JP2019034947A - 眼疾患を予防または治療するための方法および組成物 - Google Patents

眼疾患を予防または治療するための方法および組成物 Download PDF

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Abstract

【課題】哺乳類対象者における眼病または疾患を予防または治療するための医薬の使用の提供。【解決手段】その必要がある哺乳類対象者における糖尿病性黄斑浮腫の症状を予防、治療または改善するための医薬の製造における、ペプチドD-Arg-2'6'-Dmt-Lys-Phe-NH2またはその薬学的に許容可能な塩の使用。【選択図】なし

Description

(0001) 本技術は一般的に、糖尿病性黄斑浮腫といった眼病あるいは眼疾患を予防または治療する複合物および方法に関係する。特に、本技術は眼病や眼疾患を予防あるいは治療するために芳香族カチオン性ペプチドの有効量を投与することに関するものである。
(0002) 読者の理解を深めるために次の記述が提供されるが、提供されている情報あるいは引用参照文献は、本発明に対する従来技術とは認められない。
(0003) 視神経および網膜の病気と変性疾患は、世界中で失明の主な原因となっている。網膜の重大な変性疾患としてはARMD (加齢性黄斑変性) がある。ARMD は米国内の年齢50歳以上の人々の間で最も一般的な失明疾患であり、その罹患率は年齢と共に増大する。ARMD は、滲出型 (新生血管型) あるいは乾燥型 (非新生血管型) とに分類され、乾燥型疾患がより一般的に見られる。滲出型 ARMD は、乾燥型 ARMD が進行したものと考えられ、血管生成に付随する。黄斑変性は、通常は加齢と共に中心網膜が歪み薄くなった場合に発症するが、眼内炎症と血管形成 (滲出方ARMDのみ) および／あるいは眼内感染によっても特徴化される。不適切な血管形成あるいは血管新生は、網膜虚血に起因すると考えられており、それに続く遊離基の生成によって、酸化性組織損傷、局所炎症、増殖因子 (例えばVEGFとFGF)と炎症仲介物質の産生という結果になる。
(0004) 網膜は眼球の一部であり、光に敏感である。黄斑は網膜の中心部、円錐体が豊富な小さな領域であり、色彩検出の特殊神経末端であり、昼間視力が依存する部位で、詳細な中心視覚を司る部位である。網膜障害は、I型糖尿病による失明の最大原因であり、II型糖尿病においてもよく認められる。網膜障害の度合いは、糖尿病の羅患期間に依存し、一般的に糖尿病発症後10年以上が経過すると進行し始める。糖尿病性網膜症には、毛細管透過性の増大、浮腫と滲出液により特徴付けられる非増殖性網膜障害、あるいは網膜から硝子体まで延長する新生血管形成、瘢痕化、繊維組織沈積、網膜剥離の可能性により特徴付けられる増殖性網膜障害による網膜障害がある。糖尿病性網膜症は、慢性的に網膜を低酸素状態にする生化学的および血流学的異常を引き起す高血糖が原因で、糖化タンパク質が蓄積することによって発症すると信じられている。その他のやや非一般的な網膜障害のいくつかには、CNVM (脈絡膜新生血管膜)、CME (嚢胞様黄斑浮腫)、ERM (網膜前膜)、黄斑部円孔が含まれる。糖尿病黄斑浮腫といった黄斑疾患は、法的盲の大部分を占める。
(0005) 緑内障とは、視神経の損傷により引き起こされる眼疾患の総称である。眼球の排水が不十分なために上昇したIOP (眼内圧) が緑内障の主要原因である。緑内障は眼球加齢とともにしばしば進行し、あるいは眼球の負傷、炎症、腫瘍、白内障、糖尿病の結果として発症する場合がある。また、ステロイド治療により上昇したIOPが原因で発症する場合もある。緑内障治療に効果的であると立証され薬物治療は、硝子体液の産生を減少させるあるいは眼球の排水を促進させることによりIOPを低減させるものである。このような薬物はしばしば血管拡張薬であり、交感神経系に対する作用があり、またアドレナリン拮抗薬を含む。
概要
(0006) 本技術は一般的に、芳香族カチオン性ペプチドの治療上有効な量を対象者に投与することにより、哺乳類動物の眼病あるいは眼疾患を予防または治療することに関係する。
(0007) 一局面においては、本発明の開示は、哺乳類動物対象者における糖尿病黄斑浮腫の症状を予防、治療あるいは改善する方法を提供し、当該方法は、治療上有効な量のペプチド D-Arg-2’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 あるいはその薬学的に許容可能な塩を対象者に投与することにより構成され、ここで当該ペプチドは、眼内、経口あるいは非経口により投与される。
(0008) ある態様においては、治療上有効な量のペプチドが眼球の一箇所あるいは複数箇所に眼内で投与される。ある態様においては、後眼房、鋸状縁、毛様筋、毛様体小帯、シュレム管、瞳孔、前眼房、角膜、虹彩、水晶体皮質、水晶体核、毛様体突起、結膜、下斜筋、下直筋、内直筋、網膜動脈および静脈、視神経乳頭、硬膜、網膜中心動脈、網膜中心静脈、視神経、渦静脈、テノン嚢、黄斑、窩、強膜、脈絡膜、上直筋、網膜で構成される群から、眼球の一領域あるいは複数領域が選択される。ある態様においては、当該眼球領域は黄斑である。ある態様においては、当該哺乳類動物はヒトである。
(0009) ある態様においては、対象者は、黄斑変性、網膜中心厚、網膜内水分、黄斑中心窩厚 (macular central fovea thickness)、対比感度 (contrast sensitivity)、視力低下のひとつ以上の症状を羅患するおそれがある、羅患していると疑われる、あるいは羅患していると診断されている。ある態様においては、当該ペプチドは、少なくとも1種類の治療薬が追加されて、ペプチドの投与前、投与後、投与と同時、あるいはこれらの組み合わせによって投与される。
(0010) 一局面においては、本発明の開示は、哺乳類動物対象者における糖尿病黄斑浮腫の症状を予防、治療あるいは改善する方法を提供し、当該方法は、治療上有効な量のペプチド D-Arg-2’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 あるいはその薬学的に許容可能な塩を対象者に投与することにより構成され、ここで組成物は、眼内、経口あるいは非経口により投与される。
(0011) ある態様においては、当該組成物が眼球の一箇所あるいは複数箇所に眼内で投与される。ある態様においては、後眼房、鋸状縁、毛様筋、毛様体小帯、シュレム管、瞳孔、前眼房、角膜、虹彩、水晶体皮質、水晶体核、毛様体突起、結膜、下斜筋、下直筋、内直筋、網膜動脈および静脈、視神経乳頭、硬膜、網膜中心動脈、網膜中心静脈、視神経、渦静脈、テノン嚢、黄斑、窩、強膜、脈絡膜、上直筋、網膜で構成される群から、眼球の一領域あるいは複数領域が選択される。
(0012) ある態様においては、当該眼球領域は黄斑である。ある態様においては、当該哺乳類動物はヒトである。対象者は、黄斑変性、網膜中心厚、網膜内水分、黄斑中心窩厚、対比感度、視力低下のひとつまたは複数を羅患するおそれがある、羅患していると疑われる、あるいは羅患していると診断されている。ある態様においては、当該組成物は、少なくとも1種類の治療薬が追加されて、ペプチドの投与前、投与後、投与と同時、あるいはこれらの組み合わせによって投与される。
(0013) 一局面においては、本発明の開示は、哺乳類動物対象者における急性眼性虚血が原因の微小血管損傷の症状を予防、治療あるいは改善する方法を提供し、当該方法は、治療上有効な量のペプチド D-Arg-2’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 あるいはその薬学的に許容可能な塩を対象者に投与することにより構成され、ここで当該ペプチドは、眼内、経口あるいは非経口的に投与される。
(0014) ある態様においては、当該方法は更に、対象者に血管再生術を施す過程により構成される。ある態様においては、眼性虚血形成の前あるいは後に当該対象者に当該ペプチドが投与される。ある態様においては、血管再生術を施す前、あるいは途中、あるいは後に対象者にペプチドが投与されるか、あるいは血管再生術を施す前、途中、後に継続的に投与される。
(0015) 一局面においては、本発明の開示は、眼科領域の疾患を予防、治療あるいは改善する方法であって、芳香族カチオン性ペプチドを必要とする対象者に投与することから構成される。一局面においては、当該芳香族カチオン性ペプチドは、以下を有するペプチドである：
少なくとも正味1価の正電荷、
最小4個のアミノ酸、
最大約20個のアミノ酸、
正味の正電荷 (pm) の最小個数とアミノ酸残留物 (r) の総数との関係において、3pm は、r + 1 以下の最大数であり、また芳香族基の最小個数 (a) と正味の正電荷の総数 (pt) との関係において、2a は pt + 1 以下の最大数であるが、ただしa が 1の場合、pt もまた 1である場合は除く。特定の態様においては、当該哺乳類動物はヒトである。
(0016) ある態様においては、2pm は r+1 以下の最大数であり、pt に等しくてよい。当該芳香族陽イオンペプチドは、最小2価あるいは最小3価の正電荷を有する水溶性ペプチドでよい。
(0017) ある態様においては、当該ペプチドは、非天然的に生成されないアミノ酸の1個または複数個で構成され、例えば、1個または複数個のD-アミノ酸である。ある態様においては、C-末端でのアミノ酸のC-末端カルボキシル基はアミド化されている。ある態様においては、当該ペプチドは最小4個のアミノ酸を有する。当該ペプチドは、最大個数約6個、最大個数約9個、あるいは最大個数約12個のアミノ酸を有してよい。
(0018) ある態様においては、当該ペプチドは、式 Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2 あるいは 2,’6’-Dmp-D-Arg-Phe-Lys-NH2 を有してよい。特定の態様においては当該式は D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 である。
(0019) ある態様においては、当該ペプチドは式 I により定義される：
ここで R1 および R2 は、
(i) 水素、
(ii) 鎖状または分岐 C1-C6 アルキル、
から独立に選択され、R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11 および R12 は、
(i) 水素、
(ii) 鎖状または分岐 C1-C6 アルキル、
(iii) C1-C6 アルコキシ、
(iv) アミノ、
(v) C1-C4 アルキルアミノ、
(vi) C1-C4 ジアルキルアミノ、
(vii) ニトロ、
(viii) ヒドロキシル、
(ix) ハロゲン (ただし「ハロゲン」には、塩化、フッ化、臭化、ヨウ化が包括される)
から独立に選択され、そして、n は1から5の整数である。
(0020) 特定の態様においては、R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12 は水素であり、n は 4 である。別の態様においては、R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R11 はすべて水素であり、R8 と R12 はメチル、R10 はヒドロキシル、n は 4 である。
(0021) ある態様においては、当該ペプチドは式 II により定義される：
ここで、R1 と R2 は、
(i) 水素、
(ii) 鎖状または分岐 C1-C6 アルキル、
から独立に選択され、R3 とR4 は、
(i) 水素、
(ii) 鎖状または分岐 C1-C6 アルキル、
(iii) C1-C6 アルコキシ、
(iv) アミノ、
(v) C1-C4 アルキルアミノ、
(vi) C1-C4 ジアルキルアミノ、
(vii) ニトロ、
(viii) ヒドロキシル、
(ix) ハロゲン （ただし「ハロゲン」には、塩化、フッ化、臭化、ヨウ化が包括される）、
から独立に選択され、R5, R6, R7, R8, R9 は、
(i) 水素、
(ii) 鎖状または分岐 C1-C6 アルキル、
(iii) C1-C6 アルコキシ、
(iv) アミノ、
(v) C1-C4 アルキルアミノ、
(vi) C1-C4 ジアルキルアミノ、
(vii) ニトロ、
(viii) ヒドロキシル、
(ix) ハロゲン (ただし「ハロゲン」には、塩化、フッ化、臭化、ヨウ化が包括される)
から独立に選択され、そして、n は 1 から 5までの整数である。
(0022) 当該芳香族の陽イオンペプチドは様々な方法で投与することができる。ある態様においては、当該ペプチドは、眼内、経口、局所、鼻腔内、目視、腹腔内、非経口、静脈内、皮下、経皮 (例：イオン電気泳動) により投与される。
(0023) 一局面においては、本発明の開示は、局所、イオン電気泳動あるい眼内投与により組成された、薬学的に許容可能量のペプチド D-Arg-2’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 あるいは Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2 を含む医薬組成物を提供する。
(0024) 一局面においては、本発明の開示は、薬学的に許容可能量のペプチド D-Arg-2’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 およびその薬学的に許容可能量のアセテート塩そして／またはトリフルオロアセテート塩といった当該ペプチドの塩、あるいは薬学的に許容可能量の Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2 またはその薬学的に許容可能量のアセテート塩から構成される、点眼剤組成物を提供する。ある態様においては、当該組成物は、角膜、眼房水、眼球レンズ内で可溶である。ある態様においては、当該組成は更に保存剤により構成される。ある態様においては、当該保存剤は濃度1％未満で存在する。
(0025) ある態様においては、当該組成は更に、酸化防止剤、金属錯体、抗炎症剤、抗生剤、抗ヒスタミン剤から構成される群から選択される活性薬剤で構成される。ある態様においては、当該酸化防止剤は、ビタミンA, ビタミンC、ビタミンE、リコピン、セレン、α-リポ酸、補酵素 Q、グルタチオン、またはカロチノイドにより構成される群から選択される作用剤で構成される。ある態様においては、当該組成は更に、アセクリジン、アセタゾールアミド、アネコルタブ、アプラクロニジン、アトロピン、アザペンタセ、アゼラスチン、バシトラシン、ベフノロール、ベタメタゾン、ベタキソロール、ビマトプロスト、ブリモニジン、ブリンゾラミド、カルバコール、セレコキシブ、クロラムフェニコール、クロルテトラサイクリン、シプロフロキサシン、クロモグリケート、クロモリン、シクロペントレート、シクロスポリン、ダピプラゾール、デメカリウム、デキサメタゾン、ジクロフェナク、ジクロルフェナミド、ジピベフリン、ドルゾラミド、エコチオフェート、エメダスチン、エピナスチン、エピネフリン、エリトロマイシン、エトキスゾラミド、オイカトロピン、フルドロコルチゾン、フルオロメトロン、フルルビプロフェン、ホミビルセン、フラマイセチン、ガンシクロビル、ガチフロキサシン、ゲンタマイシン、ホマトロピン、ヒドロコルチゾン、イドクスウリジン、インドメタシン、イソフルロフェート、ケトロラック、サジテン、ラタノプロスト、レボベタクスロール、レボブノロール、レボカバスチン、レボフロキサシン、ロドキサミド、ロテプレドノール、メドリゾン、メタゾラミド、メチプラノロール、モキシフロキサシン、ナファゾリン、ナタマイシン、ネドクロミル、ノルフロキサシン、オフロキサシン、オキシメタゾリン、オロパタジン、オキシメタゾリン、ペミロラスト、ペガプタニブ、フェニレフリン、フィゾスソスチグミン、ピロカルピン、ピンドロール、ピレノキシン、ポリミキシンB、プレドニゾロン、プロパラカイン、ラニビズマブ、リメキソロン、スコポラミン、セゾラミド、スクアラミン、スルファセタミド、スプロフェン、テトラカイン、テトラシクリン、テトラヒドロゾリン、テトリゾリン、チモロール、トブラマイシン、トラボプロスト、トリアムシノロン、トリフルオロメタゾラミド、トリフルリジン、トリメトプリム、トロピカミド、ウノプロストン、ビダラビン、キシロメタゾリン、これらの薬学的に許容可能量の塩、およびこれらの組み合わせから構成される群から選択される作用剤で構成される。
(0026) 図 1A および 1B は、30 mM のグルコース (HG) による共処理として使用される D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) (10 nM, 100 nM, 1 μM, 10 μM) の異なる濃度の効果を示す。図 1A は、アネキシン V/PI 染色後の流量血球計算による分析としてのアポトーシスの分析を示し、HRECs (Q3) に対する生存率は、処理後24時間でそれぞれ99.3%, 83.2%, 84.3%, 90.7%, 92.8%, 94.3% であった。図 1B は、HREC に対する生存率をグラフで示したものである。.濃度 100nM, 1μM, 10μM の D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) に対するデータは、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) による共処理をしなかった、高グルコースに曝された細胞により見られるものより有意に高かった。* p<0.05 対 30 mM 高グルコース処理された群。 (0027) 図 2A〜2Fは、30 mMのグルコースに24 時間および48 時間曝されたHRECでの細胞内の活性酸素種 (ROS) を減少させたD-Arg-2’,6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) による共処理を示す一連の顕微鏡写真である。細胞内 ROS はジヒドロエチジウムを用いて測定された。それぞれ、24時間および48時間での、2A, 2D 通常培養基；2B, 2E 30 mM グルコース；そして 2C, 2F 30 mM グルコース + D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) (100 nM) である。 (0028) 図 3A および 3B は、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) が高グルコースにより処理されたHREC のミトコンドリア電位の消失を防止することを示す。図 3A を見よ。HRECのΔΨm は、JC-1 蛍光プローブ染色後の流量血球計算により測定された。高グルコース (30 mM) 処理の結果、24時間および48時間後での、培養されたHRECのミトコンドリア細胞膜電位の急激な消失が認められた。これとは対照的に、流量血球計算分析によると、30mM グルコースにより共処理された D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) は、高グルコースのみの群と比較して ΔΨm を増加させることが示された。 図 3B を見よ。24時間および48時間、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31)により共処理された高グルコース HREC内のΔΨm の定量的分析によれば、高グルコースのみでは ΔΨm に逆効果を及ぼした。これとは対照的に、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) ではΔΨm が制御レベルまでに回復した。値は、3回重複実施された6件の別々の実験の 平均値 ± SD (標準偏差) である。*p < 0.05 である。 (0029) 図 4A および 4D は、通常グルコース群および D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) 共処理群におけるHREC が、24時間および48時間後により多数のチトクローム c 染色および HSP 60 染色の正確な重複を有することを示す共焦点顕微鏡写真を示し、これはチトクロームcとミトコンドリアの共局所化を示唆するものである。処理後24時間および48時間経過後にチトクローム c は明らかに、30 mMのグルコースで処理されたHRECの細胞質内で増加する。図 4B および 4E は、ウェスタンブロットにより決定された、ミトコンドリアと細胞質のチトクローム c の内容物を示す。図 4C および 4F は、24時間および48時間、高グルコースおよびD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) により共処理されたHRECのミトコンドリアと細胞質のチトクローム c の内容物のパーセント割合の定量分析を示す。 図４Ａ−Ｃの項に記載のとおり。 (0030) 図 5A および 5B は、高グルコース (HG) で処理されたHRECのカスパーゼ 3 の増大した発現量が、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) 共処理により減少したことが、ウェスタンブロットにより検出されたことを示す。カスパーゼ 3 発現量は β-アクチンに発現量で正規化された。 図 5C〜E は、高グルコース処理されたHRECにおいて、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) によりTrx2 の発現が増加したことを示す。図 5C は、24時間および48時間、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) により処理された30 mMのグルコースに曝されたHRECにおけるTrx2のmRNA レベルを示す。図 5D は、ウェスタンブロットにより測定されたTrx2 タンパク質発現量のレベルを示す。図 5E は、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) 共処理付きまたは無しの高グルコースにより24時間または48時間曝されたHRECでのTrx2のタンパク質レベルの定性的分析を示す。 (0031) 図 6 は、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) の糖尿病のラットのレンズに対する影響を示す写真である。上行：糖尿病のラットから得たレンズ、下行：D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) または Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2 (SS-20) により治療された糖尿病のラットから得たレンズ。 (0032) 図 7 は、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) および Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2 (SS-20) の糖尿病のラットのレンズに対する影響を示す一連の写真である。糖尿病は、高脂質食餌とストレプトゾトシン (HFD/STZ) (上行) あるいはストレプトゾトシン(STZ) のみ (下行) により誘発された。 (0033) 図 8 は、正常なラット、糖尿病のラット、そして D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) により治療された糖尿病のラットからのレンズ上皮を示す一連の顕微鏡写真である。糖尿病は STZ により誘発された。 (0034) 図 9は、正常なラット、糖尿病のラット、そして D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) により治療された糖尿病のラットからのレンズ上皮を示す一連の顕微鏡写真である。糖尿病は HFD/STZ により誘発された。 (0035) 図 10A および 10B は、正常なラット (NRC)、糖尿病のラット、そして Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2 (SS-20) または D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) により治療されたラットからの血液網膜関門の完全性をエバンズブルー血管外漏出による分析により示すチャートである。(A) 糖尿病は STZ により誘発され、(B) 糖尿病は HFD/STZ により誘発された。 (0036) 図 11 は、正常なラット (NRC)、糖尿病のラット (HFD/STZ)、そして D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) により治療されたラットからの網膜微小血管の一連の顕微鏡写真を示す。 (0037) 図 12 は、正常なラット、糖尿病のラット (STZ)、そして D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) により治療されたラットからの網膜微小血管の一連の顕微鏡写真を示す。 (0038) 図 13A〜13D は、正常ラット (A)、STZラット (B)、STZ/Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2 治療済みラット (SS-20) (C)、または STZ/D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 治療済み (SS-31) (D) の網膜微小血管内のタイトジャンクション構成タンパク質クローディン5の分布を示す一連の顕微鏡写真である。 (0039) 図 14 は、疾患のない個人 (HTM) からの線維柱帯網細胞およびD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) を投与した緑内障患者 (GTM) からの線維柱帯網細胞に対する D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) の細胞毒性の欠如を示すチャートである。 (0040) 図 15 は、緑内障患者 (GTM) からの線維柱帯網細胞内で200 μMのH2O2 により誘発されたミトコンドリア電位(ΔΨm) の減少を投与量に依存して阻止するD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) による共処理を示す一連の共焦点顕微鏡写真である。 (0041) 図 16 は、緑内障患者 (GTM) からの線維柱帯網細胞内で200 μMのH2O2 により誘発されたミトコンドリア膜電位(ΔΨm) の減少をTMRMおよび流量血球計算により測定し、投与量に依存して阻止するD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) による共処理として示す一連のチャートである。 (0042) 図 17 は、GTM および HTM 細胞内でのミトコンドリア膜電位(ΔΨm)を比較するチャートである。 (0043) 図 18は、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) による処理への応答でのGTM細胞の形態変化を逆位相差顕微鏡を使用して観測して示す一連の顕微鏡写真である。 (0044) 図 19 は、投与量に依存する仕方で400 μMの H2O2 により起こされた、GTM細胞内のミトコンドリア膜電位の消失をD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) による共処理によって減少したことを共焦点顕微鏡を使用して示す一連の顕微鏡写真である。 (0045) 図 20 は、400 μMの H2O2 により起こされた、GTM細胞内のミトコンドリア膜電位 (ΔΨm) の消失をD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) による共処理によって減少したことを、TMRMおよび共焦点顕微鏡 (倍率 200倍) を使用して示す一連の顕微鏡写真である。 (0046) 図 21 は、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) による処理への応答でのGTM細胞の形態変化を逆位相差顕微鏡を使用して観測して示す一連の顕微鏡写真である。 (0047) 図 22は、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) が主要ヒト網膜色素上皮 (RPE) 細胞の生存力 (MTT試験により測定) には影響しないことを示すチャートである。 (0048) 図 23A は、異なる濃度の tBHP のRPE 細胞の生存力 (MTT試験により測定) への影響を示すチャートである。図 23B は、増加中の tBHP濃度に曝された場合の、異なる濃度の D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) の細胞の生存力への影響を示すチャートである。 (0049) 図 24A〜24Cは、脈絡膜新生血管 (CNV) マウスモデルにおける病理学的効果を示す一連の顕微鏡写真である。 図 24D は、治療実施群と対照群におけるCNV 領域を示すグラフである。 (0050) 図 25 は、酸素誘発網膜症 (OIR) マウスモデルにおける病理学的効果を示す一連の顕微鏡写真である。P17 OIRマウスでの図 24D は、治療実施群と対照群におけるCNV 領域を示すグラフである。P17正常マウスと比較して、P17 OIRマウスでの無血管性および新血管分布に注目されたい。 (0051) 図 26A〜26Dは、OIRマウスモデルにおけるD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) 投与の効果を示す一連の顕微鏡写真である。 図 26E は、対照群および治療実施群の新生血管領域を示すグラフである。D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) が無血管領域を減少させている。 (0052) 図 27A は、異なる投与量の tBHP の マウス網膜腫瘍から派生させた661W 錐体細胞線の細胞生存力への影響を示すチャートである。図 27B はtBHPに誘発された 661W 細胞死亡の減少における1 μM のD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) の効果を示すチャートである。 (0053) 図 28は、対照群および D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) 治療実施群のマウスにおける網膜変性症のマウスモデルでの網膜外側核層 (ONL) の厚さを示す一連の顕微鏡写真である。 (0054) 図 29は、対照群および D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) 治療実施群のマウスにおいて錐体内外部分を選択的に染色するピーナッツ凝集素 (PNA) により染色された網膜フラットマウントの錐体細胞線密度を示す一連の顕微鏡写真を示す。 (0055) 図 30は、網膜変性症のマウスモデルでの酸化脂質損傷の標識である、アクロレインに対する染色を示す一連の顕微鏡写真である。 (0056) 図 31は、FACS 分析を使ったRPE細胞の3つの群における細胞内 ROS 生成の蛍光強度を示す一連のグラフである。図 31A は、対照 RPE 細胞におけるROS 生成を示し、図 31Bは、500μM の tBHPで3時間処理されたRPE細胞におけるROS生成を示し、図 31Cは、500μM の tBHPで3時間処理され、そして1μMの D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) で処理されたRPE細胞におけるROS生成を示す。 図 31D は、ROS 蛍光を示す棒グラフである。 (0057) 図 32 は、FACS 試験におけるJC-1により標識されたMMPの分析を示す一連のグラフである。3通りの異なる濃度のD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) 群が分析された。 (0058) 図 33A〜33Cは、1μMの D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) の tBHPにより誘発されたMMP減少への影響を示す一連のグラフである。図 33A：対照群、図 33B： 500μMの tBHPを3時間の群、図 33C：1μMの D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) を4時間 + 500μM の tBHP を3時間の群。 図 33D は、異なる群に対して蛍光比率を比較するチャートである。*p<0.01、C 対 B. (0059) 図 34A〜34Cは、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) の250μMのtBHP を24時間使用して誘導させた細胞死の影響を示す一連のグラフである。図 34A：対照群、図 34B：250μMの tBHPを24時間、図 34C：1μMの D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) を4時間 + 250μMのtBHPを24時間の群。 図 34Dは、異なる群に対して蛍光比率を比較するチャートである。*p < 0.05 C 対 B. (0060) 図 35は、RPE 細胞の3 つの群においてtBHPにより誘発されたMDAレベルを示すチャートである。*p<0.05, 1μMのD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) を4時間 + 250μMのtBHPを24時間の群 対 250μM の tBHPを 24時間。 (0061) 図 36は、対照群およびD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) 治療実施群における、FACS分析を使用して測定した、GTM およびHTM細胞のTMRMの蛍光強度を示すグラフである。 (0062) 図 37は、対照群およびD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) 治療実施群における、FACS分析を使用して測定した、GTM およびHTM細胞のROSの蛍光強度を示すグラフである。 (0063) 図 38A〜38Dは、対照群およびD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) 治療実施群の細胞死の値をQ2+Q4 象限における細胞のパーセント割合で表わしたグラフである。 図３８Ａ−Ｂの項に記載のとおり。 (0064) 図 39A および 39Bは、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) によりH2O2 で処理したGTM3 および iHTM 細胞で細胞内ROS生成が低減したことを示すグラフである。 (0065) 図 40A および40 B は、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) がH2O2 により誘起されたGTM3 および iHTM 細胞のミトコンドリア脱分極に抗して保護したことを示すグラフである。 (0066) 図 41 は、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) を投与されたマウスをストレプトゾトシン (STZ) 処理した場合の空間周波数 (SPF)閾値を示すチャートである。
