CN108369197B - 使用热波检测分析物的装置和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测分析物(132)的装置(100)，其包括：在衬底(110)上的聚合物材料(112)；传热元件(114)，其热耦合至所述衬底；温度修改装置(118)，其热耦合到所述传热元件；控制器(121)，用于产生从传热元件发出的热(202)波；流动池(122)，其被放置并配置成使液体(124)在聚合物材料之上通过；温度传感器(134)，用于检测在聚合物材料之上通过的液体的温度(T2)；以及处理器(123)，用于至少部分地基于所述传热元件处的热波与所述液体中的衰减热波(204)之间的相移来计算所述液体中的分析物(132)的浓度。本发明还公开了形成这种装置和检测分析物的相关方法。

Description

使用热波检测分析物的装置和方法
技术领域
本公开的实施方式总体上涉及例如在被配置成产生热波的散热器上方使用聚合物材料检测分析物的装置和方法。
背景技术
分子印迹聚合物(MIP)可用于检测在复杂混合物中的化学物质。在现代研究中，这些聚合物对于生物分析应用越来越令人感兴趣。使用这些MIP的优点包括：简单和便宜的生产；机械、化学和热稳定性；可重用性；以及长保质期。近年来，分子印迹的概念已经扩展到用微米尺寸的细胞对薄聚合物薄膜进行表面压印以创建用于检测蛋白质、糖蛋白、植物病毒、人病毒、细菌、花粉、酵母细胞、甚至哺乳动物的红细胞的所谓“表面印迹聚合物”(SIP)。SIP是在表面具有压痕的聚合物材料，其具有与所需靶标的一部分相匹配的形状和功能。SIP适合与较大物体(例如，细胞、细菌等)结合，这些物体不能很快扩散穿过MIP的孔。在聚合之后可以通过软化聚合物发生压印。使用文献中描述的生物传感器检测细胞通常通过重力检测、电子读出平台或微流体技术进行。然而，这些技术往往耗时，难以分析，或需要昂贵的设备。
例如，在2014年1月9日公布的美国专利申请公布2014/0011198A1“基于传热阻力的分析生物粒子(Heat-Transfer Resistance Based Analysis Bioparticles)”中描述了基于分析物浓度的附着有MIP的衬底的耐温性(temperature resistance)，其全部公开内容由此通过引用并入本文。
提供在下述细胞之间进行区分的能力的低成本的传感器平台对于现代研究和工业来说会是一个有价值的工具，所述细胞在形状、尺寸和其表面上的官能团的官能性上具有略微差异。
发明内容
在一些实施方式中，一种用于检测分析物的装置包括：衬底，其具有在其表面上形成的聚合物材料；散热器，其热耦合到衬底的与聚合物材料相对的表面；温度修改装置，其热耦合到散热器；控制器，其被配置成使温度修改装置产生从散热器发出的热波；以及，流动池，其被放置并被配置成使液体在衬底的聚合物材料之上通过。该装置还可以包括：温度传感器，该温度传感器被放置并且被配置成检测在聚合物材料之上通过的液体的温度；以及处理器，其被配置成至少部分地基于散热器处的热波与液体中的衰减热波之间的相移来计算液体中的分析物的浓度。
一种用于检测分析物的方法包括：使含有分析物的液体在衬底上的聚合物材料之上通过；使分析物结合到聚合物材料上；从散热器穿过衬底向聚合物材料提供热波；检测液体的温度；以及，至少部分地基于由散热器产生的热波与在液体中的衰减热波之间的相移来计算液体中的分析物的浓度。
一种形成用于检测分析物的装置的方法包括：在衬底的表面上形成聚合物材料；将散热器热耦合到衬底的与聚合物材料相对的表面；将温度修改装置热耦合到散热器；配置控制器以使温度修改装置产生从散热器发出的热波；配置流动池以使液体在衬底的聚合物材料之上通过；配置温度传感器以检测在聚合物材料之上通过的液体的温度；以及，配置处理器以至少部分地基于散热器处的热波与液体中的衰减热波之间的相移来计算液体中的分析物的浓度。
在一些实施方式中，一种用于表征细菌的方法包括使含有包含第一细菌和第二细菌的分析物的液体在衬底上的聚合物材料之上通过并与衬底上的聚合物材料接触。将聚合物材料配制成与第一细菌结合，并且第一细菌以比第二细菌高的亲和性与聚合物材料结合。聚合物材料的传热性质基于与其结合的分析物的量而变化。该方法还包括使分析物的第一细菌和第二细菌的一部分结合到聚合物材料上，从聚合物材料中去除至少一部分第二细菌，检测衬底的温度，并且至少部分基于衬底的温度计算液体中的第一细菌的浓度。
在其他实施方式中，一种用于表征包含细菌的液体的方法包括使含有第一细菌菌株和至少第二细菌菌株的液体在衬底上的聚合物材料之上通过并与衬底上的聚合物材料接触。将聚合物材料配制成与第一细菌菌株结合，并且第一细菌以比至少第二细菌高的亲和性与聚合物材料结合。聚合物材料的传热性质根据与其结合的材料的量而变化。该方法进一步包括使一部分第一细菌和一部分至少第二细菌结合到聚合物材料上，洗涤聚合物材料以从中去除至少第二细菌，在洗涤聚合物材料之后使液体在聚合物材料之上通过，至少第二次洗涤聚合物材料以从中去除至少第二细菌，检测衬底的温度，并且至少部分基于聚合物材料的温度计算液体中的第一细菌的浓度。
附图说明
图1是示出用于检测分析物的装置的简化示意图；
图2是示出热波如何在图1的装置中行进的简化示意图；
图3是示出用于检测分析物的另一装置的简化示意图；
图4是示出根据本公开的实施方式测量的多巴胺的结合等温线的图；
图5是示出根据本公开的实施方式测量的多巴胺的校准曲线的图；
图6是示出根据本公开的实施方式测量的温度变化的图；
图7是示出根据本公开的实施方式测量的热阻的时间相关值的图；
图8是以剂量响应曲线的形式示出图7的热阻数据的图；
图9是示出根据本公开的实施方式产生的热波的图；
图10是示出根据本公开的实施方式在穿过衬底之后测量的热波的图；
图11是示出根据本公开的实施方式所测量的在图10中所示的热波的相移的图；
图12是示出根据本公开的实施方式在穿过衬底之后测量的热波的图；
图13是示出根据本公开的实施方式所测量的在图12中所示的热波的相移的图；
图14和15分别是用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌压印的聚合物的光学显微镜分析；
图16是示出交替暴露于死和活的大肠杆菌中的装置的热响应的图，在暴露之间有冲洗；
图17是总结图5中所示的热响应的箱线图；
图18和19是示出交替暴露于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的装置的热响应的图，在暴露之间有冲洗；
图20是总结图7和8中所示的热响应的箱线图；
图21是示出暴露于增加浓度的大肠杆菌的装置的热响应的图，在暴露之间有冲洗；
图22是从图10所示的热响应导出的剂量-响应曲线；
图23是示出在暴露之间冲洗的情况下暴露于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的混合物的装置热响应的图以及总结热响应的箱线图；
图24至图30是示出根据本公开的实施方式测量的装置的温度变化的图；
图31至37是示出根据本公开的实施方式在穿过衬底之后测量的热波的图；
图38和40是示出根据本公开的实施方式测量的在暴露于类似物和靶标细菌时的装置的温度变化的图；
图39和41分别是示出图38和40中描绘的数据在0.03Hz处的相移的图；
图42是示出根据本公开的实施方式在反复暴露于细菌混合物期间测量的装置的温度变化的图；
图43是示出图42示出其温度变化的装置的热响应的图以及总结热响应的箱线图；以及
图44是示出图42所描述的数据在0.03Hz处的相移的图。
具体实施方式
本文呈现的图示不是任何特定装置或方法的实际视图，而仅仅是用于描述本公开的示例实施方式的理想化表示。在附图之间共同的元素可以保持相同的数字标识。
如本文所用，术语“模板分子”和“模板细菌”分别指用于形成分子印迹聚合物(MIP)或表面印迹聚合物(SIP)的分子或细菌。然后，这种MIP或SIP可以检测具有与用于形成MIP或SIP的模板分子相对应的官能性的“靶标分子”或“结合配偶体”。
如本文所用，词语“可以”涵盖单词“能够”，并且词语“可以是”包括取决于上下文的单数“是”或复数“是”。此外，单词“可以”的存在旨在表示用于实践或实施本公开的实施方式的选项，而没有限制。
图1是示出用于检测分析物的装置100的简化示意图。在一些实施方式中，装置100可以被配置成检测靶标分子、核酸如DNA和/或RNA、在DNA和/或RNA中的单核苷酸多态性(SNP)、小分子、蛋白质、细菌等。
装置100可以包括衬底110，所述衬底110具有位于其表面上的聚合物材料112。例如，聚合物材料112可以形成或设置在衬底110的大致平坦的表面上，并且衬底110的另一个相对的大致平坦的表面可以不含聚合物材料112。在一些实施方式中，衬底110可以包括金属(例如，铝)、合金、半导体(例如，硅、掺杂的金刚石等)、电绝缘材料(例如，未掺杂的金刚石)。聚合物材料112可以包括任何材料，对于所述材料而言，传热性质基于与其结合的分析物的量而变化。例如，聚合物材料112的热导率、热扩散率、热容量或另一种性质可以随着在其表面上的分析物的浓度而变化。
