JP2019019119A - Ｒａｇｅアプタマーを含む癌を治療するための医薬組成物 - Google Patents
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Abstract
【課題】「ＲＡＧＥ」は、膜貫通型の細胞表面タンパク質であり、ＣＭＬを含む終末糖化産物（ＡＧＥｓ）の受容体として機能している。本開示は、ＲＡＧＥアプタマーの新規治療用途を提供することを目的とする。【解決手段】本開示は、メラノーマ、膵臓癌、乳癌、肺癌、腎細胞癌、大腸癌、および肝癌からなる群から選択される癌を治療するための、ＲＡＧＥアプタマーを含む医薬組成物に関する。【選択図】図２
Description
本開示は、ＲＡＧＥアプタマーの治療用途に関する。
終末糖化産物（Advanced Glycation End-products；ＡＧＥｓ）は、グルコースなどの還元糖のカルボニル基と、タンパク質のアミノ基との非酵素的な反応（メイラード反応）により生じる高分子物質である。糖尿病などで慢性的に高血糖が続くと、循環血液中や組織でＡＧＥｓの生成が促進される。ＡＧＥｓは、その受容体であるＲＡＧＥ（Receptor for AGEs）を介して、様々な糖尿病関連疾患や加齢関連疾患に関与することが示唆されている。
アプタマーは、一本鎖の短いＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドであり、様々な標的に高い親和性および特異性で結合することができる。これまでに、ＲＡＧＥに結合してＲＡＧＥとそのリガンドとの結合を阻害するアプタマーが、糖尿病合併症や高血圧性腎障害の治療に有効であることが報告されている（特許文献１）。
本開示は、ＲＡＧＥアプタマーの新規治療用途を提供することを目的とする。
本開示は、ある態様において、ＲＡＧＥアプタマーを含む癌を治療するための医薬組成物に関する。
本開示により、ＲＡＧＥアプタマーを有効成分とする癌の治療薬が提供される。
特に具体的な定めのない限り、本明細書で使用される用語は、有機化学、医学、薬学、分子生物学、微生物学等の分野における当業者に一般に理解されるとおりの意味を有する。以下にいくつかの本明細書で使用される用語についての定義を記載するが、これらの定義は、本明細書において、一般的な理解に優先する。
「ＲＡＧＥ」（Receptor for AGEs）は、膜貫通型の細胞表面タンパク質であり、ＣＭＬ（Nε-(carboxymethyl) lysine）を含む終末糖化産物（ＡＧＥｓ）の受容体として機能する。ＲＡＧＥのリガンドとしては、グリセルアルデヒド由来のＡＧＥ−２を含む各種ＡＧＥｓの他、ＨＭＧＢ−１（High Mobility Group Box 1）およびＬＰＳなどが知られている。
「アプタマー」は、特異的に標的物質に結合する能力を持った一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡであり、種々の立体構造をとりタンパク質や化合物に結合して抗体のような機能を発揮する。本明細書において「ＲＡＧＥアプタマー」とは、ＲＡＧＥに結合してＲＡＧＥとそのリガンドとの結合を阻害する、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。
ＲＡＧＥアプタマーは、ＳＥＬＥＸ（Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment）法によって調製することができる。一本鎖ＤＮＡをライブラリー源とするＳＥＬＥＸ法の概要を以下に説明する。まず、任意の２つのプライマー配列で挟まれた適当な長さのランダム配列を含むテンプレートＤＮＡを合成する。本発明においては、ランダム配列の長さは、３５塩基〜１２０塩基が適切である。このテンプレートＤＮＡをＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction：ポリメラーゼ連鎖反応）で増幅して、ランダムＤＮＡアプタマープールを得る。次いで、このランダムＤＮＡアプタマープールを標的物質と会合させ、結合しなかったＤＮＡを除去し、そして結合したＤＮＡアプタマーを抽出する。得られたＤＮＡアプタマーを、上記プライマー配列を用いるＰＣＲによって増幅する。このとき、５〜８ｍＭのＭｇ２＋存在下でＰＣＲを行って、複製の正確性を低下させて変異を導入しやすくすることにより、標的物質との会合前のＤＮＡアプタマープールに存在しない新たなＤＮＡアプタマーを含むＤＮＡアプタマープールが得られる。新たなＤＮＡアプタマーは、結合力がより強い可能性があり、すなわち、ＤＮＡアプタマーが進化する可能性が生じる。この進化したＤＮＡアプタマープールについて、上記の一連の操作を５〜１５ラウンド繰り返すことによって、標的物質に結合するＤＮＡアプタマーが得られる。最終ラウンドの後、得られたＤＮＡアプタマープールは、当業者が通常行う操作によってクローニングされ、次いで配列決定される。このＳＥＬＥＸ法における、テンプレートＤＮＡの合成、ＰＣＲなどの操作、ならびにクローニングおよび配列決定は、当業者が通常用いる方法によって行われる。ＲＡＧＥアプタマーは、このようにして決定された配列に基づいて、当業者が通常用いる方法によって化学合成することができる。
ＲＡＧＥアプタマーは、その安定性を増加させるため、修飾ヌクレオチドにより構成されていてもよい。例えば、ＲＡＧＥアプタマーは、ヌクレオチド間の結合部位にあるリン酸基の一部または全部において酸素原子が硫黄原子に置換された、ホスホロチオエート型（Ｓ化）オリゴヌクレオチドであってよい。
ＲＡＧＥアプタマーは、一本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡのいずれであってもよいが、好ましくは一本鎖ＤＮＡである。ＲＡＧＥアプタマーは、少なくとも３５塩基からなり、好ましくは３５塩基〜１２０塩基、より好ましくは３５塩基〜７０塩基である、さらにより好ましくは３５塩基〜５０塩基である。
ある態様において、ＲＡＧＥアプタマーは、以下の配列番号１〜１０のいずれかの配列を含む一本鎖ＤＮＡである。
CCTGATATGGTGTCACCGCCGCCTTAGTATTGGTGTCTAC （配列番号１）
TCTGTTCAGGTTGGTACGGTGGAAGGTGTGATTCACGAGG （配列番号２）
CTTGGGTTGTTTATGTCGACCGCCAGTTTTGTGTTCAGCA （配列番号３）
CATTCTTAGATTTTTGTCTCACTTAGGTGTAGATGGTGAT （配列番号４）
TTGGTTCTCTTGCCCTCTTCTATTTTGTACGATGTTTCCT （配列番号５）
TTCCACTGAGTGCCGCGGACTGTTGTTGGGAGGTGGTGTG （配列番号６）
ATGGGGAGGAGGGGTGTCGTGGGGGGTGGGGGAGTGGGGA （配列番号７）
CTGGGGATGACTCGGATAGGATGTACGAGTTTGATGTGTA （配列番号８）
TTTGATCGAGCTGCGCCCTCCTCGCCGTAGAAGAGTGTGT （配列番号９）
TTTGGGGTGGAGTTAGGGGTGGATCAAGCGGGATTGTGTA （配列番号１０）
CCTGATATGGTGTCACCGCCGCCTTAGTATTGGTGTCTAC （配列番号１）
TCTGTTCAGGTTGGTACGGTGGAAGGTGTGATTCACGAGG （配列番号２）
CTTGGGTTGTTTATGTCGACCGCCAGTTTTGTGTTCAGCA （配列番号３）
CATTCTTAGATTTTTGTCTCACTTAGGTGTAGATGGTGAT （配列番号４）
TTGGTTCTCTTGCCCTCTTCTATTTTGTACGATGTTTCCT （配列番号５）
TTCCACTGAGTGCCGCGGACTGTTGTTGGGAGGTGGTGTG （配列番号６）
ATGGGGAGGAGGGGTGTCGTGGGGGGTGGGGGAGTGGGGA （配列番号７）
CTGGGGATGACTCGGATAGGATGTACGAGTTTGATGTGTA （配列番号８）
