JP2018534944A - 転写ターミネーターおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
人工転写ターミネーターおよびそれらの使用が本明細書で提供される。一態様において、非天然核酸配列はY−X−Zステム−ループを含むことができ、ここで:Yは、10−30ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり;Xは、3−12ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、ここで、各ヌクレオチドは、X内のいずれか他のヌクレオチドと塩基対合せず;Zは、10−50ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、Yに対して少なくとも70%相補性を有する。
Description
関連出願への相互参照
本出願は、2015年11月30日出願の米国仮特許出願第62/260,700号の利益および優先権を主張し、その全開示内容が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、2015年11月30日出願の米国仮特許出願第62/260,700号の利益および優先権を主張し、その全開示内容が参照により本明細書に組み込まれる。
分野
一般に、本開示は、分子クローニングに有用な非天然合成遺伝子構成要素に関する。より詳細には、天然または非天然DNAインサートのクローニングにおける使用のために人工転写ターミネーターを提供する。
一般に、本開示は、分子クローニングに有用な非天然合成遺伝子構成要素に関する。より詳細には、天然または非天然DNAインサートのクローニングにおける使用のために人工転写ターミネーターを提供する。
分子クローニングおよび組換えDNA技術において、遺伝子またはそのフラグメントのような種々のDNAインサートは、ベクター中へしばしば導入され、その後、宿主培養物中で増殖される。しかしながら、例えば、生存に不必要な二次タンパク質への、DNAインサートの不所望の発現は、宿主の健康および生育に有害である。発現率および細胞代謝に対する修飾の特定の調整を可能にする制御可能な発現系が、所望される。組換え発現系の1つの重要な態様は、終結効率を包含する転写効率である。低終結効率は、読み通し転写(read−through trancription)およびそれ自身で細胞にストレスを与える長いmRNAの製造を引き起こすが、とりわけプラスミドベクターの分野において、それにまして、不必要なタンパク質の発現を引き起こし、または導入遺伝子構築物の複製制御を妨害し得る。
従って、転写ターミネーターのような改良されたベクター構成要素、とりわけ、高終結効率を有する合成非天然ターミネーターに対する要望が存在する。
要約
本開示は、多重クローニング、多重シークエンシング、および定方向性クローニング(fixed orientation cloning)のために構築されるベクターおよびベクター構成要素を提供する。本明細書で記載されるベクターおよびベクター構成要素は、宿主に対して有害であり得る挿入配列を首尾よくクローン化させる。本明細書で記載されるベクターは、該挿入DNAがクローン化されるべき領域を活発に転写するプロモーターを含有する直接選択ベクターの不利益にも対抗する。いくつかの実施形態において、該挿入DNAフラグメントを転写しない低バックグラウンドベクターが提供される。従って、挿入DNAが運ばれる宿主に対して有害なまたはストレスをかける、有毒なまたはそうでなければ有害なペプチドまたはタンパク質をコードする挿入DNAは、該宿主により容認されることができる。
本開示は、多重クローニング、多重シークエンシング、および定方向性クローニング(fixed orientation cloning)のために構築されるベクターおよびベクター構成要素を提供する。本明細書で記載されるベクターおよびベクター構成要素は、宿主に対して有害であり得る挿入配列を首尾よくクローン化させる。本明細書で記載されるベクターは、該挿入DNAがクローン化されるべき領域を活発に転写するプロモーターを含有する直接選択ベクターの不利益にも対抗する。いくつかの実施形態において、該挿入DNAフラグメントを転写しない低バックグラウンドベクターが提供される。従って、挿入DNAが運ばれる宿主に対して有害なまたはストレスをかける、有毒なまたはそうでなければ有害なペプチドまたはタンパク質をコードする挿入DNAは、該宿主により容認されることができる。
