射され、ＳＨＧ光が対物レンズ２１に入射し、正反射光ＬＢが対物レンズ２１に入射しないように調整する。

また、試料穴５４から外光が入射するのを防止するため、例えば、図７に例示するように、試料穴５４の周囲に遮光性弾性部材５７を配置してもよい。また、試料穴５４の周囲を除き、ハウジング５０の下面全体に遮光性の弾性部材を配置してもよい。

ＳＨＧ顕微鏡１００の構成は、同様の機能を実現できるならば、適宜変更可能である。例えば、偏光子１４とバンドパスフィルタ１３の位置は、入れ替え可能であり、検光子２４とバンドパスフィルタ２３の位置は、入れ替え可能である。

また、実施の形態では、バンドパスフィルタ１３と２３についても、ホルダ内で回転可能とする構成を例示したが、これらについては、回転させない構成としてもよい。

偏光子１４と検光子２４の両方を回転可能としたが、いずれか一方のみ回転可能としてもよい。

また、偏光子１４と検光子２４を手動で回転する例を例示したが、回転を自動化してもよい。例えば、ｉ）偏光子１４と検光子２４をモータで回転制御する機構とし、ii）偏光子１４の回転角φ１＝０として、検光子２４の回転角φ２を０〜１８０°の範囲でΔφ２ずつ変化させて、各角度で撮像素子２０で撮像し、iii）続いて、偏光子１４の回転角φ１を＋Δφ１して、φ１＝Δφ１とし、検光子２４の回転角φ２を０〜１８０°の範囲でΔφ２ずつ変化させる、という動作をφ１＝φ２＝１８０°となるまで繰り返し、例えば、取得した画像のうちで最もコントラストの高い数枚を自動的に抽出するように構成してもよい。

また、当初、ステップ角Δφ１とΔφ２を相対的に大きくしておき、続いて、ステップ角Δφ１とΔφ２を相対的に小さい値とし、コントラストの高い画像が得られたときの回転角φ１とφ２を基準として、偏光子１４と検光子２４の位置を微調整する等してもよい。

上記実施の形態においては、照明器ホルダ６２に、バンドパスフィルタ１３を配置したが、配置しなくてもよい。また、試料穴５４及び装着穴５６が塞がれている構成で、ハウジング５０内に外光が入射しない構成になっている場合には、バンドパスフィルタ１３及び２３を配置しなくてもよい。

照明器ホルダ６２と観測器ホルダ６３をハウジング５０に装着する構成も、互換性を有していれば、装着機構自体は任意であり、例えば、カセットタイプにしてもよい。また、照明器ホルダ６２と観測器ホルダ６３を装着することができる装着穴５６をそれぞれ制限してもよい。また、穴に限定されず、任意の装着部でよい。

さらに、照明器ホルダ６２と観測器ホルダ６３を装着する装着穴５６を複数配置する例を示したが、ハウジング５０にスライダを配置し、スライダによりこれらの部材を移動可能としてもよい。

また、上記実施の形態では、扇型のハウジング５０を例示したが、この形状は任意である。例えば、ハウジングをドーム状として、試料穴を中心とする１又は複数の円上に、複数の装着穴を配置する等してもよい。
また、照明器ホルダ６２及び観測器ホルダ６３の形状、構造、等も任意であり、適宜変更可能である。

ＳＨＧ光を観察する場合に、試料のどの部分からどの程度のＳＨＧ光が発生しているか（していないか）を測定したい場合がある。このような場合は、ＳＨＧ光の撮像とは別に、試料３０自体を撮影すればよい。この場合、例えば、偏光子１４を光路から退避させて撮像したり、検光子２４とバンドパスフィルタ２３の一方又は両方を光路から退避させたりして撮像し、ＳＨＧ光の撮像画像と対比可能としてもよい。

（実施例）
図８は本願発明の顕微鏡で試料を観察した様子を表す図である。上段の画像（ａ）〜（ｃ）は、ＳＨＧ特性を持つ物質を含む試料である硫化亜鉛（ＺｎＳ）を観察した画像である。下段の画像（ａ）〜（ｃ）は、ＳＨＧ特性を持つ物質を含む試料であるグルコースを観察した画像である。

上段及び下段それぞれの画像（ａ）は、入射光が偏光子を通過したレーザ光とノイズ光であって、対物レンズで集光した光には検光子を通過させていない場合の画像である。
画像（ｂ）は、入射光が偏光子を通過したレーザ光とノイズ光であって、対物レンズで集光した光は検光子を通過させて、偏光子と検光子の透過軸を光学的に９０°に設定した場合の画像である。
画像（ｃ）は、入射光が偏光子を通過したレーザ光とノイズ光であって、対物レンズで集光した光に検光子を通過させ、偏光子と検光子の透過軸を光学的に平行にした場合の画像である。