TTTGATCGAGCTGCGCCCTCCTCGCCGTAGAAGAGTGTGT （配列番号９）
TTTGGGGTGGAGTTAGGGGTGGATCAAGCGGGATTGTGTA （配列番号１０）
ＲＡＧＥアプタマーは、配列番号１〜１０のいずれかの配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらにより好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列同一性を有する配列を含み、ＲＡＧＥに結合してＲＡＧＥとそのリガンドとの結合を阻害する、一本鎖ＤＮＡであってよい。また、ＲＡＧＥアプタマーは、配列番号１〜１０のいずれかの配列において１、２、または３個の塩基が欠失、置換、または付加された配列を含み、ＲＡＧＥに結合してＲＡＧＥとそのリガンドとの結合を阻害する、一本鎖ＤＮＡであってもよい。
「配列同一性」とは、２つのオリゴヌクレオチド間の配列の類似の程度を意味し、比較対象の塩基配列の領域にわたって最適な状態（配列の一致が最大となる状態）にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。配列同一性の数値（％）は両方の配列に存在する同一の塩基を決定して、適合部位の数を決定し、次いでこの適合部位の数を比較対象の配列領域内の塩基の総数で割り、得られた数値に１００をかけることにより算出される。最適なアラインメントおよび配列同一性を得るためのアルゴリズムとしては、当業者が通常利用可能な種々のアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズム、ＦＡＳＴＡアルゴリズムなど）が挙げられる。塩基配列の配列同一性は、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどの配列解析ソフトウェアを用いて決定される。
ＲＡＧＥアプタマーがＲＡＧＥに結合してＲＡＧＥとそのリガンドとの結合を阻害するか否かは、例えば、ＥＬＩＳＡまたはＱＣＭ（quartz crystal microbalance）法により調べることができる。ＥＬＩＳＡの場合、ＡＧＥと結合するＲＡＧＥのＶドメイン（ｖ−ＲＡＧＥ）とＲＡＧＥアプタマーとを前反応させ、この反応混合物をＲＡＧＥのリガンド（例えばＡＧＥまたはＨＭＧＢ１）を固定化したＥＬＩＳＡプレートに添加して、プレート中のリガンドに結合したＲＡＧＥを抗ＲＡＧＥ抗体で検出する。あるいは、ｖ−ＲＡＧＥをＥＬＩＳＡプレートに固定化し、ＲＡＧＥアプタマーとそのリガンドとを添加して、ｖ−ＲＡＧＥに結合したリガンドを抗体により検出してもよい。ＱＣＭ法では、ＱＣＭセンサープレートにｖ−ＲＡＧＥを固定化し、ＲＡＧＥアプタマーの存在下または非存在下にＲＡＧＥのリガンドを添加して、ｖ−ＲＡＧＥに対するリガンドの結合をモニタリングすればよい。
好ましい態様において、ＲＡＧＥアプタマーは、配列番号１〜１０のいずれかの配列を含む一本鎖ＤＮＡであり、より好ましくは、配列番号１〜１０のいずれかの配列からなる一本鎖ＤＮＡである。別の好ましい態様において、ＲＡＧＥアプタマーは、CCTGATATGGTGTCACCGCCGCCTTAGTATTGGTGTCTAC（配列番号１）の配列を含む一本鎖ＤＮＡであり、より好ましくは、配列番号１の配列からなる一本鎖ＤＮＡである。
さらなる態様において、ＲＡＧＥアプタマーは、配列番号１〜１０のいずれかの配列を含むか、前記いずれかの配列からなり、当該配列において表１に示す位置でホスホロチオエート結合を含む一本鎖ＤＮＡである。
ＲＡＧＥアプタマーは、癌の治療に用いることができる。癌としては、メラノーマ、膵臓癌、乳癌、肺癌、腎細胞癌、大腸癌、肝癌などが例示される。好ましい態様において、癌はメラノーマである。癌の治療には、癌の増殖抑制、転移抑制、および再発抑制が含まれる。ある態様において、ＲＡＧＥアプタマーは、癌転移抑制薬として、または血管新生阻害薬として、癌の治療に用いられる。
ＲＡＧＥアプタマーを含む医薬組成物は、ＲＡＧＥアプタマーを医薬上許容される担体と混合し、固形製剤（例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤など）、または液状製剤（例えば、シロップ剤、注射剤など）として製造することができる。医薬組成物は、用時溶解して用いられる凍結乾燥製剤であってもよい。医薬上許容される担体としては、例えば、賦形剤（例えば、乳糖、ショ糖、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等）、崩壊剤（例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース等）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム等）、界面活性剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等）、溶剤（例えば、水、食塩水、大豆油等）、保存剤（例えば、p-ヒドロキシ安息香酸エステル等）などがあげられるが、これらに限定されるものではない。
医薬組成物の投与方法は、投与対象の年齢、体重、健康状態等によって適宜選択される。医薬組成物は、全身投与によっても、局所投与によっても投与しうる。例えば、メラノーマの場合、局所投与によることが好ましい。投与方法としては、経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経皮投与などが挙げられる。本発明の組成物の投与量もまた、投与方法、投与対象の年齢、体重、健康状態等によって適宜選択される。例えば、成人１日当たり、ＲＡＧＥアプタマーの量として、例えば、０．２〜１００ｍｇを投与することができるが、これに限定されない。
本開示は、癌を治療する方法であって、それを必要とする患者に有効量のＲＡＧＥアプタマーを投与することを含む方法、および、癌を治療するための医薬の製造のための、ＲＡＧＥアプタマーの使用を提供する。前記方法および使用は、医薬組成物に関する記載に準じて実施することができる。
アプタマーは、抗体と比較して免疫原性が低く、製造も容易であり、熱安定性が高く化学修飾も可能であるという利点を有する。また、受容体であるＲＡＧＥを阻害すれば、ＡＧＥｓ以外のＲＡＧＥリガンドの作用も阻害することができ、高い治療効果が期待できる。よって、ＲＡＧＥアプタマーは癌の治療薬として有益である。
本開示の例示的態様を以下に記載する。
１．ＲＡＧＥアプタマーを含む、癌を治療するための医薬組成物。
２．癌が、メラノーマ、膵臓癌、乳癌、肺癌、腎細胞癌、大腸癌、および肝癌からなる群から選択される、前記１に記載の医薬組成物。
３．癌がメラノーマである、前記２に記載の医薬組成物。
４．癌転移抑制薬である、前記１〜３のいずれかに記載の医薬組成物。
５．血管新生阻害薬である、前記１〜４のいずれかに記載の医薬組成物。
６．ＲＡＧＥアプタマーが、以下からなる群から選択される、前記１〜５のいずれかに記載の医薬組成物：
（１）配列番号１〜１０のいずれかの配列を含む、一本鎖ＤＮＡ；
（２）配列番号１〜１０のいずれかの配列と９０％以上の配列同一性を有する配列を含み、ＲＡＧＥに結合してＲＡＧＥとそのリガンドとの結合を阻害する、一本鎖ＤＮＡ；および、
（３）配列番号１〜１０のいずれかの配列において１、２、または３個の塩基が欠失、置換、または付加された配列を含み、ＲＡＧＥに結合してＲＡＧＥとそのリガンドとの結合を阻害する、一本鎖ＤＮＡ。
７．ＲＡＧＥアプタマーが配列番号１〜１０のいずれかの配列を含む、前記１〜６のいずれかに記載の医薬組成物。
８．ＲＡＧＥアプタマーが配列番号１の配列を含む、前記１〜７のいずれかに記載の医薬組成物。
９．ＲＡＧＥアプタマーが配列番号１〜１０のいずれかの配列からなる、前記１〜８のいずれかに記載の医薬組成物。
１０．ＲＡＧＥアプタマーが配列番号１の配列からなる、前記１〜９のいずれかに記載の医薬組成物。
１１．ＲＡＧＥアプタマーがホスホロチオエート型オリゴヌクレオチドである、前記１〜１０のいずれかに記載の医薬組成物。
１２．癌を治療する方法であって、それを必要とする患者に有効量のＲＡＧＥアプタマーを投与することを含む方法。