一態様において、1以上の非天然人工転写ターミネーターは、該インサートが導入される該ベクターの一部として、あるいは合成されるまたはアセンブルされる該インサートの一部としてベクター中に含まれることができる。本明細書で提供される転写ターミネーターは、転写産物(例えば、mRNA転写産物)の転写の休止を容易にするために使用されることができる。いくつかの実施形態において、該転写ターミネーターは、1以上のステム−ループ配列を含むことができる。
いくつかの実施形態において、本開示は、X−Y−Zステム−ループを含む非天然核酸配列を提供し、ここで:Yは、10−30ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり;Xは、3−12ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、その中の各ヌクレオチドは、X内のいずれか他のヌクレオチドと塩基対合せず;Zは、10−50ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、Yに対して少なくとも70%相補性を有する。
いくつかの実施形態において、Yは、多くても60%、多くても50%、または多くても40%のG/C含量を有する。Yは、Xに対して5’またはXに対して3’にあってもよい。ある特定の実施形態において、Yは、12−18ヌクレオチド長、14−16ヌクレオチド長、16−18ヌクレオチド長、17−19ヌクレオチド長、15−30ヌクレオチド長、18−27ヌクレオチド長、21−24ヌクレオチド長、24−28ヌクレオチド長、または25−29ヌクレオチド長であることができる。
Xは、該ステム−ループのループ部分であり、いくつかの実施形態において、3−8ヌクレオチド長、4−6ヌクレオチド長または5−6ヌクレオチド長であり得る。
Zは、Yと同じまたは異なる長さを有することができる。Zは、Yとの1以上のミスマッチを有し得る。Zは、Yと比較して1以上の挿入または欠失を有することができ、故に、Yと共にアニールされた場合、突出またはループを形成する。
いくつかの実施形態におけるステム−ループは、AAGCおよび/またはCATCの配列を含むことができる。いくつかの例において、該ステム−ループは配列番号3、4または6の配列を有することができる。
さらなる態様は、第1のステム−ループおよび第2のステム−ループを含む転写ターミネーターに関し、ここで、該第1のステム−ループは、本明細書で開示される非天然ステム−ループ核酸配列のいずれか1つを有し、ここで、該第1のステム−ループは、該第2のステム−ループに対し5’にある。いくつかの実施形態において、該第2のステム−ループは短いステム−ループである。該第2のステム−ループは、本明細書で開示される非天然ステム−ループ核酸配列のいずれか1つを有してもよい。該転写ターミネーターは、短いステム−ループであり得る第3のステム−ループをさらに含むことができ、または本明細書で開示される非天然核酸配列のいずれか1つをさらに有することができる。いくつかの実施形態において、該転写ターミネーターは配列番号2または5の配列を有する。
DNAインサートに作動可能に連結された、本明細書で開示される1以上の転写ターミネーターを含むベクターも本明細書で提供される。一実施形態における該ベクターは配列番号1の配列を有する。DNAインサートは、遺伝子、遺伝子フラグメント、およびオープンリーディングフレームのような目的の(例えば、クローニング目的のための)任意の核酸であることができる。いくつかの実施形態において、該DNAインサートは非天然核酸分子である。ある特定の実施形態において、該DNAインサートおよび/または転写ターミネーターのようなベクターの任意の部分は、例えば、PCT公開番号WO2014/151696、WO2014/004393、WO2013/163263、WO2013/032850、WO2012/078312、WO2004/24886、WO2008/027558、WO2010/025310およびWO2016/064856(その全ての開示は参照によりその全内容が本明細書に組み込まれる)中に記載されるような種々の合成およびアセンブリー戦略により作成される合成分子であることができる。
別の態様は、本明細書で開示されるベクターを含む操作された細胞に関する。
さらなる態様は、ベクターにおいて本明細書で開示されるいずれかの転写ターミネーターを提供することを含み、ここで、該転写ターミネーターは、DNAインサートに作動可能に連結するように操作されている、ベクターを操作する方法に関する。