上段及び下段それぞれの画像（ａ）は、試料表面で発生したＳＨＧ光を含むレーザ光とノイズ光の反射光を捉える。これらの画像では全ての偏光方向の光を捉え、試料の表面形状等が観察出来る。しかしＳＨＧ特性を持つ物質が存在するか否かはこれらの画像からは不明である。

上段及び下段それぞれの画像（ｂ）は、ＳＨＧ光である。この構成では入射光と直交する偏光方向の光を選択通過する。すなわち試料表面からのレーザ光とノイズ光の反射光は検光子により吸収され、検光子の透過軸と平行である偏光を持つＳＨＧ光のみが検光子を通過する。その結果ＳＨＧ光のみが観察されている。これらの画像によって該当物質のどの部分にどの程度ＳＨＧ特性を持った物質が分布しているのか明確になっている。

上段及び下段のそれぞれの画像（ｃ）は、ＳＨＧ光と試料表面でのレーザ光とノイズ光の反射光のうち、入射光の偏光方向と同じ偏光方向の光が観察されている。単なる表面反射であれば、入射光と同じ偏光方向となるので、ＳＨＧ光とともにレーザ光とノイズ光の反射光も観察している。これらの画像は偏光子と検光子の光軸の設定によってどのような画像が得られるかそれぞれの画像（ｂ）と比較するために撮影したものである。このことから画像（ｃ）の光から画像（ｂ）の光を差し引いたものがＳＨＧ光以外の成分、すなわちレーザ光とノイズ光の反射光であることがわかる。

以上のように、本願発明のＳＨＧ顕微鏡では、ノイズ光を除去してＳＨＧ光のみを観察することが出来る。

１０ パルスレーザ発振器
１１ 光ファイバ
１２ 集光レンズ
１３、２３ バンドパスフィルタ
１４ 偏光子
２０ 撮像素子
２１ 対物レンズ
２２ 接眼レンズ
２４ 検光子
３０ 試料
４０ コンピュータ
５０ ハウジング
５１ 底面
５２ 側面
５３ 上面
５４ 試料穴
５６ 装着穴
５７ 遮光性弾性部材
６１ キャップ
６２ 照明器ホルダ
６３ 観測器ホルダ
７０ 試料台
１００ ＳＨＧ顕微鏡

Claims (9)

1. 単一の波長成分を有するパルス光を試料に照射する照射手段と、
   前記パルス光の光路上に配置された偏光子と、
   前記試料から発した光が入射する対物レンズと、
   前記対物レンズに対向して配置された接眼レンズと、
   前記対物レンズと前記接眼レンズの間の光路上に配置された検光子と、
   を有し、
   前記対物レンズと前記検光子と前記接眼レンズとは、前記パルス光の試料表面での正反射光が入射する位置とは異なる位置に配置されている、
   ＳＨＧ顕微鏡。
2. 前記照射手段は、４００ｎｍから５６０ｎｍの単一の波長成分を有するパルス光を試料に照射する、
   請求項１に記載のＳＨＧ顕微鏡。
3. 前記偏光子と前記検光子の少なくとも一方は、光軸の方向を調整可能に配置されている、
   請求項１又は２に記載のＳＨＧ顕微鏡。
4. 前記対物レンズと前記接眼レンズの間の光路上に、前記パルス光の波長の二分の一の波長の光を選択的に通過させるフィルタをさらに有する、
   請求項１又は２に記載のＳＨＧ顕微鏡。
5. 前記パルス光の光路上に、前記パルス光の波長近傍の光を選択的に通過させるフィルタをさらに有する、
   請求項１から４のいずれか１項に記載のＳＨＧ顕微鏡。
6. 試料配置部を有するハウジングをさらに備え、
   前記照射手段は、前記ハウジングに配置され、前記試料配置部に向けてパルス光を照射し、
   前記対物レンズは前記ハウジングに装着されて、前記試料配置部に指向している、
   請求項１から５のいずれか１項に記載のＳＨＧ顕微鏡。
7. 前記ハウジングは３つ以上の装着部を備え、
   １つの装着部に前記照射手段が装着され、
   他の１つの装着部にモジュール化された前記対物レンズが装着され、
   前記照射手段とモジュール化された前記対物レンズの装着機構は互換性を有し、装着位置の変更が可能に構成されている、
   請求項６に記載のＳＨＧ顕微鏡。
8. 前記ハウジングは、その内面に、前記正反射光を減衰する手段を備える、
   請求項６又は７のいずれか１項に記載のＳＨＧ顕微鏡。
9. 単一波長成分を有し、直線偏光のパルス光を試料に照射し、
   前記試料が発する光のうち前記パルス光の正反射光を除いた光を集光し、
   前記集光した光のうち、前記単一波長の二分の一の波長近傍の波長を有し且つ特定方向の偏光方向の成分のみを観察する、
   ＳＨＧ光を観察する方法。