詳細な説明
(0067) 本発明を十分理解するには、本発明のある局面、形態、態様、変化、特長は、様々な詳細度での以下の記述を検討すべきである。
(0068) 本発明の実施においては、分子生物学、タンパク質生化学、細胞生物学、免疫学、微生物学そして組替DNAの多数の従来技術が使用される。これらの技術は周知であり、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Vols. I-III, Ausubel, Ed. (1997); Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989); DNA Cloning: A Practical Approach, Vols. I および II, Glover, Ed. (1985); Oligonucleotide Synthesis, Gait, Ed. (1984); Nucleic Acid Hybridization, Hames & Higgins, Eds. (1985); Transcription and Translation, Hames & Higgins, Eds. (1984); Animal Cell Culture, Freshney, Ed. (1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning; the series, Meth. Enzymol., (Academic Press, Inc., 1984); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, Miller & Calos, Eds. (Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1987); および Meth. Enzymol., Vols. 154 and 155, Wu & Grossman, and Wu, Eds. にそれぞれ説明されている。
(0069) 本明細書にて使用されている特定用語の定義が以下に提供されている。特に他に定義されていなければ、本明細書で使用されているすべての科学技術用語は、一般的に、本発明が属する従来技術の専門者によって共通に理解されるのと同じ意味である。
(0070) 本仕様書および添えられた請求項目で使用されているように、単数表示は明確に示さない限り複数形を含む。例えば、「細胞」は2つ以上の細胞の組み合わせおよび同様なものを含む。
(0071) 本明細書で使用されているように、「約」は当業者により理解され、それが使用される文脈に依存してある程度変化する。当業者に明確でない用語が使用される場合は、それが使用される文脈が与えられる場合、「約」は 計数値から最大10%の増減を意味する。
(0072) 本明細書で使用されているように、作用剤、医薬品あるいはペプチドを対象者に「投与」することには、対象者に化合物をその意図する機能を実行させるべく、導入あるいは送達する任意の経路を含む。投与には、上皮、口、鼻、非経口 (静脈内、筋肉内、腹腔あるいは皮下)、局所、直腸、空洞内、皮内、経皮、呼吸入、動脈内、脳内、骨間、くも膜下腔内、膀胱内、イオン泳動的、眼などを含む、任意の適切な経路により実施される。投与は自己投与および他者による投与を含む。
(0073) 本明細書で使用されているように、「アミノ酸」には天然に生成するアミノ酸、合成アミノ酸、同様に天然に生成するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体 とアミノ酸模倣体を含む。天然に生成するアミノ酸は、遺伝情報により符号化されたもの、同様に、例えばヒドロキシプロリン、γ カルボキシグルタミン酸、O‐ホスホセリンのような、後日変性されたアミノ酸である。アミノ酸類似体とは、天然に生成するアミノ酸と同じ基本的化学構造を有する化合物を指し、言い換えれば、水素に結合するα 炭素、カルボキシル基、アミノ基、そして例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムといったR基である。当該類似体には、変性R基 (例えばノルロイシン) あるいは変性ペプチド主鎖 があるが、天然に生成するアミノ酸と同じ基本的化学構造が保持されている。アミノ酸模倣体とは、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが、天然に生成するアミノ酸と同様に機能する化合物を指す。アミノ酸は 本明細書においては、通常知られている3文字記号あるいは IUPAC-IUB 生化学命名法委員会により推奨される1文字記号により呼称することができる。
(0074) 本明細書で使用されているように、「有効量」という用語は、例えば、眼球状態に付随する症状の予防あるいは緩和の結果を生む量といった、所望の治療的および／あるいは予防処置を意味する。対象者に投与する化合物の量は、その種類および疾患の重篤度、および一般的健康状態、年齢、性別、体重、医薬品への耐性といった個人の特性に依存するであろう。それはまた、疾患の度合い、重篤度、種類にも依存するであろう。熟練当業者は、これらのおよびその他の要因に応じて適切な量を決定することができよう。化合物はまた、1つまたは複数の治療化合物との組み合わせで投与することができる。本明細書で記述されている方法において、芳香族陽イオンペプチドを眼球状態のひとつまたは複数の兆候あるいは症状を有する対象者に投与してよい。例えば、「治療上有効な量」の芳香族陽イオンペプチドとは、眼疾患の生理学的影響が最小に改善されることを意味するレベルである。
(0075) 「分離された」あるいは「純化された」ポリペプチドあるいはペプチドとは、細胞物質からは十分束縛されない、あるいは他の汚染ペプチドが、それが派生される細胞または組織源からは束縛されない、あるいは化学前駆体あるいは他の化学物質が合成される場合は、その物質からは十分束縛されないことを意味する。例えば、分離された芳香族陽イオンペプチドは、その診断的あまたは治療的使用を干渉するような物質からは束縛されないであろう。当該干渉物質には、酵素、ホルモン、およびその他のタンパク質性および非タンパク質性溶質が含まれてよい。
(0076) 本明細書で使用されているように、「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書では互換に使用されており、相互にペプチド結合または変性ペプチド結合による、2個以上のアミノ酸の結合から構成される重合体、すなわちペプチド同配体を意味する。ポリペプチドは、通常ペプチド、グリコペプチドあるいはオリゴマーとして参照される短鎖、および一般的にタンパク質として参照される長鎖を意味する。ポリペプチドには、20個の遺伝子符号化されたアミノ酸以外のアミノ酸を含み得る。ポリペプチドには、翻訳後プロセシングといった自然過程により、あるいは当業者には周知の化学変性により変性されたアミノ酸配列順序を含む。
(0077) 本明細書で使用されているように、「同時」治療使用という用語は、少なくとも2種類の有効成分を同じ経路でかつ同時にあるいは十分同時刻に投与することを意味する。
(0078) 本明細書で使用されているように、「別々の」治療使用という用語は、少なくとも2種類の有効成分を異なる経路で同時にあるいは十分同時刻に投与することを意味する。
(0079) 本明細書で使用されているように、「連続」治療使用という用語は、少なくとも2種類の有効成分を同じあるいは異なる経路で異なる時刻に投与することを意味する。特に、連続使用は、1つの有効成分の全投与を他のまたは他の複数の投与開始前に実施することを意味する。従ってこれは、1つの有効成分の全投与を他のまたは他の複数の投与開始前に数分間、数時間あるいは数日間かけて実施することを意味する。この場合は同時治療はない。
(0080) 本明細書で使用されているように、「治療する」、「治療」、「改善」という用語は、治療処置および予防処置あるいは予防対策を意味し、ここで目的は、標的とする病的状態あるは障害を予防または低下 (軽減) させることである。本明細書で記述されている方法に従って、芳香族陽イオンペプチドの治療上有効な量を投与された後に、眼科領域の疾患の1つまたは複数の兆候または症状に観察可能なおよび／あるいは測定可能な低下あるいは不在が対象者に認められる場合は「治療」が成功したことになる。また、この用語は、医学的状態の治療または予防の各種形態が記述されるように「十分」であるという意味であって、総合のみならず総合治療または予防以下をも含み、ここで生物学的あるいは医学的に関連する結果が達成されることである。
(0081) 本明細書で使用されているように、障害あるいは状態の「予防」または「予防する」という用語は、統計学的標本において、未治療の標本に相対的に治療標本での当該障害あるいは状態の生成を低減させる化合物、あるいは未治療の標本に相対的に当該障害あるいは状態のひとつ以上の症状の発症を遅延させるあるいは重篤度を低減させる化合物を意味する。
芳香族陽イオンペプチド
(0082) 本技術は、特定の芳香族陽イオンペプチドを投与することにより、眼科領域の疾患の治療または予防することに関係する。理論のみに限定されないよう希望せずに、当該芳香族陽イオンペプチドにより、眼球内の酸素障害の重篤あるいは生成を低減することにより、眼科領域の疾患や状態を治療または予防することが可能である。当該芳香族陽イオンペプチドは水溶性であり極性が高い。これらの性質にも関わらず、当該ペプチドは細胞膜を容易に投下することができる。当該芳香族陽イオンペプチドは典型的には、ペプチド結合により共有結合する、最小3個のアミノ酸または最小4個のアミノ酸を含む。当該芳香族陽イオンペプチドに存在するアミノ酸の最大個数は、ペプチド結合により共有結合する約20個である。適切には、アミノ酸の最大個数は約12個であり、更に好ましくは約9個、最も好ましくは約6個である。
(0083) 当該芳香族陽イオンペプチドの当該アミノ酸は任意のアミノ酸でよい。本明細書で使用されているように、「アミノ酸」という用語は、少なくとも1個のアミノ基および少なくとも1個のカルボキシル基を含む任意の有機分子を意味するために使用される。典型的には、少なくとも1個のアミノ基は、カルボキシル基と相対的な 位置にある。アミノ酸は自然生成することがある。自然生成するアミノ酸には、哺乳類動物タンパク質に普通見出される、20個の最も通常の左旋回 (L) アミノ酸があり、例えば、アラニン (Ala)、アルギニン (Arg)、アスパラギン (Asn)、アスパラギン酸 (Asp)、システイン (Cys)、グルタミン (Gln)、グルタミン酸 (Glu)、グリシン (Gly)、ヒスタジン (His)、イソロイシン (Ile)、ロイシン(Leu)、リジン(Lys)、メチオニン (Met)、フェニルアラニン(Phe)、プロリン (Pro)、セリン (Ser)、トレオニン(Thr)、トリプトファン(Trp)、チロシン(Thr)、そしてバリン (Val)である。他の自然生成するアミノ酸には、例えば、タンパク質合成には付随しない代謝過程において合成されるアミノ酸がある。例をあげれば、アミノ酸オルニチンとシトルリンは、尿素生成中の哺乳類動物代謝過程で合成される。自然生成するアミノ酸の別の例にはヒドロキシプロリン (Hyp) が含まれる。
(0084) 当該ペプチドには、1個または複数個の自然生成はされないアミノ酸が選択肢的に含まれることがる。適切には、当該ペプチドには自然生成するアミノ酸は含まれない。人工的に生成されるアミノ酸は、左旋回 (L-)、右旋回 (D-)、あるいはそれらの混合である。人工的に生成されるアミノ酸は、典型的には、生体内の通常の代謝過程では合成されないアミノ酸であり、タンパク質内では生成されない。加えて、適切に人工的に生成されるアミノ酸はまた、通常のタンパク分解酵素により認識されない。人工的に生成されるアミノ酸は、当該ペプチドの任意の位置に存在することができる。例えば、人工的に生成されるアミノ酸は、N-末端またはC-末端、あるいはN-末端とC-末端との間の任意の位置に存在することが可能である。
(0085) 人工的に再生されるアミノ酸は、例えば、天然アミノ酸には見出されない、アルキル、アリルまたはアルキルアリル基により構成される。人工的に生成されるアルキルアミノ酸の数例としては、α-アミノブチル酸、β-アミノブチル酸、γ-アミノブチル酸、δ-アミノ吉草酸および ε-アミノカプロン酸がある。人工的に生成されるアリルアミノ酸の数例にとしては、オルソ、メタそしてパラのアミノ安息香酸がある。人工的に生成されるアルキルアリルアミノ酸の数例としては、オルト、メタおよびパラのアミノフェニル酢酸、および γ-フェニル-β-アミノブチル酸がある。人工的に生成されるアミン酸には、自然生成アミノ酸の誘導体がある。自然生成アミノ酸の誘導体は、例えば、自然生成されたアミノ酸に1個または複数個の化学基が追加されたものがある。
(0086) 例えば、1個または複数個の化学基は、1個または複数個のフェニルアラニンまたはチロシン残基の芳香族環の第 2’, 3’, 4’, 5’, 6’ 位置、あるいはトリプトファン残基のベンゾ環の第 4’, 5’, 6’, 7’ 位置に追加されてよい。当該基は芳香族環に追加できる任意の化学基である。当該基の数例としては、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、t-ブチル、C1-C4アルキルオキシ(すなわち、アルコキシ)、アミノ、C1-C4 アルキルアミノおよび C1-C4 ジアルキルアミノ (例：メチルアミノ、ジメチルアミノ)、ニトロ、ヒドロキシル、ハロ (すなわち、フルオロ、クロロ、ブロモあるいはヨウ化) といった、分岐あるいは非分岐C1-C4 アルキルがある。自然生成するアミノ酸の人工的に生成される誘導体の特定な数例には、ノルバリン(Nva) およびノルロイシン (Nle) がある。
(0087) ペプチドのアミノ酸の変性の別例は、ペプチドのアスパラギン酸またはグルタミン酸の残基のカルボキシル基の誘導体である。誘導体の一例は、アンモニア、あるいは例えばメチルアミン、エチルアミン、ジメチルアミンまたはジエチルアミンといった、第一級または第二級のアミンによるアミド化である。誘導体の別例としては、例えば、メチルまたはエチルアルコールによるエステル化がある。当該変性の別例には、リジン、アルギニンまたはヒスチジン残基のアミノ基の誘導体が含まれる。例えば、当該アミノ基はアシル化されることが可能である。いくつかの適切なアクリル基には、例えば、アセチルまたはプロピオニル基といった、上述のC1-C4 アルキル基の任意の基で構成されるベンゾイル基またはアルカノイル基が含まれる。
(0088) 人工生成されるアミノ酸は、好ましくは通常のタンパク分解酵素に耐性があり、更に好ましくは無反応である。タンパク分解酵素に耐性があるまたは無反応である人工的に生成されるアミノ酸の例には、上述の自然生成 L-アミノ酸、同様にL-そして/または人工的生成アミノ酸の任意のものの右旋回 (D-) 形が含まれる。D-アミノ酸は、特定のペプチド抗生物質であって、細胞の通常のリボソームタンパク質合成機構以外の手段によって合成されるものには見出されるのではあるが、通常はタンパク質中では生成されない。本明細書で使用されているように、D-アミノ酸は、人工生成アミノ酸であると考えられる。
(0089) タンパク分解酵素反応を最小化するには、タンパク分解酵素には、通常のタンパク分解酵素により認識されるL-アミノ酸が5個未満であるべきで、好ましくは4個未満、更に好ましくは3個未満、最も好ましくは2個未満であり、ここで当該 L-アミノ酸は自然生成または人工生成を問わない。適切には当該ペプチドは D-アミノ酸のみを有し、L-アミノ酸は有さない。当該ペプチドがアミノ酸のタンパク分解酵素反応配列順を含む場合は、当該アミノ酸に少なくとも1個は人工生成 D-アミノ酸であり、従ってタンパク分解酵素耐性が与えられる。タンパク分解酵素反応配列順の一例には、エンドペプチダーゼとトリプシンといった通常のタンパク分解酵素によりすぐに切断される隣接塩基性アミノ酸を2個以上含む。塩基性アミノ酸の例には、アルギニン、リジン、ヒスチジンが含まれる。
(0090) 芳香族陽イオンペプチドは、当該ペプチドのアミノ酸残基の総数と比較して、生理学的pHで正味正電荷量の最小数を有するべきである。この生理学的pHで正味正電荷量の最小数は、(pm) として参照される。当該ペプチドのアミノ酸残基の総数は、(r) として参照される。以下で議論される正味正電荷の最小量はすべて生理学的 pHでの値である。本明細書で使用されているように、「生理学的 pH」という用語は、哺乳類動物身体の組織および器官の細胞内の通常のpHを意味する。例えば、ヒトの生理学的 pH は約7.4であるが、哺乳類動物の生理学的 pH は約7.0から約7.8の任意のpH値となることがある。
(0091) 本明細書で使用されているように、「正味電荷量」という用語は、当該ペプチド中に存在するアミノ酸がもつ正電荷数と負電荷数との差を意味する。本明細書においては、正味電荷量は生理学的 pH で測定されるものと理解される。生理学的 pHで正に帯電する自然生成アミノ酸には、L-リシンとL-アルギニン、L-ヒスチジンが含まれる。生理学的 pHで負に帯電する自然生成アミノ酸には、L-アスパラギン酸とL-グルタミン酸が含まれる。
(0092) 典型的には、ペプチドは、正に帯電したN-末端アミノ基および負に帯電した C-末端カルボキシル基を有する。これらの電荷は生理学的 pHでお互いに打ち消しあう。正味電荷量を計算する一例として、ペプチド Tyr-Arg-Phe-Lys-Glu-His-Trp-D-Arg には、1価の負電荷量を有するアミノ酸 (例：Glu) および4価の正電荷量を有するアミノ酸 (すなわち、2個のArg残基、1個のLysと1個のHis) が存在する。従って上記ペプチドには3価の正味正電荷量を有する。
(0093) ある態様においては、当該芳香族陽イオンペプチドには、生理学的 pH での正味正電荷量の最小値 (pm) とアミノ酸残基の総数 (r) との間には関係があり、ここで 3pm は r + 1 以下の最大数となる。本態様においては、正味正電荷量 (pm) とアミノ酸残基の総数 (r) との関係は次の通りである：
(0094) 別の態様においては、当該芳香族陽イオンペプチドには、正味正電荷量の最小値 (pm) とアミノ酸残基の総数 (r) との間には関係があり、ここで 2pm は r + 1 以下の最大数である。本態様においては、正味正電荷量 (pm) とアミノ酸残基の総数 (r) との関係は次の通りである：
(0095) ある態様においては、正味正電荷量の最小値 (pm) とアミノ酸残基の総数 (r) とは等しい。別の態様においては、当該ペプチドは3価または4価のアミノ酸残基を有し、かつ最小1価の正味正電荷量を有し、好ましくは最小2価の正味正電荷量、更に好ましくは最小3価の正味正電荷量を有する。
(0096) また、当該芳香族陽イオンペプチドは、正味正電荷量の総価数 (pt)と比較して、芳香族基の最小個数を有することが重要である。この芳香族基の最小個数は (a) として以下で参照される。芳香族基を有する自然生成アミノ酸には、アミノ酸ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニンが含まれる。例えば、ヘキサペプチド Lys-Gln-Tyr-D-Arg-Phe-Trp は2価の正味正電荷 (リシンおよびアルギニン残基からの寄与) を有し、3個の芳香族基 (チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン残基からの寄与) を有する。
(0097) 当該芳香族陽イオンペプチドには、芳香族基の最小個数 (a) と生理学的 pH での正味正電荷の総価数 (pt) との間には関係があり、ここで 3a は pt + 1 以下の最大値であり、ただし pt が 1 である場合は1となる場合を除く。本態様においては、芳香族基の最小個数 (a) と正味正電荷の総価数 (pt) との関係は次の通りである：
(0098) 別の態様においては、当該芳香族陽イオンペプチドには、芳香族基の最小個数 (a) と正味正電荷の総価数 (pt) との間には関係があり、ここで 2a は pt + 1 以下の最大数である。本態様においては、芳香族アミノ酸残基の最小個数 (a) と正味正電荷の総価数 (pt) との関係は次の通りである：
(0099) 別の態様においては、芳香族基数 (a) と正味正電荷の総価数 (pt) とは等しい。
(0100) カルボキシル基、特にC-末端アミノ酸の末端カルボキシル基は、好ましくは、例えばアンモニアとアミド化され、C-末端アミドを形成する。別方法としては、C-末端アミノ酸の末端カルボキシル基は、任意の第一級あるいは第二級アミンによりアミド化される。当該第一級および第二級アミンは、例えば、アルキル、特に分岐または未分岐 C1-C4 アルキル、あるいはアリルアミンである。従って、当該ペプチドの C-末端でのアミノ酸は、アミドあるいはN-メチルアミド、N-エチルアミド、N,N-ジメチルアミド、N,N-ジエチルアミド、N-メチル-N-エチルアミド、N-フェニルアミド、N-フェニル-N-エチルアミド基に変換され得る。当該芳香族陽イオンペプチドのC-末端では起こらない、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸残基の自由カルボキシレート基もまた、当該ペプチド内のどこでも生成されればアミド化されてよい。これらの内部位置のアミド化は、アンモニアあるいは上述の第一級または第二級アミンにより可能である。
(0101) ある態様においては、当該芳香族陽イオンペプチドは、2価の正味正電荷と少なくとも1個の芳香族アミノ酸を有するトリペプチドである。特定の態様においては、当該芳香族陽イオンペプチドは、2価の正味正電荷と2個の芳香族アミノ酸を有するトリペプチドである。
(0102) 芳香族陽イオンペプチドは、次のペプチド例を含むが、これらのみには限定されない：
(0103) ある態様においては、ミュー・オピオイド受容体作用薬活動を有するペプチドは、式 Tyr-D-Arg-Phe-Lys-NH2 を有する。Tyr-D-Arg-Phe-Lys-NH2 には、アミノ酸チロシン、アルギニン、リシンからの寄与である3価の正味正電荷があり、アミノ酸フェニルアラニン、チロシンからの寄与である2個の芳香族基がある。Tyr-D-Arg-Phe-Lys-NH2 の当該チロシンは、2,’6’-ジメチルチロシン内で生成される式 2,’6’-Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2 を有する化合物といったチロシンの変性誘導体でよい。2,’6’-Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2は、分子量が640 であり、生理学的 pHで3価の正電荷を有する。2,’6’-Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2 は、エネルギーに依存しない仕方で哺乳類動物の数種類の細胞の原形質膜を容易に透過する (Zhao ら, J. Pharmacol Exp Ther. 304: 425-432, 2003)。
(0104) ミュー・オピオイド受容体作用薬活動をもたないペプチドは一般的には、N-末端 (すなわち、アミノ酸位置 1)でチロシン残基またはチロシンの誘導体を有しない。N-末端のアミノ酸は、チロシン以外の自然生成あるいは人工生成アミノ酸でよい。ある態様においては、N-末端の当該アミノ酸は、フェニルアラニンまたはその誘導体である。フェリルアラニンの模範的誘導体には、2’-メチルフェニルアラニン (Mmp)、2,’6’-ジメチルフェニルアラニン (2,’6’-Dmp)、N,2,’6’-トリメチルフェニルアラニン (Tmp)、および 2’-ヒドロキシ-6’-メチルフェニルアラニン (Hmp) が含まれる。
(0105) ミュー・オピオイド受容体作用薬活動をもたない芳香族陽イオンペプチドの一例には、式 Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2を有するものがある。別の例としては、当該 N-末端フェニルアラリンは、2,’6’-ジメチルフェニルアラニン (2’6’-Dmp) といったフェニルアラリンの誘導体でよい。アミノ酸位置 1 の 2,’6’-ジメチルフェニルアラニンを含む Tyr-D-Arg-Phe-Lys-NH2 は、式 2,’6’-Dmp-D-Arg-Phe-Lys-NH2.を有する。ある態様においては、2,’6’-Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2 のアミノ酸配列順は、Dmt がN-末端に位置しないように再配列させられる。ミュー・オピオイド受容体作用薬活動をもたない当該芳香族陽イオンペプチドの一例としては、式 D-Arg-2’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 を有するものがある。
(0106) 芳香族陽イオンペプチドおよびその誘導体には更に機能類似体が含まれる。ペプチドは、類似体が芳香族陽イオンペプチドと同機能を有する場合は、芳香族陽イオンペプチドの機能類似体と考えられる。当該類似体は、例えば、当該芳香族陽イオンペプチドの置換変異体でよく、ここで1個または複数個のアミノ酸が別のアミノ酸によって置換される。
(0107) 適切な芳香族陽イオンペプチドの置換変異体には、保存アミノ酸の置換物が含まれる。アミノ酸はそれらの物理化学的特性に従って、以下のように分類することができる：
(a) 非極性アミノ酸：Ala(A) Ser(S) Thr(T) Pro(P) Gly(G) Cys (C)；
(b) 酸性アミノ酸：Asn(N) Asp(D) Glu(E) Gln(Q)；
(c) 塩基性アミノ酸：His(H) Arg(R) Lys(K)；
(d) 疎水性アミノ酸：Met(M) Leu(L) Ile(I) Val(V)；
(e) 芳香族アミノ酸：Phe(F) Tyr(Y) Trp(W) His (H)。
(0108) ペプチド内で1個のアミノ酸を同種の別のアミノ酸で置換することは、保存置換と呼ばれ、最初のペプチドの物理化学的特性を保持することが可能である。これとは対照的に、ペプチド内で1個のアミノ酸を別種のアミノ酸で置換すると、最初のペプチドの物理化学的特性を多少なりとも変化させる。
(0109) ある態様においては、当該芳香族陽イオンペプチドは、表5に示す式を有する。


Dab = ジアミノ酪酸の
Dap =ジアミノプロピオン酸
Dmt = ジメチルチロシン
Mmt = 2’-メチルチロシン
Tmt = N, 2’,6’-トリメチルチロシン
Hmt = 2’-ヒドロキシ,6’-メチルチロシン
dnsDap = -ダンシル-L-、-ジアミノプロピオン酸
atnDap = -アントラニロイル-L-、-ジアミノプロピオン酸
Bio = ビオチン
(0110) ミュー・オピオイド受容体作用薬活動をもたない芳香族陽イオンペプチドの他の例には、表6に示される芳香族陽イオン・ペプチドが含まれるが、これらのみには限定されない。
Cha =シクロヘキシルアラニン
(0111) 表5と6に示したペプチドのアミノ酸はL-またはD-配置のいずれかである。上述のペプチドおよびそれらの任意の変異体に加え、当該ペプチドに薬学的に許容可能な塩が提供される。薬学的に許容可能な塩の典型例にはトリフルオロ酢酸塩が含まれるが、これのみには限定されない。
(0112) 当該ペプチドは当業者に周知の任意の方法によって合成してよい。タンパク質の化学合成するための適切な方法には、例えば、Stuart および Young著、Solid Phase Peptide Synthesis、2版、Pierce Chemical Company (1984), および Methods Enzymol. 289, Academic Press, Inc, New York (1997) に記述されている。
芳香族陽イオンペプチドの予防的および治療的使用
(0113) 眼球は酸化ストレスのリスクを受けやすい。機能不全のミトコンドリアが活性酸素種 (ROS) の主要部位であることを示す多数の証拠が存在する。通常の代謝中に生成される O2 の95% 以上は内部ミトコンドリア膜の電子伝達系により生成される。ミトコンドリアはまたROSの主要標的でもある。ROSに関連する眼科領域の疾患や障害の多くを治療するための酸化防止活性の普遍型をもつ化合物のミトコンドリア標的化の必要性がある。. Babizhayev MA, Yegorov YE. Reactive Oxygen Species and the Aging Eye: Specific Role of Metabolically Active Mitochondria in Maintaining Lens Function and in the Initiation of the Oxidation-Induced Maturity Onset Cataract-A Novel Platform of Mitochondria-Targeted Antioxidants With Broad Therapeutic Potential for Redox Regulation and Detoxification of Oxidants in Eye Diseases. Am J Ther. 2010 Oct 22; Barnstable CJ. Mitochondria and the regulation of free radical damage in the eye. J Ocul Biol Dis Infor. 2009 Sep;2(3):145-148; Jarrett SG ら、The importance of mitochondria in age-related and inherited eye disorders. Ophthalmic Res. 2010;44(3):179-90; Neroev VV, et al., Mitochondria-targeted plastoquinone derivatives as tools to interrupt execution of the aging program. Age-related eye disease. SkQ1 returns vision to blind animals. Biochemistry (Mosc). 2008 Dec;73(12):1317-28; Zhao C ら、Acetaminophen cytotoxicity in mouse eye: mitochondria in anterior tissues are the primary target. J Ocul Pharmacol Ther. 1997 Jun;13(3):269-76.