在一些实施方式中，聚合物材料112可以包括印迹聚合物，例如分子印迹聚合物(MIP)或表面印迹聚合物(SIP)。本领域中MIP和SIP也可被称为“塑性”抗体。MIP通常对特异性结合配偶体具有高亲和性，从而当这种结合配偶体与MIP接触时，分子与MIP结合。MIP是合成受体，其含有对其各自靶标分子具有高亲和性的纳米腔。压印(即，形成纳米腔)通常是聚合过程的一部分。MIP能够特异性地结合靶标，包括细菌，从小离子到复杂基质中的大细胞。分子与MIP的结合可以改变MIP的一些性质，例如热性质、机械性质、电性质等。因此，MIP的改变的性质可以用于在相对低浓度下检测这种分子的存在。MIP被描述于例如2009年11月12日公布的美国专利申请公布2009/0281272A1，“单分散分子印迹聚合物珠粒(Monodisperse Molecularly Imprinted Polymer Beads)”中，其全部公开内容由此通过引用并入本文。
类似地，SIP通常对特异性结合配偶体具有高亲和性，但通常可以结合到不快速扩散穿过MIP的孔的相对较大的对象(例如，细胞、细菌等)。SIP可以是在表面上形成然后在聚合后通过软化聚合物而压印的聚合物材料。
在某些实施方式中，聚合物材料112可以包括DNA、RNA、蛋白质或者其部分或类似物。例如，装置100可以包括用聚合物材料112如DNA、RNA、蛋白质、多肽、核酸聚合物、探针或者其部分或类似物(例如，互补DNA、抗体等)官能化的衬底110(例如，金刚石表面)。可配制聚合物材料112以具有对特异性结合配偶体的高亲和性，使得当此类结合配偶体与衬底110的表面接触时，分子与聚合物材料112结合。聚合物材料112也可结合到结合配偶体的类似物(例如，与结合配偶体具有相似官能性的物质)，尽管不一定具有和与结合配偶体本身结合相同的亲和性。在一些实施方式中，聚合物材料112可以包括至少约七(7)个重复单元，例如十(10)个重复单元或更多。
在一些实施方式中，聚合物材料112可以包括丝网印刷到衬底110上的材料。丝网印刷材料可以有效且大量地制造，与其他材料相比具有较高的均匀性。
装置100可以进一步包括散热器114，其热耦合到衬底110的表面如与聚合物材料112相对的表面。虽然为了简单起见而将其称为“散热器”，但是散热器114可以被配置成向衬底110提供热量或者从衬底110去除热量，因此也可以被表征为传热元件114。散热器或传热元件114可以是具有高热导率的材料，诸如过渡金属(例如，铜、银等)或其合金或混合物。在一些实施方式中，聚合物材料112可以被施加到散热器114本身。散热器114可以热耦合到被配置成检测散热器114的温度的温度传感器116(例如，热电偶或另一种装置)，并且热耦合到被配置成维持散热器114的温度的温度修改装置118。温度修改装置118可以包括例如热电装置、热交换器、风扇、电阻加热器等。温度传感器116可以是具有随温度变化的电阻的电阻器。如果散热器114的特性是已知的(例如，如果修改装置118的控制信号和散热器114的温度之间的关系被良好地表征)，则可以省略温度传感器116。在一些实施方式中，温度传感器116可以集成到温度修改装置118。例如，可以测量温度修改装置118本身的内部电阻以确定其温度。
温度传感器116和温度修改装置118可连接到控制器121，控制器121被配置(即编程)以控制温度修改装置118以使得散热器114产生从散热器114发出并穿过衬底110(包括其上的聚合物材料112)的热波。例如，控制器121和处理器123可以被并入计算机120中(例如，控制器121可以是被配置成接收和提供电信号的输入输出卡，并且可以被配置成从处理器123接收信号)。在一些实施方式中，控制器121可以是比例积分微分(PID)控制器，其能够在相对较短的时间尺度上将散热器114的温度改变少量。例如，控制器121可以将散热器114的温度改变约0.5℃或更小、约0.2℃或更小或甚至约0.05℃或更小。因此，热波可具有约1.0℃或更小、约0.4℃或更小或甚至约0.10℃或更小的振幅。控制器121可以能够经由温度修改装置118将散热器114的温度从一个设定点改变到另一个并且返回以形成具有从约0.001至约0.5Hz如从约0.005至约0.1Hz或从约0.01至约0.05Hz的频率的热波。在一些实施方式中，控制器121、温度修改装置118和散热器114可以一起产生具有可变频率的热波。基于来自温度传感器116(如果存在)的测量结果、对于温度修改装置118的已知输入或其它手段，热波的性质可以是已知的(例如，相位、振幅、在特定时间的频率、频率变化率等)。
在其他实施方式中，控制器121可以被配置成将散热器114保持在恒定的温度。在2015年8月6日公开的美国专利申请公布2015/0219584A1，“利用障碍法实时监测的生物传感器(Biosensor Using Impedimentric Real-Time Monitoring)”中描述了在恒定温度下使用散热器检测分析物，其全部公开内容由此通过引用并入本文。
装置100可以还包括流动池122，流动池122被配置成使液体124在衬底110的聚合物材料112之上通过。流动池122可以限定邻近衬底110的聚合物材料112的空区126以及入口128和出口130，液体124可流动穿过入口128和出口130。O形环131或另一合适的密封机构可将液体124保持在流动池122内靠近衬底110上的聚合物材料112。
如上所述，液体124可以包括特异性地结合到聚合物材料112并改变其热性质的分析物132。例如，分析物132可以包括一种或多种细菌菌株。如上所述，分析物132(其可以包括多个分析物132a和132b)可以特异性地结合到聚合物材料112并改变其热性质。如果液体124中存在多个分析物132a和132b，则分析物132a、132b可以具有相似的官能性，使得每个分析物132a、132b结合到聚合物材料112。分析物132a、132b可以以不同的亲和性结合到聚合物材料112。在一些实施方式中，第一分析物132a可以包括活细菌，并且第二分析物132b可以包括相同物种的死细菌。在其他实施方式中，第一分析物132a可以包括细菌，并且第二分析物132b可以包括类似的细菌。
温度传感器134(例如，热电偶或另一个装置)可以被配置成检测在流动池122中(例如，流过流动池122)的液体124的温度。计算机120可以例如通过下述方式来记录液体124的温度：通过控制器121和/或处理器123测量温度传感器134的电阻，并将该电阻与温度相关联。液体124的温度可以不同于散热器114的温度，并且可以至少部分地基于分析物132的存在或不存在以及其在液体124中的浓度而变化。例如，在2014年1月9日公布的美国专利申请公布2014/0011198A1“基于传热阻力的分析生物粒子(Heat-Transfer ResistanceBased Analysis Bioparticles”中描述了基于分析物浓度的衬底的耐温性，该文的全部公开内容由此通过引用并入本文。
在一些实施方式中，处理器123可以被配置成至少部分地基于由散热器114产生的热波与在热波穿过衬底110和聚合物材料112之后在液体124中的衰减的热波之间的相移来计算液体124中的分析物132的浓度。
图2是示出热波如何在图1的装置100中行进的简化示意表示。图2包括图1中所示的一些组件，但将它们分开示出以允许表示穿过部件和在部件之间行进的热波。具体而言，图2示出了热耦合到温度修改装置118和温度传感器116的散热器114，温度修改装置118和温度传感器116连接到计算机120。可以基于散热器114处的热波以及液体124中的热波之间的差别来测量分析物132的浓度，而不需要单独的校准步骤。
散热器114可以产生热波202并且将热波202传递到衬底110和其上的聚合物材料112。例如，如果散热器114最初保持在37℃的恒定温度，则可以通过下述方式来产生热波202：将散热器114加热到37.1℃的温度，然后将散热器114冷却到36.9℃的温度。由温度修改装置118驱动的散热器114的加热和冷却可以使衬底110和聚合物材料112以相应的方式加热和冷却。热波202可以具有振幅α1和频率
Figure BDA0001662464660000101
振幅α1和/或频率
Figure BDA0001662464660000102
可以随时间变化。例如，热波202可以具有连续变化的频率
Figure BDA0001662464660000103
如上所述，分析物132在衬底110上的存在或不存在可以改变聚合物材料112的热导率、热扩散率、热容量或另一种性质。图2在概念上说明了聚合物材料112可以在其中限定适于与分析物132的至少一部分相互作用的空腔136。不受任何具体理论的束缚，空腔136可以被配置成用于特异性地结合分析物132。因此，基于液体124中的分析物132的浓度，聚合物材料112可以从在一些空腔136中的液体124接收分析物132的粒子或分子。液体124和聚合物材料112可以在给定的温度达到平衡，使得分析物132以相等的速率结合到聚合物材料112和从聚合物材料112分离。聚合物材料112的热性质可部分取决于空腔136的与分析物132的粒子或分子结合的部分。
