JP2018535436A - 熱波を用いて分析物を検出するための、装置および方法。 - Google Patents
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Abstract
Description
実施例1〜5は、2014年1月9日に公開された米国特許出願公開第2014/0011198号明細書「Heat-Transfer Resistance Based Analysis Bioparticles」に一般的に記載されたバイオセンサ装置の態様を利用する。
エチルグリコールジメタクリレート(EGDM)、メタクリル酸(MAA)、ドーパミン塩酸塩(99%)、およびメタノールは、Acros Organics社(ラフバラ、イギリス)から購入された。重合前に、MAA中の安定剤とEGDMとは、アルミナを通る濾過によって取り除かれた。4,4’−アゾビス(4−シアノ吉草酸)と、セロトニンクレアチニン硫酸塩一水和物(98%)とは、Sigma-Aldrich社(ジリンガム、イギリス)から購入された。熱伝達測定のために、1×リン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液は、Oxoid Limited社(ベイジングストーン、イギリス)から入手したダルベッコタブレットによって作製された。
MIPおよびNIP粒子の、特異性および結合等温線は、Agilent8453分光器(ストックポート、イギリス)を用いる光学バッチ再結合実験によって測定された。再結合実験について、20mgの、MIPまたはNIP粉末は、0.3〜1.0mMの濃度の、5mlのドーパミン水溶液に添加された。得られた懸濁液は、室温においてロッキングテーブル上で12時間にわたって振とうされた。その後、懸濁液は、濾過され、ドーパミンの遊離濃度(Cf)は、UV−vis分光器によって測定された。ドーパミンの結合濃度(Sb)は、MIPおよびNIPの1グラムごとに計算され、結合等温線は、図4に示される。結合等温線を調節することによって、テンプレートドーパミンに対するMIPの特異性が測定された。選択性を試験するために、競合分子セロトニンが使用された。なぜなら、その構造は、ドーパミンに非常に類似しているからである。これらの実験のために、20mgのMIP粉末が、5mlのセロトニン水溶液に添加され、結合等温線は、懸濁液の濾過の後に測定された。
以下の実施例を通して実施された実験は、3mmのグラファイト作業電極、グラファイト対電極、およびAg/AgClリファレンス電極を有する3電極構造を備えるスクリーンプリント電極(SPE)(41mm×7mm)を利用する。
サイクリックボルタンメトリー測定は、3つの電極を用いる電位調整機(Autolab PG-STAT、Metrohm社、ユトレヒト、オランダから入手可能)を用いて実施された。実施例3に記載されたような、グラファイトスクリーンプリント電極とMIP被覆されたSPEとは、規定された作業電極として使用された。白金対電極とリファレンス電極としての飽和カロメル電極(SCE)とは、回路を完成させる。この電気分析手順は、窒素脱ガスされたpH7.4リン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液中で、5μMごとに0〜50μMの範囲のドーパミン濃度にわたって調べられた。+0.20Vにおける酸化ピークは、分析パラメータとして使用された。この実験手順は、50mV/secのスキャン速度で、−0.2V〜+0.8Vの電位範囲にわたって実施された。得られた検量線は、図5に示される。ドーパミン濃度に対する酸化ピーク高さの分析は、両方の電極の応答がおおよそ線形であることを示す。
110μlの全内部体積を有する、6mmの内径、4mmの高さのフローセルが、アクリルで作製された(Lucite International社、ランカシア、イギリスから商標PERSPEX(登録商標)として利用可能である)。フローセルは、実施例4に記載された電位調整機システムに結合され、Oリングで密閉された。フローセルと、電位調整機システムとの間の接触面積は、28mm2であった。MIP被覆されたSPE(実施例3に記載)は、水平に取り付けられ、ヒートシンクとして機能する銅ブロック上に機械的に押し付けられた。銅ブロックの温度T1は、コントロールパラメータP=8、I=1、およびD=0を有する、比例・積分・微分(PID)コントローラによって積極的にコントロールされ、熱電対によって測定された。銅ブロックの温度T1は、37.00℃で維持された。