(0114) 本明細書で記述されている芳香族陽イオンペプチドは、疾患の予防あるいは治療に有益である。特に、本発明の開示は、糖尿病性黄斑浮腫といった眼科領域の疾患あるいは障害のおそれ (あるいはかかりやすい状態) を予防および治療する方法を提供する。従って、この方法は、効果的な量の芳香族陽イオンペプチドを必要とする対象者に投与することにより、対象者の眼科領域の予防および/あるいは治療を提供するものである。例えば、眼科領域の疾患あるいは障害に寄与するひとつまたは複数の要因の改善に努めるために芳香族陽イオンペプチド化合物を対象者に投与することができる。
(0115) 本発明の技術の一局面には、治療目的での対象者の糖尿病性黄斑浮腫といった眼科領域の疾患を緩和させる方法が含まれる。治療用途においては、当該疾患や障害の症状が疑われたり既に羅患している対象者に、当該疾患の合併症および疾患進行過程での病理学的表現型を含む当該症状を治療するに十分な量、または少なくとも部分的に阻止するための量の化合物あるいは薬剤が投与される。この場合、本発明の開示は、眼科領域の疾患を患う個人を治療する方法を提供する。
(0116) ある態様においては、本発明の技術は、芳香族陽イオンペプチドを投与することにより、哺乳類動物における眼科領域の特定の疾患や障害を治療または予防する方法を提供するものである。すなわち、この技術の当該芳香族陽イオンペプチドは、眼科領域の次のような疾患および障害例を予防または治療するのに有益であるが、これらのみには限定されない：
(0117) 瞼、涙器系および眼窩の障害には、例えば、麦粒腫 (「ものもらい」または「めぼ」)；霰粒腫；眼瞼炎；眼瞼内反と睫毛乱生；外反症；兎眼；眼瞼皮膚弛緩症；眼瞼下垂症；瞼の黄色板症；リーシュマニア症、ロア糸状虫症、オンコセルカ症、シラミ寄生症での瞼の寄生虫感染；ニキビダニ属種が原因の瞼の皮膚炎；ヘルペスウィルス性 (単純疱疹) 感染症、ハンセン病、伝染性軟ゆう腫、結核、イチゴ腫、帯状疱疹での瞼の合併症；膿痂疹、涙腺炎、流涙、甲状腺異常の眼球突出での瞼の合併症が含まれるがこれらのみには限定されない。
(0118) 結膜障害には、例えば、翼状片；下位結膜出血；例えば、アカントアメーバ、小胞 (急性)、クラミジア、ジフテリア、淋菌、出血性 (急性) (感染性)、ヘルペスウィルス性 (単純疱疹) 、髄膜炎菌、ニューカースル、帯状疱疹が原因/の種類の結膜炎が含まれるが、これらのみには限定されない。
(0119) 強膜、角膜、虹彩、毛様体の障害には、例えば、強膜炎；角膜炎；角膜潰瘍；角膜摩滅；雪盲；網膜異常眼；タイゲソン表層性点状角膜炎；角膜新血管形成；フックスのジストロフィー；円錐角膜；乾性角結膜炎；虹彩炎；ブドウ膜炎；交感性眼炎が含まれるが、これらのみには限定されない。
(0120) レンズの障害には白内障が含まれるが、これのみには限定されない。
(0121) 脈絡膜と網膜の障害には、例えば、脈絡網膜性炎症；焦点性、幡腫性、また詳細不明の脈絡網膜性炎症 (例：脈絡網膜炎、脈絡膜炎、網膜炎、網膜脈絡膜炎)；滲出性網膜症；後部毛様体炎；原田病；詳細不明の脈絡網膜性炎症が含まれるが、これらのみには限定されない。
(0122) 脈絡膜のその他の障害には、例えば、脈絡網膜瘢痕；後極 (炎症後) (外傷後) の黄斑部瘢痕；太陽性網膜症；脈絡膜退化 (例：萎縮、硬化)；血管様線；遺伝脈絡膜ジストロフィー；先天性脈絡膜欠如；ジストロフィー (例：脈絡膜性 (中心性輪紋状脈絡膜萎縮)(一般的) 周囲乳頭))；脳回転状萎縮症；脈絡膜；オルニチン血症；脈絡膜出血と脈絡膜破裂 (それ以外は指定され排除されない)；脈絡膜剥離が含まれるが、これらのみには限定されない。
(0123) 網脈絡膜炎には、例えば、梅毒性、晩発型、トキソプラズマ、結核性のものが含まれる。
(0124) 網膜離解および断裂には網膜分離症が含まれる。
(0125) 網膜のその他の障害には、例えば、網膜脈管閉塞、高血圧性網膜症、糖尿病性網膜症、網膜の非炎症性破損を意味する網膜症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性、網膜上膜、末梢性網膜退化、遺伝網膜ジストロフィー、色素性網膜炎、網膜出血、網膜層分離、黄斑浮腫、網膜障害 (不特定) が含まれるが、これらのみには限定されない。
(0126) 緑内障といった網膜神経障害。
(0127) 硝子体と球体の障害には、例えば、飛蚊症が含まれるが、これのみには限定されない。
(0128) 視神経および視覚路の障害には、例えば、レーバー氏遺伝視覚神経障害と視神経円板ドル−ゼンが含まれるが、これらのみには限定されない。
(0129) 眼筋、両眼運動、視力調節と屈折の障害には、例えば、斜視 (寄り眼/うつろ目/白目)、眼不全麻痺、漸進性外部眼筋麻痺、内斜視、外斜視、屈折と視力調節の障害 (例：遠視 (遠眼)、近視 (近眼)、乱視、不同視、老眼)、内部眼筋麻痺が含まれるが、これらのみには限定されない。
(0130) 視力障害および視覚消失には、例えば、視力薄弱 (弱視)、レーバー氏先天性黒内障、暗点 (盲点)、失明、色覚異常、色盲/全色覚異常、夜盲症 (鳥目)、盲目、河川盲目症、小眼球症/欠損症が含まれるが、これらのみには限定されない。
(0131) 眼球および隣接器官のその他の障害には、アーガイル‐ロバートソン氏瞳孔が含まれるが、これのみには限定されない。角膜真菌症、眼球乾燥、レスタシス (restasis)、無虹彩症といった他の疾患。
(0132) ある態様においては、芳香族陽イオンペプチドを対象者に投与することにより、糖尿病性網膜症を治療または予防する方法を提供するものである。糖尿病性網膜症は、毛管の毛細血管瘤と点出血により特徴化される。その後、細小血管障害により棉花状白斑が網膜上に形成される。更に、血管透過性亢進の増大が起因して、糖尿病網膜症に網膜浮腫および/あるいは硬性白斑が併発する場合がある。その結果、新生血管が形成され、硝子体で成長した結合組織の牽引によって網膜剥離が引き起こされる。虹彩ルベオーシスと新脈管の緑内障が発生する場合もあり、これらが失明につながる場合がある。糖尿病性網膜症の症状には、読字困難、かすみ目、単眼視力の突然の喪失、光明周辺に輪を見る、暗点を見るおよび／または、閃光を見ることが含まれるが、これのみには含まれない。
(0133) ある態様においては、芳香族陽イオンペプチドを対象者に投与することにより、白内障を治療または予防する方法を提供するものである。白内障は、自然な硝子体の透明性の低減によって特徴付けられる、先天性または後天性の疾患である。白内障患者には、硝子体表面の曇り、硝子体内部表面の曇り、および/あるいは硝子体の腫脹を含む症状のひとつあるいは複数が現れるが、これらのみには限定されない。先天性白内障に関連する疾患の典型例は、擬似白内障、膜白内障、冠状動脈白内障、薄板状白内障、円孔白内障と繊維状白内障である。後天性白内障に関連する疾患の典型例は、老人性白内障、二次白内障、褐色白内障、併発白内障、糖尿病性白内障および外傷性白内障である。後天性白内障はまた、感電、放射線、超音波、医薬品、全身性疾患、栄養障害により誘起される。先天性白内障は更に術後白内障を含む。
(0134) ある態様においては、芳香族陽イオンペプチドを対象者に投与することにより、網膜色素変性を治療または予防する方法を提供するものである。網膜色素変性は、桿体細胞あるいは円錐体細胞の損傷によって特徴付けられる。網膜色素変性を羅患する患者には典型的には、網膜に暗線が存在する。網膜色素変性を羅患する患者にはまた、頭痛、四肢の麻痺や疼き、閃光、および/あるいは視覚変化を含む様々な症状が存在するが、これらのみには限定されない。これについては、例えば、Heckenlively ら、Clinical findings and common symptoms in retinitis pigmentosa. Am J Ophthalmol. 105(5): 504-511 (1988) を参照されたい。
(0135) ある態様においては、芳香族陽イオンペプチドを対象者に投与することにより、緑内障を治療または予防する方法を提供するものである。緑内障は、眼内圧の上昇のために視力減少につながることにより特徴付けられる遺伝的疾患である。緑内障は、創傷、手術、その他の構造的形成異常といった、患者に既存する眼科領域の不調から発症することがある。緑内障はどの年齢でも発症する可能性があるが、しばしば加齢に伴い進行し失明につながることがある。緑内障患者は典型的には、21 mmHg を超える眼内圧を示す。しかしながら、正常眼圧緑内障では、緑内障性変性が視野や視神経乳頭で認められ、そのような眼内圧、すなわち 21 mmHg を超える値が認められない場合がある。緑内障の症状には、かすみ目、極度の眼の痛み、頭痛、光周辺の後輪、吐き気および/あるいは嘔吐が含まれるが、これらのみには限定されない。
(0136) ある態様においては、芳香族陽イオンペプチドを対象者に投与することにより、黄斑変性を治療または予防する方法を提供するものである。黄斑変性は典型的には、加齢に付随する疾患である。一般的な黄斑変性には、滲出性、乾性、そして非加齢性の黄斑変性が含まれる。乾性黄斑変性は、全体の約80〜90％を占め、萎縮性、非滲出性、ドルーゼノイド黄斑変性のいずれかとして知られる。乾性黄斑変性により、ドルーゼンが典型的には網膜色素上皮の下部に蓄積する。ドルーゼンが黄斑の光受容体の機能に障害を及ぼす場合に失明に至る。乾性黄斑変性の症状には、視覚の歪曲、中心視覚の歪曲、明暗歪曲、および/あるいは色覚変化が含まれるが、これらのみには限定されない。乾性黄斑変性は徐々に進行する失明に至る可能性がある。
(0137) 滲出性黄斑変性はまた、新血管形成、網膜下新血管形成、滲出性変性、円盤状変性として知られている。滲出性黄斑変性の場合、異常な血管が黄斑の下に成長する。この血管から黄斑に体液が漏出し、光受容体を損傷する。滲性黄斑変性は急速に進行し中心視覚を損傷する。滲出および乾性のいずれの黄斑変性も同一の症状を示す。非加齢性の黄斑変性はしかしながら、稀であり、遺伝、糖尿病、栄養失調、外傷、感染、その他の要因に関連する。非加齢性の黄斑変性にはまた、視覚の歪曲、中心視覚の歪曲、明暗歪曲、および/あるいは色覚変化が含まれるが、これらのみには限定されない。
(0138) ある態様においては、芳香族陽イオンペプチドを対象者に投与することにより、黄斑障害、特に糖尿病黄斑浮腫を治療または予防する方法を提供するものである。
糖尿病と黄斑障害
(0139) 糖尿病は現在、米国人口の2580万人 (8.3%) が羅患している。2005〜2008年では、年齢40歳以上の糖尿病患者 420万人 (28.5%) に糖尿病性網膜症があり、内 655,000人 (糖尿病患者の4.4%) が重度の視力低下に至るほど進行した糖尿病性網膜症を羅患している。インスリン非依存型糖尿病の最近の913症例においては、糖尿病患者の 8% (600,000名の患者) に黄斑障害が認められると報告されている。糖尿病患者数が増加するに従い、糖尿病黄斑症障患者もまた増加すると推定される。
(0140) 糖尿病は、年齢20〜74歳成人の失明の主要原因である。糖尿病黄斑症は、糖尿病網膜症と合わせ、糖尿病患者おける網膜疾患のひとつとして重要であると考えられる。糖尿病黄斑症は、黄斑浮腫、虚血性黄斑症、網膜色素上皮症と黄斑牽引とに分類される。糖尿病網膜症治療の目的は失明予防 (視力喪失) であり、一方糖尿病黄斑症治療の目的は、視力低下の防止および改善である。
(0141) 黄斑は、中心視力 (最も鮮鋭で高い視力)を得るために、網膜の他の部分とは形状が著しく異なり、高濃度の感色錐体細胞を有する特殊形状 (内網状層と内核層の不在) をなす。従って、臨床的に問題となる中心視力の低下は黄斑障害が原因である。光凝固術と硝子体茎切除術の開発により、網膜障害が原因の失明はほぼ予防可能となったが、黄斑障害に対しては満足の行く結果は得られていない。従って、黄斑障害には網膜症治療とは異なる治療法が必要である。これはまた、黄斑障害患者の多くが網膜症は羅患していないことから注目に値する。実際、糖尿病網膜症治療としての汎網膜光凝固は、糖尿病黄斑症での黄斑浮腫を悪化させ、例えば視力を更に低下させると推定されている。従って、治療は、視力を維持し改善することにより、患者の生活の質 (QOL) の改善に向かわせることに焦点が当てられる。
(0142) 網膜血管内皮細胞と網膜色素上皮細胞で構成される血液網膜柵の漏れにより引き起こされる黄斑浮腫は、黄斑障害の約90%を占め、黄斑障害での視力低下の主要原因である。この視力低下は失明には至らないが、通常の生活が困難となる視覚障害と意味する極度の視力低下を引き起こす。医療技術の進歩により平均寿命が延びたことにより、視力低下はQOLを考慮する上では無視することのできない重大問題である。
(0143) 視力低下の防止あるいは改善のための治療法には、光凝固術、硝子体切徐および化学療法が含まれる。光凝固術および硝子体切徐は、関連臨床研究において効果が評価されているが、黄斑浮腫に対する効果と安全性は確立されていない。実際、血管新生緑内障と悪化中の浮腫の合併症が起こる臨床例がある。治療にはステロイド (消炎作用) および炭酸脱水酵素 (炭酸デヒドラターゼとも呼ばれる) 反応抑制剤 (抗緑内障作用) が対症療法に使用されるが、それらの効果は確立されておらず、長期間にわたる投与により副作用が起こり、従って糖尿病のような慢性疾患での連続使用は一般的には好ましくない。
糖尿病性黄斑浮腫
(0144) 上述にように、糖尿病網膜症 (DR) および糖尿病性黄斑浮腫 (DME) は、糖尿病患者でよく見られる微小血管の合併症であり、視力が突然衰弱し、究極的には失明することがある。DR の進行期は虚血に続発する異常な網膜血管の増加が特徴である。酸素付加した血液を低酸素網膜に供給しようと試みるとこれらの血管は成長する。DR 進行中は随時、糖尿病患者にはまたDMEもまた進行する可能性があり、黄斑領域の腫大による網膜の肥厚が認められる。拡張した透過性の過剰な毛細管と、毛細血管瘤から血漿が漏出するために血液網膜関門の損傷するとDMEが起こる。
(0145) 黄斑浮腫は糖尿病ではよく見られる。糖尿病患者が黄斑浮腫を羅患する障害でのリスリは約10%である。米国内のみでもほぼ百万人が現在DMEを羅患しており、毎年約 300,000 件の症例が起こっている。
(0146) DME は、糖尿病網膜症 (網膜疾患) の程度と密接に関係する。DME は、糖尿病網膜症患者の失明の主要原因である。高血圧 (血圧の上昇) と体液鬱滞もまた、血管から網膜に体液を輸送する微小血管内の静圧力を増加させる。糖尿病における体液鬱滞の通常原因は、尿中のタンパク質 (たんぱく尿)の消失を伴う腎臓疾患である。
(0147) 糖尿病黄斑障害 (DME) では、黄斑の血管からの体液の漏出が原因で、糖尿病患者の網膜肥大が現れる。これらの漏出により、黄斑が厚く肥大し、視力歪曲が進行する。肥大が失明につながる可能性はあるが、この原因が中心視力を喪失させることがある。黄斑浮腫が拡大すると、中心視野の中央あるいは周辺にぼやけが発生する。糖尿病性黄斑浮腫からの視力低下は何ヶ月間も進行する場合があり、焦点が明確に定まらなくなる。
(0148) DME は、(1) 脈管異常 (主に毛細血管瘤) が原因となり体液が漏出する焦点性黄斑浮腫および (2) 網膜で拡張した毛細管に起因するびまん性黄斑浮腫の2種類に分類される。糖尿病性黄斑浮腫および周辺部網膜虚血との相関関係が特定されている。
(0149) 上述のように、DME治療の現在の標準療法のひとつはレーザー光凝固術である。レーザー光凝固術は、レーザーを使用して漏出が認められる血管を焼灼または浮腫を減少させるよう一定の模様を焼くという網膜治療である。この治療法には、周辺視野および夜間視野の一部喪失を含む、好ましくない副作用がある。これの副作用の結果または視野改善の希望から、網膜専門医はDME治療用として、コルチコステロイド、血管内皮成長因子 (抗-VEGF) 剤の注射を含む、FDA未認可の薬理学的治療にレーザー光凝固術を補足してきた。これらの療法はいずれも、療法効果を維持するために複数回の注射が必要であることにより限定される。
(0150) 黄斑障害、特に糖尿病性黄斑浮腫の治療、予防、改善に有益な方法および組成物が本明細書で開示されている。ある態様においては、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 あるいはアセテート塩またはトリフルオロ酢酸塩といった薬学的に許容される塩の芳香族陽イオンペプチドの療法的に効力のある量を、黄斑障害を患うまたはリスクがある、および/あるいは糖尿病性黄斑浮腫を患うまたはリスクがある患者に投与する。ある態様においては、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 あるいは薬学的に許容される塩の当該芳香族陽イオンペプチドは、例えば、点眼薬、クリーム、ローションあるいは軟膏として、経口、非経口、局所、あるいは眼に直接投与する。
(0151) ある態様においては、脈絡膜血管新生を治療あるいは予防するために、芳香族陽イオンペプチドが対象者に投与される。脈絡膜血管新生 (CNV) は、眼の脈絡膜層に血管が新たに形成することで特徴付けられる疾患である。新たに形成される血管は脈絡膜で成長して、ブルッフ膜を通過し、網膜下腔に到達する。CNV は視力障害あるいは完全失明に至る場合がある。CNV の症状には、ちらつき、光の点滅、単眼または両眼に灰色の点が発生、かすみ目、視覚歪曲および/あるいは視力喪失が含まれるが、これらのみには限定されない。
(0152) ある態様においては、網膜変性を治療あるいは予防するために、芳香族陽イオンペプチドが対象者に投与される。網膜変性は、網膜の破壊に関係する疾患である。網膜組織は、動脈や静脈の閉塞、糖尿病網膜症、未熟児網膜症および/あるいは後水晶体線維形成といった様々な理由によって劣化することがある。網膜の劣化には、一般的に網膜分離症、格子様変性が含まれており、、進行性の黄斑変性症に関連しています。網膜の劣化の症状には、視力障害、視力喪失、夜盲、トンネル視、周辺視野の損失、網膜剥離および/あるいは光感受性が含まれるが、これらのみには限定されない。
(0153) ある態様においては、酸素誘導網膜症を治療あるいは予防するために、芳香族陽イオンペプチドが対象者に投与される。酸素誘導網膜症 (OIR) は、微小血管の変性により特徴付けられる疾患である。OIR は、未熟児網膜症の研究のために確立されたモデルである。OIR は異常な新血管形成の結果発生する脈管細胞損傷に伴う。微小血管の変性は、OIRに伴う身体的変化の原因となる局所貧血につながる、.. 酸化ストレスはまた、OIRの脈管削除で重要な役割を担う。周皮細胞、平滑筋細胞、血管周囲星状細胞はしかしながら、一般的に過酸化損傷に耐性がある。例えば、Beauchamp ら、Role of thromboxane in retinal microvascular degeneration in oxygen-induced retinopathy, J Appl Physiol. 90: 2279-2288 (2001) を参照されたい。未熟児網膜症を含む OIR は概して無症候(性) である。しかしながら、異常な眼球運動、交差目、強度の近視および/あるいは白真皮は、OIR あるいは未熟児網膜症の兆候である可能性がある。一局面においては、例えば、糖尿病および代謝性障害による眼性虚血/再灌流損傷あるいは脈管合併症を伴う微小血管性損傷眼球といった、微小血管性機能障害を治療あるいは予防するために、芳香族陽イオンペプチドが対象者に投与される。ある態様においては、芳香族陽イオンペプチドは、眼性虚血を伴うリフロー現象が原因の微小血管機能障害を治療あるいは予防するために対象者に投与される。
一般
(0154) 加齢性黄斑変性(AMD)に付随する、糖尿病性黄斑浮腫 (DME) および脈絡膜血管新生 (CNV) は、先進工業国における視力喪失の主要原因である。
(0155) 黄斑浮腫 (ME)。黄斑とは、網膜の無血管中心部分で円錐体が密集する小部分であり、鮮鋭昼間色彩視力を司る。体液が黄斑に漏れて入り、黄斑の膨張や視力のぼやけの原因となることがある。
(0156) 糖尿病性黄斑浮腫 (DME)。糖尿病性黄斑浮腫は米国内での新たな失明の主要原因であり、臨床的に有意な黄斑浮腫 (CSME) は、この視力喪失の大きな原因である。進行した糖尿病網膜症（増殖性網膜症）の羅患者の約50%にまた黄斑浮腫があり、また糖尿病性黄斑浮腫は糖尿病網膜症からの視力低下の主要原因である。
(0157) DME (ICD-9-CM 362.07) は、広く焦点黄斑浮腫およびびまん性黄斑浮腫に分類される。これら2種類は治療が異なるために、重要である。焦点黄斑浮腫は、主に小動脈瘤である、体液を漏出させやすい脈管異常の病巣が原因であり、一方、びまん性黄斑浮腫 (DRT) は網膜全域の網膜微小血管の漏出が原因である。光干渉断層撮影 (OCT) という眼科技術によって、DMEに対し、DRT (網膜厚の拡散)、嚢腫状組織黄斑浮腫 (CME)、後部硝子様体牽引 (PHT)、漿液性網膜剥離 (SRD)、および牽引性網膜剥離 (TRD) なる、5つの形状模様が記述される。一連のDME 患者119人の 164 個の眼の 97% が DRT そして 55% が CMEを、他のパターンがそれぞれ 13% 未満であった。この結果は、糖尿病におけるMEはしばしば CME の模様をとるという観察と一致する。すべてのパターンに対し、増大した網膜肥厚は悪化視力と有意に相関がある (p < .005)。
(0158) DME 病態生理学。DMEは、糖尿病と関連する微小血管異常、特に網膜毛細管の漏出および毛細管を支持する周皮細胞の個数の縮小から生じると信じられている。脈管透過性要因としても知られている血管内皮成長因子(VEGF) に生成の刺激に、肥大につながる低酸素が仮定される。
(0159) DME 治療。糖尿病網膜症早期治療研究 (ETDRS) により、糖尿病性黄斑浮腫 (DME) の治療に対するガイドラインが設定された (7)。設定以来、糖尿病性黄斑浮腫の標準治療はこれまでは、糖尿病管理および合併症試験 (DCCT: Diabetes Control and Complications Trial)で示された血糖管理、英国糖尿病臨床研究 (UKPDS: United Kingdom Prospective Diabetes Study)で示された最適血圧管理、および黄斑焦点/格子レーザー光凝固術であった。ETDRS においては、レーザー光凝固術は糖尿病性黄斑浮腫からの中程度の視力喪失のリスクは 50% (初期治療後 3年間で 24% から 12% ) 低減した。.過去数年間において、DME治療のための抗血管内皮細胞増殖因子 (VEGF) 療法の使用に焦点が当てられた研究が開始された。現在、DME 用として認可された医薬品は存在しないが、臨床試験は実施中である。現在、積極的に導入あるいはまだ導入されていない臨床試験に51件のDME 研究がリストされている。それらの大部分は、抗-VEGF あるいは抗炎症 (ステロイド) である。
(0160) 嚢胞様黄斑浮腫 (CME)。CMEは 一種のMEの形態的記述であり、通常、網膜血管が関与する多くの眼内疾患に共通する最終経路である。
(0161) CME 定義。(ICD-9-CM 362.53) は、中心窩領域での嚢胞状の変化が関与する黄斑浮腫の任意の種類である。CME は、良く見られる無痛の疾患であり、通常は視力のぼやけあるいは視力歪曲を伴う。この症状にはしばしば、白内障手術、加齢黄斑変性 (AMD)、ブドウ膜炎、眼球損傷、糖尿病 (DME)、網膜静脈閉塞あるいは薬物毒性といった、さまざまな眼科領域の疾患が伴う。
(0162) CME 病理学。CME は、ぶどう膜炎あるいは白内障手術後に伴い、VEGF、プロスタグランジン、活性炎症性細胞から放出物といったサイトカインが起因することがほとんどである。他の原因には、糖尿病 (DME)、滲出型であるが乾燥型ではなく、本来漏出し易い脈絡膜新生血管 (CNV) の成長を引き起こす AMDが含まれる。網膜静脈閉塞症 (RVO) はまた、血管内静圧の増加の結果、CME も引き起こす可能性がある。
(0163) CME 治療。例えば、DME あるいは滲出性AMD などの基礎疾患を参照されたい。
(0164) 加齢黄斑変性(AMD、ARMDとも略称される). AMD は、全AMD症例の85〜90%を占める「乾燥型」(ICD-9-CM 362.51)、および全症例の10〜15% を占める「滲出型」 (ICD-9-CM 362.52) という2種類に分類される。乾燥型 AMDは、黄斑の光受容細胞の機能がゆっくりと喪失する結果発症し、中心視力が徐々にぶれる。乾燥型 AMD は、早期、中期、進行期の3段階を経過する。早・中期は、加齢に従い増加する網膜下の黄色の沈着物である「ドルーゼン」を伴う。しかしながら、ドルーゼンが病原学的にAMDに関係するかは不明である。
(0165) 乾燥型 AMD の病理学。乾燥型 AMD の原因は不明である。
(0166) 乾燥型 AMD の治療。中期から進行期 (滲出型AMD) への経過を予防あるいは遅延させるために、臨床試験において有益と立証された「AREDS ビタミン」と呼ばれる特別混合ビタミンが使用される。
(0167) 「滲出型」 AMD。滲出型 AMDは乾燥型AMDが進行したものと考えられる。この疾患は中心視力に影響し、直線は明らかに「波状」に見え、比較的急速に視力喪失が進行する可能性もある。滲出型 AMD の病理学。この疾患は通常、網膜後部の脈絡膜新生血管がブルッフ膜を貫通し黄斑の下で成長し始めるときに発症する脈絡膜血管新生 (CNV) を伴う。これらの漏出しやすい新生血管からの体液によって、黄斑が眼球後部の正常位置から上昇する。
(0168) 滲出型 AMD の治療。滲出型 AMD は、レーザー手術、光力学的治療および抗炎症剤 (ステロイド) と硝子体に注入される抗VEGF剤の眼球投与によって治療される。2010年に、ラニビズマブ (ルセンティス) およびペガプタニブ (マクジェン) が、滲出型 AMD に対してFDAにより認可され、RVOに対してラニビズマブが認可された。抗VEGF抗体の別型であるベバシズマブ (アバスチン) が滲出型 AMD に対して適用外で使用され、ラニビズマブに類似の効用があることが示された。これら両方の薬剤はまた、DMEにも匹敵する効用を示すことが報告された。DMEに対して認可された薬剤は存在しないが、DME に対し抗VEGF 抗体療法を用いたさまざまな臨床試験が現在実施されている。
(0169) 眼球の血管疾患には、以下のような多くの形態が含まれるが、これらのみには限定されない。
(0170) 糖尿病：網膜の毛細血管は糖尿病の影響を受け、その結果、血液とおよび血清滲出物が漏出する。毛細血管もまた閉塞 (毛細血管脱落) することがあり、その結果、網膜への循環が粗悪になる。網膜への循環が損われる症状は、糖尿病網膜症として知られている。進行した糖尿病性眼疾患においては、新生のもろい血管が網膜内に生成され、網膜あるいは眼中心部 (硝子体) での出血が生じる場合がある。
(0171) 側頭動脈炎：網膜を栄養する重要な血管に影響を及ぼす傾向を有する血管炎症。側頭動脈炎が抑制されないと、網膜中心動脈が影響を受け、突然として永久的な視覚喪失が発生する。
(0172) 枝静脈閉塞：網膜から血液を排出する主血管からの分岐の血栓閉塞。視力障害の度合いは閉塞の範囲および長さに依存する。
(0173) 中心静脈閉塞：網膜から血液を排出する主要血管の閉塞。この障害はしばしば高血圧に伴う。
(0174) 網膜中心動脈閉塞症：網膜に血液を供給する主要動脈の閉塞。
(0175) 糖尿病または代謝疾患が原因の血管障害
(0176) 糖尿病は血管系を損傷させることが知られている。糖尿病から発症する血管合併症は、米国内の失明、腎臓障害、循環器系障害の主要原因である。それにも関わらず、米国人2600万人に影響を及ぼしている糖尿病と、病的な血管を結びつける生理学的機構に対する理解は乏しい。最近の研究によると、内皮機能不全が糖尿病および関連代謝疾患での致命的な血管合併症につながることが示された。Wei ら、De novo lipogenesis maintains vascular homeostasis through endothelial nitric-oxide synthase (eNOS) palmitoylation. J Biol Chem. 2011 Jan 28;286(4):2933-45 を参照させよ。NOS は、インスリンによって調節される酵素である、脂肪酸シンターゼ (FAS) により合成されるパルミチン酸エステルを必要とすることが判明した。FASがないと、NOSは 内皮に適切に到達しないのである。糖尿病患者は、インスリン欠乏あるいは耐性のためFASが低レベルであり、このFAS欠乏が血管損傷に対する脆弱性が増大する原因である。そのため、障害のある脂質生成を通じた生物学的利用能の中断は、栄養状態および体組織修復を統合する新規機構であり、糖尿病性血管疾患に貢献し得る。
(0177) 虚血/再灌流に関係する微小血管損傷に起因する血管損傷
(0178) 実施例において、本発明の技術は、治療上効果的な量の芳香族陽イオンペプチドをそれを必要とする対象者に投与することにより、哺乳類動物の眼性虚血/再灌流損傷の治療あるいは予防に関する。ある態様においては、本発明は、眼性虚血/再灌流に続く眼微小血管 (例：毛細血管) の損傷の治療、予防あるいは改善に有用である方法に関するものである。
(0179) 一局面においては、本発明の技術は、例えば、D-Arg-2’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 あるいは薬学的に許容される塩といった、本技術の治療上効果的な量の本技術の芳香族陽イオンペプチドをそれを必要とする対象者に投与することにより、哺乳類の対象者に眼組織の微小血管損傷を治療あるいは予防する方法を提供する。ある態様においては、当該方法は更に、対象者の血管再生術を実施するステップから構成される。ある態様においては、眼微小血管の損傷/負傷には、閉塞、弱化、結果として漏出を起こす断裂、破損、および/あるいは新生血管の拡大が含まれるが、これらのみには限定されない。ある態様においては、当該哺乳類動物対象者は、眼性虚血を羅患している、あるいは罹患するおそれがある。ある態様においては、眼球組織に付随する再流がない解剖学的領域のおそれ、あるいはその領域から疾患を患う。ある態様においては、当該再流がない解剖学的領域には、対象者の微小血管の断裂あるいは閉塞がある。ある態様においては、当該対象者には、眼性虚血前に本発明の技術である芳香族陽イオンペプチドが投与される。ある態様においては、当該対象者には、眼性虚血後に本発明の技術である芳香族陽イオンペプチドが投与される。
(0180) ある態様においては、対象者には、血管再生術実施前に、当該芳香族陽イオンペプチドが投与される。別の態様においては、当該対象者には血管再生術実施後に、当該芳香族陽イオンペプチドが投与される。別の態様においては、当該対象者には血管再生術実施の間、そして後に、当該芳香族陽イオンペプチドが連続投与される。また別の態様においては、当該対象者には血管再生術実施の前、間そして後に、当該芳香族陽イオンペプチドが連続投与される。
(0181) ある態様においては、対象者には、血管再生術実施後、少なくとも3時間、少なくとも5時間、少なくとも8時間、少なくとも12時間、あるいは少なくとも24時間、当該芳香族陽イオンペプチドが投与される。ある態様においては、当該対象者には、血管再生術実施後、少なくとも8時間経過後、少なくとも4時間経過後に、少なくとも2時間経過後、少なくとも1時間経過後、少なくとも10分経過後に当該芳香族陽イオンペプチドが投与される。
(0182) 各種実施例においては、対象者は 眼梗塞、脳梗塞を羅患している、あるいは血管再生術を必要とする。ある態様においては、血管再生術により眼球摘出される。ある態様においては、血管再生術により、1種類あるいは複数種類の血栓溶解剤が投与される。ある態様においては、当該1種類あるいは複数種類の血栓溶解剤が、組織プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、プラスミノゲンのアシル化物、プラスミンのアシル化物、そしてアシル化ストレプトキナーゼ・プラスミノゲン複合体から成る群から選択される。
(0183) 一局面において、本発明は、眼科領域の疾患のひとつまたは複数の兆候あるいは兆しを変調する芳香族陽イオンペプチドを対象者に投与することにより、当該対象者の眼科領域の障害を予防する方法を提供する。眼科領域の障害に対してリクスがある対象者は、例えば、本明細書で記述される、診断あるいは予知分析の任意の組み合わせにより特定することができる。予防措置においては、疾患や不調に影響されやすい、あるいはそうでなければリスクがある対象者に、当該リスクの排除または低減、重篤度の軽減、あるいは、疾患の生化学的、病理組織学的そして/または行動的症状、当該疾患進行中に示される合併症および病理学的表現形質を含み、疾患発現を遅延するために十分な量の芳香族陽イオンペプチドの医薬組成物あるいは薬剤を投与する。異常性で特徴化される症状の発現前に、そのような疾患や障害が予防される、あるいはその進行が遅延されるよう芳香族陽イオンの投与が実施される。例えば、ミトコンドリア機能の向上または改善あるいは酸素障害を低減に作用する芳香族陽イオンペプチドは、異常性の種類に依存して、対象者を治療するために使用することができる。適切な化合物を本明細書で記述されるスクリーニング分析に基づいて決定することができる。
(0184) 神経変性疾患または障害を予防または治療するための芳香族陽イオンペプチドの経眼投与。一局面においては、当該技術には、一対象者の神経変性疾患または障害を予防または治療するための治療上有効な量の本発明の1つまたは複数の芳香族陽イオンペプチド (例：D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 そして/または薬学的に許容可能なその塩) をそれを必要とする対象者に経眼投与を利用する方法を含む。ある態様においては、投与の眼経路は、それを必要とする一対象者の眼球組織への投与のために適切に調剤された本発明の芳香族陽イオンペプチドの局所適用である。治療用途においては、当該疾患あるいは障害の疑いあるいは既に羅患している対象者へ当該疾患または障害の症状を治療あるいは少なくとも部分的阻止するのに十分な量の合成物または薬剤が投与される。その場合、本発明の開示により、神経変性疾患あるいは障害を患う個人を治療する方法を提供する。本発明の方法はまた、任意の神経疾患あるいは障害に伴う酸化的損傷を低減するためにも使用することができる。当該神経変性疾患は、中枢および末梢神経系の任意の細胞、組織あるいは器官に影響を及ぼす。当該細胞、組織あるいは器官の例には、脳、脊髄、ニューロン、ガングリオン、シュワン細胞、星状細胞、乏枝神経膠細胞と小膠細胞が含まれる。
(0185) 神経変性障害は、卒中、あるいは外傷性脳損傷または脊髄損傷といた急性障害の場合があり得る。別の態様においては、神経変性疾患あるいは障害は慢性神経変性障害の場合があり得る。慢性神経変性障害においては、フリーラジカルが例えばタンパク質を損傷させる。当該タンパク質の一例は、アミロイドβタンパク質である。自由基による損傷に伴う神経変性疾患には、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症 (ルー・ゲーリック病としても知られている) が含まれる。
(0186) ある態様においては、本発明の技術により、哺乳類動物において、芳香族陽イオンペプチドを経眼投与することにより、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症 (ALS) といった特定の神経変性疾患を治療あるいは予防する方法が提供される。
(0187) 芳香族陽イオンペプチドに基づく療法の生物学的効果の決定。様々な実施例において、適切な生体内外分析が実施され、特定の芳香族陽イオンペプチド に基づく治療およびその投与が治療を意図するのかが決定される。様々な実施例においては、生体外分析は、対象者に障害に関与する代表的細胞を用いて実施され、与えられた芳香族陽イオンに基づく治療がこの好ましい効果を当該細胞に及ぼすかが決定される。療法に使用される化合物は、ヒト対象者体での試験の前に、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ラビット、その他の動物を含め、これらのみには限定されない適切な動物モデルで試験することが可能である。同様に、生体内分析に対しては、ヒト対象者での試験の前に従来知られている任意の動物モデル系を使用することが可能である。ある態様においては、眼科領域の障害に伴う症状を示す対象者に芳香族陽イオンペプチドを投与すると、以下の1つあるいは複数の症状が改善される。
投与形態および効果的投与量
(0188) ペプチドによって細胞、器官あるいは組織を接触される従来技術の当業者に周知である如何なる方法を使用することが可能である。適切な方法には、試験管内、生体外、生体外方法が含まれる。生体内方法には典型的に、上記のような芳香族陽イオンペプチドを哺乳類動物、好ましくはヒトに投与することが含まれる。生体内治療を用いると、効果的な量 (好ましい治療効果を有する量) の当該芳香族陽イオンペプチドが対象者に投与される。投与量および投与部位は、対象者の眼科領域の障害の程度、例えばその治療指数など使用された特定の芳香族陽イオンペプチドの特性、対象者、および対象者の病歴などに依存する。