衬底110和/或其上的聚合物材料112可改变从中穿过的热波202以形成衰减热波204。衰减热波204可由温度传感器134检测并由计算机120记录。衰减热波204可以具有振幅α2和频率
Figure BDA0001662464660000104
其可以与热波202的振幅α1和频率
Figure BDA0001662464660000106
不同。可以将在振幅α1、α2和/或频率
Figure BDA0001662464660000105
上的差异与结合到聚合物材料112上的分析物132的量相关联并且因此与液体124中的分析物132的浓度相关联。与在稳定状态下测量液体124的温度的常规方法相比，对振幅α1、α2和/或频率
Figure BDA0001662464660000107
的差异的测量可以允许装置100检测到与聚合物材料112结合的分析物132的相对较低的量(对应于在液体124中分析物132的较低浓度)。
在其他实施方式中，处理器123可以被配置成基于散热器114和液体124之间的稳态温度差来计算分析物132的浓度。
在某些实施方式中，分析物132可以结合到非平面表面。例如，图3是示出用于检测分析物132的另一装置200的简化示意图。装置200可包括热电偶210，其具有在其表面上形成的基体材料212。例如，基体材料212可以形成在热电偶210的大致圆柱形表面上，使得热电偶210的整个末端被封闭。热电偶210可以包括在两种材料之间的接合点，所述材料被配置成在电触点216、218之间提供与温度相关的电压。在一些实施方式中，热电偶210可以包括一种或多种金属(例如，铂、金、铱、钯等)或合金(例如，镍合金、铜合金、铑合金、铼合金、铁合金、钼合金等)。
基体材料212可以是聚合物材料，例如，聚乳酸-(L)-酸，其在本领域中可被称为PLLA。PLLA是透明的，是从环境可再生资源(如淀粉或含糖农产品)生产起来便宜的，是可生物降解的和生物相容的。此外，可以将PLLA溶解在氯仿中以使得能够施加到热电偶210。基于期望的性质，可以选择另一种材料而不是PLLA作为基体材料212。在一些实施方式中，基体材料212可以包括聚氨酯、聚乳酸、聚己酸内酯、聚(乳酸-乙醇酸共聚物)、聚(D、L-丙交酯-共-乙交酯)或另一种经选择的聚合物。基体材料212可以在热电偶210的外部上呈薄的、光滑的且均匀的涂层的形式。通过基体材料212的涂层的均匀性可以使得装置200能够产生可再现的结果。可以考虑到基体材料212的热阻来选择基体材料212的厚度，以影响热量可以朝向或远离热电偶210流动的速率。因此，较薄的基体材料212有益于其中需要快速响应或温差很小的应用。
基体材料212可以被选择为展现出至少一些弹性，使得装置200可以是柔性的以允许热电偶210弯曲而不破坏基体材料212。这可以使装置200能够用于需要紧密间隙或弯曲(例如，在导管中体内使用)的应用。
测定聚合物214可以位于基体材料212的表面上。在一些实施方式中，测定聚合物214可以直接结合到热电偶210的表面，并且可以省略基体材料212。测定聚合物214可以包括传热性质响应于与其结合的分析物的量而变化的材料。例如，测定聚合物214的热导率、热扩散率、热容量或其他性质可以随着其表面上的分析物的浓度而变化。
在一些实施方式中，测定聚合物214可以包括印迹聚合物(MIP或SIP)、DNA、RNA、蛋白质或者其部分或类似物(例如，抗体)。测定聚合物214可以被配置成对特定结合配偶体具有高亲和性，从而当这种结合配偶体与热电偶210的表面接触时，分子与测定聚合物214结合。在一些实施方式中，测定聚合物214可以包括至少约七(7)个重复单元，例如十(10)个重复单元或更多。
在一些实施方式中，装置200可以包括处理器223，处理器223被编程为计算与测定聚合物214结合的分析物的量。处理器223可以至少部分地基于与测定聚合物214结合的分析物的量计算出与装置200接触的液体中的分析物的浓度。例如，处理器223可以通过如下文献中公开的方法来计算分析物的量：在2014年1月9日公布的美国专利申请公布2014/0011198A1“基于传热阻力的分析生物粒子(Heat-Transfer Resistance Based AnalysisBioparticles”；或在2014年8月28日公布的美国专利申请公布2014/0242605A1“基于传热阻力的分析生物粒子(Heat-Transfer Resistance Based Analysis Bioparticles)”，其各自的全部公开内容由此通过引用并入本文。在某些实施方式中，处理器223可以用于检测在散热器处或从散热器发出的热波与在热电偶210处的衰减热波之间的相移。处理器223然后可以至少部分基于散热器处的热波与热电偶210处的衰减热波之间的振幅差异计算液体中的分析物的浓度。
再次回到图1，聚合物材料112可以形成或以其他方式设置在衬底110上。例如，聚合物材料112可以丝网印刷到金属衬底110上。丝网印刷可以有效地执行并且扩大以大量产生，同时与其他方法相比具有较高的均匀性。在例如2012年7月26日公布的美国专利申请公布2012/0186999A1“电化学传感器(Electrochemical Sensor)”中描述了衬底的丝网印刷，其全部公开内容由此通过引用并入本文。
散热器114可以在与聚合物材料112相对的表面处热耦合到衬底110。例如，散热器114可以被放置成与衬底110直接物理接触，使得热量可以通过传导从散热器114流动到衬底110。在一些实施方式中，可以将导热材料(例如，具有导热填料的可聚合液体基质)放置成与散热器114和衬底110物理接触以消除在散热器114和衬底110之间的空气间隙。类似地，温度修改装置118可以通过直接物理接触、通过导热材料或通过其它适当的方式热耦合到散热器114。
控制器121(例如，PID控制器)可以电连接到温度修改装置118以提供足以驱动散热器114的温度的功率，并且使温度修改装置118改变散热器114的温度以产生热波202(图2)。
流动池122可以固定在衬底110附近，使得液体124穿过入口128进入流动池122，接触聚合物材料112，然后穿过出口130离开流动池122。在一些实施方式中，流动池122可以通过一个或多个紧固件138(例如，螺钉)连接到散热器114。在其他实施方式中，流动池122可以通过整体螺纹或通过滑动配合接头连接到散热器114。O形环131或其他密封件可被配置成保持液体124不直接接触散热器114、温度修改装置118或衬底110的背面。
温度传感器134可以设置在流动池122的空区126内以测量流过流动池122的液体124的温度。温度传感器134可以通过粘合剂或其他适当方式固定到流动池122。温度传感器134可以电连接到处理器123，处理器123可以包括欧姆计。处理器123可以被配置成连续检测在温度传感器134处的温度，并且至少部分地基于通过散热器114所产生的热波202(图2)和液体124中的衰减热波204(图2)之间的相移来计算液体124中的分析物132的浓度。
图1所示并且如上所述的装置100可以用于检测任何经选择的分析物132，例如细菌。例如，装置100可用于检测、感测和量化液体124中的生物分析物或其他化学物质。装置100可用于检测、感测和量化细菌的特定菌株，无论细菌是活的还是死的，或区分复杂混合物中的细菌类型。分析物132可以是溶解或以其他方式与液体124混合的气体、液体或固体。例如，装置100可用于检测、感测、量化分析物、抗体、抗原、核酸(例如DNA、RNA等)，包括具有特定序列的核酸(例如SNP)、蛋白质、小分子(例如，多巴胺、组胺等)或其他物质。在一些实施方式中，装置100可用于检测组胺、多巴胺、血清素、肾上腺素、哌甲酯等。
本文所公开的分子印迹方法的许多有吸引力的特征之一是可以将方法应用于各种各样的分析物。在例如下文中描述了小的有机分子(例如，药物、杀虫剂、氨基酸和肽、核苷酸碱基、类固醇、糖等)的压印：K.Haupt和K.Mosbach,“分子印迹聚合物及其在仿生传感器中的应用(Molecularly Imprinted Polymers and Their Use in BiomimeticSensors),”Chem.Rev.100,2495 2504(2000)；以及，G.Mustafa和P.Lieberzeit,“MIP传感器正在走向现实世界的应用(MIP Sensors on the Way to Real-World Applications),”于Springer Series on Chemical Sensors and Biosensors,vol.12,pp.167-187(Springer,2012)。也可以通过类似的方法压印较大一些的有机化合物(例如，肽)。