１３．癌を治療するための医薬の製造のための、ＲＡＧＥアプタマーの使用。
１．ＲＡＧＥアプタマーを含む、癌を治療するための医薬組成物。
２．癌が、メラノーマ、膵臓癌、乳癌、肺癌、腎細胞癌、大腸癌、および肝癌からなる群から選択される、前記１に記載の医薬組成物。
３．癌がメラノーマである、前記２に記載の医薬組成物。
４．癌転移抑制薬である、前記１〜３のいずれかに記載の医薬組成物。
５．血管新生阻害薬である、前記１〜４のいずれかに記載の医薬組成物。
６．ＲＡＧＥアプタマーが、以下からなる群から選択される、前記１〜５のいずれかに記載の医薬組成物：
（１）配列番号１〜１０のいずれかの配列を含む、一本鎖ＤＮＡ；
（２）配列番号１〜１０のいずれかの配列と９０％以上の配列同一性を有する配列を含み、ＲＡＧＥに結合してＲＡＧＥとそのリガンドとの結合を阻害する、一本鎖ＤＮＡ；および、
（３）配列番号１〜１０のいずれかの配列において１、２、または３個の塩基が欠失、置換、または付加された配列を含み、ＲＡＧＥに結合してＲＡＧＥとそのリガンドとの結合を阻害する、一本鎖ＤＮＡ。
７．ＲＡＧＥアプタマーが配列番号１〜１０のいずれかの配列を含む、前記１〜６のいずれかに記載の医薬組成物。
８．ＲＡＧＥアプタマーが配列番号１の配列を含む、前記１〜７のいずれかに記載の医薬組成物。
９．ＲＡＧＥアプタマーが配列番号１〜１０のいずれかの配列からなる、前記１〜８のいずれかに記載の医薬組成物。
１０．ＲＡＧＥアプタマーが配列番号１の配列からなる、前記１〜９のいずれかに記載の医薬組成物。
１１．ＲＡＧＥアプタマーがホスホロチオエート型オリゴヌクレオチドである、前記１〜１０のいずれかに記載の医薬組成物。
１２．癌を治療する方法であって、それを必要とする患者に有効量のＲＡＧＥアプタマーを投与することを含む方法。
１３．癌を治療するための医薬の製造のための、ＲＡＧＥアプタマーの使用。
以下、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
１．方法
試薬
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（脂肪酸およびグロブリンフリー、凍結乾燥粉末）、Ｄ−グリセルアルデヒド、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、およびＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）はSigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)より購入した。モノクロ−ナル抗８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシン（８−ＯＨｄＧ）抗体（Ａｂ）は、Japan Institute for the Control of Aging, NIKKEN SEIL Co., Ltd. (Shizuoka, Japan)より入手した。ＲＡＧＥ、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＣＤ３１、およびβアクチンに対するポリクローナル抗体は、Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)より購入した。サイクリンＤ１およびｐ２７に対するマウスモノクローナル抗体およびウサギポリクローナル抗体は、Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)より得た。ＰＣＮＡ（proliferation cell nuclear antigen)、ＭＣＰ−１(monocyte chemoattractant protein-1)、およびＣＤ１０７ｂ（Ｍａｃ−３）に対するウサギポリクローナル抗体、およびｍｅｌａｎＡに対するウサギモノクローナル抗体は、Abcam Ltd (Cambridge, United Kingdom)より得た。カルボキシ−Ｈ２ＤＦＦＤＡ (5-(and-6)-carboxy-2',7'-dihydrofluorescein diacetate)は、Thermo Fisher Scientific (Sab Jose, CA, USA)から購入した。
試薬
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（脂肪酸およびグロブリンフリー、凍結乾燥粉末）、Ｄ−グリセルアルデヒド、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、およびＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）はSigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)より購入した。モノクロ−ナル抗８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシン（８−ＯＨｄＧ）抗体（Ａｂ）は、Japan Institute for the Control of Aging, NIKKEN SEIL Co., Ltd. (Shizuoka, Japan)より入手した。ＲＡＧＥ、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＣＤ３１、およびβアクチンに対するポリクローナル抗体は、Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)より購入した。サイクリンＤ１およびｐ２７に対するマウスモノクローナル抗体およびウサギポリクローナル抗体は、Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)より得た。ＰＣＮＡ（proliferation cell nuclear antigen)、ＭＣＰ−１(monocyte chemoattractant protein-1)、およびＣＤ１０７ｂ（Ｍａｃ−３）に対するウサギポリクローナル抗体、およびｍｅｌａｎＡに対するウサギモノクローナル抗体は、Abcam Ltd (Cambridge, United Kingdom)より得た。カルボキシ−Ｈ２ＤＦＦＤＡ (5-(and-6)-carboxy-2',7'-dihydrofluorescein diacetate)は、Thermo Fisher Scientific (Sab Jose, CA, USA)から購入した。
ＡＧＥｓの調製
ＢＳＡ（２５ｍｇ／ｍｌ）を、滅菌条件下で０．１ＭのＤ−グリセルアルデヒドと１週間インキュベートした。次いで、結合していない糖を、リン酸緩衝生理食塩水に対する透析により除去した。得られた糖化ＢＳＡ（本明細書中、ＡＧＥ−ＢＳＡとも記載する）を、以下の実験でＡＧＥｓとして使用した。対照の非糖化ＢＳＡは、Ｄ−グリセルアルデヒドを添加しない点を除き、同一の条件で調製した。また、ＡＧＥ−ＢＳＡを抗原としてＡＧＥｓに対するマウスモノクローナル抗体を作製した。
ＢＳＡ（２５ｍｇ／ｍｌ）を、滅菌条件下で０．１ＭのＤ−グリセルアルデヒドと１週間インキュベートした。次いで、結合していない糖を、リン酸緩衝生理食塩水に対する透析により除去した。得られた糖化ＢＳＡ（本明細書中、ＡＧＥ−ＢＳＡとも記載する）を、以下の実験でＡＧＥｓとして使用した。対照の非糖化ＢＳＡは、Ｄ−グリセルアルデヒドを添加しない点を除き、同一の条件で調製した。また、ＡＧＥ−ＢＳＡを抗原としてＡＧＥｓに対するマウスモノクローナル抗体を作製した。
ＲＡＧＥアプタマーの調製
特開２０１６−０７９１８４号公報に記載のとおり、ＳＥＬＥＸ法により、ＲＡＧＥに結合するアプタマーとして以下の配列番号１〜１０の配列が選択された。これら配列に基づき、ヌクレオチド間の結合部位にあるリン酸基の酸素原子が硫黄原子に置換された表２の＃１〜＃１０のアプタマーを合成した。以下の実験では、ＲＡＧＥ＃１をＲＡＧＥアプタマーとして使用した。
CCTGATATGGTGTCACCGCCGCCTTAGTATTGGTGTCTAC （配列番号１）