(0189) 当該効果的量は、臨床前試験および臨床試験中に医師および臨床研究者に周知の方法によって決定されよう。本発明の方法に有益なペプチドの有効量は、医薬組成物においては好ましくは、医薬組成物を投与する周知の方法の任意回数、必要とする哺乳類動物に投与することができる。ある態様においては、当該ペプチドは全身投与される。ある態様においては、当該ペプチドは局所投与される。ある態様においては、当該ペプチドは、皮膚上、経口、経鼻、非経口的 (静脈、筋肉、腹膜または皮下) 、局所、直腸内、皮内、経皮、吸引、動脈内、大脳内、骨間内、クモ膜下腔内に、膀胱内、イオン泳動的、経眼、等で投与される。投与には、自己投与および他者による投与が含まれる。
(0190) 眼科領域への適用に対しては、効果的な量の治療芳香族陽イオンペプチドが、後眼房、鋸状縁、毛様体筋、毛様体小帯、シュレム管、瞳孔、前房、角膜、虹彩、レンズ皮質、レンズ核、毛様体突起、結膜、下傾斜筋肉、下直筋、内側直筋、網膜動脈と静脈、視神経円板、硬膜、中心網膜動脈、中心網膜静脈、視神経、渦静脈、テノン嚢、黄斑、窩、強膜、脈絡膜、上直筋、網膜を含む眼球の部位に投与される。ある態様においては、眼球の部位に投与される治療に有効な量の治療芳香族陽イオンペプチドは、濃度10-13 〜 10-6 モル、例えば約 10-7 モルである。ある態様においては、眼球の部位に投与される治療に有効な量の治療芳香族陽イオンペプチドは、濃度 10-11 〜 10-6、10-9 〜 10-6、あるいは 10-7 〜 10-6 モル、10-6 〜 10-1 モル、10-4 〜 10-1 oモル、または10-2 〜 10-1モルである。ある態様においては、眼球の部位に投与される治療に効果的な量の治療芳香族陽イオンペプチドは、濃度10-1 モルないし10 1 モルである。投与計画は、標的組織での治療濃度を維持するように最適化され、最も好ましくは、毎日あるいは毎週1回であるが、連続投与 (例：非経口注入または経皮適用) もまた含まれよう。
(0191) 本明細書で記述される当該治療芳香族陽イオンペプチドは、投与のため医薬組成物と単一物にあるいは組み合わせで統合し、本命最初で記述する障害に治療または予防に使用することができる。当該合成物は典型的に、活性剤および薬学的に許容可能な担体を含む。本明細書で使用される用語、「薬学的に許容される担体」には、生理食塩水、溶媒、分散媒体、被膜剤、抗菌剤と抗真菌薬、等張性および吸収遅延剤、等、薬学的投与と親和性を有するものが含まれる。補助的な活性剤はまた組成に含めることができる。
(0192) 医薬組成物は典型的には、意図する投与経路と和合性があるように組成される。投与経路の例には、非経口 (例：静脈、皮内、腹膜内、または皮下)、経口、吸入、経皮 (局所)、経眼、イオン泳動、経粘膜投与が含まれる。非経口、皮内、皮下投与に使用される溶液や懸濁液には次の成分が含まれ得る、すなわち、注射用の水のような無菌の希釈剤、生理食塩液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたはその他の合成溶媒；ベンジルアルコールまたはメチル・パラベンといった抗菌薬；アスコルビン酸またはナトリウム重亜硫酸塩といった酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸のようなキレート試薬；アセテート、クエン酸塩またはリン酸塩、および塩化ナトリウムまたはブドウ糖の張度調整剤といった緩衝剤である。pH は、塩酸または水酸化ナトリウムといった酸または塩基により調整することができる。非経口調整物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは多回投与バイアルに封入することができる。患者あるいは治療担当医の便宜上、投与組成物は、治療過程に必要なすべての装置 (例：薬の小びん、希釈剤びん、注射器と針) を含む一式で提供できる。
(0193) 注射可能薬物の使用に適する医薬組成物には、無菌水溶液 (水溶性) あるいは無菌の注射可能な溶液または分散液の即座の準備のための分散液と無菌の粉末を含めてよい。静脈内投与のための適当な担体には、生理的食塩水、静菌水、クレモホルELTM(米国ニュージャージー州パリスパニー所在のBASF社製)、またはリン酸塩緩衝食塩水 (PBS) が含まれる。すべての場合において、非経口投与のための合成物は無菌でなければならなく、また簡単なシリンジ可能性が存在するという意味で液体であるべきである。当該合成物は製造と保管の状況下で安定でなければならなく、例えば、バクテリアや真菌といった微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。
(0194) 当該治療芳香族陽イオンペプチド化合物には、例えば、水、エタノール、多価アルコール (例：グリセロール、プロピレングリコールと液体ポリエチレングリコール、など) 、を含む溶媒や分散媒体である担体、および適当なそれらの混合物を含めてよい。適切な流動性は、レシチンのような皮膜剤の使用により、また分散の場合は必要な粒子経の維持により、また界面活性剤の使用により、維持することができる。微生物作用の防止は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チオメルサールなどといった各種抗菌剤と抗真菌薬 によって達成可能である。グルタチオンと他の酸化防止剤は、酸化防止のために含めてよい。多くの場合、これら企業の多くは、例えば、砂糖、マンニトールなどの多価アルコール、ソルビトール、塩化ナトリウムといった等張剤を含むことが望ましい場合がある。例えば、アルミニウム・モノステアリン酸塩またはゼラチンといった吸収遅延剤を組成物に含めることによって、注射可能な組成物を長期間にわたり吸収させることが可能となる。
(0195) 上述の成分の1つまたはそれらの組合せを用いた適切な溶媒の中に活性化合物を必要量に取り入れることによって、無菌の注射可能な溶液を準備することができ、その後必要に応じて、フィルタ処理した殺菌を行う。一般的に分散液は、基本的分散媒体および必要な他の成分として上述の成分から選択されたものが含まれる無菌媒体に、活性化合物を加えることによって調合される。無菌の注射可能な溶液を調合するための無菌粉末の場合、典型的な調合方法には真空乾燥および凍結乾燥が含まれ、これらの方法により活性成分の粉末に、前段階で無菌にフィルタ処理した溶液から所望の成分を加えたものを製造することができる。
(0196) 眼科用途には、当該治療化合物が眼で使用するのに適切な、溶液、懸濁液、軟膏に組成される。一般に眼科用組成については、Mitra (編集)、Ophthalmic Drug Delivery Systems, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y. (1993)、また Havener, W. H., Ocular Pharmacology, C.V. Mosby Co., St. Louis (1983) も参照されたい。眼科医薬品化合物は局部投与のため、溶液、懸濁液、軟膏、クリーム、固体インサートに組成してよい。当該治療芳香族陽イオンペプチドの1回投与量は0.1 ng から 5000μg、1 ng から 500μg、あるいは10 ng から 100μg の配意でヒトの眼に適用することが可能である。
(0197) 局所製剤は、以下には限定されないが、眼科用液剤 (例：点眼液)、眼科用ゲルまたは眼科用軟膏、油性乳剤を含む、眼科局所投与に適した任意形状が可能である。本発明の技術の芳香族陽イオンペプチドの局所投与はまた、適切な医薬品含有層に1つまたは複数の芳香族陽イオンペプチドを含み、瞼に置かれる眼科貼付剤、ならびに1つまたは複数の芳香族陽イオンペプチドを含み、結膜嚢の上下位置に挿入される眼科インサートの使用で構成される (例えばWO0059420 を参照されたい)。
(0198) 点眼剤は、1つまたは複数の本発明技術の芳香族陽イオンペプチドを無菌の生理食塩水や緩衝液等の水溶液に溶解させることにより、あるいは使用前に粉末組成物と組み合わせることにより調剤してよい。当該点眼剤には等張化剤 (例： 食塩等)、緩衝剤 (例：ホウ酸、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等)、保存剤 (例：塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、クロロブタノール等)、濃厚剤 (例：ラクトース、マンニトール、マルトースなどの糖類、別例：ナトリウム・ヒアルロン酸、カリウム・ヒアルロン酸などのヒアルロン酸またはその塩、別例：コンドロイチン硫酸などのムコ多糖体、別例：ポリアクリル酸ナトリウム、カルボキシビニル・ポリマー、ポリアクリレート架橋体等) といった他の添加物を含めてよい。
(0199) 眼科用軟膏は、1つまたは複数の芳香族陽イオンペプチド D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 または薬学的に許容されるそれらの塩を塩基に混合させることにより調製される。眼科用軟膏に使用される塩基の例には、ペトロラタム、セレン 50、プラスチベース、マクロゴール等が含まれるが、これらには限定されない。
(0200) 代表的な眼科粘度賦活剤であって本発明の組成に使用可能なものには、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピル・セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチル・セルロース、ポリエチレングリコール300、ポリエチレングリコール400、ポリビニルアルコール、およびプロビドンが含まれる。
(0201) アルマシラート、アルギン酸塩、キサンタンガム、ゼラチン、アカシアとトラガカントゴムといった天然生成物もまた眼科溶液の粘度を増加させるのに使用することができる。
(0202) 低張性点眼剤は角膜の浮腫を引き起こし、高張性点眼剤は角膜を変形させてしまうので、張度は重要である。理想的な張度は約 300 mOsM である。張度は、この分野の専門家には周知であるRemington: The Science and Practice of Pharmacy に記述されている方法によって達成することができる。
(0203) 本発明技術の芳香族陽イオンペプチドは、ドライアイ症状の治療に有益である。本発明技術により、それを必要とする対象者のドライアイの予防、治療、改善に有効な芳香族陽イオンペプチドから構成される局所組成が提供される。
(0204) 本発明技術の芳香族陽イオンペプチドは、以下には限定されないが、例えば、糖尿病黄斑浮腫を含む黄斑障害の治療に有益である。本発明技術により、それを必要とする対象者の糖尿病黄斑浮腫の予防、治療、改善に有効な芳香族陽イオンペプチドから構成される局所組成が提供されるが、これはこの疾患のみには限定されない。
(0205) ある態様においては、以下には限定されないが、例えば、糖尿病黄斑浮腫を含む黄斑障害の治療、予防、改善のための、単回投与での等張溶液に適用に、芳香族陽イオンペプチドの眼科投与に適した投与システムが提供される本発明技術が実現されるが、これはこの疾患のみには限定されない。D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 または薬学的に許容されるその塩を使用した当該投与システムの典型例は、実施例9に記述されている。
(0206) ある態様においては、本発明技術により投与システムが提供される、すなわち、以下には限定されないが、例えば、糖尿病黄斑浮腫を含む黄斑障害の治療、予防、改善のために芳香族陽イオンペプチドを使用した、複数回投与での眼科適用のための等張溶液であるが、これはこの疾患のみには限定されない。D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 または薬学的に許容されるその塩を使用した当該投与システムの典型例は、実施例10に記述されている。
(0207) ある態様においては、本発明技術により投与システムが提供される、すなわち、以下には限定されないが、例えば、糖尿病黄斑浮腫を含む黄斑障害の治療、予防、改善のために芳香族陽イオンペプチドを使用した、重金属に対し安定化させた単回または複数回投与での眼科適用のための等張溶液であるが、これはこの疾患のみには限定されない。D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 または薬学的に許容されるその塩を使用した当該投与システムの典型例は、実施例11に記述されている。
(0208) ある態様においては、本発明技術により投与システムが提供される、すなわち、以下には限定されないが、例えば、糖尿病黄斑浮腫を含む黄斑障害の治療、予防、改善のための、本発明技術の芳香族陽イオンペプチドを使用した、単回または複数回投与での長期間眼科適用のための等張溶液であるが、これはこの疾患のみには限定されない。D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 または薬学的に許容されるその塩を使用した当該投与システムの典型例は、実施例12に記述されている。
(0209) ある態様においては、本発明技術により、以下には限定されないが、例えば、糖尿病黄斑浮腫を含む黄斑障害の治療、予防、改善のための、本発明技術の芳香族陽イオンペプチドを使用した複数回または単回投与での眼科適用に、粘性溶液あるいは熱硬化性ジェルを使用した眼科投与システムが提供されるが、これはこの疾患のみには限定されない。D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 または薬学的に許容されるその塩を使用した当該投与システムの典型例は、実施例13に記述されている。
(0210) ある態様においては、本発明技術により、以下には限定されないが、例えば、糖尿病黄斑浮腫を含む黄斑障害の治療、予防、改善のための、本発明技術の芳香族陽イオンペプチドを蛋白質加水分解から保護するためにリポソーム・エマルジョンを使用した眼科投与システムが提供されるが、これはこの疾患のみには限定されない。D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 または薬学的に許容されるその塩を使用した当該投与システムの典型例は、実施例14に記述されている。
(0211) ある態様においては、本発明技術により、以下には限定されないが、例えば、糖尿病黄斑浮腫を含む黄斑障害の治療、予防、改善のための、徐放性を得るためにアルブミン小球体に封入された本発明技術の芳香族陽イオンペプチドから構成される眼科投与システムが提供されるが、これはこの疾患のみには限定されない。D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 または薬学的に許容されるその塩を使用した当該投与システムの典型例は、実施例15に記述されている。
(0212) ある態様においては、本発明技術により、以下には限定されないが、例えば、糖尿病黄斑浮腫を含む黄斑障害の治療、予防、改善のための、芳香族陽イオンペプチドを眼球組織に貯蔵放出するよう、注射可能なPLA/PGA小球体に封入された本発明技術の芳香族陽イオンペプチドから構成される眼科投与システムが提供されるが、これはこの疾患のみには限定されない。D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 または薬学的に許容されるその塩を使用した当該投与システムの典型例は、実施例16に記述されている。
(0213) ある態様においては、本発明技術により、例えば、糖尿病黄斑浮腫を含む黄斑障害の治療、予防、改善のための、本発明技術の芳香族陽イオン・ペプチドを局所的あるいはインプラントを通じて徐放するために徐々に消滅する生物分解性薄膜に包まれた当該芳香族陽イオンペプチドから構成される眼科投与システムが提供されるが、これはこの疾患のみには限定されない。D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 または薬学的に許容されるその塩を使用した当該投与システムの典型例は、実施例17に記述されている。
(0214) 上述した投与システムは、1つまたは複数の当該芳香族陽イオンペプチドと1つまたは複数の治療上有効な薬物の組み合わせで構成されてよい。
(0215) ある態様においては、治療法形成には、本発明技術の芳香族陽イオンペプチド、あるいはそのアセテート塩、トリフルオロ酢酸塩、および医薬賦形剤といった薬学的に許容される塩が含まれる。ある態様においては、治療法形成には、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2、あるいはそのアセテート塩、トリフルオロ酢酸塩、および医薬賦形剤 (例：当該ペプチド の担体として使用される薬理的に不活性な物質) といった薬学的に許容される塩が含まれる。
(0216) 例えば、以下には限定されないが、糖尿病黄斑浮腫を含む黄斑障害の治療、予防、改善のための眼科用薬剤には、非毒性補助剤が含まれ、これには例えば、チメロサール、塩化ベンザルコニウム、メチルパラベンおよびプロピルパラベン、臭化ベンゾドデシニウム、ベンジルアルコールまたはフェニルエタノールといった、外傷用ではない抗生物質成分や、塩化ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムまたはグルコン酸塩バッファといった緩衝成分、そして、ソルビタン・モノラウレート、トリエタノールアミン、ポリオキシエチレン・ソルビタン モノパルミチレート、エチレンジアミン四酢酸といった、その他の従来の成分があるが、これらのみには限定されない。
(0217) 以下には限定されないが、例えば、糖尿病黄斑浮腫を含む黄斑障害の治療、予防、改善のための眼科溶液または懸濁液は、眼に許容可能なレベルの当該芳香族陽イオンペプチドを維持するために必要な回数投与してよい。哺乳類の眼への投与は毎日約1ないし2回でよい。
(0218) 以下には限定されないが、例えば、糖尿病黄斑浮腫を含む黄斑障害の治療、予防、改善のための経口組成剤は、一般的には不活性希釈剤および食用担体を含む。経口治療投与の目的の活性化合物を賦形剤と組み合わせて、錠剤、トローチ、例えばゼラチンカプセルといったカプセルの形状で使用することができる。薬学的に親和性がある結合、および/あるいは免疫賦活剤を当該化合物の一部として含めることができる。錠剤、ピル、カプセル、トローチ、および同様な形状には、以下の任意成分あるいは同様な性質の化合物を含むことができる：微結晶セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンといった結合剤、澱粉やラクトースといった賦形剤、アルギン酸、プリモジェル、コーンスターチといった崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムまたはステローテスといった潤滑剤、コロイド状2酸化ケイ素といった滑剤、蔗糖、サッカリンといった甘味剤、あるいはペパーミント、メチル・サリチル酸塩またはオレンジ香味料といった着香料。
(0219) 吸引投与に対しては、以下には限定されないが、例えば、糖尿病黄斑浮腫を含む黄斑障害の治療、予防、改善のためには、当該化合物は、例えば二酸化炭素といった適切な高圧ガスを含む加圧容器やディスペンサからのエアゾールスプレーあるいは噴霧器の形状で投与することができる。当該方法には、米国特許第 6,468,798 号で記述されたものが含まれる。
(0220) 以下には限定されないが、例えば、糖尿病黄斑浮腫を含む黄斑障害の治療、予防、改善のための、本明細書で記述されているような治療用組成物の全身投与には、経粘膜または経皮の手段が含まれる。経粘膜投与または経皮投与に対しては、浸透すべき障壁に適切な浸透剤が使用され構成される。当該浸透剤は当分野では周知であり、例えば、経粘膜投与には、洗剤、胆汁酸塩、フシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は鼻スプレーを使用して達成することができる。経皮投与には、活性化合物は、当分野では周知である、軟膏、膏薬、ゲル類またはクリームに組成することができる。ある態様においては、経皮投与はイオン永動により実施することが可能である。
(0221) 治療タンパク質あるいはペプチドは担体システムに組成することができる。当該担体はコロイドシステムが可能である。当該コロイドシステムはリポソーム、リン脂質二重層溶媒が可能である。ある態様においては、治療ペプチドは、ペプチドの完全性を維持しつつリポソームに封入される。当業者が知るように、さまざまなリポソームの作成方法がある。(Lichtenberg ら、Methods Biochem. Anal., 33:337-462 (1988); Anselem ら、Liposome Technology, CRC Press (1993) を参照のこと)。リポソーム組成すると、クリアランスを延ばし、細胞取り込みを増大させることができる (Reddy, Ann. Pharmacother., 34 (7-8):915-923 (2000) を参照のこと)。活性剤もまた、例えば、以下には限定されないが、可溶性、不溶性、浸透性、不浸透性、生分解性、あるいは胃保持力のある重合体またはリポソームといった薬学的に許容可能な成分から作成された粒子に充填することができる。当該粒子には、ナノ粒子、生分解性ナノ粒子、微粒子、生分解可能微粒子、ナノ球、生分解可能ナノ球、微小球体体、生分解可能微小球体体、カプセル、乳化剤類、リポソーム、ミセル、およびウィルス・ベクトル・システムが含まれるが、これらには限定されない。
(0222) 担体はまた、例えば、生分解可能な、生物学的適合性の重合体母体が可能である。ある態様においては、治療用ペプチドはタンパク質の完全性を維持しつつ、重合体母体に埋め込むことができる。当該重合体は、ポリペプチド、タンパク質または多糖類といった天然生成物、またはポリエステル繊維α-ヒドロキシ酸合成物といった合成物でよい。例としては、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、エラスチン、酢酸セルロース、硝酸セルロース、多糖類、フィブリン、ゼラチン、およびそれらの組合せが含まれる。ある態様においては、当該重合体はポリ乳酸 (PLA) あるいはコ・ポリ乳酸/グリコール酸 (PGLA) である。当該重合体母体は、微粒子やナノ粒子を含む、各種形状や大きさで生成し分離することができる。重合体を組成すると、治療効果の持続につながる可能性がある。(Reddy, Ann. Pharmacother., 34 (7-8):915-923 (2000) を参照のこと)。ヒト成長ホルモン (hGH) の重合体処方物は、臨床試験で使用されてきた。(Kozarich および Rich, Chemical Biology, 2:548-552 (1998) を参照のこと)。
(0223) 本発明技術の一種類あるいは複数の芳香族カチオン性ペプチドは、Younic らの著書、An assessment of the ocular safety of inactive excipients following sub-tenon injection in rabbits .J Ocul Pharmacol Ther. 2008 Apr;24(2):206-16 に詳細に記述される一種類あるいは複数種類の付形剤を用いた生成に適切である。
(0224) 重合体微小球体体からの徐放性製剤の例は、PCT 出願公開 WO 99/15154 (Tracy ら)、米国特許第 5,674,534 号および第 5,716,644 号 (いずれも Zale ら)、PCT 出願公開 WO 96/40073 (Zale ら)、および PCT 出願公開 WO 00/38651 (Shah ら) に開示されている。米国特許第 5,674,534 号および第 5,716,644 号、PCT 出願公開 WO 96/40073 は、塩の凝集に対して耐性を与えたエリトロポイエチンを含む重合体母体を記述している。
(0225) ある態様においては、当該治療用組成物は、移植および微小カプセル投与システムを含む放出制御製剤といった、治療用組成物を身体から急速に排除しないように保護する担体を用いて調整される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリエチレングリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル類とポリ乳酸といった、生物分解性、生体適合性重合体を使用することができる。当該組成は既存技術を用いて調整することができる。当該物質はまた、例えば、アルザ・コーポレーション社およびノバ・ファーマスーティカル社といった会社から商業的に入手することができる。リポソーム懸濁液 (細胞特異性抗原へのモノクローナル抗体を用いて特定の細胞を標的としたリポソームを含む) もまた、薬学的に許容可能な担体として使用可能である。これらは、例えば米国特許第4,522,811号に開示されているような当業者に周知の方法に従って製造することができる。
(0226) 当該治療組成物はまた、細胞間送達のために組成することもできる。例をあげれば、リポソーム送達システムは当業者に周知であり、例えば、Chonn および Cullis, “Recent Advances in Liposome Drug Delivery Systems,” Current Opinion in Biotechnology 6:698-708 (1995); Weiner, “Liposomes for Protein Delivery: Selecting Manufacture and Development Processes,” Immunomethods 4 (3) 201-9 (1994); および Gregoriadis, “Engineering Liposomes for Drug Delivery: Progress and Problems,” Trends Biotechnol. 13 (12):527-37 (1995) を参照されたい。Mizguchi ら、Cancer Lett. 100:63-69 (1996) は、生体内と生体外の両方にタンパク質をを送達するための膜融合性リポソームの使用を記述している。
(0227) 当該治療剤の用量、毒性および治療効能は、細胞培養液または実験動物での標準的な薬学的手順によって決定することが可能であり、例えば、LD50 (母集団の50% に致命的な用量) および ED50 (母集団の50% に治療効果がある用量) の決定がそうである。毒性と治療効果との間の当該用量比は治療指数であり、比 LD50/ED50 として表現される。高い治療指数を示す化合物が望ましい。毒性副作用を示す化合物は使用可能ではあるが、送達システムを慎重に設計し、影響を受けていない細胞への潜在的損傷を最小限に止めるように、影響を受けた組織に当該化合物を標的とし、従って副作用を低減させるべきである。
(0228) 細胞培養定量検定および動物実験から得られたデータを、ヒトでの用量範囲を定式化するために使用することができる。当該化合物の当該用量は好ましくは、毒性が僅かまたは無く ED50 を含む循環濃度の範囲内に存在する。当該用量は、使用する投与形式および利用する投与経路に依存して、この範囲内で変化してよい。当該方法で使用される如何なる化合物に対しても、治療に有効な用量は、初期に細胞培養定量検定から推定することができる。用量は動物モデルにおいて定量化し、細胞培養において決定された IC50 (すなわち、症状の半値抑制を達成する試験化合物の濃度) を含む循環血漿濃度を達成することができる。当該情報を使用して、ヒトにおける有益な用量を更に正確に決定することができる。血漿におけるレベルの測定は、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定することが可能である。
(0229) 典型的には、治療または予防処置効果を達成するための、当該芳香族カチオン性ペプチドの有効用量は、１日に体重１キログラム当り約 0.000001 mg ないし、１日に体重１キログラム当り約10,000 mg の範囲である。好ましくは当該用量は、１日に体重１キログラム当り約 0.0001 mg ないし、１日に体重１キログラム当り約100 mg の範囲である。例えば、用量は、1 mg/体重kgまたは 10 mg/体重kg で毎日、２日に１回、3日に1回、あるいは1〜10 mg/kg の範囲内で毎週、2週間に1回、3週間に1回と設定することができる。ある態様においては、ペプチドの単回用量は体重1kg当り 0.1〜10,000 micrograms の範囲である。ある態様においては、一担体における香族カチオン性ペプチドの濃度は、送達されたミリリットル当り0.2 〜 2000 マイクログラムである。例示的な用量では、毎日１回あるいは毎週1回の投与が必要である。時間間隔はまた、対象者の血糖値あるいはインスリンを測定しそれに応じて用量あるいは投与を調整することで示唆されるように不規則でもよい。治療応用においては、疾患が緩和するまたは終わるまで、好ましくは対象者が疾患の症状の部分的改善あるいは完治するまで、比較的短期間での比較的高い用量が時として必要である。その後、患者には予防措置的な用量で投与してよい。
(0230) ある態様においては、治療に効果的な芳香族カチオン性ペプチドの量は、10-11 〜 10-6 モル、例えば約 10-7 モルの標的組織でのペプチド濃度として定義してよい。この濃度は、0.001 ないし 100 mg/kg の全身投与あるいは身体表面積当りの等価な用量で送達することができる。標的組織での治療濃度を維持するように投与の予定が最適化され、最も好ましくは、毎日1回または毎週1回であるが、連続投与 (例えば、非経口注入または経皮適用) もまた含まれる。
(0231) ある態様においては、当該芳香族カチオン性ペプチドの用量は、「低」、「中」、「高」投与レベルで提供される。ある態様においては、当該低用量は、約 0.0001 ないし約 0.5 mg/kg/h、好ましくは約 0.01 ないし 0.1 mg/kg/h が提供される。ある態様においては中用量は、約 0.1 ないし約 1.0 mg/kg/h、適切には約 0.1 ないし約 0.5 mg/kg/h が提供される。ある態様においては、高用量は、約 0.5 ないし約 10 mg/kg/h、適切には約 0.5 ないし約 2 mg/kg/h が提供される。
(0232) 熟練当業者は、疾患または障害の重篤度、対象者の一般的健康および／あるいは年齢、そして他に存在する疾患を含む、対象者の有効な治療に要求される投与およびタイミングに影響を及ぼす要因があることを認識するが、これらのみには限定されない。更に、本明細書に記述されている治療用組成物の治療に有効な量による対象者の治療には、単回治療あるいは一連の治療が含まれ得る。
(0233) 熟練当業者は、病気または障害の重篤度、対象者の一般的健康および／あるいは年齢、そして他に存在する疾患を含む、対象者の有効な治療に要求される投与およびそタイミングに影響を及ぼす要因があることを認識するが、これらのみには限定されない。更に、本明細書に記述されている治療用組成物の治療に有効な量による対象者の治療には、単回治療あるいは一連の治療が含まれ得る。
(0234) 現在の方法に従って治療される哺乳類は、例えば、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマといった家畜、イヌ、ネコといったペット、ラット、マウス、ウサギといった実験動物を含む、任意の哺乳類でよい。好ましい実施例においては、当該哺乳類はヒトである。
芳香族カチオン性ペプチドおよび他の治療剤の併用療法
(0235) 以下には限定されないが、例えば、糖尿病黄斑浮腫を含む黄斑障害の治療、予防、改善のためのある症例においては、本明細書で記述されている芳香族カチオン性ペプチド (あるいは薬学的に許容される塩、エステル、アミド、前駆薬または溶媒和化合物) の少なくとも一種類を別の治療剤と組み合わせて投与することが適切である。例証のみを挙げるならば、患者が本明細書で記述した該芳香族カチオン性ペプチドの一種類を受けて経験する副作用が炎症である場合、元来の治療剤と抗炎症剤とを組み合わせて投与するのが適切であろう。あるいは、例証のみを挙げるならば、本明細書で記述されている化合物のひとつの治療効果は、抗原性補強剤の投与により向上する (すなわち、それ自体は治療に利点をもたらすことは少ないが、他の治療剤との組み合わせにより、患者への全般的治療効果が向上する)。あるいは、例証のみを挙げるならば、本明細書で記述した化合物のひとつを、眼疾患の予防または治療に治療的効果もある他の治療剤 (これもまた最適治療計画を含むとする) と併用すると患者が経験する利点が増大する。例のみを挙げるならば、本明細書で記述した該芳香族カチオン性ペプチドの一種類の投与が関与する黄斑障害の治療において、黄斑変性の他の治療剤あるいは療法でも患者に治療上の利点を更に大きく提供することが可能である。いずれの場合においても、治療中の眼疾患、障害あるいは状態に関わらず、単純に2種類の治療剤を添加すると、患者が経験する全般的利点が増大する、あるいは患者は相乗効果的利点を経験するであろう。
(0236) 併用療法の特効の非限定的例には、一酸化窒素 （NO）誘導物質、スタチン、負に帯電したリン脂質、酸化防止剤、ミネラル、抗炎症剤、抗血管新生剤、マトリックス・メタロプロテイナーゼ抑制剤、カロチノイドと併用する少なくと一種類の芳香族カチオン性ペプチドの使用が含まれる。数例としては、適切な併用剤が複数の分類 (例証のみとして挙げれば、ルテイン、酸化防止剤、カロチノイド) に入る。更に、芳香族カチオン性ペプチドはまた、シクロスポリン Aの例のみとして、患者に利点をもたらす併用剤を追加して投与してよい。
(0237) 更に、当該芳香族カチオン性ペプチドはまた、例のみとして、体外レオフェレシス (別名膜差次的濾過) の使用、埋込み型ミニチュア望遠鏡の使用法、ドルーゼのレーザー光凝固、およびマイクロ刺激治療を含む、患者に追加効果あるいは相乗効果をもたらす処置を併用して使用してよい。
(0238) 酸化防止剤を使用すると、黄斑変性とジストロフィーを羅患する患者に利点があることが示されてきた。例えば、Arch. Ophthalmol., 119: 1417-36 (2001); Sparrow ら、J. Biol. Chem., 278:18207-13 (2003) を見よ。少なくとも一種類の当該芳香族カチオン性ペプチドと併用可能であろう適切な酸化防止剤の例には、ビタミンC、ビタミンE、ベータカロチンと他のカロチノイド、補酵素 Q、4-ヒドロキシ-2、2、6、6-テトラメチルピペリジン-N-オキシル (別名テンポール)、ルテイン、ブチルヒドロキシトルエン、レスベラトロル、トロロックス類似物 (PNU-83836-E)、コケモモ・エキスが含まれる。
(0239) ミネラルにはまた黄斑変性とジストロフィーを羅患する患者に利点があることが示されてきた。例えば、Arch. Ophthalmol., 119: 1417-36 (2001) を見よ。少なくとひとつの芳香族カチオン性ペプチドのと併用可能であろうミネラルには、銅含有鉱物 (例えば酸化第二銅)、亜鉛含有鉱物 (例えば、酸化亜鉛)、セレン含有化合物が含まれる。
(0240) 負に帯電したリン脂質を使用すると、黄斑変性とジストロフィーを羅患する患者に利点があることが示されてきた。例えば、Shaban および Richter, Biol. Chem., 383:537-45 (2002)；Shaban ら、Exp. Eye Res., 75:99-108 (2002) を見よ。少なくと一種類の芳香族カチオン性ペプチドのと併用可能であろう負に帯電したリン脂質には、カルジオリピン、ホスファチジルグリセロールが含まれる。正に帯電したおよび／あるいは中性のリン脂質もまた、芳香族カチオン性ペプチドと併用すると、黄斑変性とジストロフィーを羅患する患者に利点があることが示される。
(0241) カロチノイドの使用と光受容器細胞で必要な光防護の維持との相関関係が見出されてきた。カロチノイドは、テルペノイド群の自然生成される黄色ないし赤色の色素であり、植物、藻、バクテリア、そして鳥や甲殻類といった動物に見出される。カロチノイドには600種類以上のカルチノイドが特定されている、大きな分子の群である。カロチノイドには、炭化水素（カロチン）と彼らの酸素を含ませた、アルコール派生物（キサントフィル）が含まれる。それらには、アクチニオエリトロール、アスタキサンチン、カンタキサンチン、カプサンチン、カプソルビン、β-8’-分離カロテナル（分離カロテナル）、β-12’-分離カロテナル、α-カロチン、β-カロチン、「カロチン」（α-カロチンとβ-カロチンの混合物）、γ-カロチン、β-クリプトキサンチン、ルテイン、リコピン、ビオレリトリン、ゼアキサンチン、およびその水酸基のまたはカルボキシルを含有する部材のエステル類。カロチノイドの多くはシスおよびトランス異性体の形状で自然生成するが、合成化合物はしばしばラセミ混合物である。