さらなる態様は、(a)DNAインサートに作動可能に連結するように操作された、本明細書で開示されるいずれかの転写ターミネーターを提供すること;(b)該DNAインサートの転写を可能にすること;および(c)該転写ターミネーターで該DNAインサートの転写を終結させることを含む、DNAインサートの転写を終結させる方法に関する。
詳細な説明
本開示は、多重クローニング、多重シークエンス、および/または定方向性クローニングのために構築されたベクター、ベクター構成要素およびポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、宿主に有害であり得る挿入配列は、本明細書で提供されるポリヌクレオチドを用いて首尾よくクローン化されることができる。このことは、自然遺伝学としばしば2つの点で異なる遺伝子操作においてとりわけ有利である。第一に、非常に強力なプロモーターが高流量のRNAポリメラーゼ(RNAP)を生成する合成回路に頻繁に必要とされる。第二に、次の転写ユニットに干渉しないために、設計は比較的短い一本鎖DNAに沿ってモジュール的に体系化され、該高流量のRNAPは敏速に止められる必要がある。このハードスタート−ハードストップ設計は、強力なターミネーターの必要性を導入する。
本開示は、多重クローニング、多重シークエンス、および/または定方向性クローニングのために構築されたベクター、ベクター構成要素およびポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、宿主に有害であり得る挿入配列は、本明細書で提供されるポリヌクレオチドを用いて首尾よくクローン化されることができる。このことは、自然遺伝学としばしば2つの点で異なる遺伝子操作においてとりわけ有利である。第一に、非常に強力なプロモーターが高流量のRNAポリメラーゼ(RNAP)を生成する合成回路に頻繁に必要とされる。第二に、次の転写ユニットに干渉しないために、設計は比較的短い一本鎖DNAに沿ってモジュール的に体系化され、該高流量のRNAPは敏速に止められる必要がある。このハードスタート−ハードストップ設計は、強力なターミネーターの必要性を導入する。
いくつかの実施形態において、挿入DNAフラグメントを転写しない低バックグラウンドベクターが提供される。該ベクターは、本明細書で記載される特性を有する1以上の合成非天然ポリヌクレオチド配列を含むことができる。該ポリヌクレオチドは、(通常は、ターミネーターをコードする)DNA、または(通常は、ヘアピン構造へ折り畳まれることができ、該ターミネーターを含み得る)RNAであることができる。該ポリヌクレオチドは、(とりわけRNAについては)一本鎖、または(とりわけDNAについては)二本鎖であることができる。
ある特定の実施形態において、該ポリヌクレオチド配列は転写ターミネーターである。1以上のターミネーターは、挿入配列の5’および/または3’において、および/または該挿入配列内に含まれることができる。該ターミネーターは、ベクター中へ構築されることができる。いくつかの実施形態において、該ターミネーターは、該ベクター中にその後に導入される挿入配列の一部として、合成またはアセンブルされることができる。種々の合成およびアセンブリー戦略は、例えば、PCT公開番号WO2014/151696、WO2014/004393、WO2013/163263、WO2013/032850、WO2012/078312、WO2004/24886、WO2008/027558、WO2010/025310およびWO2016/064856(その全ての開示は参照により全内容が本明細書に組み込まれる)に記載される。
いくつかの実施形態において、1以上の標的核酸の合成またはアセンブリー後、それらはベクター中へ個々にクローン化されることができ、またはかかるクローニングは平行して多重化様式で実施されることができる。本明細書で開示される1以上の転写ターミネーターの組み込みにより、クローニング成功率および効率を増加させることができる。
定義
便宜のため、本明細書、実施例および特許請求の範囲中で使用される特定の用語がここに集められる。他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本開示が属する分野における通常の当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。