例如，在下文中已经提出了用于压印较大结构如蛋白质、细胞和矿物晶体的方案：M.Kempe,M.Glad,和K.Mosbach,“使用酶核糖核酸酶A进行表面压印的方法(An Approach Towards SurfaceImprinting Using the Enzyme Ribonuclease A),”J.Molecular Recognition,8,35-39(1995)；S.Hjerten等,“凝胶模拟抗体选择性识别蛋白质(Gels Mimicking Antibodies inTheir Selective Recognition of Proteins),”Chromatographia 44,227-234(1997)；H.Shi等,“用于蛋白质识别的模板印迹纳米结构表面(Template-ImprintedNanostructured Surfaces for Protein Recognition),”Nature 398,593-597(1999)；A.Aherne等“细菌介导的聚合物表面光刻(Bacteria-Mediated Lithography of PolymerSurfaces),”J.Am.Chem.Soc.118,8771-8772(1996)；以及，S.M.D’Souza等,“方解石在晶体印迹聚合物表面的定向成核(Directed Nucleation of Calcite at a Crystal-Imprinted Polymer Surface),”Nature 398,312-316(1999)。在下文中描述了作为药物先进药物递送桥的分子压印：B.Sellergren和C.Allender,“分子印迹聚合物：先进药物递送的桥梁(Molecularly Imprinted Polymers:A Bridge to Advanced Drug Delivery),”Advanced Drug Delivery Reviews 57,1733-1741(2005)。本段中引用的每个文件的全部公开内容由此通过引用并入本文。
为了检测分析物132，可以使含有分析物132的液体124穿过流动池122，与衬底110上的聚合物材料112相邻并接触。分析物132(例如，粒子、分子或细菌)结合到聚合物材料112，改变聚合物材料112的一种或多种热性质。在检测期间，液体124可以连续地流过流动池122，或者液流可以在检测开始之前终止。无论液体124是流动的还是停滞的，热波202(图2)和衰减热波204都可以穿过液体124。液体124的热特性对于流动和停滞的液体124可以不同，但可以基于液流特性来确定。在一些实施方式中，流动池122和其中的液体124可在检测分析物132之前达到测试温度。如上所述，聚合物材料112可以是配制成结合感兴趣的特定分析物132的分子印迹聚合物。
从散热器114穿过衬底110向聚合物材料112提供热波202(图2)。控制器121(例如，PID控制器)可以经由温度修改装置118例如通过下述方式改变散热器114的温度：以预选的频率将散热器114的温度升高和降低预选的量。散热器114的温度变化可以小得足以使得变化不会显著地干扰可能同时发生的其他测量。例如，即使散热器114的温度变化，只要平均温度测量的时间尺度长于变化的频率，并且/或者与由分析物132与聚合物材料112的相互作用引起的温度变化相比，温度变化的量是小的，就也可以测量在流动池122中的液体124的平均温度。在一些实施方式中，散热器114可以提供具有从大约0.001至约0.5Hz如从约0.005至约0.1Hz或从约0.01至约0.05Hz的频率的热波202。此外，热波202的频率可以在测试期间变化(例如，频率可以从低频连续变化到高频，或者反之亦然)。热波202可具有约1.0℃或更小、约0.4℃或更小或甚至约0.10℃或更小的振幅。
可以测试在流动池122中的液体124的温度，并且可以将结果与散热器114的温度进行比较。
可以至少部分地根据由散热器114产生的热波202与液体124中的衰减热波204之间的相移来计算液体124中的分析物132的浓度。可以由处理器123基于已知浓度的液体的响应来执行热波202和衰减热波204的比较。在一些实施方式中，热波202与衰减热波204的比较可以至少部分地基于振幅、相移或另一特性。
热波的测量使得能够测量热阻而不显著改变聚合物材料112的整体温度。不受任何特定理论的束缚，这样的测量看起来是对于电子领域中的电容或电感的测量的热类似物。例如，测量电阻揭示关于电子装置或材料的一些信息，但测量电容或阻抗会揭示附加信息，例如装置或材料如何响应于负载。类似地，通过本文公开的方法测量热阻可以揭示测量稳态温度差不能揭示的附加信息。
例如，当施加热波时，可以以在靶标与受体结合后液体中的衰减热波的振幅、频率和/或相位的变化的形式获得不同类型的信息。相移可能会根据输入频率而变化。由热波提供的信息量远远大于稳态分析，并且信息可以使得能够检测或区分更多种类的的材料。
此外，并且同样不受任何特定理论的束缚，当分析物132结合到其受体(即，空腔136)上时，聚合物材料112的热质量可能增加。在结合分析物132之前，空腔136可以充满液体。在分析物132结合到其受体后，液体可以被分析物132取代，从而增加整个换能器(transducer)系统的热质量。
在一些实施方式中，第一分析物132a可以通过从聚合物材料112中去除第二分析物132b而与第二分析物132b区分。例如，如果第一分析物132a是活细菌并且第二分析物132b是死细菌，则可以从聚合物材料112(例如，用缓冲液)洗涤或清洗死细菌，留下活细菌。第一分析物132a与第二分析物132b之间的亲和性差异可以促进这种辨别。在一些实施方式中，第一分析物132a可以是用于形成聚合物材料112的模板分子，第二分析物132b可以是具有一些类似官能性的分子或细菌。因此第二分析物132b可以至少弱地结合到聚合物材料112。
实施例
实施例1至5基于在2014年1月9日公布的美国专利申请公布2014/0011198A1“基于传热阻力的分析生物粒子(Heat Transfer Resistance Based Analysis Bioparticles)”中大致描述的生物传感装置的方面。
实施例1：具有用于检测多巴胺的模板的MIP的制备。
乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDM)、甲基丙烯酸(MAA)、多巴胺盐酸盐(99％)和甲醇购自Acros Organics(英国Loughborough)。在聚合之前，通过在氧化铝上过滤去除MAA和EGDM中的稳定剂。4,4'-偶氮双(4-氰基戊酸)和血清素肌酸酐硫酸盐一水合物(98％)购自SigmaAldrich(英国Gillingham)。为了传热测量，使用从Oxoid Limited(英国Basingstoke)获得的Dulbecco片剂制备1x磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液。
将MAA(0.54g，6.6mmol)、EGDM(2.96g，14.9mmol)和4,4'-偶氮双(4氰基戊酸)(65mg)的混合物与多巴胺(0.063g，0.33mmol)、模板分子一起溶于甲醇(3.67ml)和水(0.57ml)中。该混合物用N2脱气并加热以引发聚合。为了使反应完全完成，将混合物在65℃保持12小时。在聚合后，研磨本体聚合物并筛分，以得到直径小于10μm的微粒。通过用甲醇和水的50/50混合物连续萃取，从MIP粉末中去除多巴胺。在6小时后，MIP基本上不含多巴胺，如使用来自Thermo Scientific(英国Loughborough)的NICOLETTM 380FT-IR装置通过AT-IR光谱学所证实的。随后，MIP粉末在100℃在烘箱中干燥12小时。根据相同的方法合成非印迹聚合物(NIP)作为对照，但不存在多巴胺。
实施例2：测试用于检测多巴胺的MIP
通过使用安捷伦8453分光光度计(英国Stockport)的光学分批重新结合实验来确定MIP和NIP粒子的特异性和结合等温线。对于重新结合实验，将20mg MIP或NIP粉末加入到5ml的浓度在0.3-1.0mM之间的多巴胺水溶液中。在室温下将所得悬浮液在摇床上摇晃12小时。随后，过滤悬浮液，并通过紫外可见光谱测定多巴胺的游离浓度(Cf)。计算每克MIP和NIP的多巴胺结合浓度(Sb)以及结合等温线，并将其显示在图4中。通过拟合结合等温线，确定MIP对模板多巴胺的特异性。为了测试选择性，使用了竞争剂分子血清素，因为它的结构与多巴胺非常相似。对于这些实验，将20mg MIP粉末加入到5ml的血清素水溶液中，并在过滤悬浮液后确定结合等温线。
图4示出了在MIP与其参比NIP之间的结合上有显著差异。为确定特异性，使用印迹因子(IF)，其是在选定浓度下与MIP结合的量除以与参比NIP结合的量。结合等温线使用以下类型的两参数拟合进行拟合以分析特定浓度下的印迹因子(等式1)：
等式1：
Figure BDA0001662464660000181
等式1对应于Freundlich等温线，并且如果假定结合位点和亲和常数的分布是异构的，则可用于拟合MIP结合等温线。在Cf＝0.3mM时，IF为3.1±0.1，而由于结合位点的饱和，较高浓度产生稍低的IF值(～2.5)。结果与文献中的其他多巴胺MIP相当。MIP对竞争者血清素的响应与参比没有显著不同，表明系统的选择性。
实施例3：MIP涂覆的丝网印刷电极(SPE)的制备
贯穿以下实施例进行的实验利用丝网印刷电极(SPE)(41mm×7mm)，其包括具有3mm石墨工作电极、石墨对电极和Ag/AgCl参比电极的三电极配置。