TCTGTTCAGGTTGGTACGGTGGAAGGTGTGATTCACGAGG （配列番号２）
CTTGGGTTGTTTATGTCGACCGCCAGTTTTGTGTTCAGCA （配列番号３）
CATTCTTAGATTTTTGTCTCACTTAGGTGTAGATGGTGAT （配列番号４）
TTGGTTCTCTTGCCCTCTTCTATTTTGTACGATGTTTCCT （配列番号５）
TTCCACTGAGTGCCGCGGACTGTTGTTGGGAGGTGGTGTG （配列番号６）
ATGGGGAGGAGGGGTGTCGTGGGGGGTGGGGGAGTGGGGA （配列番号７）
CTGGGGATGACTCGGATAGGATGTACGAGTTTGATGTGTA （配列番号８）
TTTGATCGAGCTGCGCCCTCCTCGCCGTAGAAGAGTGTGT （配列番号９）
TTTGGGGTGGAGTTAGGGGTGGATCAAGCGGGATTGTGTA （配列番号１０）
特開２０１６−０７９１８４号公報に記載のとおり、ＳＥＬＥＸ法により、ＲＡＧＥに結合するアプタマーとして以下の配列番号１〜１０の配列が選択された。これら配列に基づき、ヌクレオチド間の結合部位にあるリン酸基の酸素原子が硫黄原子に置換された表２の＃１〜＃１０のアプタマーを合成した。以下の実験では、ＲＡＧＥ＃１をＲＡＧＥアプタマーとして使用した。
CCTGATATGGTGTCACCGCCGCCTTAGTATTGGTGTCTAC （配列番号１）
TCTGTTCAGGTTGGTACGGTGGAAGGTGTGATTCACGAGG （配列番号２）
CTTGGGTTGTTTATGTCGACCGCCAGTTTTGTGTTCAGCA （配列番号３）
CATTCTTAGATTTTTGTCTCACTTAGGTGTAGATGGTGAT （配列番号４）
TTGGTTCTCTTGCCCTCTTCTATTTTGTACGATGTTTCCT （配列番号５）
TTCCACTGAGTGCCGCGGACTGTTGTTGGGAGGTGGTGTG （配列番号６）
ATGGGGAGGAGGGGTGTCGTGGGGGGTGGGGGAGTGGGGA （配列番号７）
CTGGGGATGACTCGGATAGGATGTACGAGTTTGATGTGTA （配列番号８）
TTTGATCGAGCTGCGCCCTCCTCGCCGTAGAAGAGTGTGT （配列番号９）
TTTGGGGTGGAGTTAGGGGTGGATCAAGCGGGATTGTGTA （配列番号１０）
動物実験
メラノーマ細胞であるＧ３６１細胞（American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）（２×１０６個）を、６週齢雌無胸腺ヌードマウス（Japan Clea, Tokyo, Japan）の上位側腹部に皮内注射した（ｎ=１４）。マウス腹腔内に、ＲＡＧＥアプタマー（３８．４ｐｍｏｌ／ｄａｙ／ｇ体重、ｎ＝６）またはビヒクル（ｎ＝８）を、浸透圧ミニポンプ（Alzet osmotic pumps, model 1004, Cupertino, CA, USA）により持続注入した。腫瘍の最小径と最大径および体重を１週間に２回測定し、腫瘍体積を以下の式により計算した：体積（ｍｍ３）＝（（最小径）２×（最大径））／２。ＲＡＧＥアプタマーまたはビヒクルの４２日間の持続注入後、マウスを殺し、肝臓障害のマーカーであるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）のレベルを化学分析装置（FUJI DRI-CHEM 4000V; Fujifilm Co., Tokyo, Japan）により測定した。Ｇ３６１メラノーマおよび肝臓を、免疫組織化学的解析のため採取した。
メラノーマ細胞であるＧ３６１細胞（American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）（２×１０６個）を、６週齢雌無胸腺ヌードマウス（Japan Clea, Tokyo, Japan）の上位側腹部に皮内注射した（ｎ=１４）。マウス腹腔内に、ＲＡＧＥアプタマー（３８．４ｐｍｏｌ／ｄａｙ／ｇ体重、ｎ＝６）またはビヒクル（ｎ＝８）を、浸透圧ミニポンプ（Alzet osmotic pumps, model 1004, Cupertino, CA, USA）により持続注入した。腫瘍の最小径と最大径および体重を１週間に２回測定し、腫瘍体積を以下の式により計算した：体積（ｍｍ３）＝（（最小径）２×（最大径））／２。ＲＡＧＥアプタマーまたはビヒクルの４２日間の持続注入後、マウスを殺し、肝臓障害のマーカーであるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）のレベルを化学分析装置（FUJI DRI-CHEM 4000V; Fujifilm Co., Tokyo, Japan）により測定した。Ｇ３６１メラノーマおよび肝臓を、免疫組織化学的解析のため採取した。
［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ標識ＲＡＧＥアプタマーの分布および動態
８週齢雌Ｂａｌｂ／ｃ−ｎｕ／ｎｕマウスに、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ標識ＲＡＧＥアプタマー（３８．４ｐｍｏｌ／ｄａｙ／ｇ体重）を浸透圧ポンプにて持続注入し、注入開始前（０日目）、注入開始後１日目、３日目および７日目、および注入停止後３日目および７日目に、マウスを殺し、血液および臓器を採取した。ＲＡＧＥアプタマーの半減期は、７日間注入後の皮膚におけるアプタマー量が半減するまでに要する時間とした。
８週齢雌Ｂａｌｂ／ｃ−ｎｕ／ｎｕマウスに、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ標識ＲＡＧＥアプタマー（３８．４ｐｍｏｌ／ｄａｙ／ｇ体重）を浸透圧ポンプにて持続注入し、注入開始前（０日目）、注入開始後１日目、３日目および７日目、および注入停止後３日目および７日目に、マウスを殺し、血液および臓器を採取した。ＲＡＧＥアプタマーの半減期は、７日間注入後の皮膚におけるアプタマー量が半減するまでに要する時間とした。
免疫組織化学的解析
Ｇ３６１メラノーマの標本を、４％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋し、４μＭ間隔で切片化した。内因性のペルオキシダーゼ活性を阻害し、切片を、８−ＯＨｄＧ、ＡＧＥｓ、ＲＡＧＥ、ＰＣＮＡ、サイクリンＤ１、ｐ２７、ＶＥＧＦ、ＣＤ３１、ＭＣＰ−１、ＣＤ１０７ｂ（Ｍａｃ−３）、およびｍｅｌａｎＡに対する抗体と４℃で一晩インキュベートした。サイクリンＤ１以外の反応は、Histofine Simple Stain MAX-PO(MULTI) (Nichirei Co., Tokyo, Japan)で反応を可視化し、サイクリンＤ１の発現は、VECTOR M.O.M. immunodetection Kit (Vector Lab., Inc., Burlingame, CA, USA)により検出した。各サンプルについて５つの異なるフィールドの免疫反応を、マイクロコンピューター支援ImageJにより測定した。
Ｇ３６１メラノーマの標本を、４％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋し、４μＭ間隔で切片化した。内因性のペルオキシダーゼ活性を阻害し、切片を、８−ＯＨｄＧ、ＡＧＥｓ、ＲＡＧＥ、ＰＣＮＡ、サイクリンＤ１、ｐ２７、ＶＥＧＦ、ＣＤ３１、ＭＣＰ−１、ＣＤ１０７ｂ（Ｍａｃ−３）、およびｍｅｌａｎＡに対する抗体と４℃で一晩インキュベートした。サイクリンＤ１以外の反応は、Histofine Simple Stain MAX-PO(MULTI) (Nichirei Co., Tokyo, Japan)で反応を可視化し、サイクリンＤ１の発現は、VECTOR M.O.M. immunodetection Kit (Vector Lab., Inc., Burlingame, CA, USA)により検出した。各サンプルについて５つの異なるフィールドの免疫反応を、マイクロコンピューター支援ImageJにより測定した。