(0242) ヒトにおいては、網膜には主に、ゼアキサンチンとルテインという2種類のカルチノイドが選択的に蓄積される。これら2種類のカロチノイドは強力な酸化防止剤であり、青色光を吸収するので、網膜保護に役立つと考えられる。ウズラを用いた研究によれば、カルチノイドが欠乏した食餌により飼育された群ではゼアキサンチン濃度が低い網膜が認められ、非常に多数のアポトーシス性光受容器細胞による証拠として、重大な光損傷が観察されたが、その一方、ゼアキサンチン濃度が高い群では損傷は最小であった。少なくとひとつの芳香族カチオン性ペプチドのと併用する適切なカルチノイドの例には、ゼアキサンチンとルテイン、並びに上記カルチノイドの任意のものが含まれる。
(0243) 適切な一酸化窒素誘導物質には、内因子 NOを刺激する化合物、または生体内での内因性内皮由来弛緩因子 (EDRF)のレベルを上昇させる化合物、または一酸化窒素シンターゼの基質である化合物が含まれる。当該化合物には、例えば、L-アルギニン、L-ホモアルギニンと、N-ヒドロキシ-L-アルギニンとそれらのニトロソ化類似物とニトロシル化類似物 (例：ニトロソ化L-アルギニン、ニトロシル化L-アルギニン、ニトロソ化N-ヒドロキシ-L-アルギニン、ニトロシル化N-ヒドロキシ-L-アルギニン、ニトロソ化L-ホモアルギニンとニトロシル化L-ホモアルギニン)、L-アルギニンの前駆体および／あるいはその生理的に許容できる、シトルリン、オルニチン、グルタミン、リジン、これらのアミノ酸の少なくとも1つから成っているポリペプチド、酵素アルギナーゼ阻害物質 (例えば、N-ヒドロキシ-L-アルギニンと2(S)-アミノ-6-ボロノヘキサン酸) といった塩類、そして一酸化窒素シンターゼ、サイトカイン、アデノシン、ブラジキニン、カルレティキュリン、ビサコジルの基質、およびフェノールフタレインが含まれる。EDRFは、内皮から分泌される血管弛緩因子であり、一酸化窒素あるいはその派生物に密接に関係すると特定されている。(Palmerら、Nature, 327:524-526 (1987); Ignarro et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:9265-9269 (1987))
(0244) スタチンは、脂質低下剤あるいは適当な一酸化窒素誘導剤として用いられる。更に、スタチンの使用と黄斑変性の遅延性発症または進行との間に関係が存在することが示威されてきた。G. McGwin ら、British Journal of Ophthalmology, 87:1121-25 (2003) を見よ。スタチンは従って、芳香族カチオン性ペプチドと併用すると、眼病あるいは眼疾患や障害 (例えば、黄斑変性とジストロフィー、網膜ジストロフィー) の患者に利点をもたらす。適切なスタチンには、例証のみとしてとして、ロスバスタチン、ピタバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、セリバスタチン、メバスタチン、ベロスタチン、フラバスタチン、コムパクチン、ロバスタチン、ダルバスタチン、フルインドスタチン、アトルバスタチン、アトルバスタチン・カルシウム（これはアトルバスタチンのヘミカルシウム塩）、およびとジヒドロコンパクチンが含まれる。
(0245) 芳香族カチオン性ペプチドと併用に適切な消炎剤には、例証のみとしてとして、アスピリンと他のサリチル酸塩、クロモリン、ネドクロミル、テオフィリン、ザイリュートン、ザフィルルカスト、モンテルカスト、プランルカスト、インドメタシンとリポキシゲナーゼ抑制剤、非ステロイド性抗炎症薬(NSAID) (例：イブプロフェンやナプロキシン)、プレドニゾン、デキサメタゾン、シクロオキシゲナーゼ抑制剤 (すなわち、NaproxenTMまたはCelebrexTMといったCOX-1またはCOX-2抑制剤)、スタチン (例証のみとして、ロスバスタチン、ピタバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、セリバスタチン、メバスタチン、ベロスタチン、フラバスタチン、コンパクチン、ロバスタチン、ダルバスタチン、フルインドスタチン、アトルバスタチン、アトルバスタチン・カルシウム (これはアトルバスタチンのヘミカルシウム塩))、ジヒドロコンパクチン、そして、解離ステロイドが含まれる。
(0246) 黄斑変性および網膜変性に付随する眼疾患や障害を治療するための、芳香族カチオン性ペプチドと併用に適切なマトリックスメタロプロテアーゼ (MMP) 抑制剤もまた投与してよい。MMP は細胞外基質の大部分の成分を加水分解することが知られている。これらのプロテアーゼは、正常組織の再形成、胚形成、創傷治癒、血管形成といった多くの生物学的過程で中心的役割を果たす。しかしながら、MMP の過剰発現が、黄斑変性を含め多くの疾患状態で観察されてきた。多数のMMPが特定されてきており、それらの大部分は多重領域亜鉛エンドペプチダーゼである。多数のメタロプロテアーゼ抑制剤が知られている (例えば、Whittaker M. ら、Chemical Reviews 99(9):2735-2776 (1999) によりMMP抑制剤のレビュー文献を見よ)。MMP 抑制剤の代表例には、メタロプロテアーゼの組織抑制剤 (TIMPs) (例：TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3, TIMP-4)、α-2-マクログロビン、テトラサイクリン (例：テトラサイクリン、ミノサイクリン、ドキシサイクリン)、ヒドロキサメート(例：BATIMASTAT、MARIMISTAT、TROCADE)、キレート化剤 (例：EDTA、システイン、アセチルシステイン、D-ペニシラミン、金塩類)、合成MMP断片、スクシニル・メルカプトプリン、ホシホナミデート、およびヒドロキシアミン酸が含まれる。芳香族カチオン性ペプチドと併用可能な MMP 抑制剤には、例証のみとして、上記抑制剤が含まれる。
(0247) 抗血管新生薬または抗VEGF薬を使用すると黄斑変性とジストロフィーを羅患する患者に利点があることが示されてきた。少なくとも一種類の芳香族カチオン性ペプチドと併用に適切な抗血管新生薬または抗VEGF薬には、Rhufab V2 (ルセンティスTM)、トリプトファニル-tRNA合成酵素 (TrpRS)、Eye001 (抗VEGF ペグ化アプタマ)、スクアラミン、RetaaneTM15mg (蓄積抑制のためのアネコルタブ・アセテート、アルコン社製)、コンブレタスタチンA4プロドラッグ(CA4P) (マクジェンTM) MifeprexTM (ミフェプリストーン−ru486)、眼球鞘下トリアムシノロン・アセトニド、硝子体内結晶質トリアムシノロン・アセトニド、プリノマスタット (AG3340−合成マトリックス・メタロプロテイナーゼ抑制体、ファイザー社製)、フルオシノロン・アセトニド (フルオシノロン眼内注入、ボシュロム/制御送達系を含む)、VEGFR抑制剤 (スウゲン) およびVEGF-トラップ (レジェネロン/アベンティス社) が含まれる。
(0248) 視覚障害軽減に使用されたきた他の眼科治療薬を少なくとも一種類の芳香族カチオン性ペプチドと併用することが可能である。当該治療には、非熱レーザー、PKC 412、エンドビオン (ニューロサーチ A/S社製)、例証のみとして挙げれば、膠派生神経組織栄養因子と睫毛の神経組織栄養因子を含む神経組織栄養因子、ジアタゼム、ドルゾラミド、フォトトロップ、9-シス-レチナール、ヨウ化燐酸線またはエコチオフェートまたは炭酸脱水酵素抑制剤を含む目薬剤 (エコー療法を含む)、AE-941 (エルテナ・ラボラトリーズ社)、シルナ-027 (シルナ・セラピューティクス社)、ペガプタニブ (ネクスター・ファーマスーティカルズ社/ギリアド・サイエンシズ社)、ニューロトロフィン (例証のみとして挙げれば、NT-4/5、ジェネンテック社のみを含む)、キャンド5 (アキュイティ・ファーマスーティカルズ社製)、ラニビズマブ (ジェネンテック社)、INS-37217 (インスパイヤー・ファーマスーティカルズ社)、インテグリン拮抗薬 (ジェリニ社およびアボット・ラボラトリーズ社を含む)、EG-3306 (アーク・セラピューティクス社)、BDM-E (バイオ・ディーム社)、サリドマイド (例えば、エントリ・メド社が使用)、カルジオトロフィン-1 (ジェネンテック社)、2-メトキシエストラジオール (アラーゲン/オクレックス社)、DL-8234 (東レ社)、NTC-200 (ニューロテック社)、テトラチオモリブデート (ミシガン大学)、LYN-002 (リンカス・バイオテック社)、微細藻類合成物 (アクアサーチ/オールバニー社、メラ医薬社）、D-9120 (セルテックグループp1c)、ATX-S10 (浜松ホトニクス社)、TGF-ベータ２ (ジェンザイム/セルトリックス社)、チロシン・キナーゼ抑制剤 (アラーガン社、スウゲン社、ファイザー社）、NX-278-L (ネクスター・ファーマスーティカルズ社/ギリアド・サイエンシズ社)、Opt-24 (OPTISフランスSA社)、網膜細胞ガングリオン神経保護剤 (コージェント・ニューロサイエンス社)、N-ニトロピラゾール誘導体 (テキサスA&M大学)、KP-102 (クレニツスキー・ファーマスーティカルズ社)、シクロスポリンA を含むが、これらのみには限定されない。
(0249) いずれの症例においても、多重治療剤は任意の順序であるいは同時に投与してよい。同時に投与する場合は、当該多重治療剤は、単一の統合形状 (例証のみとして挙げれば、単一溶液または二つの分離した溶液が含まれる)。当該多重治療剤のひとつは複数回数で投与してよく、あるいは両方とも複数回数で投与してよい。同時に投与しない場合は、複数回数投与間のタイミングは、1週間以上4週間未満、約6週間未満、約2ヶ月間未満、約4ヶ月間未満、約6ヶ月間未満、あるいは約1年間未満で変化させることができる。加えて、当該併用方法、合成物、処方は、2種類の薬剤のみに限定されない。例証のみとして挙げれば、少なくとも一種類の酸化防止剤と少なくとも一種類の負電荷リン脂質を芳香族カチオン性ペプチドと併用する、あるいは少なくとも一種類の酸化防止剤と少なくとも一種類の一酸化窒素生成物の誘導剤を芳香族カチオン性ペプチドと併用する、あるいは、少なくとも一種類の一酸化窒素生成物の誘導剤と少なくとも一種類の負電荷リン脂質を芳香族カチオン性ペプチドと併用する、などが可能である。
(0250) 更に、芳香族カチオン性ペプチドにはまた、患者に追加利点あるいは相乗効果を提供する処置を併用することができる。視力障害を軽減することが知られている、提案されている、あるいは考えられている処置としては、「限定的網膜転置」、光力学的治療 (例証として挙げれば、ブリストル‐マイヤーズ・スクイブ社の受容体を標的としたPDT、PDTによる注射のためのポルフィマーナトリウム、QLT社のベルテポルフィン、ミラベント・メディカル・テクノロジー社のロスタポルフィン、日本ペトロリアム社のタラポルフィン・ナトリウム、ファーマサイクリック社のモテキサフィン・ルテチウムを含む)、アンチセンスオリゴヌクレオチド (例証として、ノバガリ・ファーマ SA により試験された製品およびアイシス・ファーマスーティカス社ISIS-13650を含む)、レーザー光凝固、ドルーゼンレーザー加工、黄斑円孔手術、黄斑移動手術、埋込み型ミニチュア望遠鏡、ファイ・モーション アンジオグラフィ (別名マイクロレーザー治療およびとフィーダー容器治療)、陽子ビーム治療、マイクロ刺激治療、網膜剥離および硝子体手術、強膜バックル、黄斑下手術、経瞳孔温熱療法、フォトシステム I治療、RNA干渉（RNAi）の使用、体外レオフェレシス (別名膜差濾過とレオセラピー)、マイクロチップ移植、幹細胞治療、遺伝子補充療法、リボザイム遺伝子治療 (オックスフォード・バイオメディカ社低酸素反応要素、ジェネティクス社レンティパック、ジェン・ベック社PDEF遺伝子治療を含む)、光受容器/レチナール細胞移植 (ディアクリン社移植可能網膜上皮細胞、セル・ジェネシス社の網膜細胞移植を含む)、および鍼治療が含まれるが、これらのみには限定されない。
(0251) 個別患者に使用でき利点がある併用には更に、個人が特定の眼病に相関することが知られている突然変異遺伝子をもつかを判断するための遺伝子試験の実施が含まれる。例証のみとして挙げると、ヒト ABCA4 遺伝子における欠損が、シュタルガルト病、錐体杆体ジストロフィー、加齢性黄斑変性、色素性網膜炎を含む5つの異なる網膜表現型に付随すると考えられる。Allikmets ら、Science, 277:1805-07 (1997)、Lewis ら、Am. J. Hum. Genet., 64:422-34 (1999)、Stone ら、Nature Genetics, 20:328-29 (1998)、Allikmets, Am. J Hum. Gen., 67:793-799 (2000)、Klevering ら、Ophthalmology, 11 1:546-553 (2004) を見よ。加えて、シュタルガルト病の常染色体性優性形態は、ELOV4 遺伝子における突然変異により発生する。Karan ら、Proc. Natl. Acad. Sci. (2005) を見よ。これらの突然変異を有する患者は、本明細書で記述される方法において、治療および／あるいは予防上の利点が期待される。
(0252) 本発明は更に以下の実施例により開示されるが、いかなる場合においても本発明の範囲を限定すべきものではない。
実施例 1 -［ジメチルチロシン-2-14C］D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH 2 のニュージーランド白ウサギの眼への皮下投与と局所注射後の眼内薬物動態および生体内分布
(0253) 本実施例は、[ジメチルチロシン-2-14C] D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 のニュージーランド白ウサギの眼への皮下投与と局所注射後の眼内薬物動態と生体内分布、およびその派生全放射能を示威するものである。
(0254) 16 匹のニュージーランド白ウサギに10 mg/mL の 14C-放射標識付き D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 を処方した。実験動物は少なくとも生後12週間であり、投与時の体重は2.30〜3.43 kg であった。実験動物は表7に従い治療群に無作為化された。
(0255) 投与溶液は14.70 mg (補正因子 0.782) の放射標識されていない D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 および 17.49 mg (補正因子 0.770) の 14C-標識化 D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 を組み合わせて調整され、pH 7.4 の0.01M PBS、2.5 mLに溶解し、濃度 9.97 mg/mL (1 % 自由ペプチド) および放射標識を付けた濃度 460.1 Ci/mL を得た。投与溶液の3分取 (100 μL) を生理食塩水により容積25 mL とした。希釈溶液の複製 100 μL 分取に対し、液体シンチレーション計数法 (LSC) により放射能を定量化した。測定放射能は、理論値の5%以内の精度であった。投与溶液は使用前に最大24時間2〜8°Cで保存、あるいは今後の使用のために -70°C で保存した。
(0256) 第1日目に、1% (10 mg/mL) のD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2、40 μL の投与溶液を群A〜Gの各実験動物に局所注射した。群H〜Iの各実験動物には、投与溶液の単回皮下注射量 0.1 mL/kg (1 mg/kg) を背側肩甲領域に与えた。所定の時間に各実験動物に麻酔をかけ、心臓穿刺により採血した。実験動物は心臓穿刺後に安楽死させた。約 3 ± 0.5 mL の全血を K2EDTA 試験管に採取した。4分割量 (100 μL) を直接、燃焼円錐に変換させた。血液分取は分析するまで、≦-20°C で保管した。
(0257) 群 A〜Gに対し、各群から右眼球と1個の左眼球 (N = 3 眼球) を採取し剖検した。残った左眼球 (群 Gを除く) は、可能な 3D-QWBA (提供的全身オートラジオグラフィー) 分析のために採取し、結膜は眼球にそのまま残した。群 H〜Iに対しては、各実験動物から両眼球を採取し剖検した。剖検に供した眼球は全て、通常の生理食塩水ですすぎ眼房水試料を採取した。これらの眼球は眼球除去し、液体窒素で凍結させ、切開する前に≦-80°C で保存した。適切な眼球から、硝子体液、角膜、結膜、虹彩/毛様体、レンズ、網膜、脈絡膜と強膜を採取し、重量を測定し、分析する前に≦-20°C で保管した。眼房水試料もまた分析する前に≦-20°C で保管した。
(0258) 全ての放射能測定は、ベックマン社製液体シンチレーションスペクトロメータを使用して実施した。2つの血液分取を燃焼させ、2つの分取は、必要に応じて燃焼するように保存した。各眼球から、角膜、結膜、虹彩/毛様体、レンズ、網膜、脈絡膜と強膜を、燃焼円錐に入れた重量測定し、燃焼した。各眼房水試料および各硝子体液試料の複製分取は、シンチレーション液体としてInsta-Gel を用いて、シンチレーション容器に移送し、放射線能を決定した。
結果
(0259) 14C-標識化 D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 を両眼に局部注射した後、最初の時点から最後の時点である、投与後15分から24時間で眼球の全組織および各実験動物の血液で放射能を測定した。測定結果は眼球組織内での等価薬濃度の急速な増加が示され、特に、結膜 (7425 ± 5344 ng-equi/g)、角膜 (1976 ± 359 ng-equi/g)、そして強膜 (917 ± 466 ng-equi/g) であり、これらは投与後30分で最大に達した。脈絡膜、レンズ、網膜を含む、眼球の他の組織はそれぞれ、208 ± 95 ng- equi/g、185 ± 75 ng- equi/g、96.7 ± 22.7 ng- equi/g と、やや小さい最大等価薬濃度に達した。これらの最大値にはまた、投与後 4時間とかなり長時間後に達した。最大濃度では、結膜、角膜、強膜の等価薬濃度はそれぞれ、眼球への全用量に対し、0.293±0.198%、0.028±0.005%、0.051±0.035% であった。
(0260) 14C-labeled D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 の皮下注射後、1 時間後の血液濃度 356 ng- equi/g、そして2時間後の 87.9 ng- equi/g で放射能が存在した。投与後 1 時間では、等価薬濃度は最大となり、結膜 (650 ± 12 ng- equi/g)、脈絡膜 (558 ± 251 ng- equi/g)、強膜 (530 ± 47 ng- equi/g)、虹彩/毛様体 (513 ± 2 ng- equi/g)、網膜 (336 ± 3 ng- equi/g)、角膜 (209 ng- equi/g) であった。D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 派生放射能は、眼球の他の組織ではより低濃度で観測された。当該組織内の当該濃度は、2時間後には様々な度合いで消滅したが、 眼房水とレンズでは例外的に徐々に増加した。眼球投与後の薬物動態学パラメ−タが表8にまとめられている。
(0261) これらの結果から、本明細書で記述された方法および組成物が、眼病あるいは眼疾患や障害の治療あるいは予防に芳香族カチオン性ペプチドを眼球注射すると有効であることが示された。これらの結果は、糖尿病黄斑浮腫を含む眼病あるいは眼疾患や障害の治療あるいは予防に D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 といった、本発明技術の芳香族カチオン性ペプチドを眼内投与することが可能であることを示すものである。
実施例 2 - ヒト網膜上皮細胞の高グルコース誘導損傷の予防
(0262) ヒト網膜上皮細胞 (HREC) の高グルコース誘導損傷の予防における本発明の芳香族カチオン性ペプチドの効果を培養 HREC で研究した。
(0263) 本発明の研究に有効な HREC 培地の方法は周知である。一般的には、Li B, Tang SB, Zhang G, Chen JH, Li BJ. Culture and characterization of human retinal capillary endothelial cell. Chin Ophthal Res 2005; 23: 20-2、Premanand C, Rema M, Sameer MZ, Sujatha M, Balasubramanyam M. Effect of curcumin on proliferation of human retinal endothelial cells under in vitro conditions. Invest Ophthalmol Vis Sci 2006; 47: 2179-84 を見よ。
(0264) 簡潔にいえば、HREC 細胞を正常な対照群、グルコース 30 mM の投与群、30 mM グルコース + D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 の投与群の3群に分割する。異なる濃度の D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (10 nM, 100 nM, 1μM, 10μM) を用いた、高グルコース共治療でのHREC生存をアネキシン V+PI 試験および流動細胞計測を用いて測定した。一般的は、Koopman, G., Reutelingsperger, C. P., Kuijten, G. A. M., Keehnen, R. M. J., Pals, S. T., van Oers, M. H. J. 1994. Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis. Blood 84: 1415、Homburg, C. H., de Haas, M., von dem Borne, A. E., Verhoeven, A. J., Reutelingsperger, C. P. および Roos, D. 1995. Human neutrophils lose their surface Fc gamma RIII and acquire Annexin V binding sites during apoptosis in vitro. Blood 85: 532、Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H.,および Reutelingsperger, C. 1995. A novel assay for apoptosis - flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. J. Immunol. Meth. 184: 39、Fadok, V. A.,Voelker, D. R., Campbell, P. A., Cohen, J. J., Bratton, D. L.および Henson, P. M. 1992. Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages. J. Immunol. 148: 2207 を見よ。
(0265) D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 を用いた高グルコース共治療でのHRECの生存を24時間と48時間で試験した。結果を図1に示し、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 の投与によりHRECの生存が有意に改善され、アポトーシス細胞と壊死細胞が減少したことが示された。D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 による治療により、ROS (図 2) の生成もまた低減した。
(0266) HRECのミトコンドリア膜電位消失に対する高グルコースによる保護剤としての D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 の試験を実施した。ミトコンドリア介在経路が、高グルコース誘導性細胞死に対するD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 の保護効果が重要かを決定するために、流動細胞計測によりΔΨm を測定した。D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 無しの高グルコースによる HREC 治療から24時間または48時間経過後に、高グルコース群で観測された赤色と緑色の蛍光の比の有意な減少によって示されたように、ミトコンドリア膜電位の急激な消失が JC-1 蛍光プローブによって検出された。これとは対照的に 100 nM のD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 で共治療群でのΔΨ はほぼ変化せず、正常グルコース対照群に相当した (図 3)。これらのデータは、高グルコースへの曝露によって起こされるミトコンドリア膜電位消失がD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 によって防止されることが示された。
(0267) グルコース (30 mmol/L) により誘発されるシトクロム c がHRECのミトコンドリアから放出される。固定されたHREC は、シトクロム c 抗体およびミトコンドリア特定タンパク質抗体 (HSP60) によって免疫標識された。共焦点顕微鏡分析により、正常培養およびグルコースを用いて共治療したD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2における正常培養 HRECには、重複したシトクロム c 染色とミトコンドリア染色があり、シトクロム c とミトコンドリアの共在性が示された (図 4)。30 mmol/L グルコースを用いた治療から24時間または48時間経過後に、HRECの細胞質にシトクロム c が観測されたが、これはミトコンドリアからHREC 細胞の細胞質へのシトクロム c の放出がグルコースにより誘導されるが、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 によりミトコンドリアと細胞質との間の当該移動が減少し得ることを示す。
(0268) ミトコンドリアからのシトクロム c 放出を防止すると、カスパーゼ-3活性が減少する結果となる。図 5に示されるように、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 により、高グルコースで治療された HREC内でカスパーゼ-3 タンパク質発現が減少する。劈開カスパーゼ-3 タンパク質発現をウエスタンブロット (図 5A) により測定した。HREC を 30 mM のグルコースに曝露させてから 24 時間またｈ48時間経過後に、カスパーゼ-3 発現のレベルが劇的に増加した。同時に、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 共治療群においては、カスパーゼ-3 タンパク質レベルの注目すべき減少が示された (＊p<0.05)。図 5B は、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 により治療された高グルコース共治療から24時間または48時間経過後のHRECのカスパーゼ-3 タンパク質発現のレベルの定量分析を示す。
(0269) D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 により、高グルコースで治療された HRECでのTrx2 発現が増大する。図 5C は、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 を用いて共治療され 30 mM のグルコースに暴露してから24時間または48時間経過した後のHREC内のTrx2 のmRNAレベルを示す。Trx2の mRNA 発現レベルは、定量リアルタイム PCR により測定した。Trx2の mRNA 相対レベルは、18S mRNA レベルにより正規化した (＊ p<0.05 対 正常グルコース溶媒群および30 mM 高グルコース治療群)。各時刻に対し3つの独立試料を使用した。図 5D は、ウエスタンブロットを用いて測定したTrx2 タンパク質発現レベルを示す。D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 を用いて共治療され 30 mM のグルコース中のTrx2 タンパク質発現は、正常グルコース群と比較して有意に増大した (＊p<0.05)。図 5E はD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 共治療した場合とそうでない場合の高グルコース治療から24時間または48時間経過後のHREC内のTrx2のタンパク質レベルの定量分析を示す。
(0270) これらの結果により、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 が高グルコース環境でHREC細胞の生存の促進に有益であることを示す。これらの結果は、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 といった芳香族カチオン性ペプチドが、哺乳類対象者の眼病あるいは眼疾患や障害の予防あるいは治療に有益であることを示すものである。特に、これらの結果は、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 といった、本発明技術の芳香族カチオン性ペプチドが、哺乳類のヒト網膜上皮細胞の高グリコース誘発損傷の予防あるいは治療に有益であることを示す。
実施例 3 - 高脂質食餌で飼育したラットの糖尿病網膜症の予防
(0271) 本発明の芳香族カチオン性ペプチドが糖尿病網膜症の進行を予防する効果がスプラーグ・ドーリー ラット モデルで研究された。この実施例は当該実験の結果を記述するものである。
(0272) 糖尿病のラットモデルを、SDラットでの 6-週間のHFD および低用量の STZ (30 mg/kg) 注射あるいは単回の高用量の STZ (65 mg/kg) の併用によって確立した。一般的には、K. Srinivasan, B. Viswanad, Lydia Asrat, C.L. Kaul および P. Ramarao, Combination of high-fat diet-fed and low-dose streptozotocin-treated rat: A model for type 2 diabetes and pharmacological screening, Pharmacological Research, 52(4): 313-320, 2005 を見よ。正常食餌 (NRC) で飼育したラットを対照として使用した。表 9〜12は治療計画および実験プロトコルを示す。
(0273) 記述した当該実験プロトコルに従い、SD ラットモデルにおける、糖尿病と併発する障害の治療における当該芳香族カチオン性ペプチドの効果が示威された。Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2 および D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 の投与により、糖尿病ラットのレンズでの白内障発症の予防あるいは逆行の結果が認められた (図 6 と7、表 13 と 14)。
(0274) SD ラットモデルにおける、レンズ上皮に対する当該芳香族カチオン性ペプチドの効果を調査した。D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 の投与により、STZ ラットモデル (図 8) および HFD/STZ ラットモデル (図 9) の両方において上皮細胞変性が低減した。
(0275) SD ラットモデルにおける、内部の血網膜障壁機能に対する当該芳香族カチオン性ペプチドの効果を調査した。Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2 あるいは D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2を投与しなかった HFDに対する効果と比較し、Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2 および D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 の投与により、内部の血網膜障壁機能が改善した (図 10)。
(0276) SD ラットモデルにおける、網膜微小血管に対する当該芳香族カチオン性ペプチドの効果を調査した (図 11〜12)。D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 の投与により、STZ あるいは HFD/STZ ラットで網膜微小血管変性の低減が認められた。
(0277) SD ラットモデルにおける、網膜微小血管内のタイトジャンクション構成タンパク質クローディン5 に対する当該芳香族カチオン性ペプチドの効果を調査した。共焦点顕微鏡下での観察により、タイトジャンクション構成タンパク質クローディン5の分布を検出した (図 13)。正常ラット (A)では、クローディン5は網膜微小血管に沿って滑らかに直線的に均一に配列しているが、STZラット (B、矢印)では線形形状が破壊されている。Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2 (10 mg/kg) あるいは D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (10 mg/kg) で治療されたSTZ ラットの網膜微小血管上のクローディン5配列は、正常ラットのそれと類似していた (それぞれ、パネル C とD)。
(0278) 以上を総括すれば、これらの結果は総体的に、芳香族カチオン性ペプチドが、例えば、白内障および微小血管系といった、眼球における糖尿病の負の効果を防止あるいは補償することを確立するものである。その結果、本発明の当該芳香族カチオン性ペプチドの投与は、ヒト対象者において糖尿病に付随する眼病あるいは眼疾患や障害を予防あるいは治療する方法に有益である。特に、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 といった本発明の芳香族カチオン性ペプチドは、哺乳類対象者での糖尿病網膜変性の予防あるいは治療に有益である。
実施例 4 - D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH 2 による緑内障の線維柱帯細胞での酸化ストレスの防止
(0279) 本発明の芳香族カチオン性ペプチドの緑内障の予防あるいは治療の効果が緑内障の線維柱帯細胞での当該ペプチドの効果を研究することにより調査した。緑内障は世界中の不可逆的失明の第二原因である。原発開放隅角緑内症 (POAG) は緑内障の主な派生型である。POAG では、線維柱帯網の視覚異常は存在しない。しかしながら、線維柱帯網の細胞の正常機能を実行する能力に障害がある。
(0280) 本実施例においては、本発明の芳香族カチオン性ペプチドの当該効果を POAG 患者からの線維柱帯網細胞 (GTM) と疾患の無い個人からの線維柱帯網細胞 (HTM) を比較することで調査した。本発明の研究で最も役立つ方法がこれまで説明されてきた。一般的には、He Y, Ge J, Tombran-Tink J., Mitochondrial defects and dysfunction in calcium regulation in glaucomatous trabecular meshwork cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2008, 49(11):4912-22、He Y, Leung KW, Zhang YH, Duan S, Zhong XF, Jiang RZ, Peng Z, Tombran-Tink J, Ge J. Mitochondrial complex I defect induces ROS release and degeneration in trabecular meshwork cells of POAG patients: protection by antioxidants. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2008, 49(4):1447-58 を見よ。GTM 細胞は、HTM 細胞と比較すると、ミトコンドリア膜電位に著しい損傷を示す。(図 18)