使用丝网印刷机(可从英国Weymouth,DEK获得的MicroDEK1760RS，)利用模板设计制造SPE以形成3mm直径的工作电极。首先，将碳石墨油墨制剂(可从英国Gwent ElectronicMaterials Ltd获得的C2000802P2)印刷到厚度为250μm的聚酯衬底上。碳石墨油墨在60℃在风扇烘箱中固化30分钟。将介电浆料(可从Gwent Electronic Materials Ltd获得的D2070423D5)印刷到聚酯衬底上以覆盖连接。介电浆料在60℃下固化30分钟。使用边缘连接器，发现这批传感器对于氧化还原探针[Ru(NH3)]2+/3+/0.1M KCl的重现性对应于小于4％RSD。
根据MP和MI的重量百分比将MIP并入SPE的油墨中，其中MP是粒子的质量，MI是在印刷过程中使用的油墨制剂的质量。为了这些实施例的目的，MP的重量百分比是30％，MI的重量百分比是70％。
实施例4：SPE的循环伏安测量
使用三个电极，使用恒电位仪(可从荷兰的Metrohm，Utrecht获得的Autolab PGSTAT)进行循环伏安测量。使用如实施例3中所述的石墨丝网印刷电极和MIP涂覆的SPE作为限定的工作电极。铂计数器和饱和甘汞电极(SCE)作为参比电极完成电路。在氮气脱气的pH-7.4磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液中，在从0至50μM的多巴胺浓度范围内，以5μM的步长研究该电分析方案。将在+0.20V的氧化峰用作分析参数。在-0.2V至+0.8V的电势范围内以50mV/秒的扫描速率进行该实验过程。得到的校准曲线显示在图5中。氧化峰高度对多巴胺浓度的分析表明，在两个电极中的响应是近似线性的。
两个电极对多巴胺的响应可用线性拟合(R2＝0.97)表示，其表明传感器平台的敏感状态。对于裸露的SPE，梯度为0.023μA/μM多巴胺，而对于MIP修饰的SPE，梯度为0.025μA/μM多巴胺。检测限被定义为信号为标准偏差三倍时的浓度。MIP涂覆的SPE的检测限为4.7±0.05μM，裸露SPE的检测限为4.0±0.06μM。
实施例5：传热方法(HTM)
内径为6毫米、高度为4毫米、内部总体积为110微升的流动池由丙烯酸(可从英国Lancashire的Lucite International在商标
Figure BDA0001662464660000201
下获得)制成。将流动池与实施例4中描述的恒电位系统偶联，并用O形环密封。流动池和恒电位系统之间的接触面积为28平方毫米。将MIP涂覆的SPE(实施例3中所述)水平安装并机械压制在用作散热器的铜块上。铜块的温度T1由具有控制参数P＝8、I＝1和D＝0的比例积分微分(PID)控制器主动控制，并通过热电偶测量。铜块的温度T1保持在37.00℃。
将第二个热电偶放置在MIP涂覆的SPE的表面上方，其测量液体中的温度T2。通过用温度差(T1-T2)除以在保持温度恒定在37.00℃的同时所消耗的输入功率P(以瓦特为单位)来确定热阻(等式2)，缩写为Rth(℃/W)。
等式2：
Figure BDA0001662464660000202
将MIP涂覆的SPE在磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液中稳定化，然后将溶液中增加浓度的多巴胺(0至900nM)加到流动池。信号稳定后，确定在每个浓度下的Rth值。构建相应的剂量响应曲线，并且显示在图4中。
流动池放置在具有20.00±0.02℃的稳定环境温度的环境中。铜块的温度T1由PID控制器严格控制在37.00±0.02℃。流动池被填充纯PBS溶液；在T2的稳定后，加入增加浓度的多巴胺(0至1000nM)的PBS溶液。如图6所示，流入流动池的溶液的浓度的变化导致T2的快速下降。达到稳定的平台水平后，让传感池(sensor cell)稳定至少15分钟。然后T2的减少可以仅仅归因于靶标分子与MIP层的结合。图7示出了时间相关的热阻值，图8以剂量响应曲线的形式示出了相应的Rth数据。通过除以在每次向基线信号添加后观察到的Rth来计算图8中所示的归一化值。
图7示出了通过逐渐将PBS中的多巴胺浓度增加至900nM，热阻Rth从6.80±0.10℃/W逐步增加至7.92±0.09℃/W。这相当于16.5％的百分比增加，明显高于信号上的噪声(1.1％)，表明该效应是由于靶标与MIP的纳米腔的结合。当对参比NIP电极进行相同的测试时，热阻没有随着多巴胺浓度的增加而显著改变。因此，MIP似乎是对多巴胺具有特异性的。
如图8中计算的剂量-响应曲线所示，在浓度高达800nM时，结合效应随着浓度线性增加。在较高浓度下，显示趋于饱和的趋势，这可能是由于结合位点占据的增加。采用线性拟合，检测限被确定为350±30nM，这与循环伏安法(检测限为4700±50nM，参见实施例4)相比是显著的改进。
实例6：热波传输分析(TWTA)
除了分析通过功能化芯片的热传递之外，还在与其上执行HTM(实施例5)相同的样品上同时研究在对散热器的响应中的相移。
在选择的四种在PBS中的多巴胺浓度(0、300nM、400nM和800nM)下，PID控制器通过22Ω径向引线高功率电阻器(可从瑞士Schaffhausen的TE Connectivity获得的型号MPR系列)通过导热硅酮糊(可从英国Somerset的ACC Silicones Ltd.获得的SILCOTHERM SG502)将热波传输穿过散热器。如图9所示，热波具有0.1℃的振幅和从0.01Hz至0.05Hz的可变频率。当多巴胺与MIP粒子结合时，在T2处测量热波输出的相位延迟
Figure BDA0001662464660000221
和振幅减小(α1≠α2)，如图10所示。由于热波振幅仅为0.1℃，并且被同时应用在不超过4个不同的点，因此热波不会影响系统的稳定性或所计算的热阻值。
在图10中，在输入热波(T1)与穿过暴露于纯PBS缓冲溶液的、MIP涂覆的SPE的结果波之间观察到的相移是由于将热量从散热器传递至液体室的中心所需的时间。当MIP涂覆的SPE暴露于300nM多巴胺的PBS溶液时，观察到伴随着信号振幅降低的相移的轻微增加。随着多巴胺浓度的增加，测量的相移增加更多，振幅下降更多。不受任何特定理论的束缚，似乎神经递质与MIP层的结合导致在固体液体界面处的传热阻力升高。这导致从散热器到液体室的热量更慢地散失，并且似乎解释了在图10中观察到的结果。
图11示出了作为所施加的热波的频率的函数的观察到的相位。如图11所示，在0.02Hz和0.03Hz之间出现相移的较大变化，在0Hz和0.02Hz之间以及在0.03Hz和0.05Hz之间变化较小。因此，在随后的实施例中选择0.03Hz的频率来测量靶标受体动力学。在300nM以上的浓度下，在0.03Hz下测量热波输出中的显著效果。在此频率下，在PBS中观察到-57°±1°的相移，而在800nM时相移增加到-75°±2°，对应于31％±2％百分比的增加。
如图8所示，传热方法(HTM，实施例5)对多巴胺的检测限为约350mN。然而，如实施例6中所述，通过测量相移响应，在300nM成功测量多巴胺。在800nM的较高浓度下，传热方法产生16±1％的效应，这比对于相移响应而言低近两倍。因此，热波传递分析(TWTA，实施例6)可以改善多巴胺的检测。
实施例7：检测香蕉中的多巴胺
将香蕉在组合的蒸锅和搅拌器(可从荷兰Eindhoven的Royal Philips获得的Avent型号SCF870/20)中研磨4分钟，随后在3200rpm下离心5分钟。过滤上清液以获得清澈的液体，其被加入增加浓度的多巴胺(62.5，125，250，500，1000，2000nM)。在500nM和更高的浓度下，观察到对热阻的显著影响。
使用掺加多巴胺的香蕉衍生液重复实施例6中所述的测试。归一化到初始温度37.00℃的热波输出的结果和相应的相移如图12所示。仅提供了500nM和更高浓度的结果，因为在较低浓度下没有观察到显著差异。将温和的过滤器(10点中值)应用于数据以校正粘度效应。图13示出了作为施加的热波的频率的函数的所观察到的相位。在掺加浓度为500nM时，与纯的未掺加溶液中的37±2Hz相比较，测量到-55±3Hz的相移。以百分比增加计算，测量到46％±2％的差异，这是掺加的多巴胺浓度和香蕉中存在的初始多巴胺的效应的组合。因为500nM仍处于生物样品中存在多巴胺的浓度范围内，所以该实施例7显示热波传递分析(TWTA)技术可用于测量生物相关多巴胺浓度。
常规方法难以实施以测量与食品有关的样品，因为粘度高以及在食品样品中存在其他干扰化合物，例如大蛋白质。例如，某些化合物的检测限可能由于非特异性结合和较高的噪音水平而增加(比较实施例6，其中可检测缓冲液中300nM的浓度，对于实施例7，其中可检测掺加的香蕉流体中500nM的浓度)。
下表1比较了在缓冲溶液和在食物样品中的MIP修饰的多巴胺SPE的检测限。表1显示热方法可以提供优于常规电化学方法的优点，因为缓冲溶液中的检测限大约低一个数量级。此外，热方法使得能够测量复杂的食物样本。与HTM相比，分析热波的传输具有显著更高的效应大小(多巴胺缓冲溶液中800nM时为31％比16％)，并且通过需要较不严格的温度控制来提高检测限。