Ｇ３６１メラノーマ細胞およびヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）
Ｇ３６１細胞は、１０％ウシ胎児血清添加ＤＭＥＭで維持した。細胞増殖、ＲＴ−ＰＣＲ、およびウェスタンブロッティングの実験では、Ｇ３６１細胞を、１ｍｇ／ｍｌの非糖化ＢＳＡまたはＡＧＥ−ＢＳＡにより、各種濃度のＲＡＧＥアプタマーまたはＮＡＣの存在下または非存在下で２４時間処理した。Ｇ３６１細胞の実験は、１％ウシ胎児血清を含む培地において行った。
Ｇ３６１細胞は、１０％ウシ胎児血清添加ＤＭＥＭで維持した。細胞増殖、ＲＴ−ＰＣＲ、およびウェスタンブロッティングの実験では、Ｇ３６１細胞を、１ｍｇ／ｍｌの非糖化ＢＳＡまたはＡＧＥ−ＢＳＡにより、各種濃度のＲＡＧＥアプタマーまたはＮＡＣの存在下または非存在下で２４時間処理した。Ｇ３６１細胞の実験は、１％ウシ胎児血清を含む培地において行った。
ＨＵＶＥＣは、Lonza Group Ltd. (Basel, Switzerland)より入手した。ジヒドロエチジウム（ＤＨＥ）染色およびＲＴ−ＰＣＲ解析の実験では、ＨＵＶＥＣを、５０μｇ／ｍｌの非糖化ＢＳＡまたはＡＧＥ−ＢＳＡにより、１００ｎＭのＲＡＧＥアプタマーの存在下または非存在下で４時間処理した。ＨＵＶＥＣの実験は、２％ウシ胎児血清、ヒト線維芽細胞増殖因子、およびヘパリンを含む培地において行った。
Ｇ３６１細胞における細胞内活性酸素種（ＲＯＳ）生成の測定
ＲＯＳの細胞内生成は、蛍光標識であるカルボキシ−Ｈ２ＤＦＦＤにより検出した。Ｇ３６１細胞を、１０μＭのカルボキシＨ２ＤＦＦＤＡとともに、またはカルボキシＨ２ＤＦＦＤＡを添加せず、１時間インキュベートした。その後、細胞を１ｍｇ／ｍｌの非糖化ＢＳＡまたはＡＧＥ−ＢＳＡにより、１、１０、１００ｎＭのＲＡＧＥ−アプタマーの存在下または非存在下で処理した。２４分後、細胞内のスーパーオキシド産生を測定した。ＲＯＳ産生は、カルボキシＨ２ＤＦＦＤＡを処理した細胞の蛍光から、カルボキシＨ２ＤＦＦＤＡを処理しなかった細胞の蛍光を差し引いて算出した。
ＲＯＳの細胞内生成は、蛍光標識であるカルボキシ−Ｈ２ＤＦＦＤにより検出した。Ｇ３６１細胞を、１０μＭのカルボキシＨ２ＤＦＦＤＡとともに、またはカルボキシＨ２ＤＦＦＤＡを添加せず、１時間インキュベートした。その後、細胞を１ｍｇ／ｍｌの非糖化ＢＳＡまたはＡＧＥ−ＢＳＡにより、１、１０、１００ｎＭのＲＡＧＥ−アプタマーの存在下または非存在下で処理した。２４分後、細胞内のスーパーオキシド産生を測定した。ＲＯＳ産生は、カルボキシＨ２ＤＦＦＤＡを処理した細胞の蛍光から、カルボキシＨ２ＤＦＦＤＡを処理しなかった細胞の蛍光を差し引いて算出した。
Ｇ３６１細胞増殖アッセイ
Ｇ３６１細胞の増殖は、ＷＳＴ−１に基づく比色分析により、製造元（Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA）の説明にしたがい測定した。
Ｇ３６１細胞の増殖は、ＷＳＴ−１に基づく比色分析により、製造元（Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA）の説明にしたがい測定した。
ＨＵＶＥＣのＲＯＳ産生
ＨＵＶＥＣを、３ＭのＤＨＥ (Molecular Probes Inc., Eugene, OR, USA)を含有するフェノールレッドフリー最小必須培地でインキュベートした。３０分後、画像を共焦点レーザー顕微鏡により得た。ＲＯＳ産生は、各サンプルの５つの異なるフィールドにおける蛍光強度により評価し、マイクロコンピューター支援ImageJにより解析した。
ＨＵＶＥＣを、３ＭのＤＨＥ (Molecular Probes Inc., Eugene, OR, USA)を含有するフェノールレッドフリー最小必須培地でインキュベートした。３０分後、画像を共焦点レーザー顕微鏡により得た。ＲＯＳ産生は、各サンプルの５つの異なるフィールドにおける蛍光強度により評価し、マイクロコンピューター支援ImageJにより解析した。
ＨＵＶＥＣへの［３Ｈ］チミジン取り込み
ＨＵＶＥＣを、５０μｇ／ｍｌの非糖化ＢＳＡまたはＡＧＥ−ＢＳＡにより、１００ｎＭのＲＡＧＥアプタマーの存在下または非存在下で２０時間処理した。［３Ｈ］チミジンとさらに４時間インキュベートした後、細胞内への［３Ｈ］チミジンの取り込みを測定した。
ＨＵＶＥＣを、５０μｇ／ｍｌの非糖化ＢＳＡまたはＡＧＥ−ＢＳＡにより、１００ｎＭのＲＡＧＥアプタマーの存在下または非存在下で２０時間処理した。［３Ｈ］チミジンとさらに４時間インキュベートした後、細胞内への［３Ｈ］チミジンの取り込みを測定した。
ウェスタンブロット解析
サイクリンＤ、ｐ２７、およびβアクチンに対する抗体でメンブレンを染色し、次いで免疫複合体をＥＣＬ検出システム（Amersham Bioscience, Buckinghamshire, United Kingdom）により可視化した。
サイクリンＤ、ｐ２７、およびβアクチンに対する抗体でメンブレンを染色し、次いで免疫複合体をＥＣＬ検出システム（Amersham Bioscience, Buckinghamshire, United Kingdom）により可視化した。
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡを、Ｇ３６１メラノーマ標本、培養Ｇ３６１細胞、またはＨＵＶＥＣから、NucleoSpin RNA XS kit (Takara Bio Inc., Shiga, Japan)により供給元の説明にしたがい抽出した。定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、TaqMan 5 fluorogenic nuclease chemistry (Applied Biosystems, San Francisco, CA, USA)により行った。
全ＲＮＡを、Ｇ３６１メラノーマ標本、培養Ｇ３６１細胞、またはＨＵＶＥＣから、NucleoSpin RNA XS kit (Takara Bio Inc., Shiga, Japan)により供給元の説明にしたがい抽出した。定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、TaqMan 5 fluorogenic nuclease chemistry (Applied Biosystems, San Francisco, CA, USA)により行った。
ＨＵＶＥＣへのＴＨＰ−１細胞の接着の評価
ＨＵＶＥＣを、５０μｇ／ｍｌの非糖化ＢＳＡまたはＡＧＥ−ＢＳＡにより、１００ｎＭのＲＡＧＥアプタマーの存在下または非存在下で２４時間処理し、その後、ＢＣＥＣＦ−ＡＭ標識ＴＨＰ−１細胞と４時間インキュベートした。インキュベーション後、接着したＴＨＰ−１細胞の蛍光強度を測定した。
ＨＵＶＥＣを、５０μｇ／ｍｌの非糖化ＢＳＡまたはＡＧＥ−ＢＳＡにより、１００ｎＭのＲＡＧＥアプタマーの存在下または非存在下で２４時間処理し、その後、ＢＣＥＣＦ−ＡＭ標識ＴＨＰ−１細胞と４時間インキュベートした。インキュベーション後、接着したＴＨＰ−１細胞の蛍光強度を測定した。
統計学的解析
いずれの値も平均±ＳＤで示した。２つの動物群間の統計学的比較は、Student’s t-testにより行った。多重比較は、One-way ANOVAとTukey’s test、Dunnett’s test、Steel-Dwass test、またはStudent’s t-testとにより行った。
いずれの値も平均±ＳＤで示した。２つの動物群間の統計学的比較は、Student’s t-testにより行った。多重比較は、One-way ANOVAとTukey’s test、Dunnett’s test、Steel-Dwass test、またはStudent’s t-testとにより行った。
２．結果
ＲＡＧＥアプタマーの生体内分布および動態