(0281) 当該細胞を、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2. 投与前に過酸化水素に曝露させた「A群」細胞、過酸化水素投与前にD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2. に曝露させた「B群」細胞、そしてD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2. と過酸化水素を同時に投与した「C群」細胞、の3つの群に分割した。
(0282) D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 がHTM あるいは GTM 細胞に対し細胞毒性効果があるかどうかを調べるために、様々な濃度のD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 を細胞に投与し、LDH 試験を使用して細胞毒性効果を測定した。LDH 細胞毒性試験は細胞障害活性を分析する比色方法である。当該試験では、損傷した細胞から放出される、安定した細胞基質である乳酸脱水素酵素 (LDH) 酵素が定量測定される。放出された LDH を、ジアホラーゼによりテトラゾリウム塩 (ヨードニトロテトラゾリウム (INT)) が赤色ホルマザンへの変色を呈する結合酵素反応により測定した。本発明の研究において有益な細胞から LDH を検出する方法は知られている。一般的には、Haslam, G. ら (2005) Anal. Biochem. 336: 187、Tarnawski, A. (2005) Biochem. Biophys. Res. Comm. 333: 207、Round, J. L ら (2005) J. Exp. Med. 201: 419、Bose, C. ら (2005) Am. J. Physiol. Gastr. L. 289: G926、Chen, A. および Xu, J. (2005) Am. J. Physiol. Gastr. L. 288: G447 を見よ。LDH 活性は、一定時間での NADH 酸化あるいは INT 還元として決定される。この結果を図14に示すが、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 は、HTM および GTM 細胞の生存力には影響を及ぼさないことが示された。
(0283) 本発明の研究において有益なTMRMを用いた、ミトコンドリア膜電位の測定はAndrea Rasola および Massimo Geuna の著書, A flow cytometry assay simultaneously detects independent apoptotic parameters, Cytometry 45:151-157, 2001、MitoprobeTM JC-1 Kit for Flow Cytometry, Molecular Probes, Invitrogen, USA に記述されている。図 16 は、GTM 細胞での結果を示す。総体的にこれらの結果によると、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 による治療は、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 投与前に過酸化水素に曝露させた細胞のミトコンドリア膜電位を改善させることが示される。
(0284) A群 HTM および GTM 細胞をD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2. 投与前に過酸化水素に曝露された場合のこれらの細胞のミトコンドリア膜電位 (ΔΨm) を測定した。最初にテトラメチルローダミン メチル エステル (TMRM, 500 nM x 30 min) で標識させた細胞を共焦点顕微鏡測定した (図 15)。ミトコンドリア膜電位はまた、ミトコンドアリア選択プローブ テトラメチルローダミン メチル エステル (TMRM, 500 nM x 30 分) で標識させ、流動細胞分析法を用いて測定した (図 16〜17)。
(0285) B群 GTM 細胞を過酸化水素投与前に D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 に曝露させた場合に、これらの細胞を調べた。図 18 は、様々な濃度の D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 を投与した細胞の逆位相対照顕微鏡測定の結果を示す。これらの結果から、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 が濃度や時間に依存しながら、過酸化水素が介在する形態変化から細胞を保護することを示す。すなわち、過酸化水素が介在した細胞がD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 ペプチドに曝露すると、細胞の消失や円形化が減少する。HTM および GTM 細胞のミトコンドリア膜電位 (ΔΨm) はまた、これらの細胞が過酸化水素投与前にD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 に曝露した場合でも調査した。ミトコンドリア膜電位がテトラメチルローダミン メチル エステル (TMRM, 500 nM x 30 分) で標識させた細胞を共焦点顕微鏡測定した (図 19〜21)。これらの結果は、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 の前処理は、用量に依存して、過酸化水素に曝露させた細胞のミトコンドリア膜電位を改善させることを示す。そのことから、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 は、GTM 細胞での酸化ストレスに対する防止効果をもたらすことがわかる。
(0286) GTM および HTM 細胞でのD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2による急性酸化障害の緩和効果を調査した。図 36 は、FACS 分析を用いたGTM および HTM 細胞 のTMRMの蛍光強度を示す。H2O2 中の GTM 対照群と比較して、蛍光強度のパーセント割合は、10-6M の D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2、10-7M の D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2、10-8Mの D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2では、それぞれ 35.2±2.12%、56.2±4.04%、50.3±4.46%、47.5±2.82%、ここで n=4であり、HTM 群ではそれぞれ、37.4±0.725%、57.7±1.80%、50.6±3.06%、49.4±2.27%、ここで n=4 であった。＊＊ は、GTM H2O2 群と比較して p<0.01、＊ は、GTM H2O2 群と比較して p<0.05 、▲▲▲ はHTM H2O2 群と比較して p<0.001 であった。
(0287) 図 37 は、FACS 分析を用いた、対照群とD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 治療群 での GTM および HTM 細胞のROSの蛍光強度を示す。GTM H2O2, 中のGTM対照群と比較した細胞間ROS生成のパーセント割合は、10-6M の D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2、10-7M の D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2、10-8M の D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 の群では、それぞれ、146.0 ± 2.27%、84.5±8.75%、102.0±5.69%、133.0±5.17% (n=3) であり、HTM 群ではそれぞれ、153.0±3.46%、79±2.39%、91.8±3.49%、129.0±8.24% (n=4) であった。対照群と比較してGTM および HTM H2O2 群に対しp<0.001、＊＊＊ は、GTM H2O2 群と比較し p<0.001を意味し、▲▲▲ は、HTM H2O2 群と比較しp<0.001 を意味し、▲▲ は、HTM H2O2 群と比較しp<0.01 を意味する。図 38は、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 が H2O2 により誘発された細胞アポトーシスの量を減少させることを示す。
(0288) GTMおよびHTM細胞での持続的な酸化損傷に対するD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 の効果を調査した。細胞は、10-6, 10-7, 10-8 M の D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 を使用して1時間 前処理してから、200μM の H2O2 で 24 時間培養し、持続的な酸化損傷に対する D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 の保護効果を調査した。図 39 および表 15 は、GTM および HTM 細胞 の持続的な酸化損傷からのROS生成に対する D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2の効果を示す。図 40 および表 16 は、各治療群での GTM および HTM 細胞の MMP変化を示す。
(0289) 総体的に述べれば、これらの結果は、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 は10-4 M ではGTM およびHTM 細胞の両方に細胞毒性を示さず、過酸化水素で誘発される持続性および急性酸化ストレスは、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (>10-9 M) により防止することが可能であることを示すものである。これらの結果は、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 といった本発明技術の芳香族カチオン性ペプチドが、哺乳類対象者の眼病あるいは眼疾患や障害の予防あるいは治療に有益であることを示すものである。特に、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 は、哺乳類の緑内障の防止あるいは治療に有益である。
実施例 5 - D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH 2 による初代網膜色素上皮細胞での酸化ストレスの防止
(0290) 初代網膜色素上皮 (RPE) 細胞を培養し、本発明の芳香族カチオン性ペプチドによる、これらの細胞での酸化損傷を減少させる効果を調査した。初代網膜色素上皮細胞の研究に対する有益な方法は記述されている。Dunn ら ARPE-19, A Human Retinal Pigment Epithelial Cell Line with Differentiated Properties, Experimental Eye Research, 1996, 62(2): 155-170 を参照されたい。最初に、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 は、これらの細胞に逆効果を及ぼさなかったことを示す。初代培養されたヒト RPE を異なる濃度の D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 のみで24時間培養し、MTT 試験を用いて細胞生存性を決定した (図 22)。
(0291) 次に、初代 RPE 細胞の生存性を tBHP および様々な濃度の D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 の存在中で試験した。細胞は 96個のウエルプレートに、ウエル当り10,000個の細胞を入れ、24時間培養してから、次の24時間では飢餓させた。その後、増加する濃度の tBHP に細胞を曝露させ (図 23A)、あるいは異なる濃度のD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 で 4時間プレインキュベートさせ、その後6時間 tBHP で刺激した (図 23B)。これらの結果は、tBHP 投与に応じて D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 により細胞生存性が向上したことを示す。RPE 細胞での3つの群における細胞間ROS 生成もまた、FACS 分析を用いて調査した。図 31A は、対照 RPE細胞での ROS 生成を示し、図 31B は、500μM の tBHPで 3時間処理された RPE細胞でのROS生成を示し、FIG. 31C は、500μM の tBHP で3時間そして 1μM のD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2で処理された ROS 生成を示す。図 32 は、FACS 分析でJC-1により標識されたMMPを示す。3通りの異なる濃度の D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 群が分析された。500μM の tBHP で3時間の群での赤色と緑色の比は 1.08、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 で4 時間 + 500μM の tBHP で3 時間の群での赤色と緑色の比は 1.25、100 nM の D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 で4 時間 + 500μM の tBHP で3 時間の群での赤色と緑色の比は 1.4、そして 1μM の D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 で4 時間 + 500μM の tBHP で3時間の群での赤色と緑色の比は 2.28 である。図 33 は、tBHP により誘発されたMMP減少に対する1μM の D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 の効果を示す。図 33A：対照群、R/G は 3.63±0.24、図 33B: 500μM の tBHP で 3 時間の群、R/G は 1.08±0.11、図 33C：1μM の D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 で 4 時間 + 500μM の tBHP で 3 時間の群、R/G は 2.38±0.18 である。図33Dは、異なる群に対する蛍光比を比較した図である。＊p<0.01、C 対 B。
(0292) 図 34 は、250μM の tBHPで24時間 により誘発された細胞アポトーシスに対するD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 の効果を示す。図 34A：対照群、(Q2+Q4)%=1.27±0.3%、図 34B：250μMのtBHP で24時間の群、(Q2+Q4)%=15.7±0.6%、図. 34C：1μM の D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 で4時間 + 250μM の tBHP で 24 時間の群、(Q2+Q4)%=8.4±0.8%。図 34D は、異なる群に対する蛍光比を比較した図である。＊p<0.05、C 対 B。図 35 は、RPE 細胞のtBHP で 3時間の群により誘発されたMDA レベルを示す図である。(＊p<0.05).
(0293) 総体的にいえば、これらの結果は D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 が初代網膜色素上皮細胞での酸化ストレスを防止することを示す。これらの結果は、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 といった本発明技術の芳香族カチオン性ペプチドが、哺乳類対象者の眼病あるいは眼疾患や障害の予防あるいは治療に有益であることを示すものである。特に、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 は、哺乳類の網膜細胞損傷の予防あるいは治療に有益である。
実施例 6 -脈絡膜血管新生 (CNV) マウスモデルにおける、本発明の芳香族カチオン性ペプチドによる CNV の予防および治療
(0294) 一方では脈絡膜血管新生 (CNV) の予防、他方ではCNV の治療を更に示威すべく、本発明の芳香族カチオン性ペプチドをCNVのマウスモデルで試験した (図 24)。CNV をレーザー光照射により誘発させた。本研究において有益な方法は、Reich, Mol Vis 2003; 9:210-216 に記述されている。
(0295) 簡潔に記述すれば、生後 5〜6 週間の C57BL/6 オスのマウスを抱水クロラールで麻酔し、虹彩をトロピカミドで拡大させた。コンタクトレンズとしてカバーガラスを使用し、4箇所のレーザースポット (米国ルミナス社製ノビアス・スペクトラにより、532 nm, 260 mw, 0.01s, 50 μm) を右眼視神経乳頭周辺の眼底に円形に照射した。毎日の 1 mg/kg, 9 mg/kg のD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2) の腹腔内注射あるいはレーザ光凝固の前日に賦形薬を開始した。
(0296) 1週間後、マウスには深く麻酔を施し、左心室を、1 ml (50 mg/ml) の PBS-緩衝フルオレセイン・デキストランにより灌流した。眼球は摘出し、4%パラホルムアルデヒドに2時間固定した。これらの眼球を水晶体赤道で切開し、前半分および網膜を除外した。強膜と脈絡膜を含む眼球の後半分を4〜5箇所で半径方向に切断し4〜5片に分割し、スライドに載せた。フラットマウント全てを蛍光顕微鏡 (カールツァイス社製 AxioCam MRC) により検査した。Image-Pro Plus ソフトウェア (米国メリーランド州シルバースプリング、メディアサーバーネティクス社) を使用し、各CNV 部位の面積を測定した。
(0297) 各群には48箇所の新生血管形成があった。新生血管形成の面積は、IMAGE-PROPLUS6.0 ソフトウェアを使用して計算した。CNV モデルでの新生血管形成の面積は、1 mg/kg の D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 および 9 mg/kg の D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 群では、それぞれ、0.0130±0.0034, 0.0068±0.0025, 0.0067±0 であった。これらの結果は、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 の2通りの濃度では、新生血管形成の面積が有意に減少することを示す (p<0.05) (図 24)。
(0298) これらの結果は、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 といった本発明技術の芳香族カチオン性ペプチドが、哺乳類対象者の眼病あるいは眼疾患や障害の予防あるいは治療に有益であることを示すものである。特に、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 は、哺乳類の脈絡膜血管新生の防止あるいは治療に有益である。
実施例 7 -酸素誘導網膜症 (OIR) マウスモデルにおける、本発明の芳香族カチオン性ペプチドによるOIR の予防および治療
(0299) 酸素誘導網膜症 (OIR) の予防を更に示威すべく、本発明の芳香族カチオン性ペプチドをOIRのマウスモデルで試験した (図 25)。このモデルにおいては、生後7日目の網膜血管障害が部分的に進行したマウスの子を高酸素 (酸素75%) 状態に5日間置くと、網膜血管の成長が止まり著しい脈管消滅が認められた。生後12日目にこれらのマウスの子は室内空気に戻され、生後17日目に鮮紅色補償網膜新血管形成が発症した。この病理的血管新生のモデルは、増殖性糖尿病性網膜症 (DR) の代替として広範に使用されている。
(0300) 本発明の芳香族カチオン性ペプチドによるOIR予防効果を調査すべく、OIR を誘発したマウスの子に当該マウスには芳香族カチオン性ペプチド (例えば、Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2 または D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2) を約6週間同時に投与した。この結果を図26に示し、これから D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 を使用した治療では、鮮紅色補償網膜新血管形成が防止されたことが示される。これらの結果は、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 といった本発明技術の芳香族カチオン性ペプチドが、哺乳類対象者の増殖性糖尿病性網膜症の予防法に有用であることを示すものである。
(0301) これらの結果は、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 といった本発明技術の芳香族カチオン性ペプチドが、哺乳類対象者の眼病あるいは眼疾患や障害の予防あるいは治療に有益であることを示すものである。特に、これらの結果は、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 といった本発明技術の芳香族カチオン性ペプチドが、哺乳類対象者の酸素誘導網膜症 (OIR) の予防あるいは治療に有益であることを示すものである。
実施例 8 - 色素性網膜炎のモデルにおいて、光受容器細胞死を減少させる酸化防止剤
(0302) 円錐細胞特異線 661Wがマウスの網膜腫瘍から得られた。661W 細胞の本研究に有益な方法は前述されている。一般的には、Gearoid Tuohy, Sophia Millington-Ward, Paul F. Kenna, Peter Humphries および G. Jane Farrar, Sensitivity of Photoreceptor-Derived Cell Line (661W) to Baculoviral p35, Z-VAD.FMK, およびFas-Associated Death Domain, Investigative Ophthalmology and Visual Science. 2002;43:3583-3589 を見よ。円錐細胞での酸化ダメージの予防または減少への本発明の芳香族カチオン性ペプチドの効果を試験するためにこれらの細胞を培養した (図 27)。最初に、661W 細胞の生存性が tBHP の影響を受けたことが示された (図 27A)。異なる用量の tBHP が当該細胞に3時間にわたり投与された。次に、異なる用量のD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 により、tBHP 誘発性の 661W 細胞死が低減することが示された (図. 27B)。
(0303) tBHP に誘発されたミトコンドリア生存性の喪失を防止する D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2) の潜在可能性を調査すべく、100 nmol/L のD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 を 661w 細胞の培地に投与した。この結果が図 30に示されており、JC-1試験により示されるように、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 を投与しなかった細胞と比較し、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 によりミトコンドリア生存性が有意に向上したことがわかる。
(0304) これらの結果は、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 といった本発明技術の芳香族カチオン性ペプチドが、哺乳類対象者の眼病あるいは眼疾患や障害の予防あるいは治療に有益であることを示すものである。特に、これらの結果は、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 といった本発明技術の芳香族カチオン性ペプチドが、哺乳類対象者の網膜色素変性の予防あるいは治療に有益であることを示すものである。
実施例 9 - 網膜変性におけるマウスモデルでの D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH 2 の効果(0305) 網膜変性の更なる予防を示威すべく、本発明の芳香族カチオン性ペプチドを網膜変性のマウスモデルにより試験した。眼球へのレーザー光照射によりCNVを誘発させた。(実施例6を見よ)。光受容体細胞死の原因解明のために網膜変性のマウスモデルが長年研究されてきた。網膜変性 (以前は、rodless retina (無柱網膜) と同一の rd または r と略されていたが、現在は Pde6b rd1である)、プルキンエ細胞変性 (pcd)、神経 (nr)、遅延性網膜変性 (rds、現在は Prph Rd2)、網膜変性 3 (rd3 )、運動ニューロン退化 (mnd)、網膜変性 4 (Rd4 )、網膜変性 5 (rd5)、白斑 (vit , 現在は Mitf mi-vit)、網膜変性 6 (rd6 )、網膜変性 7 (rd7)、ニューロンセロイド脂褐素症 ( nclf )、網膜変性8 (rd8 )、網膜変性 9 (Rd9 )、網膜変性10 (rd10)、そして錐体光受容細胞機能喪失 (cpfl1) のように、自然発生するマウス突然変異は、網膜の光受容体の変性と同時に他の網膜細胞は変性させないことを明確に示す。
(0306) 図 28 は、対照群および D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 治療マウス群での網膜変性のマウスモデルにおける網膜外核層 (ONL) の厚さを示す、一連の顕微鏡写真である。結果は、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 を使用して治療したマウスは、未治療のマウスと比較し、ONLでの細胞列数がより多く保持されることを示す。核の内外セグメントを選択的に染色するピーナッツアグルチニン (PNA) で染色した網膜フラットマウントはまた、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 治療マウスでは錐体細胞密度がより多いことも示される (図 29)。これらの結果は、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 といった本発明技術の芳香族カチオン性ペプチドが、網膜変性のマウスモデルにおける網膜外核層への代償的損傷を防止することを示す。
(0307) これらの結果は、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 といった本発明技術の芳香族カチオン性ペプチドが、哺乳類対象者の眼病あるいは眼疾患や障害の予防あるいは治療に有益であることを示すものである。特に、これらの結果は、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 といった本発明技術の芳香族カチオン性ペプチドが、哺乳類対象者の網膜変性の予防あるいは治療に有益であることを示すものである。
実施例 10 - 眼球送達システム：本発明技術の芳香族カチオン性ペプチドを使用する単位投与点眼用等張液
(0308) 本発明技術の芳香族カチオン性ペプチドを、等張液の単位投与点眼で眼球に送達するのに適する眼球送達システムが構築された。D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 を使用した当該送達システムの例示的実施例が本明細書に記述されている。100mg (1mg/ml) あるいは 1g (10/mg/ml) のD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 に等価なペプチドあるいはその薬学的に許容可能な塩 (例えば、アセテート塩またはトリフルオロ酢酸塩) が 約50mlの注射用水 NF (国民医薬品集) に溶解され、それに適切な量のトレハロース、マンニトール、蔗糖、または他の糖類が増量剤および浸透張力調節剤として下記のように追加される。結果として得られる溶液に、塩化ナトリウムおよび L-グルタチオンを下記のように分散溶解させる。注射用水 NF を 100ml まで加え、無菌濾過により滅菌し、単位用量をポリエチレン容器に入れ使用する。「NA」は「不適」を意味する。
(0309) 更にあるいは別に、本発明技術の芳香族カチオン性ペプチドを眼球に送達するのに適する眼球送達システムを構築するに当り、当該ペプチドおよび一種類または複数種類の薬学的に許容可能な賦形剤を含めるようにすることができる。例えば、100mg (1mg/ml) あるいは 1g (10/mg/ml) のD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 に等価なペプチドあるいはその薬学的に許容可能な塩 (例えば、アセテート塩またはトリフルオロ酢酸塩) を含めた配送システムが約50mlの注射用水 NF (国民医薬品集) に溶解される。一種類または複数種類の薬学的賦形剤が組成の使用目的に従って選択され、眼球送達システムに追加することができる。
(0310) 本実施例は、芳香族カチオン性ペプチドを、哺乳類対象者の眼病あるいは眼疾患や障害の予防あるいは治療のために眼球送達するのに有益である芳香族カチオン性ペプチドの組成を示威するものである。
実施例 11 - 眼球送達システム：本発明技術の芳香族カチオン性ペプチドを使用する複数回数投与点眼用等張液
(0311) 単回投与使用の代わりに、抗菌保存剤プロピルパラベン (0.05〜0.02%, w/v) およびメチルパラベン (0.10〜0.25%, w/v) を実施例10 における溶液と同じ溶液に加えることにより複数回投与用に組成することができる。プロピレングリコール (2-5%, v/v) もまた、抗菌性を改善すべく添加してもよい。これとは別に 0.01〜0.02% (w/v) の塩化ベンザルコニウムを0.1% (w/v) ジナトリウム EDTA を併用することもできる。これらの溶液は無菌でタイプ I ガラスまたはポリエチレンの点眼容器に複数回数投与に充填することができる。
(0312) 本実施例は、芳香族カチオン性ペプチドを、哺乳類対象者の眼病あるいは眼疾患や障害の予防あるいは治療のために眼球送達するのに有益である芳香族カチオン性ペプチドの組成を示威するものである。
実施例 12 - 眼球送達システム：本発明技術の芳香族カチオン性ペプチドを使用する、重金属に対して安定化させた単回または複数回数投与点眼用等張液
(0313) D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 あるいはその薬学的に許容可能な塩 (例えば、アセテート塩またはトリフルオロ酢酸塩) は酸化し易いので、鉄、銅、その他のイオンといった重金属が介する酸化不安定性を改善するために、抗酸化剤 L-グルタチオンに加えて、実施例 10または11の 溶液に 0.05〜0.1% (w/v) のナトリウム EDTA を添加することができる。更に、プロピルガリウム酸塩、異性重亜硫酸ナトリウム、その他のチオール・メルカプタンといった他の抗酸化剤も使用することができる。
(0314) 本実施例は、芳香族カチオン性ペプチドを、哺乳類対象者の眼病あるいは眼疾患や障害の予防あるいは治療のために眼球送達するのに有益である芳香族カチオン性ペプチドの組成を示威するものである。
実施例 13 -眼球送達システム：本発明技術の芳香族カチオン性ペプチドを使用する、耐用年数を延長した単回または複数回数投与点眼用等張液
(0315) D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 あるいはその薬学的に許容可能な塩 (例えば、アセテート塩またはトリフルオロ酢酸塩) は、溶液中で徐々に加水分解するが、それは 2〜3年間の商業的保存期間を得ることができるような反応速度であるので、実施例 10〜12の溶液を無菌で凍結乾燥させ、2つの容器、再構成可能なビンまたはディスペンサで乾燥粉末を注射用水と混合させて、1日、1週間あるいは1ヶ月間にわたり限定的に使用するよう設計された分配可能な点眼液を提供することができる。
(0316) 本実施例は、芳香族カチオン性ペプチドを、哺乳類対象者の眼病あるいは眼疾患や障害の予防あるいは治療のために眼球送達するのに有益である芳香族カチオン性ペプチドの組成を示威するものである。
実施例 14 - 眼球送達システム：本発明技術の芳香族カチオン性ペプチドを使用する、単位または複数回数投与点眼用の粘性溶液または熱硬化ゲル：
(0317) 粘性誘導重合体 A には、例えば、メチルセルロース、ヒドロキシプロピル・セルロース、ヒドロキシ・プロピル メチルセルロース、カルシウムおよびカルボキシメチルセルロース、ナトリウムおよびカルボキシメチルセルロースカルシウム、アルギン酸とそのカルシウムまたはナトリウム塩、ポリアクリル酸とそのナトリウムまたはカルシウム塩、メタクリル酸塩重合体、およびそれらの派生物、ポリビニルアルコールが含まれるが、これらのみには限定されない。
(0318) 熱硬化ゲル重合体 B は典型的には、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレン ブロック共重合体 (BASF社のプルロニック F-127 または F-68)。
(0319) D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 あるいは薬学的に許容可能なその塩 (例えば、アセテート塩またはトリフルオロ酢酸塩) の溶液に、当該選択量の粘性誘導重合体A を添加してから分散させて適切な粘度 > 100cP (センチポアユズ) を得ることが可能である。これに続いて、当該選択量の熱硬化性重合体Bを当該混合物に溶解し分散させる。次に、他の成分を添加し、溶液を最終容積に調整し、50〜100cP の半粘性ゲルを形成させることが可能である。この溶液を無菌濾過し、滅菌し、ポリエチレンまたは他の適切かつ親和性のある重合体の容器に入れることができる。点眼時に当該物質はゲル化し、下瞼の下に徐々に流れる半固体物を形成し、そこから芳香族カチオン性ペプチド (例えば、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2) が角膜を湿潤する涙液に徐放される。
(0320) 本実施例は、芳香族カチオン性ペプチドを、哺乳類対象者の眼病あるいは眼疾患や障害の予防あるいは治療のために眼球送達するのに有益である芳香族カチオン性ペプチドの組成を示威するものである。
実施例 15 - 眼球送達システム：本発明技術の芳香族カチオン性ペプチドをタンパク質加水分解から保護するリポソーム・乳化剤
(0321) 本発明技術に芳香族カチオン性ペプチドといったペプチド (例えば、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 あるいはアセテート塩やトリフルオロ酢酸塩といった、それらの薬学的に許容可能な塩) を、涙液から通常見出されるリソソームやプロテアーゼの攻撃から保護するために、多重膜小嚢 （MLV) を含むリポソーム・乳化剤を使用して当該薬物を封じ込めて保護することができる。リポソーム処方物にはまた、投与時に当該芳香族カチオン性ペプチド (例えば、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2) を制御放出するという利点がある。
(0322) 熟練当業者は、当該治療用乳化剤の組成にはさまざまな脂質成分が使用可能であることを理解している。どの成分を選択するかは、ある場合では、当該当該芳香族カチオン性ペプチドと当該成分との相互作用、使用目的、好ましいリリースパターンに依存する。芳香族カチオン性ペプチド (例えば、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2) 投与のための例証的なリポソーム組成が下表 19に示される。