便宜のため、本明細書、実施例および特許請求の範囲中で使用される特定の用語がここに集められる。他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本開示が属する分野における通常の当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。
本明細書で、冠詞「a」および「an」は、1または1より多い(すなわち、少なくとも1の)該冠詞の文法上の目的語を示すために使用される。例として、「an element」は、1つの要素または1より多い要素を示す。
本明細書で使用される場合、「約」なる語は、20%以内、より好ましくは10%以内、最も好ましくは5%以内を意味する。「実質上」なる語は、50%より大きい、好ましくは80%より大きい、最も好ましくは90%または95%より大きいことを意味する。
本明細書で使用される場合、「アミノ酸配列」なる語は、任意の長さの連続するアミノ酸残基の配列を示す。ここで、「ポリペプチド」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」、または「タンパク質」なる語は、「アミノ酸配列」なる語と交換可能に用いられ得る。
遺伝的要素(genetic element)、プラスミドまたはベクターの「コピー数」は、宿主細胞中にいくつのコピーが存在するかを示す。一般に、コピー数は、使用される複製起点(「ORI」)により決定され、該ORI中の変異を用いて操作されることができる。例えば、pMB1 ORIが、1細胞あたり約20コピーを維持する一方、2つのみの変異により異なるpMB1 ORIの誘導体を含有するpUCは、1細胞あたり700ものコピーを製造するであろう。「高コピー数」遺伝的要素またはプラスミドは、例えば、少なくとも1細胞あたり100コピーが存在するまでそれ自身を複製することができるものである。一般に使用される高コピー数プラスミドは、pUC(pMB1誘導体ORI)、Pbluescript(ColE1誘導体ORI)、およびpGEM(pMB1誘導体ORI)を包含する。「低コピー数」遺伝的要素またはプラスミドは、例えば1細胞あたり約20未満コピーで存在する。一般に使用される低コピー数プラスミドは、pBR322(pMB1 ORI)、pET(pMB1 ORI)、pGEX(pMB1 ORI)、pColE1(ColE1 ORI)、pR6K(R6K ORI)、pACYC(p15A ORI)、pSC101(pSC101 ORI)およびpLys(p15A ORI)を包含する。
「遺伝的要素」は、自己複製を行うことができる任意のコーディングまたは非コーディング核酸配列であり得る。遺伝的要素は、1以上の複製起点、オペロン、遺伝子、遺伝子フラグメント、エキソン、イントロン、マーカー、調節配列、プロモーター、オペレーター、カタボライトアクチベータータンパク質(サイクリックAMPレセプタータンパク質、「CAP」としても知られる)結合部位、エンハンサー、転写ターミネーター、または作動可能に共に連結されることができる任意のそれらの組み合わせを包含し得る。例えば、プラスミド、ファージベクター、ファージミド、トランスポゾン、コスミド、染色体、人工染色体、エピソーム、ウイルス、ビリオン等を包含する。いくつかの例において、「遺伝的要素」および「ベクター」は交換可能に使用される。
「宿主」は、ベクターに対するまたは外因性核酸分子、ポリヌクレオチド、および/またはタンパク質の組み込みに対するレシピエントであることができる、または該レシピエントである、任意の個々のウイルスまたは細胞またはその培養物を包含することが意図される。また、それは、単一のウイルスまたは細胞の子孫を包含することも意図される。該子孫は、天然の、偶発的または意図的な変異のために、元の親細胞と必ずしも完全に(形態学的に、あるいはゲノムまたは全DNA相補体において)同一でなくてもよい。ウイルスは、ファージであることができる。細胞は、原核性または真核性であってもよく、限定するものではないが、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞およびほ乳類細胞、例えば、ネズミ、ラット、サルまたはヒト細胞を包含する。