機能化チップを通る熱伝達の分析に加えて、ヒートシンクに対応する位相シフトは、HTM(実施例5)が行われたのと同じ試料において同時に調べられた。
バナナは、蒸し器および混合器(Avent model SCF870/20、Royal Philips社、アイントホーフェン、オランダから入手可能)を組み合わせて4分間粉砕され、続いて5分間にわたって3200rpmで遠心された。上清は、透明な液体を得るために濾過され、徐々に増加する濃度のドーパミン(62.5、125、500、1000、2000nM)を添加された。500nM以上の濃度において、熱抵抗における顕著な効果が観察された。
エシュリヒア・コリ(Escherichia coli)(ATCC(登録商標)8739(商標))と、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)(ATCC(登録商標)6538(商標))との特徴付けられた株は、Leibniz Institute DSMZ社、ブラウンシュヴァイク、ドイツから入手した。20mlの普通ブイヨン(商品番号x929.1、Carl Roth社、カールスルーエ、ドイツ)が、E.コリ(E.Coli、大腸菌)の単一コロニーに播種され、20mlのCaso broth(品番x938.1、Carl Roth社)がS.アウレウス(S. aureus)の単一コロニーに播種された。両方のコロニーは、攪拌しながら、37℃で一晩増殖された。
スピンコーティング溶液は、122mgの4,4’−ジイソシアノジフェニルメタン、222mgのビスフェノールA、および25mgのフロログルシノールを500μLの無水テトラヒドロフラン(THF)に溶解させることによって作製された。全ての試薬は、少なくとも99.9%の純度を有し、ディーゲム、ベルギーのSigma-Aldrich社から受け取ったように使用された。溶液は、穏やかに撹拌しながら65℃で200分間にわたってそのゲル化点まで重合された。溶液は、1:5の比率で無水THFに希釈された。1.2±0.1μmの平均厚さを有するポリウレタン層(Dektak 3ST、Sloan Instruments社、サンタバーバラ、カルフォルニア、アメリカ)は、溶液を2000rpmで60秒間にわたってスピンコートすることによって、1cm2の表面積を有する各アルミナ基板上に形成された。
6mmの内径と、4mmの高さとを有し、110μlの内部総体積を有するフローセルは、アクリル(ランカスター、イギリスのLucite International社から商標PERSPEX(登録商標)として利用可能)で作製された。フローセルは、電位調整器に結合され、Oリングで密閉された。フローセルと電位調整システムとの間の接触面積は、28mm2であった。SIP被覆された基板(実施例9に記載された)は、ヒートシンクとして機能する銅ブロックに、水平に取り付けられ、機械的に押し付けられた。銅ブロックの温度T1は、コントロールパラメータP=8、I=1、およびD=0で比例・積分・微分(PID)制御装置によって積極的に制御され、熱電対によって測定された。銅ブロックの温度T1は、37.00℃に維持された。
SIP被覆された基板の顕微鏡イメージングは、ディーゲム、ベルギーのLeica Microsystems社から入手可能なDM750光学顕微鏡で実施された。SIP被覆された基板は、640xおよび1000xの倍率で画像化された。ソフトウェア(ImageJ version 1.44p、ベセズダ、メリーランド、アメリカ、国立衛生研究所から入手可能)は、SIP被覆された基板の顕微鏡画像における単位面積毎の細胞インプリントの数を決定するために使用された。細胞インプリントの平均表面範囲は、SIP被覆された基板の各種類について、各SIP被覆された基板上の5つの位置において、3つの異なる試料の細胞インプリント数に基づいて計算された。