表1：多巴胺的MIP修饰的SPE的检测限
Figure BDA0001662464660000241
MIP粒子与丝网印刷油墨的直接混合可以消除电极制备中的一些步骤，并且可以实现功能化电极的大规模生产。不仅针对缓冲溶液，而且针对相关食物样品，热波传输分析(TWTA)可以导致纳摩尔体系中的多巴胺的检测限。另一个好处是这种技术可以与传热方法同时进行，从而可以直接验证结果。所描述的方法提供了用于快速且成本有效地检测神经递质的新方法，其可用于生物医学和临床研究领域。
实施例8：细菌培养和样品制备
大肠杆菌(
Figure BDA0001662464660000242
8739TM)和金黄色葡萄球菌(
Figure BDA0001662464660000243
6538TM)的特征菌株获自德国Braunschweig的Leibniz Institute DSMZ。用大肠杆菌单菌落接种20ml营养肉汤(项目编号x929.1，来自德国Karlsruhe的Carl Roth GmbH+Co KG)。用金黄色葡萄球菌的单菌落接种20ml Caso肉汤(项目编号x938.1，来自Carl Roth)。使两个菌落在进行搅拌的同时在37℃下过夜生长。
将1ml的每个过夜培养物稀释在20ml的相应肉汤中，并使其在37℃下生长3小时或直到获得为1的OD600(即，在600nm波长下测量的光密度，与细菌浓度相关的测量)。之后，通过离心形成沉淀收集细胞，将沉淀用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤一次，然后重悬于PBS中以达到所需浓度。
实施例9：细菌印迹聚氨酯层的制备
通过将122mg的4,4'-二异氰酸根合二苯基甲烷、222mg的双酚A和25mg的间苯三酚溶解在500μL无水四氢呋喃(THF)中来制备旋涂溶液。所有试剂具有至少99.9％的纯度，并且如从比利时Diegem的Sigma-Aldrich N.V.收到的来使用。在温和搅拌下将该溶液聚合至65℃的凝胶点200分钟。将该溶液以1:5的比例在无水THF中稀释。通过以2000rpm将溶液旋涂在铝衬底上60秒，各衬底具有1cm2的表面积，形成用表面光度仪(profilometer)(Dektak3ST，Sloan Instruments Corporation，Santa Barbara，California，USA)测量的平均厚度为1.2±0.1μm的聚氨酯层。
使用购自比利时Schelle的Malvom N.V.的Dow Corning
Figure BDA0001662464660000251
184有机硅弹性体试剂盒制备聚二甲基硅氧烷(PDMS)印模。通过向每个印模应用400μL的在PBS中的细菌悬浮液形成细菌覆盖的PDMS印模。允许细菌沉降到印模表面60秒。通过以3000rpm旋涂印模60秒来去除多余的流体，以在印模表面上产生致密的单层细菌。
在70Pa的压力下将每个细菌覆盖的印模压入铝衬底之一上的聚氨酯层中。聚氨酯在惰性气体中在65℃下固化18小时，然后从衬底表面去除印模。用乙醇和PBS洗掉模板细菌，在衬底表面留下选择性结合腔。因此，表面印迹聚合物(SIP)被制备成对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌各自具有选择性。
实施例10：传热方法(HTM)
内径为6毫米、高度为4毫米并且内部总体积为110微升的流动池由丙烯酸(可从英国Lancashire的Lucite International在商标
Figure BDA0001662464660000261
下获得)制成。将流动池与恒电位器耦合，并用O形环密封。流动池和恒电位系统之间的接触面积为28平方毫米。将SIP涂覆的衬底(实施例9中描述的)水平安装并机械压制在用作散热器的铜块上。铜块的温度T1由具有控制参数P＝8、I＝1和D＝0的比例-积分-微分(PID)控制器主动控制，并通过热电偶测量。铜块的温度T1保持在37.00℃。
将第二个热电偶放置在SIP涂覆的衬底的表面上方，其测量液体中的温度T2。通过用温度差(T1-T2)除以在保持温度恒定在37.00℃的同时所消耗的输入功率P(以瓦特为单位)来确定热阻，缩写为Rth(℃/W)，如等式2(见实施例5)中所示。
在每次实验开始时，将SIP涂覆的衬底在PBS缓冲液(pH＝7.4)中稳定化。通过以2.5mL/min的受控流速注射3mL细菌溶液(1×107CFU/mL的PBS)将细菌引入系统。SIP-涂覆的衬底被稳定化，在这之后，SIP-涂覆的衬底用PBS以0.25mL/min的流速进行冲洗12分钟(总体积3mL)，以从SIP层去除任何未结合的细菌。HTM设置以每秒一次测量的速率监控固液界面处的热阻(Rth)。
实施例11：显微成像
使用从比利时的Diegem的Leica Microsystems可获得的DM750光学显微镜进行SIP涂覆的衬底的显微成像。SIP涂覆的衬底以放大倍数640x和1000x成像。使用软件(从美国马里兰州(Maryland)的Bethesda的国立卫生研究院(National Institutes ofHealth),可获得的ImageJ版本1.44p)来确定在SIP涂覆的衬底的显微图像上每单位面积的细胞印迹的数量。基于每种类型的SIP涂覆的衬底的三种不同样品以及每种SIP涂覆的衬底上的五个位置的细胞印迹计数计算细胞印迹的平均表面覆盖率。
用大肠杆菌压印的SIP表面的光学显微镜分析(图11)清楚地显示具有对应于细菌尺寸的1.5至3μm变化的长度和0.5至1.5μm的宽度的杆状印迹。计算出的表面覆盖率1.11×106±6.62×105印迹/cm2对应于6.02±1.6％的总表面覆盖率。金黄色葡萄球菌SIP的光学显微镜分析(图15)显示了直径为±500nm-800nm的球形印迹的不均匀分布。2.91×106±8.73×105印迹/cm2的印迹表面覆盖率对应于9.12±2.1％的总表面覆盖率。
实施例12：活的和死的细菌之间的辨别
如实施例8和9中所述，SIP涂覆的衬底被形成，并用PBS(浓度1×107CFU/mL)中的活大肠杆菌细胞压印。将SIP涂覆的衬底以其未经涂覆的抛光的背面压印到铜块上，以确保在SIP涂覆的衬底和铜块之间的热接触。将SIP涂覆的衬底放置在被填充PBS的流动池中。使SIP涂覆的衬底的Rth信号稳定60分钟。将死细菌以2.5mL/min的流速引入流动池72秒。停止流动，并使Rth信号稳定60分钟，使细菌向SIP表面沉降。通过用PBS以0.25mL/min的速率冲洗流动池12分钟来去除任何未结合的细菌。经过60分钟的稳定间隔后，用活的大肠杆菌细胞重复实验。这个实验的结果示出在图16和17中。
图16示出两种暴露事件(即，暴露于活的和死的大肠杆菌细胞)导致SIP涂覆的衬底的固-液界面处的热阻增加。与添加死细菌相关的增加可以通过用PBS冲洗来部分逆转，而由添加活的大肠杆菌细胞引起的增加看起来是不可逆的。图17是汇总数据的箱线图。误差线表示在信号上的噪声的标准偏差。
图16和17表明将死细菌的PBS溶液添加后信号(Rth)增加0.67±0.15℃/W。在用PBS冲洗腔室后，信号回落到基线以上的值0.36±0.16℃/W。将活菌注入测量室后，信号再次升高至值0.91±0.21℃/W。用缓冲溶液冲洗不会导致Rth的可测量的下降，并且信号保持在基线以上的0.93±0.19℃/W。
在实施例12和图16和17中描述的热阻试验显示了在初始暴露于死亡和活细菌后的可比较的响应，尽管死细胞的Rth增加略低。死细菌细胞的形态似乎与印迹聚合物表面上的微腔的尺寸相容。另外，死细菌在其外膜上表达一些细菌特异性官能团，这可以提供死细菌和印迹表面之间的部分功能匹配。活细胞和死细胞两者通过聚合物的微腔改变热流动性质，通常增加固-液界面处的热阻。漂洗印迹表面可以提供足够的剪切力以从印迹表面上的微腔去除死细菌。另一方面，将印迹表面暴露于活的大肠杆菌可能产生热阻的增加，这种增加不能通过简单的冲洗来逆转。印迹和活细菌之间的联系似乎比印迹和死细菌之间的联系更加稳定。来自相同物种的死细菌和活细菌之间的区别可能基于在压印期间在微腔内产生的化学官能化。
实施例13：大肠杆菌和金黄色葡萄球菌之间的选择性
如实施例8和9中所述，形成SIP涂覆的衬底并用金黄色葡萄球菌细胞(革兰氏阳性菌)和大肠杆菌细胞(革兰氏阴性菌)压印。将SIP涂覆的衬底以它们的未涂覆的经过抛光的背面机械压印到铜块上，以确保在SIP涂覆的衬底和铜块之间的热接触。将SIP涂覆的衬底放置在被填充PBS的流动池中。通过将SIP-涂覆的衬底连续暴露于类似的非靶标细菌和靶标细菌而获得时间相关的Rth数据。流动池在两次暴露事件之间以受控速度被冲洗。