本明細書で使用される場合、「同一性」は、配列マッチングを最大にするように、すなわち、ギャップおよび挿入を考慮して配列が並べられる場合、2以上の配列中の対応する位置の同一ヌクレオチドの割合を意味する。同一性を決定する方法は、テストされる配列間の最大のマッチングを与えるように設計される。さらに、同一性を決定する方法は、公的に入手可能なコンピュータープログラムにおいて体系化される。2配列間の同一性を決定するコンピュータープログラム方法は、限定するものではないが、GCGプログラムパッケージ、BLASTP、BLASTNおよびFASTAを包含する。BLASTプログラムは、NCBIおよび他のソース(BLAST Manual,Altschul,S.ら,NCBI NLM NIH Bethesda,Md.20894;Altschul,S.ら,J.Mol.Biol.215:403−410(1990))から公的に入手可能である。よく知られたスミス ウォーターマン アルゴリズム(Smith Waterman algorithm)は、同一性を決定するために用いられてもよい。例えば、BLASTNは、11.0のオープンギャップペナルティーおよび1.0の拡張ギャップペナルティーを有するデフォルトのパラメーターを用い、blosum−62 matrixを利用して実行されることができる。
本明細書で使用される場合、「包含する(including)」、「含む(comprising)」、「有する(having)」、「含有する(containing)」、「含む(involving)」および本明細書でのそれらのバリエーションは、その後に挙げられる項目およびその等価物並びに追加の項目を包含することを意図される。「−からなる」は、限定された範囲の要素または特徴に関するクローズエンデッド(close−ended)として理解される。「本質的に−からなる」は、明記された要素および工程に範囲を限定するが、特許請求の範囲に記載された発明の基礎的で新規な特性に実質的に影響しないものを除外しない。
本明細書で使用される場合、「インサート」は、ベクター内の適合領域にライゲートされる非相同核酸配列である。インサートは、ポリペプチドをコードする1以上の核酸配列(例えば、遺伝子またはそのフラグメント)を含み得る。インサートは、例えば、該インサートの転写および/または翻訳を可能にする調節領域または他の核酸要素を含み得る。
本明細書で使用される場合、「核酸」、「核酸配列」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、「遺伝子」または他の文法上の同意義語は、共有結合した少なくとも2つのヌクレオチド、デオキシヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれか、またはそのアナログを意味する。ポリヌクレオチドは、例えば、20、50、100、200、300、500、1000、2000、3000、5000、7000、10,000等を包含する任意の長さのポリマーである。
本明細書で使用される場合、オリゴヌクレオチドは、少なくとも2つの共有結合したヌクレオチド残基を含む核酸分子であり得る。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、10−1,000ヌクレオチド長であり得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、10−500ヌクレオチド長、または500−1000ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約20−約300ヌクレオチド長(例えば、約30−250、約40−220ヌクレオチド長、約50−200ヌクレオチド長、約60−180ヌクレオチド長、あるいは約65−約150ヌクレオチド長)、約100−約200ヌクレオチド長、約200−約300ヌクレオチド長、約300−約400ヌクレオチド長、または約400−約500ヌクレオチド長であり得る。しかしながら、より短いまたはより長いオリゴヌクレオチドを使用してもよい。オリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖核酸であり得る。本明細書で使用される場合、用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」は、交換可能に使用され、天然または非天然合成ポリマー形態のヌクレオチドを示す。一般に、用語「核酸」は、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」の両方を包含し、ここで、「ポリヌクレオチド」はより長い核酸(例えば、1,000より多い塩基または塩基対、5,000より多い塩基または塩基対、10,000より多い塩基または塩基対、等)を示してもよく、「オリゴヌクレオチド」はより短い核酸(例えば、10−500塩基または塩基対、20−400塩基または塩基対、40−200塩基または塩基対、50−100塩基または塩基対、等)を示してもよい。