(0323) 卵ホスファチジルコリン(EPC) および 卵ホスファチジルグリセロール (EPG) は、例えば アバンティ・リピッド社 (米国アラバマ州バーミングハム所在) から商業製品として入手可能である。脂質純度は薄層クロマトグラフィーによって決定することができ、典型的には、純度約99%の脂質が使用される。コレステロール (CH) およびαトコフェロール (a-T) もまた、例えばそれぞれ、ニュー・チェック・プレップ社 (米国ミネソタ州エイシアン所在) および シグマ・ケミカル社 (米国ミズリー州セントルイス所在) から商業製品として入手可能である。同様に典型的には、純度約 99% 以上を有する CH と a-Tが使用される。活性剤である D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 あるいは、アセテート塩やトリフルオロ酢酸塩といった、それらの薬学的に許容可能な塩をカプセルに入れるために提供される。当該活性剤の最終濃度は、使用目的に応じて、例えば、約 0.001 mg/ml ないし約 1.0 mg/ml 以上が可能である。
(0324) 5通りの例証的な MLV 処方のための脂質成分のモル比を表 19に示す。MLV 処方物には、クロロホルム貯蔵液の脂質成分を試験管または丸底フラスコを用いて混合することができる。当該クロロホルムはロータリーエバポレーターによって取り除くことができ、脂質混合物を適切な容積の t ブタノールに溶解させて当該脂質混合物を完全に可溶化させることができる。当該ブタノール溶液は次に、一夜かけてドライアイス/アセトンで凍結乾燥させる。当該乾燥脂質は次に pH 7.4のリン酸緩衝塩類溶液 (PBS) 中で水和させることができる。
(0325) 当該脂質薄膜は次に、室温で約15分間攪拌して水和させ、約 0.2〜10 ミクロンの範囲の不均一な大きさを有するMLV懸濁液を形成させる。当該小嚢処方物は次に、選択した大きさの孔を有するポリカーボネート膜を透過させて大きさを決定する。処方物を全部、1.0 ミクロンのポリカーボネート膜を透過させ、最初の小嚢の大きさ (中性リポソームの場合に何らかの凝集が起こる前の) 約 1 ミクロンを有する小嚢を生成する。大きさがこれより小さい小嚢を生成するには、一度大きさを決定した小嚢を 0.4 および 0.2 ミクロンの大きさの孔に透過させれば、大きさが 0.2 ミクロンに範囲の小嚢を生成することができる。
(0326) 典型的には、カプセルに封入された芳香族カチオン性ペプチドを含む MLVは、遠心分離によりPBSで3回洗浄することにより、リポソームが付随しない自由芳香族カチオン性ペプチドに遊離させることができる。
(0327) 当該処方物の保護効果は、カプセルに封入された芳香族カチオン性ペプチドを含む MLV を、涙液から通常見出される一種類または複数種類のプロテアーゼと接触させて試験し、カプセルに封入されていない芳香族カチオン性ペプチドの変性に時間変化率と比較して、当該芳香族カチオン性ペプチドの変性の時間変化率を決定することができる。カプセルに封入されていない芳香族カチオン性ペプチド単独の変性率と比較して、涙液から通常見出される一種類または複数種類のプロテアーゼ内でカプセルに封入された芳香族カチオン性ペプチドを含む MLVの低変性率 を観測すると、当該処方物は、本発明技術の芳香族カチオン性ペプチドをタンパク質加水分解から保護するために有益な適切なリポソーム・乳化剤であり、当該芳香族カチオン性ペプチドを対象者の眼球に眼球送達するのに有益であることが示される。
(0328) 本実施例は、芳香族カチオン性ペプチドを、哺乳類対象者の眼病あるいは眼疾患や障害の予防あるいは治療のために眼球送達するのに有益である芳香族カチオン性ペプチドの組成を示威するものである。
実施例 16 - 眼球送達システム：徐放のためにアルブミン微小球体に封入した本発明技術の芳香族カチオン性ペプチド
(0329) 本発明技術の芳香族カチオン性ペプチドといったペプチド (例えば、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 あるいはアセテート塩やトリフルオロ酢酸塩といった、それらの薬学的に許容可能な塩) を、例えば注射あるいはゲルや軟膏の眼球投与といった眼周辺への局所投与のために、ペプチド微小球体を含む処方物が提供される。微小球体処方物には当該芳香族カチオン性ペプチドが封入され、当該芳香族カチオン性ペプチドの時間経過に従う徐放が可能となる。リポソーム処方物と同様、微小球体処方物は、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 といった芳香族カチオン性ペプチドをタンパク質分解酵素から保護する。
(0330) 当該処方物の保護効果は、芳香族カチオン性ペプチドを封入した微小球体を、涙液から通常見出される一種類または複数種類のプロテアーゼと接触させて試験し、微小球体に封入されていない芳香族カチオン性ペプチドの変性の時間変化率と比較して、当該芳香族カチオン性ペプチドの変性の時間変化率を決定することができる。微小球体に封入されていない芳香族カチオン性ペプチド単独の変性率と比較して、涙液から通常見出される一種類または複数種類のプロテアーゼが存在する中で芳香族カチオン性ペプチドが封入された微小球体の低変性率を観測すると、当該処方物は、本発明技術の芳香族カチオン性ペプチドをタンパク質分解から保護するために有益な適切なリポソーム・乳化剤であり、当該芳香族カチオン性ペプチドを対象者の眼球に眼球送達するのに有益であることが示される。
(0331) 典型的には、当該微小球体は粘膜表面に接触するゲルである生体適合性材料から生成される。澱粉微小球体 (必要に応じて交差架橋される) が典型的な物質である。微小球体を形成することができる他の物質には、澱粉誘導物 (例：ヒドロキシエチル澱粉、ヒドロキシプロピル澱粉、カルボキシメチル澱粉、陽イオン澱粉、アセチル化澱粉、燐酸化澱粉、コハク酸派生物、グラフト化澱粉)、アミロデキストリン、ゼラチン、アルブミン、コラーゲン、デキストランとデキストラン誘導体といった変性澱粉 (例：ジエチルアミノエチル-デキストラン（DEAEデキストラン）、デキストラン硫酸、デキストラン・メチル・ベンジルアミド・スルホン酸塩、デキストラン・メチルベンジルアミド・カルボン酸塩、カルボキシメチル・デキストラン、ジホスホン酸デキストラン、デキストラン・ヒドラジド、パルミトイル・デキストラン、リン酸デキストラン)、ポリビニルアルコール、ポリ乳酸-コ-グリコリド、ヒアルロン酸とその、例えば、ベンジルとエチル・エステルといった誘導物、ジェランガムとその、例えば、ベンジルとエチル・エステルといった誘導物、ペクチンとその、例えば、ベンジルとエチル・エステルといった誘導物が含まれる。
(0332) 微小球体の生成は薬学文献に詳細に記述されており (例えば、Davis “Microspheres and Drug Therapy,” Elsevier Biomedical Press, 1984 を見よ)、乳化剤と相分離方法が共に適切である。例えば、アルブミン微小球体は、均質化技術または攪拌技術により、必要に応じて少量の界面活性剤を添加した適切な油中でアルブミン分散液を生成させる水中油型乳化法を使用して生成することができる。次の実施例は、大きさの範囲が約 0.1μm ないし 10μm である微小球体の生成を示すものである。各微小球体処方としては、当該薬物 (例えば、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 あるいはアセテート塩やトリフルオロ酢酸塩といった、それらの薬学的に許容可能な塩) を当該微小球体に、封入、混合、あるいは吸収させることができる。
A. 溶剤抽出によるヒアルロン酸エステル微小球体の作製
(0333) 例えば、ジメチルスルホキシドの中のベンジル・ヒアルロン酸エステル（Hyaff-11）といった重合体に 0.5%のアラセル Aを含有する白色鉱油を混合した、6% w/v 溶液により乳化剤を形成することができる。10分間の連続攪拌 (1000 rpm)によって、内相が外油層に追加される (それぞれの比は 1:16 v/v である)。エチルアセテートが抽出溶剤として当該乳化剤に 2:1 v/v の比で添加される。抽出は、微小球体が形成されるまで、700 rpm での攪拌を15 分間続ける。微小球体の懸濁液を濾過し、n-ヘキサンでよく洗浄し乾燥させる。初期重合体溶液を添加することにより、一種類または複数種類の芳香族カチオン性ペプチド (例えば、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 あるいはアセテート塩やトリフルオロ酢酸塩といった、それらの薬学的に許容可能な塩) を微小球体に含めることができる。
B. 乳化作用を用いた澱粉微小球体の作製
(0334) 5 g の澱粉を40 ml の水と共に透明なゲルが得られるまで加熱(70°C) することにより、10% の澱粉ゲルを得ることができる。冷却後、容積 50 mlに水を添加する。抗酸化剤および1% v/v Span 80 を含む100 mlの大豆油 BPにこの澱粉ゲルの 20 ml を加え、7000 rpm にて3分間等質化させる。この乳化液に 100 ml の高温 (80°C) 大豆油 BP (抗酸化剤を含む) を加え、115°C で加熱しながら15分間以上、パドル攪拌機を使用して 1500 rpm で攪拌する。乳化液は115°C で攪拌され、攪拌中に氷に入れ急冷する。次に 100 ml のアセトンを加え、微小球体が15分間、4500 rpm で遠心分離される。ペレットがアセトン中に懸濁するので、所望の大きさの画分を例えば0.5μm のフルオロ孔フィルターといった適切なふるい目で濾過して得る。得られた微小球体は空気乾燥させる。
C. アルブミン微小球体の作製
(0335) アルブミン微小球体は、Ratcliffe ら (1984) J. Pharm. Pharmacol. 36, 431-436 に記述されている方法を変更して作成することができる。容積 1mlの pH 6.8の5%ヒト血清アルブミンまたは卵アルブミンを、25mlのオリーブ油または軽油 に0.25 mlの Span 85 を添加するまたは添加せずに加える。混合物は次に、機械的攪拌機 (ハイドルフ社) を使用し、775 rpm (コンパクト・インスツルメント社製タコメーター DOT 1) にて、乱流条件で10 分間、混合セル内で攪拌し、w/o 乳化液を形成させる。次に、グルタルアルデヒド溶液 25% (w/v) を3.6% (v/v) の水溶性相に加え更に30分間攪拌し、変性させアルブミンを架橋させる。2500 g の遠心分離を20分間行い、微小球体を収集する。油を除外し、球体をジエチルエーテル、続いてエタノールで洗浄する。微小球体をデカンテーションによって収集する。
D. 小さな澱粉微小球体の作製
(0336) 5グラムのジャガイモ澱粉を約90°C の水95 ml に溶解させる。3 g のポリエチレングルコール (mw =6000) および 47 ml の水から第2の溶液Aを調整する。この溶液を約70°C に加熱してから、温かい澱粉溶液を攪拌しながら加え、乳化液を形成させる。二相系を (内相として澱粉溶液を用いて) 形成させ、混合物を連続攪拌しながら室温まで冷却させると、内相がゲル粒子に変換する。当該粒子を室温で濾過し、100 ml のエタノールで攪拌してから、再度濾過し、空気中で乾燥させる。
(0337) 上述の微小球体は、必要に応じて、化学架橋または加熱処理で変性させることができる。
E. 本発明技術の芳香族カチオン性ペプチドを含む、凍結乾燥させた微小球体の作製(0338) 本発明技術の芳香族カチオン性ペプチド (例えば、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 あるいは、アセテート塩やトリフルオロ酢酸塩といった、それらの薬学的に許容可能な塩)を一種類または複数種類含む凍結乾燥させた微小球体の処方には、約 50〜100 mg の芳香族カチオン性ペプチド溶液を 50 ml の水で調整することができる。所望の量の微小球体 (例えば、上述のように、芳香族カチオン性ペプチド無しで作成したもの) を12 ml の水に20 mlの芳香族カチオン性ペプチド溶液に分散させる (微小球体と溶液に比を約 15:1 mg : ml に維持)。当該2種類の懸濁液を室温にて1時間攪拌し、凍結乾燥させて粉末組成物を得る。凍結乾燥は、ベルジャー装置に収まるエドワード・モデュリョ社製凍結乾燥機を使用して、圧力 0.08 torr (10.7 N/m2)、凝集温度 -53°Cおよび生成物保存温度約 20°C として行うことができる。当該凍結乾燥過程は約24時間で行い、その後、最終生成物を適切な投与装置 (必要に応じて) に充填し、投与前に 4°C で防湿剤を所用して保存することができる。
(0339) 本実施例は、芳香族カチオン性ペプチドを、哺乳類対象者の眼病あるいは眼疾患や障害の予防あるいは治療のために眼球送達するのに有益である芳香族カチオン性ペプチドの組成を示威するものである。
実施例 17 - 眼球送達システム：本発明技術の芳香族カチオン性ペプチドを眼球組織にデポー放出するための注射可能な PLA/PGA 微小球体
(0340) 50〜200 mg の D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (あるいは、あるいは、アセテート塩やトリフルオロ酢酸塩など、それらの薬学的に許容可能な塩) といった芳香族カチオン性ペプチドを 3.8 g の乳酸グリコール共重合体 (乳酸/グリコール酸 = 75/25 (mole %), GPC 重量平均分子量 = 10,000、GPC 数平均分子量 = 4,400、末端基定量による数平均分子量 = 4,300、製造元： 和光純薬工業(ロット 880530)) を6.7 g (5.0 ml) のジクロロメタン中で溶解させる。得られる溶液を17°C に冷却し、約 11°C ないし約 16°C に調整したポリビニルアルコールの 0.1% 水溶液 1000 ml に注ぎ込む。その後、混合液をタービンミキサーを使用して7000 rpm で乳化させ、O/W 乳化液を作成する。この O/W 乳化液を室温にて3時間攪拌してジクロロメタンを蒸発させる。油相は遠心分離機 (05PR-22、日立) を使用し 2000 rpm で固化させ収集することができる。この固体を蒸留水に再度分散させてから遠心分離機にかけ、未結合の薬成分を洗い流す。収集した微小カプセルを少量の蒸留水に再度分散させ、0.3 g の D-マンニトールを加え凍結乾燥させ粉末を得る。
(0341) 別の態様として、100〜400 mg の芳香族カチオン性ペプチド (例えば、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 あるいは、アセテート塩やトリフルオロ酢酸塩といった、それらの薬学的に許容可能な塩) を乳酸グリコール共重合体 (8.0 g (6.0 ml) のジクロロメタン中に3.6g) の溶液に溶解する。得られる溶液を15℃に冷却し、約 14°C に調整したポリビニルアルコールの 0.1% 水溶液 1000 ml に注ぎ込む。その後、混合液をタービンミキサーを使用して7000 rpm で乳化させ、O/W 乳化液を作成する。この O/W 乳化液を室温で3時間攪拌してジクロロメタンを蒸発させる。油相は固化させ遠心分離機 (日立製 05PR-22) を使用し 2000 rpm で固化させ収集することができる。この固体を蒸留水に再度分散させてから遠心分離機にかけ、未結合の薬成分などを洗い流す。収集した微小カプセルを少量の蒸留水に再度分散させ、0.3 g の D-マンニトールを加え凍結乾燥させ粉末を得る。
(0342) 当業者には PLA-PGA 微小カプセルのコアセルベートを作成する方法は多数存在することは周知であり、選択した方法は、ある場合には、必要な放出率、使用目的、所望の芳香族カチオン性ペプチドの濃度に依存するであろう。例えば、ある応用例においては、当該芳香族カチオン性ペプチド (例えば、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 あるいは、アセテート塩やトリフルオロ酢酸塩といった、それらの薬学的に許容可能な塩) は、約 1mgないし5 mg/日で眼に局所投与される。この用量を達成するには、1モル当り30〜150 mg のカプセル封入ペプチドを含む組成物が処方される。これは、眼周辺付近でのデポーとして局部注射する場合、約 0.6〜3 グラムの投与に相当する。
(0343) 更に、ジクロロメタンよりも毒性が少ない溶剤 (フッ化炭素、液体 CO2、シロキサン、天然油) もまた使用可能であり、界面活性剤、分散剤、促進剤を調整して放出率を変更することも可能である。
(0344) 本実施例は、芳香族カチオン性ペプチドを、哺乳類対象者の眼病あるいは眼疾患や障害の予防あるいは治療のために眼球送達するのに有益である芳香族カチオン性ペプチドの組成を示威するものである。
実施例 18 - 眼球送達システム：本発明技術の芳香族カチオン性ペプチドを局所的あるいは移植組織を通じて徐放するための、芳香族カチオン性ペプチドを含む徐々に消耗する生物分解性のある薄膜
(0345) 本発明技術の D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (あるいはアセテート塩やトリフルオロ酢酸塩といった、それらの薬学的に許容可能な塩) といった芳香族カチオン性ペプチドを移植組織などの眼空洞への標的とした徐放を提供するために薄膜組成物を使用することができる。典型的には、眼科用医薬品を送達するための薄膜組成物には、水溶性の薄膜を形成する重合体および脂肪酸グリセリドまたはエステルとの組み合わせが含まれる。
(0346) 本発明技術の (例えば、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 or アセテート塩やトリフルオロ酢酸塩といった、それらの薬学的に許容可能な塩) といった芳香族カチオン性ペプチドを含む、2つの異なる例証的な薄膜を下表 20に示する。当該薄膜は、メタノールにヒドロキシプロピルセルロース (HPC)、マイベロール18-92、および芳香族カチオン性ペプチドを融解させて作成することができる。当該溶液は容器内に入れ、薄膜 (例えば、円盤形状) がメタノールを蒸発させて得ることができる。2つ例証的な薄膜の成分と寸法を表20に示す。
(0347) 本発明技術の芳香族カチオン性ペプチド (例えば、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 あるいは、アセテート塩やトリフルオロ酢酸塩といった、それらの薬学的に許容可能な塩) の眼球投与により、ALSを羅患するあるいはALSを発症するおそれがある治験者の生存率が増大するかを決定すべく、G93A 遺伝子組み換え血族 ALS マウスに、生後30日から、実施例10〜19で記述された眼球送達システムを用いて当該芳香族カチオン性ペプチドを毎日投与した。当該マウスには、震戦および後肢把持の出現のほかロータロッドでの運動機能低下により疾患発現と判断された時点で検査を実施した。
(0348) 当該芳香族カチオン性ペプチドは、当該芳香族カチオン性ペプチドを投与されなかった対象者で観測された発現時と比較し、疾患発現を遅延させ、従って、当該芳香族カチオン性ペプチドの眼球投与は、対象者のALS予防あるいは治療に有益な方法である。
(0349) 本実施例は、芳香族カチオン性ペプチドを、哺乳類対象者の眼病あるいは眼疾患や障害の予防あるいは治療のために眼球送達するのに有益である芳香族カチオン性ペプチドの組成を示威するものである。
実施例 19 - パーキンソン氏病予防のための本発明技術の芳香族カチオン性ペプチドの眼球投与
(0350) MPTP は、線条体ドーパミン・ニューロンを選択的に破壊する神経毒であり、パーキンソン病の動物モデルとして使用することができる。MPTPの代謝物であるMPP+は、ミトコンドリアを標的にし、電子輸送の複合体 Iを阻止し、ROS 生成を増大させる。本発明技術の芳香族カチオン性ペプチド (例えば、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 あるいは、アセテート塩やトリフルオロ酢酸塩といった、それらの薬学的に許容可能な塩) の眼球投与が、MPTPで治療したマウスのドーパミン・ニューロン喪失を防止するかを決定すべく、MPTP (10 mg/kg) の3回投与を、2時間おきにマウス (n=12) に実施した。MPTP注射前30分そしてMPTP注射後1時間後と12時間後に、実施例10〜19または22で記述された眼球送達システムを用いて当該芳香族カチオン性ペプチドを毎日眼球投与した。1週間後、実験動物を検査に供し、線条体内脳領域をチロシン・ヒドロキシラーゼ活性のために免疫染色し、ドーパミンおよびDOPACとHVAのレベルを高圧液体クロマトグラフィーによって定量化する。(一般的には、USP7781405 を見よ)。
(0351) 当該芳香族カチオン性ペプチドにより、MPTPで治療したマウスのドーパミンニューロンの喪失が予防され、従って当該芳香族カチオン性ペプチドの眼球投与は対象者のパーキンソン病を予防あるいは治療のために有益な方法である。当該芳香族カチオン性ペプチドは、MPTPで治療したマウスの線条体ドーパミン、DOPAC (3,4-ジヒドロキシフェニル酢酸) および／あるいは HVA (ホモバニリン酸) レベルを増大させる。
(0352) これらの結果は、本発明技術の芳香族カチオン性ペプチド (例えば、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 あるいはアセテート塩やトリフルオロ酢酸塩といった、それらの薬学的に許容可能な塩) の眼球投与への投与は、神経変性疾患の治療あるいは予防に有益であることを示す。特に、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 といった、当該発明技術の芳香族カチオン性ペプチドは、対象者のパーキンソン病を予防あるいは治療のために有益な方法であることを示す。
実施例 20 - 本発明技術の芳香族カチオン性ペプチドの眼球投与によるALS羅患対象者の生存期間の増大
(0353) 本発明技術の芳香族カチオン性ペプチド (例えば、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 あるいはアセテート塩やトリフルオロ酢酸塩といった、それらの薬学的に許容可能な塩)の投与により、ALS 羅患する、あるいはALS発症のおそれがある対象者の生存率が増大するかを決定すべく、G93A 遺伝子組み換え血族 ALS マウスに、生後30日から、実施例10〜19で記述された眼球送達システムを用いて当該芳香族カチオン性ペプチドを毎日投与した。当該マウスには、震戦および後肢把持の出現のほか、ロータロッドでの運動機能低下により疾患発現と判断された時点で検査を実施した。
(0354) 当該芳香族カチオン性ペプチドは、当該芳香族カチオン性ペプチドを投与されなかった対象者で観測された発現時と比較し、疾患発現を遅延させ、従って、当該芳香族カチオン性ペプチドの眼科領域の投与は、対象者のALS予防あるいは治療に有益な方法である。
(0355) これらの結果は、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2といった本発明技術の芳香族カチオン性ペプチドの眼球送達が、神経変性疾患の治療あるいは予防に有益であることを示す。特に、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2といった本発明技術の当該芳香族カチオン性ペプチドの眼球投与は、対象者のALS予防あるいは治療に有益な方法である。
実施例 21 -本発明技術の芳香族カチオン性ペプチドの投与による、急性眼性虚血が原因の微小血管性損傷/障害の予防、治療、あるいは改善
(0356) 網膜および視神経への虚血侵襲は、緑内障、急性眼性高血圧、糖尿病性網膜症、高血圧、脈管閉塞、そして巨細胞動脈炎において頻繁に認められ、ニューロンで膠網膜要素を重大な撹乱に至り、最後には失明に至ることがある。虚血再灌流損傷により特徴づけられる眼圧 (IOP) の急性上昇のラットモデルを、Grozdanicおよび同僚 (2003)により記述されたように使用し、急性眼性虚血後の微小血管性損傷/障害に対する、本発明技術の芳香族カチオン性ペプチド (例えば、D-Arg-2’,6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 あるいは、アセテート塩やトリフルオロ酢酸塩といった、それらの薬学的に許容可能な塩) の投与の効果を決定した。(一般的に、Grozdanic, SD ら、Functional characterization of retina and optic nerve after acute ocular ischemia in rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2003 Jun;44(6):2597-605 を見よ)。すなわち、急激な IOP上昇 (110 mm Hg/60 分) により、ラットの網膜虚血が誘発した。IOP 上昇治療 (用量/容積は決定予定) の約10分前に芳香族カチオン性ペプチドの注入を開始し、芳香族カチオン性ペプチドの注入時間は約70分間である。対象者の各眼球の網膜血管は、Brown およびMagargal により記述されているように、蛍光眼底血管造影法を使用して、損傷 (例えば、網膜毛管の非潅流、漏出など) が可視化し調査した。Brown GC, Magargal LE. The ocular ischemic syndrome. Clinical, fluorescein angiographic and carotid angiographic features. Int Ophthalmol. Feb 1988;11(4):239-51 を参照されたい。当該芳香族カチオン性ペプチドは、当該芳香族カチオン性ペプチドの投与を受けなかった対象者と比較した場合、網膜毛管の非潅流、漏出がより少ないことから判断して、網膜血管に損傷および／あるいは非潅流の程度を改善し、従って当該芳香族カチオン性ペプチドの投与は、対象者における急性眼性虚血後の微小血管性損傷/障害の予防、治療、あるいは改善に有益である。
(0357) これらの結果は、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 といった本発明技術の芳香族カチオン性ペプチドの眼球送達は神経変性疾患の治療あるいは予防に有益であることを示す。特に、当該結果はD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2といった本発明技術の当該芳香族カチオン性ペプチドは、対象者の急性眼性虚血が原因の微小血管性損傷/障害の予防あるいは治療に有益であることを示す。
実施例 22 - 本発明技術の芳香族カチオン性ペプチドの局所製剤
(0358) 本発明技術は、眼球組織への局所投与に有益な、本明細書で開示されている当該芳香族カチオン性ペプチドの製剤を提供するものである。
(0359) 眼球組織への適用に有益であり、作成可能な局所製剤の例示的実施例が以下に詳細に記述される。
(0360) 局所製剤 1：少なくともポリエチレングルコール 400 - 0.4 % 潤滑剤と プロピレングルコール - 0.3 % 潤滑剤から構成され、眼球組織への投与に適するpHに調整された、本発明技術の一種類または複数の芳香族カチオン性ペプチド (例えば、D-Arg-2’,6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 あるいは、アセテート塩やトリフルオロ酢酸塩といった、それらの薬学的に許容可能な塩)。
(0361) 局所製剤 2：少なくとも、ホウ酸、塩化カルシウム、ヒドロキシプロピル・グアー、塩化マグネシウム、塩化カリウム、純水、塩化ナトリウム、塩化亜鉛から構成され、そして塩酸そして／または水酸化ナトリウムを含み得る、眼球組織への投与に適するpHに調整された、本発明技術一種類または複数の芳香族カチオン性ペプチド (例えば、D-Arg-2’,6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 あるいは、アセテート塩やトリフルオロ酢酸塩といった、それらの薬学的に許容可能な塩)。
(0362) 局所製剤 3：少なくとも、ポビドン、ホウ酸、塩化カリウム、ホウ酸ナトリウム、塩化ナトリウム、エデト酸二ナトリウム、ソルビン酸から構成され、眼球組織への投与に適するpHに調整された、本発明技術の一種類または複数の芳香族カチオン性ペプチド (例えば、D-Arg-2’,6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 あるいは、アセテート塩やトリフルオロ酢酸塩といった、それらの薬学的に許容可能な塩)。
(0363) 局所製剤 4:少なくとも、塩化ベンザルコニウム、ホウ酸、エデト酸二ナトリウム、純水、ホウ酸ナトリウムと塩化ナトリウムから構成され、眼球組織への投与に適するpHに調整された、本発明技術の一種類または複数の芳香族カチオン性ペプチド (例えば、D-Arg-2’,6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 あるいは、アセテート塩やトリフルオロ酢酸塩といった、それらの薬学的に許容可能な塩)。
(0364) 局所製剤 5：少なくとも、ホウ酸、塩化カルシウム二水和物、クエン酸一水和物、GenAqua（ペロオキシホウ酸ナトリウム）、塩化マグネシウム六水化物、ホスホン酸、塩化カリウム、純水、そして、塩化ナトリウムから構成され、眼球組織への投与に適するpHに調整された、本発明技術の一種類または複数の芳香族カチオン性ペプチド (例えば、D-Arg-2’,6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 あるいは、アセテート塩やトリフルオロ酢酸塩といった、それらの薬学的に許容可能な塩)。
(0365) 局所製剤 6：少なくとも、グリセリン、ヒマシ油、ポリソルベート80、カルボマー共重合体タイプA、純水、そして水酸化ナトリウムから構成され、適するpHに調整された、本発明技術の一種類または複数の芳香族カチオン性ペプチド (例えば、D-Arg-2’,6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 あるいは、アセテート塩やトリフルオロ酢酸塩といった、それらの薬学的に許容可能な塩)。
(0366) また本発明技術は、眼球組織治療に適する局所製剤において、本発明技術一種類または複数の芳香族カチオン性ペプチドの治療上有効な量に局所投与を必要とする対象者でのドライアイ障害を予防、治療、あるいは改善する方法を提供する。簡潔に記述すれば、局所製剤 1〜6 (試験製剤) が、ドライアイの症状のおそれがある対象者、あるいはその症状を羅患する対象者に個別に投与し、涙液を測定する。当該製剤を投与した対象者での涙液の生成を増大させる局所製剤 1〜6 は、芳香族カチオン性ペプチドなしの対照製剤を受けた対象者と比較する場合、当該試験製剤は、対象者のドライアイ障害に予防、治療あるいは改善に有益であることが示される。
(0367) 局所製剤 1〜6 はまた、本発明技術の芳香族カチオン性ペプチドの眼球投与が、中枢神経系障害または本明細書に記述されている他の眼病に有益であろう。
(0368) 本実施例は、芳香族カチオン性ペプチドを、哺乳類対象者の眼疾患や障害あるいは神経疾患や障害の予防あるいは治療のために眼球送達するのに有益である芳香族カチオン性ペプチドの組成を示威するものである。
実施例 23 - 芳香族カチオン性ペプチドを使用した、糖尿病性黄斑浮腫の予防および治療 A. はじめに
(0369) 先天的に黄斑をもたない、単歯類、重歯類、肉食動物を実験モデルとして使用し、浮腫を網膜視細胞層内で表現し、網膜視細胞層の厚さを評価に使用する。その反面、非人類霊長類においては通常は黄斑が存在するので、黄斑内で浮腫を表現し、黄斑の厚さおよび／あるいは体積を評価に使用することができる。黄斑の厚さなどは、黄斑中心窩の部位で好ましく評価される。眼内虚血・再灌流処置は、眼内圧を上昇させてから次に、再灌流させるために眼内圧を低下させることにより網膜血流を阻止して容易に実施することができる。網膜視細胞層の厚さは、個別的にかなり異なるので、実験によっては、処置した眼と未処置の眼を好ましくは同一個体に設定し、片眼のみに眼内虚血・再灌流処置を実施した。このように実施することにより、「処置された眼の厚さ／未処置の眼の厚さ」の相対的評価を、各動物に未処置の眼に基づいて実施することが可能になる。
(0370) 評価すべき薬学的製剤 (例えば、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 )あるいは、アセテート塩やトリフルオロ酢酸塩といった、それらの薬学的に許容可能な塩を糖尿病黄斑症を羅患するモデル動物に投与してから、上述にように浮腫に対する薬学的製剤の有効性を評価し、ここで糖尿病黄斑症 (例えば、黄斑浮腫) に対する当該薬学的製剤の効果を評価することができる。薬学的製剤の投与方法は特に限定されず、経口、非経口、局所 (例えば、点眼または眼軟膏)、眼球投与が可能であり、薬学的製剤の投与方法は、眼内虚血／再灌流の導入後に実施され、従って治療効果を明確にすることができる。
B. 効能薬学的試験 1 - ラット試験 1
1. 試験方法
(0371) 体重約250gの SD系ラット (生後8週間) オスに、ストレプトゾトシン (シグマ社製STZ)を用量60 mg/kg で尾に静脈注射し糖尿病を誘発させる。STZによる処置から 1週間後に血清グルコーを測定し、少なくとも 300 mg/dl グルコースをもつラットを糖尿病ラットとして実験に供した。当該設定群は、下記の5群であり、STZ による処置から2週間後に 5% アラビアゴム感光液またはD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 溶液を、経口、非経口、局所で毎日1回または2回、2日間に下記のように投与する。
(0372) (1) 正常対照群 (ラット 5 匹)：5 ml/kg の比で 5% アラビアゴム感光液を与える。
(0373) (2) 糖尿病対照群 (ラット 7匹)：5 ml/kg の比で 6% アラビアゴム感光液を与える。
(0374) (3) 経口 D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (あるいは、アセテート塩やトリフルオロ酢酸塩といった、それらの薬学的に許容可能な塩)：糖尿病群には、100 mg/ml, 500 mg/ml または1000 mg/ml の D-Arg-2’,6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (各濃度で ラット 4 匹) を含むが、これらのみには限定されずに、約 1 ng/ ml ないし約 10,000 mg/ml のD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 の経口懸濁剤の 1ml を5% アラビアゴム感光液で毎日2回投与する。
(0375) (4) 非経口 D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2、あるいはアセテート塩やトリフルオロ酢酸塩といった、それらの薬学的に許容可能な塩：糖尿病ラットには、体重1キログラム当り約 1 ng ないし体重1キログラム当り約 10,000 mg のD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (各濃度で ラット 4 匹) を毎日2回、局所投与 (例えば、眼球付近) を実施する。
(0376) (5) 点眼 D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2、あるいはアセテート塩やトリフルオロ酢酸塩といった、それらの薬学的に許容可能な塩：糖尿病群には、約 0.1 ng/ml ないし約 1000 mg/ml (例えば、約 0.01 ng ないし約 100 mg) の D-Arg-2’,6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 溶液を、実施例10に従って処方された、1 mg/ml、10 mg/ml または100 mg/ml (各濃度で ラット 4 匹) を含むが、これらのみには限定されずに、毎日、直接眼球に2 滴 (約50 μl/滴) を投与する。
(0377) SZTの2週間にわたる投与後に、下記処置により眼内虚血を誘発させる。当該処置の完了後、実験動物通常通りに2日間飼育し、その後眼球を摘出し組織学的評価を実施する。薬学的製剤の投与もまた、虚血治療後、再灌流に対し実施した (2日間)。
2. 眼内圧上昇による網膜虚血誘発