SIP被覆された基板は、実施例8および実施例9に記載されたように、PBS中の生きているE.コリ細胞(1×107CFU/mLの濃度)で形成され、インプリントされた。SIP被覆された基板は、SIP被覆された基板と銅ブロックとの間の熱的接触を確実にするために、その被覆されていない、研磨された背面を銅ブロックに機械的に押圧された。SIP被覆された基板は、PBSで満たされたフローセル中に配設された。SIP被覆された基板のRth信号は、60分間にわたって安定化された。死んだ細菌は、2.5mL/分の流速で、72秒間にわたってフローセルに導入された。流れが止められ、Rth信号は60分間にわたって安定化され、細菌はSIP表面に沈殿させられた。任意の未結合細菌は、0.25mL/分の流速で12分間にわたってPBSでフローセルを洗浄することによって除去された。60分間の安定期間後、実験は、生きているE.コリ細胞で繰り返された。この実験の結果は、図16および図17に示される。
SIP被覆された基板は、実施例8および実施例9に記載されたように、S.アウレウス細胞(グラム陽性細菌)およびE.コリ細胞(グラム陰性細菌)で形成され、インプリントされた。SIP被覆された基板は、SIP被覆された基板と銅ブロックとの間の熱的接触を確保するために、被覆されていない研磨された背面を銅ブロックに機械的に押し付けられた。SIP被覆された基板は、PBSで満たされたフローセル内に配設された。時間依存性Rthデータは、SIP被覆された基板を、類似体の非標的細菌、および標的細菌に連続的に暴露することによって得られた。フローセルは、両方の暴露の間に、制御された速度で洗浄された。
1×107CFU/mLの濃度を有するE.コリ細胞のPBSストック溶液の一部は、100、50、20、および10倍に希釈され、SIP被覆された基板(実施例8および実施例9に記載されたように、E.コリでインプリントされた)は、フローセル内の増加した濃度の標的E.コリ細胞に連続的に暴露された。各暴露工程の間において、フローセルは、0.25mL/分の速度で12分間にわたってエタノールですすがれ、続いて0.25mL/分の速度で12分間にわたってPBSですすがれた。この実験結果は、図21に示される。結果は、SIP被覆された基板の検出限界(LoD)を特定する。
溶液は、1:99の比率で、E.コリ細胞およびS.アウレウス細胞の両方を含んで作製された。細菌の総濃度は、1×107CFU/mLであった。この混合物は、連続的な濃縮実験において使用された。
7種類の細菌でインプリントされたポリウレタン層であって、E.コリ、S.アウレウス、K.ニューモニエ(K. pneumoniae)、P.アエルギノーサ(P. aeruginosa)、S.エピデルミディス(S. epidermidis)、A.バウマンニイ(A. baumannii)、およびE.コリ K−12に感受性を有するポリウレタン層は、実施例9に記載されたように形成された。ポリウレタン層は、実施例10に記載されたようにフローセル中においてアルミニウム基質上に配設された。フローセルは、それぞれ時間の関数、銅ブロックの温度T1を変化させるように構成された。
細菌に感受性を有する7種類の細菌インプリントポリウレタン層、実施例16において試験されたものと同一のものは、交差選択性試験について使用された。また、他のSIPは、9枚全ての基板を試験することができるように、C.ディフィシル(C. difficile)と、E.セコルム(E. cecorum)とでインプリントされた。
現場での細菌検出および同定中に遭遇する試料は、微量の標的に加えて、過剰の競合分子および細胞を含むことが予測され得る。この条件を刺激するために、実施例9に記載されたような、S.アウレウスを用いるインプリントSIPは、SIPを細菌の混合物に暴露する進行性濃縮実験について選択された。S.アウレウスと過剰の8種類の非標的細菌とを含む、実施例19において試験された9種類の細菌の混合物が作製された。各非標的細菌に対するS.アウレウスの比率は、1:99であり、細菌の総濃度は、1×107CFU/mLであった。SIPは、混合物に5回連続して暴露され、各暴露の間に緩衝液(PBS)で洗浄された。
Claims (45)
- 分析物(132)を検出するための装置(100)であって、
