JP2019012082A - 核酸分析装置、および核酸分析方法 - Google Patents
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Abstract
Description
前記検出部は、光源と、所定の波長域を通過させる複数の光学フィルタと、対物レンズと、励起光を反射させ、蛍光を通過させる第1のダイクロイックミラーと、蛍光色素から発した蛍光を色素毎に異なる割合で分離する第2のダイクロイックミラーと、分離後にそれぞれの蛍光を検出する少なくとも2つの2次元センサとを備え、
前記基板は、前記各2次元センサにて画像上に検出されるマークを有し、
前記各2次元センサにて取得した画像の画像位置合わせを、画像上に検出される基板のマークを用いて行い、前記マークを基準として視野内の領域を複数に分割し、分割した領域毎に前記第1および前記第2のダイクロイックミラーの分光特性の分離比率変化の計算値を用いて蛍光色素解析を行うことを特徴とする核酸分析装置および、分析方法を提供する。
その後、算出した輝度の比率を元にして蛍光色素の特定を行う。フローセルには、図7に示すように、各測定視野内に位置検出用のマーク801をもっている、図7には十字のマーク等を記載しているがこの形状及び個数は任意の数をとることができる。このマークは、各パネルに必ず測定されるようにパターン化されている。カメラにて検出される画像上で、マークの領域は蛍光がないダークの領域として検出される。パターン認識などを用いてマークの位置の検出が可能である。本実施例では、マーク位置座標を元にして、各カメラにて取得した蛍光画像から同一輝点の抽出を行う。各輝点について、透過側または反射側で検出された光の強度比を算出する。輝点抽出の方法及び各点の輝度の算出の方法は、様々であるが、ガウシアンフィッティングを行うことによって輝点の中心座標、輝度を算出することが可能である。
101 試薬容器
102 試薬保管庫
103 送液機構
104 フローセル
105 温調機構
106 検出部
107 XYステージ
108 送液用シリンジ
109 廃液部
201 励起光照射部
202 励起蛍光用ダイクロイックミラー
203 対物レンズ
204 蛍光フィルタ
205 色分離用ダイクロイックミラー
206、207 チューブレンズ
208、209 2次元カメラ
210 Zステージ
212、213 フィールドフラットナ
220 光源
221 コリメートレンズ
222 フィルタ切替機構
301 視野中心部からの光線
302、303 視野端からの光線
304 計測視野
401 45度入射に対する分光特性
402 49度入射に対する分光特性
403 41度入射に対する分光特性
501 励起蛍光用ダイクロイックミラーの分光特性
502 色分離用ダイクロイックミラーの分光特性
503 FAMの蛍光特性
504 Cy3の蛍光特性
601 FAMの蛍光分離を示す図
602 Cy3の蛍光分離を示す図
603 FAMの蛍光で透過側に結像する波長域
604 FAMの蛍光で反射側に結像する波長域
605 Cy3の蛍光で透過側に結像する波長域
606 Cy3の蛍光で反射側に結像する波長域
701 対物レンズで撮影可能な最大視野
702 視野絞り挿入時の照射領域
801 測定視野内マーク
Claims (21)
- 試薬や試料を送液する送液機構と、送液される流路を有する基板と、前記基板を設置するステージと、塩基伸長反応を行う温調機構と、蛍光を検出し、蛍光画像を観察する検出部を備える核酸分析装置において、
前記検出部は、光源と、所定の波長域を通過させる複数の光学フィルタと、対物レンズと、励起光を反射させ、蛍光を通過させる第1のダイクロイックミラーと、蛍光色素から発した蛍光を色素毎に異なる割合で分離する第2のダイクロイックミラーと、分離後にそれぞれの蛍光を検出する少なくとも2つの2次元センサとを備え、
前記基板は、前記各2次元センサにて画像上に検出されるマークを有し、
前記各2次元センサにて取得した画像の画像位置合わせを、画像上に検出される基板のマークを用いて行い、前記マークを基準として視野内の領域を複数に分割し、分割した領域毎に前記第1および前記第2のダイクロイックミラーの分光特性の分離比率変化の計算値を用いて蛍光色素解析を行うことを特徴とする核酸分析装置。 - 請求項1において、
前記視野内の分割した領域毎に前記第1および前記第2のダイクロイックミラーの分光特性の分離比率変化の計算値は、各ダイクロイックミラーの設計値から算出した各色素の分離比率と、各輝点から得られた各色素の分離比率を比較することにより得られることを特徴とする核酸分析装置。 - 請求項1において、
前記第1のダイクロイックミラーと、前記第2のダイクロイックミラーは、光軸に対して同じ方向へ傾けて配置されていることを特徴とする核酸分析装置。 - 請求項1において、