図１Ａに示すように、ＲＡＧＥアプタマーを７日間継続的に投与すると、主に脂肪組織、皮膚、筋肉および腎臓に分布した。注入を停止すると、ＲＡＧＥアプタマーのレベルは徐々に減少したが、浸透圧ポンプの除去から７日後でも皮膚および肝臓で検出された（図１Ｂ）。皮膚におけるＲＡＧＥアプタマーの消失半減期は、約３．７±１．１日であった。
ＲＡＧＥアプタマーの生体内分布および動態
図１Ａに示すように、ＲＡＧＥアプタマーを７日間継続的に投与すると、主に脂肪組織、皮膚、筋肉および腎臓に分布した。注入を停止すると、ＲＡＧＥアプタマーのレベルは徐々に減少したが、浸透圧ポンプの除去から７日後でも皮膚および肝臓で検出された（図１Ｂ）。皮膚におけるＲＡＧＥアプタマーの消失半減期は、約３．７±１．１日であった。
ヌードマウスにおけるＲＡＧＥアプタマーの腫瘍増殖および体重に対する効果
図２ＡおよびＢに示すように、Ｇ３６１メラノーマ細胞はヌードマウスにおいて増殖の速い腫瘍を形成し、その大きさは４２日後に４００ｍｍ３に達した。ＲＡＧＥアプタマーの腹腔内への持続注入により、３１日目から腫瘍体積の有意な減少がみられ、この腫瘍増殖阻害効果は４２日目まで維持された。実験終了時点で、ＲＡＧＥアプタマー処理マウスにおけるＧ３６１腫瘍の体積は、ビヒクル処理マウスの体積の１／３であった（図２Ｂ）。処理開始から１７日目以降、ＲＡＧＥアプタマー処理マウスの体重は、ビヒクル処理マウスの体重より有意に重かった（図２Ｃ）。
図２ＡおよびＢに示すように、Ｇ３６１メラノーマ細胞はヌードマウスにおいて増殖の速い腫瘍を形成し、その大きさは４２日後に４００ｍｍ３に達した。ＲＡＧＥアプタマーの腹腔内への持続注入により、３１日目から腫瘍体積の有意な減少がみられ、この腫瘍増殖阻害効果は４２日目まで維持された。実験終了時点で、ＲＡＧＥアプタマー処理マウスにおけるＧ３６１腫瘍の体積は、ビヒクル処理マウスの体積の１／３であった（図２Ｂ）。処理開始から１７日目以降、ＲＡＧＥアプタマー処理マウスの体重は、ビヒクル処理マウスの体重より有意に重かった（図２Ｃ）。
ヌードマウスのＧ３６１腫瘍におけるＡＧＥ−ＲＡＧＥ酸化ストレスに対するＲＡＧＥアプタマーの効果
図３Ａ−Ｃに示すように、免疫組織化学的解析により、ヌードマウスのＧ３６１腫瘍において、酸化ストレスマーカーである８−ＯＨｄＧ、ＡＧＥｓ、およびＲＡＧＥの発現レベルが、ＲＡＧＥアプタマーの処理により有意に減少したことが明らかとなった。
図３Ａ−Ｃに示すように、免疫組織化学的解析により、ヌードマウスのＧ３６１腫瘍において、酸化ストレスマーカーである８−ＯＨｄＧ、ＡＧＥｓ、およびＲＡＧＥの発現レベルが、ＲＡＧＥアプタマーの処理により有意に減少したことが明らかとなった。
ヌードマウスにおける腫瘍増殖、血管新生、およびマクロファージ浸潤に対するＲＡＧＥアプタマーの効果
増殖細胞の免疫組織化学的検出により、ＰＣＮＡ陽性の細胞核の全細胞核に対する割合が、ＲＡＧＥアプタマーを処理したヌードマウスのＧ３６１メラノーマにおいて有意に低いことが明らかとなった（図４Ａ）。さらに、ＲＡＧＥアプタマーの処理により、Ｇ１期の進行を促進するＧ１サイクリンの一つであるサイクリンＤ１、およびＧ１期の停止をもたらすサイクリン依存キナーゼ阻害因子であるｐ２７の、腫瘍におけるｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルが減少した（図４ＢおよびＣ）。また、図４Ｄ−Ｇに示すように、ＲＡＧＥアプタマーの４２日間の処理により、ヌードマウスにおけるＶＥＧＦ、ＭＣＰ−１、並びに、それぞれ内皮細胞およびマクロファージのマーカーであるＣＤ３１およびＭａｃ−３の腫瘍での発現レベルが減少した。これらの結果は、ＲＡＧＥアプタマーがＧ３６１細胞の増殖を直接的に抑制したこと、およびＲＡＧＥアプタマーが血管新生および腫瘍へのマクロファージの浸潤を抑制したことを示す。
増殖細胞の免疫組織化学的検出により、ＰＣＮＡ陽性の細胞核の全細胞核に対する割合が、ＲＡＧＥアプタマーを処理したヌードマウスのＧ３６１メラノーマにおいて有意に低いことが明らかとなった（図４Ａ）。さらに、ＲＡＧＥアプタマーの処理により、Ｇ１期の進行を促進するＧ１サイクリンの一つであるサイクリンＤ１、およびＧ１期の停止をもたらすサイクリン依存キナーゼ阻害因子であるｐ２７の、腫瘍におけるｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルが減少した（図４ＢおよびＣ）。また、図４Ｄ−Ｇに示すように、ＲＡＧＥアプタマーの４２日間の処理により、ヌードマウスにおけるＶＥＧＦ、ＭＣＰ−１、並びに、それぞれ内皮細胞およびマクロファージのマーカーであるＣＤ３１およびＭａｃ−３の腫瘍での発現レベルが減少した。これらの結果は、ＲＡＧＥアプタマーがＧ３６１細胞の増殖を直接的に抑制したこと、およびＲＡＧＥアプタマーが血管新生および腫瘍へのマクロファージの浸潤を抑制したことを示す。
ヌードマウスにおけるＧ３６１腫瘍の肝転移に対するＲＡＧＥアプタマーの効果
ＲＡＧＥアプタマーの処理により、ヌードマウスにおいて、ＡＳＴおよびＡＬＴの上昇が有意に阻害され、Ｇ３６１腫瘍の肝転移が減弱した（図５）。メラノーマのマーカーであるＭｅｌａｎＡは、正常非担がんマウスでは検出されなかった。
ＲＡＧＥアプタマーの処理により、ヌードマウスにおいて、ＡＳＴおよびＡＬＴの上昇が有意に阻害され、Ｇ３６１腫瘍の肝転移が減弱した（図５）。メラノーマのマーカーであるＭｅｌａｎＡは、正常非担がんマウスでは検出されなかった。
ＡＧＥ−ＢＳＡに暴露されたＧ３６１メラノーマ細胞における、ＲＯＳ産生、細胞増殖、ＶＥＧＦおよびＭＣＰ−１の遺伝子発現に対するＲＡＧＥアプタマーの効果
図６−１〜６−３に示すように、ＡＧＥ−ＢＳＡは、Ｇ３６１メラノーマ細胞におけるＲＯＳ産生、細胞増殖、サイクリンＤ１およびｐ２７の発現、およびＶＥＧＦおよびＭＣＰ−１のｍＲＮＡレベルを有意に増加させ、これらはいずれも濃度依存的にＲＡＧＥアプタマーの処理により抑制された。抗酸化剤であるＮＡＣの作用は、ＲＡＧＥアプタマーに類似し、３ｍＭのＮＡＣはＧ３６１細胞に対するＡＧＥ−ＢＳＡのこれら効果を有意に減弱させた。これらの結果は、ＲＡＧＥアプタマーによる腫瘍増殖の抑制がＧ３６１細胞におけるＡＧＥ−ＲＡＧＥ-酸化ストレス系の阻害によるものであることを示唆する。
図６−１〜６−３に示すように、ＡＧＥ−ＢＳＡは、Ｇ３６１メラノーマ細胞におけるＲＯＳ産生、細胞増殖、サイクリンＤ１およびｐ２７の発現、およびＶＥＧＦおよびＭＣＰ−１のｍＲＮＡレベルを有意に増加させ、これらはいずれも濃度依存的にＲＡＧＥアプタマーの処理により抑制された。抗酸化剤であるＮＡＣの作用は、ＲＡＧＥアプタマーに類似し、３ｍＭのＮＡＣはＧ３６１細胞に対するＡＧＥ−ＢＳＡのこれら効果を有意に減弱させた。これらの結果は、ＲＡＧＥアプタマーによる腫瘍増殖の抑制がＧ３６１細胞におけるＡＧＥ−ＲＡＧＥ-酸化ストレス系の阻害によるものであることを示唆する。
ＡＧＥ−ＢＳＡに暴露されたＨＵＶＥＣにおける、ＲＯＳ産生、細胞増殖、および炎症反応に対するＲＡＧＥアプタマーの効果
Ｇ３６１細胞の場合と同様に、ＡＧＥ−ＢＳＡは、ＨＵＶＥＣにおけるスーパーオキシドの産生、［３Ｈ］チミジン取り込みにより測定される細胞増殖、およびＶＥＧＦ、ＶＣＡＭ−１およびＭＣＰ−１の遺伝子発現、並びにＴＨＰ−１マクロファージのＨＵＶＥＣへの接着を有意に刺激し、これらはいずれもＲＡＧＥアプタマーにより阻害された（図７）。１００ｎＭのＲＡＧＥアプタマーは、非糖化ＢＳＡに暴露されたＨＵＶＥＣにおけるＲＯＳ産生、ＶＥＧＦ、ＭＣＰ−１、またはＶＣＡＭ−１のｍＲＮＡレベルには影響しなかった（データ非提示）。これらの結果は、ＲＡＧＥアプタマーが血管内皮細胞においてＡＧＥ−ＲＡＧＥ系を阻害し、血管新生およびマクロファージ浸潤を抑制することを示唆する。
Ｇ３６１細胞の場合と同様に、ＡＧＥ−ＢＳＡは、ＨＵＶＥＣにおけるスーパーオキシドの産生、［３Ｈ］チミジン取り込みにより測定される細胞増殖、およびＶＥＧＦ、ＶＣＡＭ−１およびＭＣＰ−１の遺伝子発現、並びにＴＨＰ−１マクロファージのＨＵＶＥＣへの接着を有意に刺激し、これらはいずれもＲＡＧＥアプタマーにより阻害された（図７）。１００ｎＭのＲＡＧＥアプタマーは、非糖化ＢＳＡに暴露されたＨＵＶＥＣにおけるＲＯＳ産生、ＶＥＧＦ、ＭＣＰ−１、またはＶＣＡＭ−１のｍＲＮＡレベルには影響しなかった（データ非提示）。これらの結果は、ＲＡＧＥアプタマーが血管内皮細胞においてＡＧＥ−ＲＡＧＥ系を阻害し、血管新生およびマクロファージ浸潤を抑制することを示唆する。