表面に形成されたポリマー材料(112)を有する基板(110)であって、該ポリマー材料が、前記分析物に結合するように調製され、前記ポリマー材料の熱伝達特性が、前記ポリマー材料に結合した前記分析物の量に基づいて変化するように調製された基板(110)と、
前記ポリマー材料の反対側の前記基板の表面に熱的に結合した熱伝達要素(114)と、
前記熱伝達要素に熱的に結合した温度調節装置(118)と、
前記温度調節装置に前記熱伝達要素から発する熱波(202)を生じさせるように構成された制御装置(121)と、
液体(124)を前記基板の前記ポリマー材料に通すように配設され、構成されたフローセル(122)と、
前記ポリマー材料を通る前記液体の温度(T2)を検出するように構成された温度センサ(134)と、
前記熱伝達要素と前記液体中の減衰した熱波(204)との間の位相シフトの少なくとも一部に基づいて、前記液体中の分析物(132)の濃度を計算するように構成された処理装置(123)とを含むことを特徴とする装置。 - 前記処理装置は、前記熱伝達要素における前記熱波と、前記液体中の前記減衰した熱波との間の振幅の差の少なくとも一部に基づいて、前記分析物の前記濃度を計算するように構成されたことを特徴とする請求項1に記載の装置。
- 前記基板は、金属、または金属合金を含むことを特徴とする請求項1に記載の装置。
- 前記熱伝達要素は、銅を含むことを特徴とする請求項1に記載の装置。
- 前記制御装置は、可変周波数で前記熱伝達要素の温度を変化させるように構成されたことを特徴とする請求項1に記載の装置。
- 前記ポリマー材料は、分子インプリントポリマー、または表面インプリントポリマーなどのインプリントポリマーを含むことを特徴とする請求項1に記載の装置。
- 前記ポリマー材料は、DNA、RNA、タンパク質、ならびにその一部および類似体からなる群から選択された材料を含むことを特徴とする請求項1に記載の装置。
- 前記ポリマー材料は、第2細菌に対する前記ポリマー材料の第2親和性よりも高い第1親和性を有する第1細菌に結合するように調製されたことを特徴とする請求項1に記載の装置。
- 前記第1細菌は、生きている細菌を含み、前記第2細菌は、死んだ細菌を含み、前記生きている細菌と、前記死んだ細菌とは、同じ種に属することを特徴とする請求項8に記載の装置。
- 前記第1細菌は、第1の種を含み、前記第2細菌は、第2の種を含み、該第2の種は、前記第1の種の類似体であることを特徴とする請求項8に記載の装置。
- 分析物を検出するための方法であって、
分析物(132)を含む液体(124)を基板(110)のポリマー材料(112)に通し、該ポリマー材料が、前記分析物に結合するように調製され、前記ポリマー材料の熱伝達特性が、前記ポリマー材料に結合した前記分析物の量に基づいて変化するように調製されることと、
前記分析物を前記ポリマー材料に結合させることと、
熱伝達要素(114)から前記基板を通って前記ポリマー材料に熱波(202)を供給することと、
前記液体の温度(T2)を検出することと、
前記熱伝達要素によって供給された前記熱波と、前記液体中の減衰した熱波(204)との間の位相シフトの少なくとも一部に基づいて、前記液体中の前記分析物の濃度を計算することとを含むことを特徴とする方法。 - 前記熱伝達要素に熱的に結合した温度調節装置(118)の温度(T1)を変化させるように構成された制御装置(121)によって前記熱波を生成することをさらに含むことを特徴とする請求項11に記載の方法。
- 前記液体中の前記分析物の濃度を計算することは、前記熱伝達要素における前記熱波と、前記液体中の前記減衰した熱波との間の振幅の差を測定することを含むことを特徴とする請求項11に記載の方法。
- 熱伝達要素から前記基板を通って前記ポリマー材料まで熱波を供給することは、前記熱波の周波数を変えることを含むことを特徴とする請求項11に記載の方法。
- 前記液体の温度を検出することは、時間の関数として前記液体の前記温度を検出することを含むことを特徴とする請求項11に記載の方法。
- 前記液体中の前記分析物の濃度を計算することは、前記液体中の生物学的分析物の濃度を計算することを含むことを特徴とする請求項11に記載の方法。
- 前記液体中の生物学的分析物の濃度を計算することは、前記液体中のヒスタミンの濃度を計算することを含むことを特徴とする請求項16に記載の方法。