本開示の核酸分子は、天然ヌクレオチド、例えば、形成途中のデオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA)分子から形成され得る。あるいは、天然核酸は、ペプチド核酸(PNA)またはロックド核酸(locked nucleic acids)(LNA)におけるような、その性質を改変する構造修飾を包含し得る。天然または合成塩基を用いた核酸分子の固相合成は、当該分野では周知である。該用語は、等価物、ヌクレオチドアナログから作成されるRNAまたはDNAいずれかのアナログ、および記載されている実施形態に適用可能であるように一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドを包含すると理解されるべきである。本開示において有用なヌクレオチドは、例えば、天然ヌクレオチド(例えば、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド)、またはヌクレオチドの天然または合成修飾、または人工塩基を包含する。いくつかの実施形態において、核酸の配列は天然に存在しない(例えば、cDNAまたは相補的DNA配列、または人工設計配列)。
通常、核酸において、ヌクレオシドはリン酸ジエステル結合により連結される。核酸が文字配列により表示される場合はいつでも、該ヌクレオシドは左から右へ5’から3’の順序であることが理解されるだろう。IUPAC表記法(IUPAC notation)に従い、「A」はデオキシアデノシンを示し、「C」はデオキシシチジンを示し、「G」はデオキシグアノシンを示し、「T」はデオキシチミジンを示し、「U」はリボヌクレオシド、すなわちウリジンを示す。加えて、1より多い種類のヌクレオチドがその位置で生じる場合に使用される文字もある:「W」(すなわち、弱い結合)はAまたはTを示し、「S」(強い結合)はGまたはCを示し、「M」(アミノに対して)はAまたはCを示し、「K」(ケトに対して)はGまたはTを示し、「R」(プリンに対して)はAまたはGを示し、「Y」(ピリミジンに対して)はCまたはTを示し、「B」はC、GまたはTを示し、「D」はA、GまたはTを示し、「H」はA、CまたはTを示し、「V」はA、CまたはGを示し、「N」は任意の塩基A、C、GまたはT(U)を示す。核酸配列は4つの天然デオキシヌクレオチドに限定されず、リボヌクレオシドおよび非天然ヌクレオチドも含み得ることが理解される。括弧中に与えられるヌクレオチド配列またはヌクレオチド中の「/」は、DNA配列中のTに代わるRNA配列中の代替のUのような、代替のヌクレオチドを示す。従って、U/TまたはU(T)は、UまたはTのいずれかであり得る1つのヌクレオチド位置を示す。同様に、A/Tは、ヌクレオチドAまたはTを示し;G/Cは、ヌクレオチドGまたはCを示す。UとTとの間の機能的同一性のため、本明細書でのUまたはTへのいずれかの言及は、TまたはUのもう一方としての開示としても見るべきである。例えば、(RNA配列上の)配列UUCGへの言及は、(対応するDNA上の)配列TTCGの開示としても理解される。便宜のみのため、これらの選択肢の1つのみが本明細書で記載される。相補的ヌクレオチドまたは塩基は、AおよびT(またはU);GおよびC;GおよびUのような塩基対合可能なものである。
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結され」または「作動可能に配置され」なる語は、第1の活性(例えば、ターミネーター活性)を有する遺伝子構成要素が、第2の活性を有する別の遺伝子構成要素(例えば、プロモーター、オペレーター、カタボライトアクチベータータンパク質結合領域、エンハンサー、遺伝子、遺伝子フラグメント、オープンリーディングフレーム、等)と同じ核酸分子内にあるように操作され、機能的関係性があることを意味する。例えば、ターミネーターがインサートに作動可能に連結されることは、該インサートからの転写がターミネーターで終結されることができるように、該ターミネーターおよびインサート(例えば、遺伝子)がともに操作される(例えば、発現カセットにおいて)ことを意味する。
本明細書で使用される「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」なる語は、アミノ酸残基のポリマーを示す。これらの語は、1以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工化学類似体であるアミノ酸ポリマー、並びに天然アミノ酸ポリマー、修飾残基を含有するもの、および非天然アミノ酸ポリマーにも適用する。本出願の場合、「ポリペプチド」なる語は、抗体またはそのフラグメントを包含する。