图18示出将大肠杆菌印迹的SIP暴露于金黄色葡萄球菌细胞在PBS(浓度1×107CFU/mL)中的悬浮液使固-液界面处的热阻增加0.62±0.14℃/W。用PBS冲洗流动池使信号回到基线(ΔRth＝0.07±0.21℃/W)。用具有相同浓度的大肠杆菌溶液重复循环产生0.96±0.16℃/W的不可逆的Rth增加(冲洗时的ΔRth＝0.94±0.12℃/W)。当将金黄色葡萄球菌印迹的SIP暴露于大肠杆菌，然后是金黄色葡萄球菌时，观察到类似的趋势，如图19所示。暴露于大肠杆菌细胞溶液使得Rth信号以0.76±0.09℃/W增加，但用PBS冲洗流动池后，热阻稳定于在基线以上的值0.12±0.11℃/W。将SIP暴露于靶标细胞溶液导致热阻增加0.91±0.17℃/W。用PBS冲洗细胞不会显著改变信号(0.87±0.19℃/W)。
因此，图18和19各自显示了在对类似非靶标细菌以及最终对靶标细菌的连续细菌暴露事件期间用大肠杆菌(图18)或金黄色葡萄球菌(图19)压印的SIP的时间相关的Rth测量。在这两种情况下，添加非靶标细菌物种导致热阻增加，但当用缓冲溶液冲洗流动池时信号返回到基线附近。靶标细菌与SIP的结合导致Rth不可逆转的上升。这些实验的结果总结在图20中的箱线图中。
实施例14：灵敏度测试和剂量-响应曲线
将浓度为1×107CFU/mL的大肠杆菌细胞的PBS储备液的部分稀释100、50、20和10倍，并且SIP涂覆的衬底(用大肠杆菌压印，如实施例8和9中所述)在流动池中连续暴露于浓度增加的靶标大肠杆菌细胞。在每个暴露步骤之间，以0.25mL/min的速度用乙醇冲洗流动池12分钟，接着以0.25mL/min的速率用PBS冲洗12分钟。该实验的结果显示在图21中。结果确定了SIP涂覆的衬底的检测限(LoD)。
添加大肠杆菌细胞时热阻增加，并且该增加似乎是浓度相关的。图21中所示的时间相关热阻数据表明，将SIP涂覆的衬底暴露于1×105CFU/mL的浓度不会导致Rth的可测量的增加。在加入2×105CFU/mL的浓度后，信号开始增加。信号似乎在5×105CFU/mL的浓度处开始饱和。将与来自先前实验的结果结合起来的这些结果用于建立图22所示的剂量-响应曲线，图22示出了在对数尺度上作为添加的靶标细菌浓度的函数的在Rth中的响应。
剂量-响应曲线遵循根据以下公式的经验指数拟合函数：
Figure BDA0001662464660000291
其中c是大肠杆菌的浓度，A、B和C是常数。通过图22中获得的数据绘制的指数拟合具有0.9901的R2值。
在实施例14和图21和22中描述的灵敏度测试揭示了本文所述的传感器定性地对样品中的靶标细菌物种的升高的浓度作出响应，并且可以量化该响应。在相对较低的浓度下，传感器的响应可能会保持在噪声水平内。但是从阈值浓度(实施例14中的约2×105CFU/mL)开始，Rth信号增加到足够高于基线的值，以便在统计学上可区分(表明足够量的细胞与在印迹的聚合物上的微腔相互作用并结合，阻止热量流过聚合物并由此增加传热阻力)。随着浓度的增加，该效应变得更明显，但聚合物似乎饱和(在实施例14中在高于5×105CFU/mL的浓度)。使用对数据的指数拟合并将检测限定义为信噪比大于3的浓度，实施例14中的样品的检测限(LoD)为1.5×105CFU/mL。LoD可能受到例如用于细菌印迹的合成方案的影响，包括沉积时间、旋涂速度和加速度、模板浓度以及印模表面的表面官能化。另外，可以通过电子降噪、屏蔽、绝缘等来改善信号的噪声。
实施例15：检测半复杂基质中的大肠杆菌
制备含有1:99比例的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌细胞的溶液。细菌总浓度为1×107CFU/mL。该混合物用于渐进富集实验。
如实施例9中所述，用大肠杆菌压印SIP涂覆的衬底。将衬底连续三次暴露于混合物，并在每次暴露事件之间用缓冲液冲洗衬底。结果显示在图23中，并且表明信号(Rth)与第一次暴露事件后与基线相比没有显著增加。在第二次和第三次暴露步骤后，Rth增加。暴露于细菌混合物后，Rth信号最初增加至饱和。
将在每个步骤的饱和度水平(使用图23右侧的刻度表示)确定为分别在暴露于混合物之后和在用缓冲液冲洗之后的ΔRth之比。LoD被图示为虚线，并且被定义为在信号上的标准偏差的三倍，对应于26.4％。在前两个周期后，信号仅达到0.8±8.1％和11.8±7.8％，远低于检测限。经过第三轮暴露后，信号在32.1±8.0％的饱和水平处超过检测限，
不受任何特定理论的束缚，似乎在第一次暴露中靶标和类似细胞都结合到SIP涂覆的衬底上。在冲洗后，信号回落到与基线值没有显著差异的值。靶标细胞(大肠杆菌)在混合物中的总浓度仅为1×105CFU/mL，其低于实施例14中确定的LoD。此外，大肠杆菌细胞被金黄色葡萄球菌细胞以99：1在数量上超过，金黄色葡萄球菌细胞是一种类似细菌，其也可以结合到在SIP涂覆的衬底中的微腔。大肠杆菌细胞不能与已经被金黄色葡萄球菌细胞占据的微腔结合。由于空间位阻，类似细菌还可以防止靶标细菌与SIP涂覆的衬底相互作用。
这些问题可以通过增加暴露循环次数来至少部分地克服。对于每个循环，信号似乎饱和并且最终到达LoD，这表明富集可以提高SIP涂覆的衬底的灵敏度，并且可以使其在越来越复杂的混合物中检测较低浓度的细菌。
实施例16：用于检测细菌物种的热波分析
如实施例9中所述形成对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌、鲍曼不动杆菌和大肠杆菌K-12具有选择性的七种细菌印迹聚氨酯层。聚氨酯层放置在流动池中的铝衬底上，如实施例10中所述。流动池各自被配置成作为时间的函数改变铜块的温度T1。
每种衬底在缓冲溶液中经历浓度增加的靶标细菌。对于每种浓度的靶标细菌，温度T1保持恒定一段时间，然后变化以施加热波。通过施加功率P，衬底下的温度保持恒定在37℃。及时监测液体流动池的温度T2。还随时间监测热阻(即，Rth＝(T1-T2)/P)。结果显示在图24至30中。
这些结果表明，当流动池中的靶标细菌数量增加时，液体流动池中的温度(T2)降低。这似乎表明细菌与衬底上的聚氨酯结合，增加了固-液界面处的热阻(Rth)，这又导致T2下降。
分析每个浓度下的热波，并且将其显示在图31至37中。对于每个波，确定T2的相对变化，并且将结果相对于输入波对于时间进行绘制。
在图31至37中的数据示出，增加在流动池中的靶标细菌的浓度导致透过衬底的热波的相移和热波振幅的降低。不受任何特定理论的束缚，看起来随着细菌与衬底上的聚氨酯结合，在界面处的热阻增加，从而抑制热能转移至液体。这可以从波的振幅变化看出。另外，热波在芯片上消散较慢，导致观察到的相移。相移和/或振幅变化可以与样品中细菌的浓度相关联，并且可以用来表征样品。
实施例17：印迹的SIP对细菌的选择性
将与实施例16中测试的那些相同的对细菌有选择性的七种细菌印迹聚氨酯层用于交叉选择性测试。此外，使用艰难梭菌和盲肠肠球菌将其他SIP压印，使得可以测试总共九个衬底。
为了确定衬底的选择性，如实施例10中所述，将每种SIP连续在流动池中暴露于八种类似细菌，最后暴露于靶标(即已经印迹的细菌)。在每种暴露步骤中，将细菌在PBS(pH7.4，浓度1×107CFU/mL)中的悬浮液注入流动池中。对于每种细菌，温度T1保持恒定一段时间，然后变化以施加热波。通过施加功率P，将衬底下的温度保持恒定在37℃。及时监测液体流动池的温度T2。还随时间监测热阻(即，Rth＝(T1-T2)/P)。信号稳定后，用缓冲溶液冲洗SIP以去除任何未结合的物质。重复该过程，直至已经测试了八种类似细菌的每种细菌，并且最后用靶标测试。
在图38中示出大肠杆菌SIP的时间相关的温度曲线和TWTA分析。这些结果表明，当流动池中的靶标细菌数量增加时，液体流动池中的温度(T2)降低。这似乎表明细菌与衬底上的聚氨酯结合，增加了固-液界面处的热阻(Rth)，这又导致T2下降。当用PBS冲洗衬底时，除靶标物之外的细菌往往被冲走。
向流动池添加类似细胞导致T2减少，这可以通过用缓冲液冲洗而容易地逆转，其对应于实施例13的结果。然而，当加入大肠杆菌K-12细胞时，信号没有完全返回到基线并稳定在中间值。添加靶标大肠杆菌细胞进一步降低信号至最小值，之后，信号在使用缓冲液冲洗时保持恒定。这些发现由TWTA证实。图39显示了在大肠杆菌印迹的SIP上每种细菌的TWTA测试在0.03Hz下的相移。与输入波相比，前七种类似细菌不会引起在透射波中的相移，但是暴露于类似大肠杆菌K-12和靶标大肠杆菌细胞导致可测量的相移，对于大肠杆菌细胞观察到最大值。
在大肠杆菌K-12印迹的SIP上的类似实验证实了这些结果，如图40和41所示。除了这些实验之外，对于研究中的每种细菌压印SIP，并且SIP连续暴露于靶标和类似细菌。数据表明在使用这些SIP的类似实验中没有观察到交叉选择性。这些实验的结果总结在表2中。
表2：用不同细菌压印的SIP的交叉选择性
Figure BDA0001662464660000341
S＝特异性细胞结合，NS＝非特异性细胞结合，无＝无细胞结合
实施例17中描述的结果表明具有一个或多个印迹SIP的传感器平台可以以定量的方式选择性地区分缓冲液中的各种类型的细菌。
实施例18：当暴露于复杂混合物时印迹SIP的选择性
在现场细菌检测和识别期间遇到的样品可能预期除了痕量靶标之外也包含过量的竞争分子和细胞。为了模拟这种情况，如实施例9中所述，选择用金黄色葡萄球菌压印的SIP用于将SIP暴露于细菌混合物的渐进富集实验。制备在实施例19中测试的9种细菌的混合物，其含有金黄色葡萄球菌和过量的八种非靶标细菌。金黄色葡萄球菌与各非靶标细菌的比例为1:99，细菌总浓度为1×107CFU/mL。将SIP连续5次暴露于混合物，并在每次暴露事件之间用缓冲液(PBS)冲洗。