- 分析物を含む液体を基板のポリマー材料に通すことは、前記分析物を含む前記液体を分子インプリントポリマーに通すことを含むことを特徴とする請求項11に記載の方法。
- 分析物を含む液体を基板のポリマー材料に通すことは、前記分析物を含む前記液体を、DNA、RNA、タンパク質、ならびにそれらの一部および類似体からなる群から選択された材料に通すことを含むことを特徴とする請求項11に記載の方法。
- 熱伝達要素から前記基体を通って前記ポリマー材料に熱波を供給することは、前記熱伝達要素の温度(T1)を0.2℃未満だけ変化させることを含むことを特徴とする請求項11に記載の方法。
- 前記液体中の前記分析物の濃度を計算することは、多数の種を含む混合物中の1種類の細菌濃度を計算することを含むことを特徴とする請求項11に記載の方法。
- 前記液体中の前記分析物の濃度を計算することは、同じ種の、生きている細菌と死んだ細菌とを含む混合物中の生きている細菌の濃度を計算することを含むことを特徴とする請求項11に記載の方法。
- 前記分析物以外の材料を前記ポリマー材料から除去するために前記ポリマー材料を洗浄することをさらに含むことを特徴とする請求項11に記載の方法。
- 分析物(132)を検出するための装置(100)を形成するための方法であって、
基板(110)の表面にポリマー材料(112)を形成し、該ポリマー材料は、前記分析物に結合するように調製され、前記ポリマー材料の熱伝達特性は、前記ポリマー材料に結合した前記分析物の量に基づいて変化するように調製されることと、
熱伝達要素(114)を前記ポリマー材料の反対側の前記基板の表面に熱的に結合させることと、
温度調節装置(118)を前記熱伝達要素に熱的に結合させることと、
前記温度調節装置に前記熱伝達要素から発する熱波(202)を生じさせるように制御装置(120)を構成することと、
液体(124)が前記基板の前記ポリマー材料を通るようにフローセル(122)を構成することと、
前記ポリマー材料を通る前記液体の温度(T2)を検出するように温度センサ(134)を構成することと、
前記熱伝達要素における前記熱波と、前記液体中の減衰した熱波(204)との間の位相シフトの少なくとも一部に基づいて、前記液体中の分析物(132)の濃度を計算するように処理装置(123)を構成することとを含むことを特徴とする方法。 - 基板の表面にポリマー材料を形成することは、前記基板の前記表面に前記ポリマー材料をスクリーンプリントすることを含むことを特徴とする請求項24に記載の方法。
- 基板の表面にポリマー材料を形成することは、前記基板の前記表面に分子インプリントポリマーを形成することを含むことを特徴とする請求項24に記載の方法。
- 細菌を特徴付けるための方法であって、
第1細菌と第2細菌とを含む分析物(132)を含む液体(124)を基板(110)のポリマー材料(112)に通して接触させ、前記第1細菌に結合するように該ポリマー材料を調製し、前記ポリマー材料の熱伝達特性は、前記ポリマー材料に結合した前記分析物の量に基づいて変化し、前記第1細菌は、前記第2細菌よりも高い親和性を有する前記ポリマー材料に結合することと、
前記分析物の、前記第1細菌および前記第2細菌の一部を前記ポリマー材料に結合させることと、
前記第2細菌の少なくとも一部を、前記ポリマー材料から除去することと、
前記基板の温度を検出することと、
前記基板の前記温度の少なくとも一部に基づいて、前記液体中の前記第1細菌の濃度を計算することとを含むことを特徴とする方法。 - 前記第1細菌は、生きている細菌を含み、前記第2細菌は、死んだ細菌を含み、前記生きている細菌と、死んだ細菌とは同じ種に属することを特徴とする請求項27に記載の方法。
- 前記第1細菌は、第1の種を含み、前記第2細菌は、第2の種を含み、前記第2の種は、前記第1の種の類似体であることを特徴とする請求項27に記載の方法。
- 前記第2細菌の少なくとも一部を除去することは、前記ポリマー材料を洗浄することを含むことを特徴とする請求項27に記載の方法。
- 前記ポリマー材料を洗浄することは、前記ポリマー材料をリン酸緩衝生理食塩水溶液ですすぐことを含むことを特徴とする請求項30に記載の方法。