上記複数の光学フィルタは、少なくとも短波長域にバンドを持つ第1のフィルタと長波長域にバンドを持つ第2のフィルタを備え、
さらに、これらのフィルタを切り替える切替機構を備える核酸分析装置。 - 請求項4において、
上記第1のフィルタは、500nm付近にピークを持つフィルタであり、少なくとも2種類の短波長域の蛍光色素を同時に励起可能なバンドを持つことを特徴とする核酸分析装置。 - 請求項5において、
上記第1のフィルタは、480nm〜520nmにバンドをもち、蛍光色素FAMとCy3を同時に励起可能であることを特徴とする核酸分析装置。 - 請求項4において、
上記第2のフィルタは、600nm付近にピークを持つフィルタであり、少なくとも2種類の長波長域の蛍光色素を同時に励起可能なバンドを持つことを特徴とする核酸分析装置。 - 請求項7において、
上記第2のフィルタは、580nm〜620nmにバンドをもち、蛍光色素Texas RedとCy5を同時に励起可能であることを特徴とする核酸分析装置。 - 請求項1において、
上記第2のダイクロイックミラーにおいて、蛍光色素ごとに特定の比率で反射光および透過光に分離して上記各2次元センサで検出することを特徴とする核酸分析装置。 - 請求項9において、
上記第2のダイクロイックミラーにおいて、550nm付近および630nm付近に緩やかなエッジをもち、エッジ付近に蛍光ピークを持つ任意の蛍光色素に対して反射光および透過光に分離する核酸分析装置。 - 請求項10において、
上記第2のダイクロイックミラーは、FAM、Cy3、Texas Red、Cy5の4種類の蛍光色素をそれぞれ固有の割合で分離可能であることを特徴とする核酸分析装置。 - 請求項4において、
光学フィルタの切替を実施することにより、4種類の異なる蛍光色素を検出する核酸分析装置。 - 請求項1において、
上記2次元センサを用いて、同一の視野を同露光時間にて撮影する核酸分析装置。 - 請求項1に記載の蛍光観察装置において、
前記光源は白色LEDまたは、Xeランプであることを特徴とする核酸分析装置。 - 請求項1に記載の蛍光観察装置において、
上記2次元センサによって同時に撮影した輝点の比率を算出することによって蛍光色素の種類を特定することを特徴とする核酸分析装置。 - 請求項1に記載の蛍光観察装置において、
前記温調機構は、ステージに設置され、前記基板を加熱及び冷却を行うことを特徴とする核酸分析装置。 - 試薬や試料を送液する送液機構と、送液される流路を有する基板と、前記基板を設置するステージと、塩基伸長反応を行う温調機構と、蛍光を検出し、蛍光画像を観察する検出部を備える核酸分析装置を用いた核酸分析方法において、
前記検出部は、光源と、所定の波長域を通過させる複数の光学フィルタと、対物レンズと、励起光を反射させ、蛍光を通過させる第1のダイクロイックミラーと、蛍光色素から発した蛍光を色素毎に異なる割合で分離する第2のダイクロイックミラーと、分離後にそれぞれの蛍光を検出する少なくとも2つの2次元センサとを備えた核酸分析装置を用いた核酸分析方法であって、
前記基板は、前記各2次元センサにて画像上に検出されるマークを有し、
前記各2次元センサにて取得した画像の画像位置合わせを、画像上に検出される基板のマークを用いて行い、前記マークを基準として視野内の領域を複数に分割し、分割した領域毎に前記第1および前記第2のダイクロイックミラーの分光特性の分離比率変化の計算値を用いて蛍光色素解析を行い、得られた蛍光色から核酸配列を決定することを特徴とする核酸分析方法。 - 請求項17において、
前記視野内の分割した領域毎に前記第1および前記第2のダイクロイックミラーの分光特性の分離比率変化の計算値は、各ダイクロイックミラーの設計値から算出した各色素の分離比率と、各輝点から得られた各色素の分離比率を比較することにより得られることを特徴とする核酸分析方法。 - 請求項17に記載の核酸分析方法であって、
上記複数の光学フィルタは、短波長域にバンドを持つ第1のフィルタと長波長域にバンドを持つ第2のフィルタを備え、
これらのフィルタを切り替えることを特徴とする核酸分析方法。 - 請求項17に記載の核酸分析方法であって、
核酸の塩基伸長反応に使用される反応液は、蛍光標識された塩基と塩基伸長のためのポリメラーゼを含み、核酸の塩基伸長反応は1塩基伸長後、塩基の蛍光標識を切断する工程を含むことを特徴とする核酸分析方法。 - 請求項20に記載の核酸分析方法であって、
核酸の1塩基伸長反応後、伸長した前記塩基の蛍光色画像を取得し、前記塩基の蛍光標識を切断する工程を含むことを特徴とする核酸分析方法。
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