１．方法
試薬
ＣＭＬは、Iris(Trischenreuth, Bavaria, Germany)から購入した。他は、実施例１と同様の試薬を用いた。ＣＭＬに対するマウスモノクローナル抗体は、Trans Genic Inc(Fukuoka, Japan)より入手した。ニトロチロシンに対するマウスモノクローナル抗体は、Stress Marq Biosciences Inc(Victoria, British Columbia, Canada)より得た。ＶＷＦに対するマウスモノクローナル抗体は、Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)より購入した。
試薬
ＣＭＬは、Iris(Trischenreuth, Bavaria, Germany)から購入した。他は、実施例１と同様の試薬を用いた。ＣＭＬに対するマウスモノクローナル抗体は、Trans Genic Inc(Fukuoka, Japan)より入手した。ニトロチロシンに対するマウスモノクローナル抗体は、Stress Marq Biosciences Inc(Victoria, British Columbia, Canada)より得た。ＶＷＦに対するマウスモノクローナル抗体は、Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)より購入した。
ＲＡＧＥアプタマーの調製
実施例１と同様に、以下の実験では、ＲＡＧＥ＃１（表２）をＲＡＧＥアプタマーとして使用した。
実施例１と同様に、以下の実験では、ＲＡＧＥ＃１（表２）をＲＡＧＥアプタマーとして使用した。
動物実験
メラノーマ細胞であるＧ３６１細胞（American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）（２×１０６個）を、６週齢雌無胸腺ヌードマウス（Japan Clea, Tokyo, Japan）の上位側腹部に皮下注射した（ｎ=１４）。１５日目から、ＲＡＧＥアプタマー（ＲＡＧＥ＃１）（３８．５ｐｍｏｌ／ｄａｙ／ｇ体重、ｎ＝６）またはビヒクル（ｎ＝７）を、腫瘍付近に注射により直接投与した。実施例１と同様に、腫瘍体積および体重を測定した。Ｇ３６１メラノーマを、免疫組織化学的解析のために採取した。
メラノーマ細胞であるＧ３６１細胞（American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）（２×１０６個）を、６週齢雌無胸腺ヌードマウス（Japan Clea, Tokyo, Japan）の上位側腹部に皮下注射した（ｎ=１４）。１５日目から、ＲＡＧＥアプタマー（ＲＡＧＥ＃１）（３８．５ｐｍｏｌ／ｄａｙ／ｇ体重、ｎ＝６）またはビヒクル（ｎ＝７）を、腫瘍付近に注射により直接投与した。実施例１と同様に、腫瘍体積および体重を測定した。Ｇ３６１メラノーマを、免疫組織化学的解析のために採取した。
免疫組織化学的解析
Ｇ３６１メラノーマの標本を、実施例１と同様に切片化し、切片を、ＣＭＬ、ＲＡＧＥ、ニトロチロシン、ＶＥＧＦ、ＣＤ３１およびＶＷＦに対する抗体と４℃で一晩インキュベートした。ＣＭＬ、ニトロチロシン、ＶＥＧＦおよびＶＷＦの発現は、VECTOR M.O.M. immunodetection Kit (Vector Lab., Inc., Burlingame, CA, USA)により検出し、その他はHistofine Simple Stain MAX-PO(MULTI) (Nichirei Co., Tokyo, Japan)で反応を可視化した。各サンプルについて５つの異なるフィールドの免疫反応を、マイクロコンピューター支援ImageJにより測定した。
Ｇ３６１メラノーマの標本を、実施例１と同様に切片化し、切片を、ＣＭＬ、ＲＡＧＥ、ニトロチロシン、ＶＥＧＦ、ＣＤ３１およびＶＷＦに対する抗体と４℃で一晩インキュベートした。ＣＭＬ、ニトロチロシン、ＶＥＧＦおよびＶＷＦの発現は、VECTOR M.O.M. immunodetection Kit (Vector Lab., Inc., Burlingame, CA, USA)により検出し、その他はHistofine Simple Stain MAX-PO(MULTI) (Nichirei Co., Tokyo, Japan)で反応を可視化した。各サンプルについて５つの異なるフィールドの免疫反応を、マイクロコンピューター支援ImageJにより測定した。
結合解析
ＲＡＧＥアプタマーがＲＡＧＥに結合してＲＡＧＥとそのリガンドとの結合を阻害するか否かを、ＱＣＭ（quartz crystal microbalance）法により調べた。ＱＣＭセンサープレートにｖ−ＲＡＧＥを固定化し、ＲＡＧＥアプタマーの存在下または非存在下にＣＭＬを添加して、ｖ−ＲＡＧＥに対するリガンドの結合をモニタリングした。
ＲＡＧＥアプタマーがＲＡＧＥに結合してＲＡＧＥとそのリガンドとの結合を阻害するか否かを、ＱＣＭ（quartz crystal microbalance）法により調べた。ＱＣＭセンサープレートにｖ−ＲＡＧＥを固定化し、ＲＡＧＥアプタマーの存在下または非存在下にＣＭＬを添加して、ｖ−ＲＡＧＥに対するリガンドの結合をモニタリングした。
Ｇ３６１メラノーマ細胞
Ｇ３６１細胞は、１０％ウシ胎児血清添加ＤＭＥＭで維持した。ＲＴ−ＰＣＲの実験では、Ｇ３６１細胞を、０、０．１、１、５μｇ／ｍｌのＣＭＬにより、ＲＡＧＥアプタマーの存在下または非存在下で４時間処理した。Ｇ３６１細胞の実験は、１％ウシ胎児血清を含む培地で行った。
Ｇ３６１細胞は、１０％ウシ胎児血清添加ＤＭＥＭで維持した。ＲＴ−ＰＣＲの実験では、Ｇ３６１細胞を、０、０．１、１、５μｇ／ｍｌのＣＭＬにより、ＲＡＧＥアプタマーの存在下または非存在下で４時間処理した。Ｇ３６１細胞の実験は、１％ウシ胎児血清を含む培地で行った。
Ｇ３６１細胞における細胞内活性酸素種（ＲＯＳ）生成の測定
ＲＯＳの細胞内生成は、実施例１と同様、蛍光標識であるカルボキシ−Ｈ２ＤＦＦＤにより検出した。Ｇ３６１細胞を、１０μＭのカルボキシＨ２ＤＦＦＤＡとともに、またはカルボキシＨ２ＤＦＦＤＡを添加せず、１時間インキュベートした。その後、細胞を０、０．１、１、５μｇ／ｍｌのＣＭＬで処理した。あるいは、１μｇ／ｍｌのＣＭＬ存在下または非存在下で、０、１、１０、１００ｎＭのＲＡＧＥアプタマーにより処理した。４０分後、細胞内のスーパーオキシド産生を測定した。ＲＯＳ産生は、カルボキシＨ２ＤＦＦＤＡを処理した細胞の蛍光から、カルボキシＨ２ＤＦＦＤＡを処理しなかった細胞の蛍光を差し引いて算出した。
ＲＯＳの細胞内生成は、実施例１と同様、蛍光標識であるカルボキシ−Ｈ２ＤＦＦＤにより検出した。Ｇ３６１細胞を、１０μＭのカルボキシＨ２ＤＦＦＤＡとともに、またはカルボキシＨ２ＤＦＦＤＡを添加せず、１時間インキュベートした。その後、細胞を０、０．１、１、５μｇ／ｍｌのＣＭＬで処理した。あるいは、１μｇ／ｍｌのＣＭＬ存在下または非存在下で、０、１、１０、１００ｎＭのＲＡＧＥアプタマーにより処理した。４０分後、細胞内のスーパーオキシド産生を測定した。ＲＯＳ産生は、カルボキシＨ２ＤＦＦＤＡを処理した細胞の蛍光から、カルボキシＨ２ＤＦＦＤＡを処理しなかった細胞の蛍光を差し引いて算出した。
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡを、培養Ｇ３６１細胞から、NucleoSpin RNA Plus kit (Takara Bio Inc., Shiga, Japan)により供給元の説明にしたがい抽出した。定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、TaqMan 5 fluorogenic nuclease chemistry (Applied Biosystems, San Francisco, CA, USA)により行った。