- 前記分析物を含む前記液体を基板のポリマー材料に通すことは、前記分析物を含む前記液体を、分子インプリントポリマー、または表面インプリントポリマーなどのインプリントポリマーに通すことを含むことを特徴とする請求項27に記載の方法。
- 前記分析物を含む液体を基板のポリマー材料に通すことは、前記分析物を含む前記液体を、DNA、RNA、タンパク質、ならびにそれらの一部および類似体からなる群から選択された材料に通すことを含むことを特徴とする請求項27に記載の方法。
- 前記ポリマー材料から前記第2細菌の少なくとも一部を除去する前に、前記基板の温度を検出することと、
前記第2細菌の少なくとも一部を前記ポリマー材料から除去する前に、前記基板の前記温度の少なくとも一部に基づいて、前記液体中の前記分析物の総濃度を計算することとをさらに含むことを特徴とする請求項27に記載の方法。 - 前記液体の温度を検出することをさらに含み、前記液体中の前記第1細菌の濃度を計算することは、前記液体の前記温度の少なくとも一部に基づくことを特徴とする請求項27に記載の方法。
- 前記ポリマー材料を通って、熱伝達要素から熱波を供給することをさらに含むことを特徴とする請求項27に記載の方法。
- 前記液体中の前記第1細菌の濃度を計算することは、前記熱伝達要素によって供給された前記熱波と、前記ポリマー材料を通って減衰した熱波との間の位相シフトの少なくとも一部に基づいて、前記液体中の前記第1細菌の濃度を計算することを含むことを特徴とする請求項36に記載の方法。
- 前記熱伝達要素に熱的に結合した温度調節装置の温度を変化させるように構成された制御装置によって前記熱波を生成することをさらに含むことを特徴とする請求項36に記載の方法。
- 前記液体中の前記第1細菌の濃度を計算することは、前記熱伝達要素によって供給された熱波と前記ポリマー材料を通って減衰した熱波との間の振幅の差に少なくとも部分的に基づいて、前記液体中の前記第1細菌の濃度を計算することを含むことを特徴とする請求項36に記載の方法。
- 前記ポリマー材料を通って熱伝達要素から熱波を供給することは、前記熱波の周波数を変化させることを含むことを特徴とする請求項36に記載の方法。
- 前記ポリマー材料を通って熱伝達要素から熱波を供給することは、前記熱伝達要素の温度(T1)を0.2℃未満だけ変化させることを含むことを特徴とする請求項36に記載の方法。
- 細菌を含む液体を特徴付けるための方法であって、
第1株の細菌(132a)と、少なくとも第2株の細菌(132b)とを含む液体(124)を、基板(110)のポリマー材料(112)に通して接触させ、該ポリマー材料は、前記第1株の細菌に結合するように調製され、前記ポリマー材料の熱伝達特性は、前記ポリマー材料に結合した材料の量に基づいて、前記ポリマー材料の熱伝達特性を変化させ、前記第1細菌が、前記少なくとも第2細菌よりも高い親和性を有する前記ポリマー材料に結合することと、
前記第1細菌の一部と、前記少なくとも第2細菌の一部とを前記ポリマー材料に結合させることと、
前記少なくとも第2細菌を前記ポリマー材料から除去するために前記ポリマー材料を洗浄することと、
前記ポリマー材料を洗浄した後、前記液体を前記ポリマー材料に通すことと、
前記少なくとも第2細菌を前記ポリマー材料から除去するために、前記ポリマー材料を少なくとも2回洗浄することと、
前記基板の温度を検出することと、
前記ポリマー材料の前記温度の少なくとも一部に基づいて、前記液体中の前記第1細菌の濃度を計算することとを含むことを特徴とする方法。 - 前記ポリマー材料を洗浄することは、該ポリマー材料をリン酸緩衝生理食塩水溶液ですすぐことを含むことを特徴とする請求項42に記載の方法。
- 前記少なくとも第2細菌を前記ポリマー材料から除去するために、前記ポリマー材料を洗浄することは、前記ポリマー材料から前記第1細菌を除去することなく、前記少なくとも第2細菌を前記ポリマー材料から除去することを含むことを特徴とする請求項42に記載の方法。
- 前記ポリマー材料を洗浄後、前記液体を前記ポリマー材料に通すことは、前記ポリマー材料に結合した前記第1細菌の量を増加させることを含むことを特徴とする請求項42に記載の方法。
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