(0378) 点滴セット(テルモ社製スルーフュージョン点滴セット) を眼内灌流溶液 (千寿製薬社製オープンガード MA) を含むびんに接続し、三方活栓が接続された延長チューブ (テルモ社) に接続する。針 (30Gx1/2、日本ベクトン・ディッキンソン社製) が当該チューム末端に取り付ける。眼内灌流溶液を含むビンを、スタンドを使用して一定の高さに固定する。当該ラットに五硼酸ナトリウム (シェリン・プロー アニマルヘルス社製ソムノペンチル) を50 mg/kg の割合でソムノペンチル投与して麻酔を施して腹腔内投与し、次に散瞳薬 (参天製薬社製マイドリンP)および局所麻酔 (参天製薬社製ベノキシル点眼 0.4%) を右眼に点眼する。麻酔薬は必要に応じて追加投与する。その後、針を当該ラットの右眼前眼房に刺し、当該三方活栓を操作しながら眼内圧を増大させる (眼内圧を60分間で130 mmgまで増大させる)。当該SD系ラットの網膜血流を停止させることで眼底が赤色から白色に変化するので、網膜虚血は容易に観察することができる。眼内圧を所定時間で増大させてから、当該針を抜き眼内圧を低下させて灌流を可能にしてから、抗菌点眼薬 (参天製薬社製タリビット眼軟膏) を右面に投与する。
3. 組織学的評価
(0379) 虚血治療後から2日後 (灌流から2日後)に、エーテル麻酔中に当該ラットの左右眼球を摘出する。摘出下眼球は、氷点に近い固定液 (3%のグルタルアルデヒドを含むリン酸塩緩衝液) 内に置き2日間固定した。その後、当該眼球リン酸塩緩衝液を使用して1日間洗浄する。洗浄した眼球は、通常の方法でパラフィンに埋め込み、視神経束を含む横断面を準備した。この横断面はヘマトキシリン・エオシン染色する。組織学的評価は、光学顕微鏡から画像分析器 (住化テクノサービス社製 IPAP-WIN) 左右側の2つの視野 (4視野/ラット)までを使用して実施した。
(0380) 得られる網膜像のそれぞれにおいて、視細胞層の厚さを測定する。浮腫の程度は、虚血/再灌流させた眼球 (右眼) の視細胞層の厚さを、統一対象者の未処置の眼球 (左眼) の視細胞層の厚さで割った値のパーセント割合で表現した。網膜細胞機能を指標として、内部網膜層 (神経節細胞層) 内の核が計数され、核喪失の程度が単位面積当たりに起こる核数の相対比で評価する。
4. 結果および考察
(0381) 正常対照群における虚血/再灌流させた視細胞層の厚さは、未処置眼球の厚さよりも薄いと予想される。その一方、糖尿病対照群のラットは、虚血/再灌流による視細胞層の増大を示すことが予想され、浮腫形成は統計学的有意性をもって示されることが期待される。D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2を投与した糖尿病群においては、当該厚さは正常対照群のそれとほぼ同じであり、浮腫は非常に低レベルで認められることが期待される。
(0382) 正常ラット対照群においては、核の喪失はないことが予想される。核の喪失は、糖尿病対照群のラットで顕著であることが予想される (例えば、核の50%以上の喪失を示す対象者を含み、対象者の30〜50%での核の顕著な喪失)。D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 を投与された糖尿病群においては、糖尿病対照群においてはと比較して、核が不在あるいは非常に多く消失することが予想される。
(0383) これらの結果により、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 が視細胞層における糖尿病下での浮腫形成を阻止し、また網膜細胞の機能障害を防止することが期待される。
(0384) これらの結果は、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 といった本発明技術の芳香族カチオン性ペプチドの経口、非経口、あるいは眼球送達が、哺乳類対象者の眼科障害の治療あるいは予防に有益であることを示す。特に、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2といった本発明技術の当該芳香族カチオン性ペプチドは、対象者の糖尿病性黄斑浮腫の予防や治療に有益な方法である。
C. 効能薬学的試験 2 - ラット試験 2
1. 試験方法
(0385) 試験は、上述の効能薬学的試験 1 に従って実施される。設定群は、SD系ラットオスの次の5群であり、STZ による処置から2週間後に, 5% アラビアゴム感光液または D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (あるいはアセテート塩やトリフルオロ酢酸塩といった、それらの薬学的に許容可能な塩) 溶液を、経口、非経口あるいは局所 (点眼) により、1日1回 投与する。
(0386) (1) 正常対照群 (10 ラット)：5 ml/kg の比率で 5% アラビアゴム感光液を与える。
(0387) (2) 糖尿病対照群 (9 ラット)：5 範囲の比率で 5% アラビアゴム感光液を与える。
(0388) (3) 経口 D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (あるいは、アセテート塩やトリフルオロ酢酸塩といった、それらの薬学的に許容可能な塩)：糖尿病群には、100 mg/ml, 500 mg/ml または1000 mg/ml の D-Arg-2’,6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (各濃度で ラット 4 匹) を含むが、これらのみには限定されずに、約 1 ng/ ml ないし約 10,000 mg/ml のD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 の経口懸濁剤の 1ml を5% アラビアゴム感光液で毎日1回投与する。
(0389) (4) 非経口 D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2、あるいはアセテート塩やトリフルオロ酢酸塩といった、それらの薬学的に許容可能な塩：糖尿病ラットには、体重1キログラム当り約 1 ng ないし体重1キログラム当り約 10,000 mg で、1 mg/kg、5 mg/kg、または10 mg/kg のD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (各濃度で ラット 4 匹) を含むが、これらのみには限定されず、毎日1回、局所投与 (例えば、眼球付近) を実施する。
(0390) (5) 点眼 D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2、あるいはアセテート塩やトリフルオロ酢酸塩といった、それらの薬学的に許容可能な塩：糖尿病群には、約 0.1 ng/ml ないし約 1000 mg/ml (例えば、約 0.01 ng ないし約 100 mg) の D-Arg-2’,6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 溶液を、実施例10に従って処方された、1 mg/ml、10 mg/ml または100 mg/ml (各濃度で ラット 4 匹) を含むが、これらのみには限定されずに、直接眼球に1日1回、2 滴を投与する。
(0391) 眼内圧増加により発症した網膜虚血が、効能薬学的試験 1 により実施される。組織学的評価もまた効能薬学的試験 1 により実施される。
2. 結果および考察
(0392) 正常対照群のラットにおける虚血/再灌流させた視細胞層の厚さは、未処置眼球の厚さよりも薄いと予想される。その一方、糖尿病対照群のラットは、虚血/再灌流による視細胞層の増大を示すことが予想され、浮腫形成は統計学的有意性 (例えば、p<0.05) をもって示されることが期待される。D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2を投与した糖尿病群においては、当該厚さは正常対照群のそれとほぼ同じ範囲/値であることが期待される。これらの結果は、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 の投与により、視細胞層における糖尿病下での浮腫形成が阻止されることを意味する。
(0393) これらの結果は、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 といった本発明技術の芳香族カチオン性ペプチドの経口、非経口、眼球送達が、哺乳類対象者の眼科障害の治療あるいは予防に有益であることを示す。特に、当該結果はD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2といった本発明技術の当該芳香族カチオン性ペプチドは、哺乳類対象者の糖尿病性黄斑浮腫の予防や治療に有益な方法であることを示す。
D. 効能薬学的試験 3 - サル (カニクイザル) 試験
1. 方法
(0394) 体重が約 2.1 ないし 2.4 kg のサル (カニクイザル) のオス(3歳)に用量 80 mg/kg で前脚にSTZを静脈注射することにより、糖尿病を誘発させる。STZ を用いた処置から2日後に、血糖値を測定し、少なくとも 200 mg/dl のグルコースを示すサルを糖尿病サルとして実験に供した。血糖値が300 mg/dlを示すサルに1日に1回または2回、インスリンを皮下投与する。設定群は、以下の5 群であり、STZ による処置から2週間後に、5% アラビアゴム感光液または D-Arg-2’, 6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (あるいはアセテート塩やトリフルオロ酢酸塩といった、それらの薬学的に許容可能な塩) 溶液を、経口、非経口あるいは局所 (点眼) により、1日1回 投与する。
(0395) (1) 正常対照群 (サル4 匹)：5 ml/kg の比率で 5% アラビアゴム感光液を投与する。
(0396) (2) 糖尿病対照群 (サル 6 匹)：5 ml/kg の比率で 5% アラビアゴム感光液を投与する。
(0397) (3) 経口 D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (あるいは、アセテート塩やトリフルオロ酢酸塩といった、それらの薬学的に許容可能な塩)：糖尿病サルには、100 mg/ml, 500 mg/ml または1000 mg/ml の D-Arg-2’,6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (各濃度で サル 4 匹) を含むが、これらのみには限定されずに、約 1 ng/ ml ないし約 10,000 mg/ml のD-Arg-2’,6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 の経口懸濁剤の 1 ml を5% アラビアゴム感光液で毎日1回投与する。
(0398) (4) 非経口 D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2、あるいはアセテート塩やトリフルオロ酢酸塩といった、それらの薬学的に許容可能な塩：糖尿病サルには、体重1キログラム当り約 0.1 ng ないし体重1キログラム当り約 10,000 mg で、1 mg/kg、5 mg/kg、または10 mg/kg のD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (各濃度で サル 4 匹) を含むが、これらのみには限定されず、毎日1回、局所投与 (例えば、眼球付近) を実施する。
(0399) (5) 点眼 D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2、あるいはアセテート塩やトリフルオロ酢酸塩といった、それらの薬学的に許容可能な塩：糖尿病サルには、約 0.1 ng/ml ないし約 1000 mg/ml (例えば、約 0.01 ng ないし約 100 mg) の D-Arg-2’,6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 溶液を、実施例10に従って処方された、1 mg/ml、10 mg/ml または100 mg/ml (各濃度で ラット 4 匹) を含むが、これらのみには限定されずに、直接眼球に毎日1回、2滴 (約50 μl/滴)を投与する。
(0400) 2週間の投与後、眼内虚血処置が下記にように実施され、処置完了後に実験動物は7日間通常通り飼育される。虚血処置前および処置から7日後に、黄斑中心窩の厚さと体積をOCT スキャナー (カールツァイス社製ストラタス OCT) を使用して、測定 (眼底の黄斑中央から1mm の範囲の直径) する。当該薬物の投与はまた、虚血処置後に再灌流も当該期間 (7日間) 実施する。
(0401) 眼内圧増大により起こされた網膜虚血は、効能薬学的試験 1に従って調査を実施する。しかしながら、ニードルの大きさは 25G x 1/2 (テルモ社) を使用する。散瞳薬 (参天製薬社製マイドリン P) が右眼に点眼された後、当該サルにはケタラール (三共ライフテック)を筋肉内投与して麻酔を実施する。続いて、局所麻酔 (ベネキシル点眼 0.4%) を眼に落とし、当該サルに開瞼器を当て瞬きを防ぐ。ケタラールによる追加の麻酔は必要に応じて実施する。
(0402) 次の方法で黄斑中心窩の厚さと体積を測定する。散瞳薬 (マイドリン P) を当該サルの右眼に落として十分に瞳孔を散大させてから、当該サルにはケタラールを筋肉投与して麻酔を実施する。その後、当該サルをモンキーチェアに座らせ頭部を固定する。眼球内部を OCT スキャナーを使用して観察して黄斑中心窩を特定してからスキャニングする。結果として得られる断面網膜像から黄斑中心窩の厚さと体積を分析する。
2. 結果
(0403) 正常対照群においては、浮腫形成が認められず、虚血処置および再灌流後の黄斑中心窩の厚さと体積 (平均値) は、処置 (虚血−再灌流) 前そして措置から7日後でも同じであると予想される。糖尿病対照群においては一方、虚血−再灌流処置から7日後に測定したときは、黄斑中心窩の厚さと体積が増大しており、浮腫の形成は統計的優位性により確認されることが予想される。糖尿病群でのこの変化 (黄斑中心窩の厚さと体積の増大) は、正常対照群と比較して、有意に増大することが予想される。D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 を投与した糖尿病群においては、浮腫形成が観測されるとは予想されない (例えば、これらの試験体は正常対照群と同様であると予想される)、あるいは、糖尿病対照群において観測されるものとは統計的に優位な程度で少ない。これらの結果は、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 の投与により、黄斑中心窩における糖尿病下での浮腫形成が阻止されることを意味する。
(0404) これらの結果は、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 といった本発明技術の芳香族カチオン性ペプチドの経口、非経口、あるいは眼球送達は哺乳類対象者の眼疾患の予防あるいは治療に有益であることを示す。特に、これらの結果はD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2といった本発明技術の当該芳香族カチオン性ペプチドは、哺乳類対象者の糖尿病性黄斑浮腫の予防や治療に有益な方法であることを示す。
E. 効能薬学的試験 4 - 臨床結果
1. 方法
(0405) 糖尿病黄斑症患者中、網膜厚の増大あるいは網膜後極における固い滲出液を有する糖尿病性黄斑浮腫の患者10 名が治験者である。D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (あるいは、アセテート塩やトリフルオロ酢酸塩といった、それらの薬学的に許容可能な塩) は、経口、非経口あるいは局所的 (点眼) に、動物モデルにおいて決定された、最も有効な用量に対応する量で朝食前に1日1回、8週間投与する。この試験期間中は、エパルレスタットの同時使用、副腎皮質性ホルモンの硝子体内注入と下位テノン嚢注入、そして光凝固と硝子体切徐は禁止する。糖尿病の基本的治療を実施し、試験期間中は良好な血糖値を与える。
(0406) 黄斑中心窩の厚さ (眼底の黄斑中央から1mm の範囲の直径)、OCT スキャナー (カールツァイス社製 OCT) を使用して、黄斑中心窩中央で測定された厚さ、および補正された視力 (Log MAR) を用いて評価される。
(0407) Log MAR (解像度の最小角度の対数) は、対数視力の1種であり、視力が解像度の最小角度の対数で表わされる。小数視力 1.0 はLog MAR では 0.0 であり、小数視力 0.1 はLog MAR では 1.0 である。Log MAR 視力 0.1〜0.5 は、少数視力 0.8〜0.32 に対応する。
2. 結果
(0408) 当該10症例からすべての評価可能な眼を評価する。試験が開始されると、黄斑中心窩の厚さ (直径範囲 1 mm) は平均値約 325 μm であることが予想され、中心窩の中央部厚さは平均的には同様であると予想される。8 週間後、これらの寸法は平均として約3〜10％またはそれ以上減少 (例えば、それぞれ約 300 μm ) することが期待される。
(0409) これらの評価された眼からは、補正視力は、すべてでなければ大部分の対象者で認識されると予想され、後退はわずかまたは皆無であろう。補正視力 (Log MAR) 平均値は処置群の対象者では改善が期待される。D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 により、黄斑障害の治療において重要な視力改善効果があることが示されることが期待され、特に黄斑浮腫 の場合ではそうである。
(0410) 従来の研究によれば、糖尿病黄斑症は、治療が困難であり徐々に悪化する疾患であると見なされてきた。本実施例の結果は、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 が糖尿病黄斑浮腫の治療に効果があることを示す。安全に関しては、特に問題となる副作用は予想されない。
(0411) これらの結果により、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2といった、本発明技術の芳香族カチオン性ペプチドを、経口、非経口、眼内にて送達することは、哺乳類対象者の眼科障害の予防あるいは治療に有益であることが示される。特に、これらの結果によれば、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2といった、本発明技術の芳香族カチオン性ペプチドは、哺乳類対象者の糖尿病黄斑浮腫の予防あるいは治療に有益であることが示される。
実施例 24 - 芳香族カチオン性ペプチドを使用した、糖尿病黄斑浮腫の治療および予防
A. 概要
(0412) 糖尿病対照ラット群においては、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 (あるいは、アセテート塩やトリフルオロ酢酸塩といった、それらの薬学的に許容可能な塩) の投与を受ける糖尿病ラット、年齢を合わせた対照ラット群、そして希釈性低ナトリウム血症を持つラット群 (正の浮腫対照群として) においては、全中心網膜厚、網膜内含水量、および見かけの拡散係数 (ADC、「水分移動性」) を定量MRI方法を使用して生体内測定するが、この方法は、Berkowitz ら、(Jan. 2012) PLoS One, vol. 7, issue 1 に記述されている。糖化ヘモグロビンおよび網膜厚の体外測定 (組織学) もまた、対照糖尿病群およびD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 処置群で実施される。
B. 方法：
1. 糖尿病の誘発
(0413) 0.01 Mのクエン酸ナトリウム緩衝 (pH 4.5) 内で調整したストレプトゾシンを5分以内に一晩絶食させた体重約200gのオス SD ラットに腹腔内注射 (60 mg/kg) して糖尿病を誘発させる。糖尿病は、非絶食のラットでの血漿高血糖 (>300 mg/dl) と排尿量増加 (60 ml/d 以上) により3日後に確認される。ラットの体重および血糖値レベルは毎週測定される。治療量以下レベルのインスリン (毎日皮下投与される0〜2 Uの NPHインスリン) を投与し血糖値レベルを尿中ケトン無しで450ないし550 mg/dl に維持する。糖化ヘモグロビンを糖尿病2ヵ月後に測定する (米国テキサス州ビューモント所在のヘレナ・ラボラトリーズ社製 グリコ・テック親和性カラム、キット 5351)。
2. 希釈性低ナトリウム血症の誘発およびスキャニング
(0414) 希釈性低ナトリウム血症 (DH) を羅患するラット：ウレタンで麻酔を実施した後 (MRIのために実施、以下参照)、糖尿病ではないラット (n =5) をスキャンし (preDH)、次に2回目のMRI スキャン (postDH、スキャン時間開始間 3.860.2 時間 (平均 6 SEM)) の前に蒸留水を腹腔内に注射する (3回注射、体重1kg当り50 ml、5分間間隔)、(ii) 網膜の厚さ測定中にADC測定、特に DH 群において使用された長時間麻酔に関する反復性試験に使用した非糖尿病対照群 (n =4) がスキャン (早期 C)され、次に2回目のスキャン(後続 C、スキャニング時間開始時刻間 4.660.3 時間) 前に数時間維持、(iii)糖尿病オス SD ラット (D)にスキャンを1回 実施する (n= 7)、そして (iv) 対応する組の年齢を合わせた対照群 (C) にスキャンを1回実施する (n= 8)。
3. D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH 2 による治療
(0415) 生後9ヶ月の糖尿病ラットをD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 を1、5または10 mg/kgの用量で腹腔 (IP) または皮下 (SC) のいずれかの方法で注射して処置する。注射は1回/日である。処置から7日後に、処置群および対照群のラットの網膜を評価する。
4. 評価
(0416) オス SD ラットを、Berkowitz らの方法に従って MRI で評価する。糖尿病誘発から、2、3、4、6、9 ヵ月後、そして年齢を合わせた非糖尿病対照群で中心網膜厚を測定する。D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 処置から7日後に、ラットをBerkowitz らの方法に従って MRI で再評価する。
5 結果
(0417) 希釈性低ナトリウム血症モデルにおいては、中心網膜厚および水分含有量は、定量 MRI により過正常であることが予想され、また網膜内水移動性のプロフィールは、細胞内浮腫のそれと一致すると予想される。糖尿病対照ラット群は過正常の全中心網膜厚を示すと予想される。水分含有の測定基準は正常より有意に大きいことが予想され、見かけの拡散係数は 網膜外周で亜正常であると予想される。D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 で処置した糖尿病ラットは、網膜厚、網膜内水分含有量、そして見かけの拡散係数においては正常値からややずれることが予想される。例証的データを下表 21 に示す。N は正常範囲を示し、+ は正常値からのずれを示すが、このずれは測定内容に応じて上下にばらつく。
(0418) これらの結果により、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2といった、本発明技術の芳香族カチオン性ペプチドの腹腔内 (IP) あるいは皮下 (SC) 送達は、哺乳類対象者における眼病あるいは眼疾患や障害の予防あるいは治療に有益である。特に、当該結果はD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2といった、本発明技術の芳香族カチオン性ペプチドが、哺乳類糖尿病黄斑浮腫の予防あるいは治療に有益であることを示す。
実施例 25 - D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH 2 を投与してストレプトゾトシン(STZ) 処置したマウスの空間周波数 (SPF) 応答
(0419) 本実施例は、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 を投与してストレプトゾトシン (STZ) 処置したマウスの空間周波数 (SPF) 応答を示すものである。
(0420) 試験体は、普通食 (ND) あるいは糖尿病食 (DD) で32週間まで飼育され、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 あるいはストレプトゾトシン付きまたは無しの対照溶媒を投与した。結果を図 41 に示し、ここで応答値は各眼に対し平均化される。
(0421) これらの結果により、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 は代謝機能不全を有する動物における視力障害を回復することが示される。STZ 処置を受けた動物は視力機能が最も衰えていたが、12週間目での全身治療開始後、24週間のD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 投与により障害は完全に回復したことが示された。糖尿病食の動物のみでは、12週間までにより大きな衰退が認められ、または30週間までには回復も認められた。
(0422) 糖尿病食で飼育しSTZ を投与した、視覚障害を伴う最大レベルの視力低下を示した動物は24週間までに完全に回復した。点眼によりD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2 を投与された場合、糖尿病食で飼育されSTZ-処置された動物の場合では、全身投与の場合よりも1ヶ月早く視力障害が回復したことが認められた。
(0423) これらの結果により、D-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2といった、本発明技術の芳香族カチオン性ペプチドは、哺乳類対象者における眼科領域障害の予防あるいは治療に有益である。特に、当該結果はD-Arg-2,’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2といった、本発明技術の芳香族カチオン性ペプチドが、哺乳類の糖尿病により誘発される視力障害の予防あるいは治療に有益である。
等価内容
(0424) 本発明は、本出願において記述される特定の態様によって限定されるものではなく、これらの実施例は当該発明の局面を個別に例示することを意図とする。当業者には自明なように、本発明の変更および改変は、発明の範囲を遺脱せずに多数実現することが可能である。本発明の範囲内で機能的に等価な方法および装置を本明細書に列挙されているものに追加することは、前述から当業者には自明であろう。そのような変更および改変は、付記した請求項目の範囲内に入る。本発明は、当該請求項目が主張する内容と等価な範囲全体と共に、付記請求項目のみにより限定されるべきである。本発明は、特定の方法、試薬、合成物、組成物または生体系には限定されないと理解すべきであり、これらは当然変化する。また、本明細書で使用した用語は、特定の態様を記述する目的のみに使用されたものであり、限定的な意図はない。
(0425) 更に、本発明の開示の特長あるいは局面は、マーカッシュ形式群により記述されており、当業者は、本開示はまた、従って、マーカッシュ形式群の個々の項目あるいは項目の下位群によっても開示されることを認識するであろう。
(0426) 当業者には理解されるように、如何なるかつ全ての目的に対し、特に提供された記述においては、本明細書で開示された範囲全体はまた、全ての可能な下位範囲およびそれらの下位範囲の組み合わせを包括するものである。列挙された範囲は如何なるものでも、同じ範囲を少なくとも半分、三分の一、四分の一などに容易に分割しながら、十分に記述しまた実施可能であることは、容易に認識することができる。非限定的例として、本明細書で記述された各範囲は、下位三分の一、中央三分の一、上部三分の一などに容易に分割することができる。当業者には理解されるように、「最大で」、「少なくとも」、「以上」、「以下」といった言語表現には、引用された数値および範囲が含まれており、続いて、上述のように議論された下位範囲分割することも含まれている。最後に、当業者が理解するように、一つの範囲には個々の構成項目を含む。従って、例えば、1ないし3個の細胞を有する群とは、1、2、または3 個の細胞を有する群を意味する。同様に、1ないし5個の細胞を有する群とは、1、2、3、4、または5個の 細胞を有する群を意味する。
(0427) 本明細書で引用した全ての特許、特許出願、仮出願、および公報は、全ての図および表を含み、それらが本明細書が明示的に教える内容と不一致しない限りにおいて、それらの全体が組み入れられる。
(0428) 他の態様が次のクレームの範囲内で設定される。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕糖尿病性黄斑浮腫の症状を予防、治療または改善する必要のある哺乳類対象者において糖尿病性黄斑浮腫の症状を予防、治療または改善する方法であって、
該対象者に、治療上有効な用量のペプチド D-Arg-2'6'-Dmt-Lys-Phe-NH 2 またはその薬学的に許容可能な塩を投与する工程を含み、
該ペプチドを、眼内に、経口的にまたは非経口的に投与することを特徴とする、方法。
〔２〕前記治療上有効な用量のペプチドを、眼の1種以上の領域に眼内投与する、前記〔1〕に記載の方法。
〔３〕前記眼の1種以上の領域が、後眼房、鋸状縁、毛様体筋、毛様体小帯、シュレム管、瞳孔、前眼房、角膜、虹彩、レンズ皮質、レンズ核、毛様体突起、結膜、下傾斜筋肉、下直筋、内側直筋、網膜動脈と静脈、視神経円板、硬膜、中心網膜動脈、中心網膜静脈、視神経、渦静脈、テノン嚢、黄斑、中心窩、強膜、脈絡膜、上直筋、および網膜から成る群から選択される、前記〔2〕に記載の方法。
〔４〕前記眼の領域が、黄斑である、前記〔3〕に記載の方法。
〔５〕前記哺乳類が、ヒトである、前記〔1〕に記載の方法。
〔６〕前記対象者が、黄斑変性、中心網膜厚、網膜内含水量、黄斑中心窩厚、対比感度、または視力の喪失の1種以上を有する恐れがある、有する疑いがある、または有すると診断される、前記〔1〕に記載の方法。
〔７〕前記ペプチドを、少なくとも1種の追加の治療薬と組み合わせて投与する、前記〔1〕に記載の方法。
〔８〕前記追加の治療薬を、ペプチド投与前に、ペプチド投与後に、ペプチド投与と同時に、またはこれらの組み合わせで投与する、前記〔7〕に記載の方法。
〔９〕糖尿病性黄斑浮腫の症状を予防、治療または改善する必要のある哺乳類対象者において糖尿病性黄斑浮腫の症状を予防、治療または改善するための組成物であって、
治療上有効な用量のペプチド D-Arg-2'6'-Dmt-Lys-Phe-NH 2 またはその薬学的に許容可能な塩を含み、
該組成物を、眼内に、経口的にまたは非経口的に投与することを特徴とする、組成物。
〔１０〕前記組成物を、眼の1種以上の領域に眼内投与する、前記〔9〕に記載の組成物。
〔１１〕前記眼の1種以上の領域が、後眼房、鋸状縁、毛様体筋、毛様体小帯、シュレム管、瞳孔、前眼房、角膜、虹彩、レンズ皮質、レンズ核、毛様体突起、結膜、下傾斜筋肉、下直筋、内側直筋、網膜動脈と静脈、視神経円板、硬膜、中心網膜動脈、中心網膜静脈、視神経、渦静脈、テノン嚢、黄斑、中心窩、強膜、脈絡膜、上直筋、および網膜から成る群から選択される、前記〔10〕に記載の組成物。
〔１２〕前記眼の領域が、黄斑である、前記〔11〕に記載の組成物。
〔１３〕前記哺乳類が、ヒトである、前記〔9〕に記載の組成物。
〔１４〕前記対象者が、黄斑変性、中心網膜厚、網膜内含水量、黄斑中心窩厚、対比感度、または視力の喪失の1種以上を有する恐れがある、有する疑いがある、または有すると診断される、前記〔9〕に記載の組成物。
〔１５〕前記組成物を、少なくとも1種の追加の治療薬と組み合わせて投与する、前記〔9〕に記載の組成物。
〔１６〕前記追加の治療薬を、前記組成物の前に、前記組成物の後に、前記組成物と同時に、またはこれらの組み合わせで投与する、前記〔15〕に記載の組成物。
〔１７〕急性眼性虚血に起因する微小血管性損傷を予防、治療または改善する必要のある哺乳類対象者において急性眼性虚血に起因する微小血管性損傷を予防、治療または改善する方法であって、
該対象者に、治療上有効な用量のペプチド D-Arg-2'6'-Dmt-Lys-Phe-NH 2 またはその薬学的に許容可能な塩を投与する工程を含み、
該ペプチドを、眼内に、経口的にまたは非経口的に投与することを特徴とする、方法。
〔１８〕前記対象者に、血管再建術を実施する工程をさらに含む、前記〔17〕に記載の方法。
〔１９〕前記対象者に、前記ペプチドを眼性虚血形成の前または後に投与する、前記〔17〕に記載の方法。
〔２０〕前記対象者に、前記ペプチドを血管再建術の前、途中または後に投与する、あるいは、血管再建術の前、途中および後に連続投与する、前記〔17〕に記載の方法。
(0428) 他の態様が次のクレームの範囲内で設定される。

Claims (20)

  1. 糖尿病性黄斑浮腫の症状を予防、治療または改善する必要のある哺乳類対象者において糖尿病性黄斑浮腫の症状を予防、治療または改善する方法であって、
    該対象者に、治療上有効な用量のペプチド D-Arg-2'6'-Dmt-Lys-Phe-NH2 またはその薬学的に許容可能な塩を投与する工程を含み、
    該ペプチドを、眼内に、経口的にまたは非経口的に投与することを特徴とする、方法。
  2. 前記治療上有効な用量のペプチドを、眼の1種以上の領域に眼内投与する、請求項1に記載の方法。
  3. 前記眼の1種以上の領域が、後眼房、鋸状縁、毛様体筋、毛様体小帯、シュレム管、瞳孔、前眼房、角膜、虹彩、レンズ皮質、レンズ核、毛様体突起、結膜、下傾斜筋肉、下直筋、内側直筋、網膜動脈と静脈、視神経円板、硬膜、中心網膜動脈、中心網膜静脈、視神経、渦静脈、テノン嚢、黄斑、中心窩、強膜、脈絡膜、上直筋、および網膜から成る群から選択される、請求項2に記載の方法。
  4. 前記眼の領域が、黄斑である、請求項3に記載の方法。
  5. 前記哺乳類が、ヒトである、請求項1に記載の方法。
  6. 前記対象者が、黄斑変性、中心網膜厚、網膜内含水量、黄斑中心窩厚、対比感度、または視力の喪失の1種以上を有する恐れがある、有する疑いがある、または有すると診断される、請求項1に記載の方法。
  7. 前記ペプチドを、少なくとも1種の追加の治療薬と組み合わせて投与する、請求項1に記載の方法。
  8. 前記追加の治療薬を、ペプチド投与前に、ペプチド投与後に、ペプチド投与と同時に、またはこれらの組み合わせで投与する、請求項7に記載の方法。
  9. 糖尿病性黄斑浮腫の症状を予防、治療または改善する必要のある哺乳類対象者において糖尿病性黄斑浮腫の症状を予防、治療または改善するための組成物であって、
    治療上有効な用量のペプチド D-Arg-2'6'-Dmt-Lys-Phe-NH2 またはその薬学的に許容可能な塩を含み、
    該組成物を、眼内に、経口的にまたは非経口的に投与することを特徴とする、組成物。
  10. 前記組成物を、眼の1種以上の領域に眼内投与する、請求項9に記載の組成物。
  11. 前記眼の1種以上の領域が、後眼房、鋸状縁、毛様体筋、毛様体小帯、シュレム管、瞳孔、前眼房、角膜、虹彩、レンズ皮質、レンズ核、毛様体突起、結膜、下傾斜筋肉、下直筋、内側直筋、網膜動脈と静脈、視神経円板、硬膜、中心網膜動脈、中心網膜静脈、視神経、渦静脈、テノン嚢、黄斑、中心窩、強膜、脈絡膜、上直筋、および網膜から成る群から選択される、請求項10に記載の組成物。
  12. 前記眼の領域が、黄斑である、請求項11に記載の組成物。
  13. 前記哺乳類が、ヒトである、請求項9に記載の組成物。
  14. 前記対象者が、黄斑変性、中心網膜厚、網膜内含水量、黄斑中心窩厚、対比感度、または視力の喪失の1種以上を有する恐れがある、有する疑いがある、または有すると診断される、請求項9に記載の組成物。
  15. 前記組成物を、少なくとも1種の追加の治療薬と組み合わせて投与する、請求項9に記載の組成物。
  16. 前記追加の治療薬を、ペプチド投与前に、ペプチド投与後に、ペプチド投与と同時に、またはこれらの組み合わせで投与する、請求項15に記載の組成物。
  17. 急性眼性虚血に起因する微小血管性損傷を予防、治療または改善する必要のある哺乳類対象者において急性眼性虚血に起因する微小血管性損傷を予防、治療または改善する方法であって、
    該対象者に、治療上有効な用量のペプチド D-Arg-2'6'-Dmt-Lys-Phe-NH2 またはその薬学的に許容可能な塩を投与する工程を含み、
    該ペプチドを、眼内に、経口的にまたは非経口的に投与することを特徴とする、方法。
  18. 前記対象者に、血管再建術を実施する工程をさらに含む、請求項17に記載の方法。
  19. 前記対象者に、前記ペプチドを眼性虚血形成の前または後に投与する、請求項17に記載の方法。
  20. 前記対象者に、前記ペプチドを血管再建術の前、途中または後に投与する、あるいは、血管再建術の前、途中および後に連続投与する、請求項17に記載の方法。
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