全ＲＮＡを、培養Ｇ３６１細胞から、NucleoSpin RNA Plus kit (Takara Bio Inc., Shiga, Japan)により供給元の説明にしたがい抽出した。定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、TaqMan 5 fluorogenic nuclease chemistry (Applied Biosystems, San Francisco, CA, USA)により行った。
２．結果
ヌードマウスに移植したヒトメラノーマの増殖に対するＲＡＧＥアプタマー直接投与の効果
Ｇ３６１細胞（２×１０６個）を、６週齢雌無胸腺ヌードマウスの上位側腹部に皮下注射した（ｎ=１４）。１５日目から、ＲＡＧＥアプタマー（ＲＡＧＥ＃１）（３８．５ｐｍｏｌ／ｄａｙ／ｇ体重、ｎ＝６）またはビヒクル（ｎ＝７）を、腫瘍付近に注射により直接投与した（図８）。その結果、ＲＡＧＥアプタマー処理群では、ビヒクル処理群と比較して腫瘍体積が有意に減少した（図９Ａ、Ｂ）。また、ＲＡＧＥアプタマー投与により体重の減少を有意に抑制した（図９Ｃ）。
ヌードマウスに移植したヒトメラノーマの増殖に対するＲＡＧＥアプタマー直接投与の効果
Ｇ３６１細胞（２×１０６個）を、６週齢雌無胸腺ヌードマウスの上位側腹部に皮下注射した（ｎ=１４）。１５日目から、ＲＡＧＥアプタマー（ＲＡＧＥ＃１）（３８．５ｐｍｏｌ／ｄａｙ／ｇ体重、ｎ＝６）またはビヒクル（ｎ＝７）を、腫瘍付近に注射により直接投与した（図８）。その結果、ＲＡＧＥアプタマー処理群では、ビヒクル処理群と比較して腫瘍体積が有意に減少した（図９Ａ、Ｂ）。また、ＲＡＧＥアプタマー投与により体重の減少を有意に抑制した（図９Ｃ）。
ヌードマウスのＧ３６１腫瘍におけるＡＧＥ−ＲＡＧＥ酸化ストレスおよび血管新生に対するＲＡＧＥアプタマー直接投与の効果
図１０Ａ−Ｆに示すように、免疫組織化学的解析により、ヌードマウスのＧ３６１腫瘍において、ＡＧＥｓの一つであるＣＭＬ、ＲＡＧＥ、酸化ストレスマーカーのニトロチロシン、血管新生因子のＶＥＧＦ、新生血管のマーカーであるＣＤ３１およびＶＷＦ（von Willebrand factor）の発現レベルが、ＲＡＧＥアプタマーの処理により、有意に減少したことが明らかとなった。これらの結果は、ＲＡＧＥアプタマーがＡＧＥ−ＲＡＧＥ酸化ストレスおよび血管新生を抑制したことを示す。
図１０Ａ−Ｆに示すように、免疫組織化学的解析により、ヌードマウスのＧ３６１腫瘍において、ＡＧＥｓの一つであるＣＭＬ、ＲＡＧＥ、酸化ストレスマーカーのニトロチロシン、血管新生因子のＶＥＧＦ、新生血管のマーカーであるＣＤ３１およびＶＷＦ（von Willebrand factor）の発現レベルが、ＲＡＧＥアプタマーの処理により、有意に減少したことが明らかとなった。これらの結果は、ＲＡＧＥアプタマーがＡＧＥ−ＲＡＧＥ酸化ストレスおよび血管新生を抑制したことを示す。
ＣＭＬとＲＡＧＥの結合親和性に対するＲＡＧＥアプタマーの影響
ＱＣＭ（Quarts Crystal Microbalance）を用いてＣＭＬとＲＡＧＥの結合親和性に対するＲＡＧＥアプタマーの影響を検討した。あらかじめホスト分子として水晶板に固定したｖ−ＲＡＧＥにＣＭＬを添加した結果、振動周波数が減少し、ＲＡＧＥとＣＭＬの結合が確認された（図１１Ａ）。同様の実験系においてＣＭＬ添加前にＲＡＧＥアプタマーを事前に投与したところＲＡＧＥアプタマーとＲＡＧＥが結合し、その後のＣＭＬとの結合を阻害する傾向が見られた（図１１Ｂ）。
ＱＣＭ（Quarts Crystal Microbalance）を用いてＣＭＬとＲＡＧＥの結合親和性に対するＲＡＧＥアプタマーの影響を検討した。あらかじめホスト分子として水晶板に固定したｖ−ＲＡＧＥにＣＭＬを添加した結果、振動周波数が減少し、ＲＡＧＥとＣＭＬの結合が確認された（図１１Ａ）。同様の実験系においてＣＭＬ添加前にＲＡＧＥアプタマーを事前に投与したところＲＡＧＥアプタマーとＲＡＧＥが結合し、その後のＣＭＬとの結合を阻害する傾向が見られた（図１１Ｂ）。
ＣＭＬに暴露されたＧ３６１メラノーマ細胞における、ＲＯＳ産生に対するＲＡＧＥアプタマーの効果
Ｇ３６１メラノーマ細胞にＣＭＬを添加するとＲＯＳ産生は有意に増加し、ＣＭＬ１μｇ／ｍｌで最もＲＯＳが産生された（図１２Ａ）。ＣＭＬ１μｇ／ｍｌを添加したＧ３６１メラノーマ細胞培養系にＲＡＧＥアプタマーを添加すると、そのＲＯＳ産生量はＣＭＬのみ投与した群と比較し有意に減少した（図１２Ｂ）。これらの結果は、ＣＭＬが酸化ストレスを誘導し、ＲＡＧＥアプタマーはそれを抑制したことを示す。
Ｇ３６１メラノーマ細胞にＣＭＬを添加するとＲＯＳ産生は有意に増加し、ＣＭＬ１μｇ／ｍｌで最もＲＯＳが産生された（図１２Ａ）。ＣＭＬ１μｇ／ｍｌを添加したＧ３６１メラノーマ細胞培養系にＲＡＧＥアプタマーを添加すると、そのＲＯＳ産生量はＣＭＬのみ投与した群と比較し有意に減少した（図１２Ｂ）。これらの結果は、ＣＭＬが酸化ストレスを誘導し、ＲＡＧＥアプタマーはそれを抑制したことを示す。
配列番号１：アプタマー
配列番号２：アプタマー
配列番号３：アプタマー
配列番号４：アプタマー
配列番号５：アプタマー
配列番号６：アプタマー
配列番号７：アプタマー
配列番号８：アプタマー
配列番号９：アプタマー
配列番号１０：アプタマー
配列番号２：アプタマー
配列番号３：アプタマー
配列番号４：アプタマー
配列番号５：アプタマー
配列番号６：アプタマー
配列番号７：アプタマー
配列番号８：アプタマー
配列番号９：アプタマー
配列番号１０：アプタマー
Claims (7)
- ＲＡＧＥアプタマーを含む、癌を治療するための医薬組成物。
- 癌が、メラノーマ、膵臓癌、乳癌、肺癌、腎細胞癌、大腸癌、および肝癌からなる群から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
- 癌がメラノーマである、請求項１または２に記載の医薬組成物。
- ＲＡＧＥアプタマーが、以下からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の医薬組成物：
（１）配列番号１〜１０のいずれかの配列を含む、一本鎖ＤＮＡ；
（２）配列番号１〜１０のいずれかの配列と９０％以上の配列同一性を有する配列を含み、ＲＡＧＥに結合してＲＡＧＥとそのリガンドとの結合を阻害する、一本鎖ＤＮＡ；および、
（３）配列番号１〜１０のいずれかの配列において１、２、または３個の塩基が欠失、置換、または付加された配列を含み、ＲＡＧＥに結合してＲＡＧＥとそのリガンドとの結合を阻害する、一本鎖ＤＮＡ。 - ＲＡＧＥアプタマーが配列番号１〜１０のいずれかの配列を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の医薬組成物。
- ＲＡＧＥアプタマーが配列番号１〜１０のいずれかの配列からなる、請求項１〜５のいずれかに記載の医薬組成物。
- ＲＡＧＥアプタマーがホスホロチオエート型オリゴヌクレオチドである、請求項１〜６のいずれかに記載の医薬組成物。
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|---|---|---|---|---|
| JP2005511770A (ja) * | 2001-12-19 | 2005-04-28 | アルケド バイオテック ゲーエムベーハー | Ｈｍｇｂタンパク質およびｈｍｇｂタンパク質をコードする核酸の使用方法 |
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| JP2016079184A (ja) * | 2014-10-21 | 2016-05-16 | 学校法人 久留米大学 | Ｒａｇｅアプタマーおよびその用途 |
-
2018
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| GLYCOCONJ J, vol. 33, JPN6022001454, 2016, pages 683 - 690, ISSN: 0004684038 * |
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