在图42中示出时间相关的温度曲线。为了验证作为用于基于SIP的细菌检测的测量技术的TWTA，HTM被用作参比技术。因此，根据等式2从温度曲线计算热阻Rth(参见实施例5)。
在图43中示出了通过应用中值滤波器来简化作为视觉指导的热阻数据。为了更清楚地显示渐进富集的效果，通过将在冲洗后的净效应大小除以在向流动池加上混合物后的最大效应大小，计算每个暴露循环(由细胞暴露和随后冲洗组成)的Rth响应的饱和水平。这些结果表明，净信号随着每个暴露循环逐渐增加，直到在四至五个暴露循环后达到检测限。检测限如在图43中的虚线表示，并且被定义为在整个测量过程中在Rth信号上的最大误差的三倍(即，3σ方法)。
在图44中描述的TWTA数据示出类似的趋势。在每个暴露循环之后在透射波中观察到的净相移逐渐增加，并且在第三暴露循环之后，信号达到检测限。
由于在混合物中竞争细菌的过量，似乎只有少量的靶标细菌可以与SIP结合。因此，在热阻Rth(图43)和相移(图44)两者中的响应都不如仅暴露于靶标细菌时的响应明显。随着暴露事件的数量增加，响应逐渐增加并最终达到检测限水平，这显然是因为从SIP清洗非靶标细菌，使结合位点在下一个循环中自由接受靶标细菌。由于HTM的信号上的噪声明显较高，因此仅在四次或甚至五次连续循环后才能达到HTM的LoD，而在使用TWTA作为测量技术时的二至三次循环后，可视为显著的可测量信号已经很明显。看起来，由于热波上噪音较低，TWTA原理的发展可以认为是在热法细菌鉴定中的一个有价值的进展。
出乎意料地发现，本文所述的方法和装置不仅可用于区分相似细菌的菌株，而且还可用于区分同一菌株的活菌和死菌。不受任何特定理论的束缚，看起来活的和死亡的大肠杆菌之间的表面化学差异足以区分它们，尽管它们在形态上相似。
此外，出乎意料地发现，漂洗非靶标分析物(例如，与靶标分析物细菌相似但不相同的细菌)可以通过释放非靶标分析物的结合位点而不从其他结合位点去除靶标分析物来提高聚合物材料的检测能力。因此，最初被靶标分析物占据的结合位点可以保持填充状态，并且可以清除最初由非靶标(但类似的)分析物占据的结合位点，以便与另一个分析物重新结合(特别是与靶标分析物重新结合)。类似细菌可以在某种程度上与印迹结合，可能是由于细胞膜上存在细菌特异性官能团，这些官能团与印迹内部的一些官能团相容。但是，结合似乎不能承受冲洗提供的剪切力。另一方面，靶标细菌似乎仍与聚合物牢固结合，使得即使在冲洗之后热阻仍保持在较高的水平。这种清除和重新结合对于表征相似或相关分析物的复杂混合物可以是有用的，因为相关分析物可以倾向于弱结合到对于另一种进行压印的位点。通过清除和重新结合分析物，可以检测较低浓度的靶标分析物。
本文描述的方法和装置可以与稳态或热波分析技术结合使用。可以使用各种形状的衬底，并且数据(例如温度)可以在各个点处收集，例如在待分析的液体中、在涂覆有聚合物材料的衬底中或在涂覆的热电偶中收集。
本文所述的方法可用于提供常规在具有复杂设备和训练有素的人员的实验室中执行的细菌的实时或接近实时表征。因此，所述方法和装置可以实现更快和更便宜的数据收集，并且可以通过例如鉴定群体内的细菌暴发来实现改善的结果。这样的方法在健康护理、环境和食品安全(例如，通过检测水、空气和食物携带的细菌)和反恐(例如，通过检测炭疽等)方面可以是有益的。

Claims (28)

1.一种用于检测分析物(132)的装置(100)，所述装置包括：
衬底(110)，所述衬底(110)具有在其表面上形成的聚合物材料(112)，所述聚合物材料被配制成与分析物结合，其中所述聚合物材料的传热性质被配制成基于与其结合的分析物的量而变化；
传热元件(114)，所述传热元件(114)热耦合到所述衬底的与所述聚合物材料相对的表面；
温度修改装置(118)，所述温度修改装置(118)热耦合到所述传热元件；
控制器(121)，所述控制器(121)被配置成使所述温度修改装置产生从所述传热元件发出的热波(202)；
流动池(122)，所述流动池(122)被放置和配置成使液体(124)在所述衬底的聚合物材料之上通过；
温度传感器(134)，所述温度传感器(134)被配置成检测在所述聚合物材料之上通过的所述液体的温度(T2)；以及
处理器(123)，所述处理器(123)被配置成至少部分地基于所述传热元件处的热波与所述液体中的衰减热波(204)之间的相移来计算所述液体中的分析物(132)的浓度。
2.权利要求1的装置，其中所述处理器被配置成至少部分地基于所述传热元件处的热波与所述液体中的衰减热波之间的振幅差来计算所述分析物的浓度。
3.权利要求1的装置，其中所述衬底包括金属或金属合金。
4.权利要求1的装置，其中所述传热元件包括铜。
5.权利要求1的装置，其中所述控制器被配置成以可变频率改变所述传热元件的温度。
6.权利要求1的装置，其中所述聚合物材料包含印迹聚合物。
7.权利要求6的装置，其中所述印迹聚合物是分子印迹聚合物。
8.权利要求6的装置，其中所述印迹聚合物是表面印迹聚合物。
9.权利要求1的装置，其中所述聚合物材料包含选自DNA、RNA、蛋白质及其部分和类似物的材料。
10.权利要求1的装置，其中所述聚合物材料被配制成以第一亲和性与第一细菌结合，所述第一亲和性高于所述聚合物材料对第二细菌的第二亲和性。
11.权利要求10的装置，其中所述第一细菌包含活细菌，并且其中所述第二细菌包含死细菌，所述活细菌和所述死细菌属于相同物种。
12.权利要求10的装置，其中所述第一细菌包含第一物种，并且其中所述第二细菌包含第二物种，所述第二物种为所述第一物种的类似物。
13.一种用于检测分析物的方法，所述方法包括：
使含有分析物(132)的液体(124)在衬底(110)上的聚合物材料(112)之上通过，所述聚合物材料被配制成与所述分析物结合，其中所述聚合物材料的传热性质被配制成基于与其结合的分析物的量而变化；
使所述分析物结合到所述聚合物材料上；
从传热元件(114)穿过所述衬底向所述聚合物材料提供热波(202)；
检测所述液体的温度(T2)；以及
至少部分地基于由所述传热元件产生的热波与所述液体中的衰减热波(204)之间的相移来计算所述液体中的分析物的浓度。
14.权利要求13的方法，所述方法还包括用控制器(121)产生所述热波，所述控制器(121)被配置成改变温度修改装置(118)的温度(T1)，所述温度修改装置(118)热耦合到所述传热元件。
15.权利要求13的方法，其中计算所述液体中的分析物的浓度包括确定所述传热元件处的热波与所述液体中的衰减热波之间的振幅差。
16.权利要求13的方法，其中从传热元件穿过所述衬底向所述聚合物材料提供热波包括改变所述热波的频率。
17.权利要求13的方法，其中检测所述液体的温度包括检测作为时间的函数的所述液体的温度。
18.权利要求13的方法，其中计算所述液体中的分析物的浓度包括计算所述液体中的生物分析物的浓度。
19.权利要求18的方法，其中计算所述液体中的生物分析物的浓度包括计算所述液体中的组胺的浓度。
20.权利要求13的方法，其中使含有分析物的液体在衬底上的聚合物材料之上通过包括使含有分析物的液体在分子印迹聚合物之上通过。
21.权利要求13的方法，其中使含有分析物的液体在衬底上的聚合物材料之上通过包括使含有分析物的液体在选自DNA、RNA、蛋白质及其部分和类似物的材料之上通过。
22.权利要求13的方法，其中从传热元件穿过所述衬底向所述聚合物材料提供热波包括将所述传热元件的温度(T1)改变小于0.2℃。
23.权利要求13的方法，其中计算所述液体中的分析物的浓度包括计算包含多个物种的混合物中的细菌浓度。
24.权利要求13的方法，其中计算所述液体中的分析物的浓度包括计算包含相同物种的活细菌和死细菌的混合物中的活细菌的浓度。
25.权利要求13的方法，所述方法还包括洗涤所述聚合物材料以从中去除除所述分析物之外的材料。
26.一种形成用于检测分析物(132)的装置(100)的方法，所述方法包括：
在衬底(110)的表面上形成聚合物材料(112)，所述聚合物材料被配制成与所述分析物结合，其中所述聚合物材料的传热性质被配制成基于与其结合的分析物的量而变化；
将传热元件(114)热耦合至所述衬底的与所述聚合物材料相对的表面；
将温度修改装置(118)热耦合至所述传热元件；
配置控制器(121)以使所述温度修改装置产生从所述传热元件发出的热波(202)；
配置流动池(122)以使液体(124)在所述衬底的聚合物材料之上通过；
配置温度传感器(134)以检测在聚合物材料之上通过的所述液体的温度(T2)；以及
配置处理器(123)以至少部分地基于所述传热元件处的热波与所述液体中的衰减热波(204)之间的相移来计算所述液体中的分析物(132)的浓度。
27.权利要求26的方法，其中在衬底的表面上形成聚合物材料包括在所述衬底的表面上丝网印刷所述聚合物材料。
28.权利要求26的方法，其中在衬底的表面上形成聚合物材料包括在所述衬底的表面上形成分子印迹聚合物。
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