「プラスミド」は、宿主の染色体DNAから独立して複製するDNAの小円状体である。宿主は、細菌、酵母、植物、またはほ乳類細胞であることができる。典型的に、プラスミドは、複製起点、選択マーカー、および1以上のクローニング部位を有する。プラスミドは、2以上の異なる宿主間でシャトル可能なように、2以上の異なる複製起点を含有することができる。
本明細書で使用される場合、「プロモーター」なる語は、目的のヌクレオチド配列のmRNAへの転写を制御し得るDNA配列を示し、一般に、他の転写因子の結合のためのRNAポリメラーゼ結合部位および1以上のオペレーターおよび/またはカタボライトアクチベータータンパク質(サイクリックAMPレセプタータンパク質、「CAP」としても知られる)結合部位を含有する。プロモーターは、構成的にアクティブであり得るか(「構成的プロモーター」)、または化学薬品、熱または光のような他の因子により制御され得る。「誘導可能プロモーター(inducible promoter)」の活性は、存在または不在、あるいは生物的または非生物的因子により誘導される。一般に使用される構成的プロモーターは、(エタノールにより抑制される)CMV、EF1a、SV40、PGK1、Ubc、ヒト ベータ アクチン、CAG、Ac5、Polyhedrin、TEF1、GDS、ADH1、(T7 RNAポリメラーゼを必要とする)CaMV35S、Ubi、H1、U6、T7、および(SP6 RNAポリメラーゼを必要とする)SP6を包含する。一般的な誘導可能プロモーターは、(テトラサイクリンまたはその誘導体により誘導可能な;TetRレセプターにより抑制可能な)TRE、(ガラクトースにより誘導可能な;グルコースを用いて抑制可能な)GAL1&GAL10、(lacレセプター(LacI)の不在において構成的である;IPTGまたはラクトースにより誘導可能な)lac、(T7およびlacのハイブリッド;lacオペレーターによっても制御されるT7 RNAポリメラーゼを必要とする;IPTGまたはラクトースにより誘導可能な)T7lac、(リプレッサーAraCに結合して転写を活性化させるアラビノースによって誘導可能な;CAP結合部位を介するグルコースの存在下で、または抗インデューサーフコース(anti−inducer fucose)の競合結合によってカタボライト抑制を抑制する)araBAD、(TrpRリプレッサーと結合する際にトリプトファンにより抑制可能な)trp、(lacおよびtrpのハイブリッド;lacプロモーターのように制御される;例えば、tacIおよびtacIIである)tac、および(温度により制御される)pLを包含する。該プロモーターは、宿主に応じて、原核生物のまたは真核生物のプロモーターであることができる。一般的なプロモーターおよびそれらの配列は、当該分野において周知である。
一般に、「ステム−ループ」配列(「ヘアピン」と交換可能に使用される)は、互いの逆相補体である単一の核酸(DNAまたはRNAまたはその他)分子内の少なくとも2つの領域が1以上の非相補的領域によって隔てられ、そのため、該非相補的領域が「ループ」を形成する一方、該相補的領域がハイブリダイズして「ステム」を形成する配列を示す。
本明細書で使用される場合、「終結(termination)」は、他に注記が無ければ、転写終結を示すものとする。「終結シグナル」または単に「ターミネーター」は、RNAポリメラーゼの転写を妨げるまたは止める核酸配列を示す。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるターミネーターは、T7 RNAポリメラーゼと関連して使用されるが、他のRNAポリメラーゼのための終結ももたらすことができる。
本明細書で使用される場合、他に明記されない限り、「転写」なる語は、DNA鋳型からのRNAの合成を示し;「翻訳」なる語は、mRNA鋳型からのポリペプチドの合成を示す。転写および翻訳はまとめて「発現」として知られる。
本明細書で使用される場合、「トランスフェクト」または「形質転換」または「形質導入」なる語は、外因性核酸を宿主細胞中に移入または導入させる過程を示す。トランスフェクトまたは形質導入細胞は、一次対象細胞およびその子孫を包含する。該宿主細胞は、細菌、酵母、ほ乳類細胞、および植物細胞であることができる。
本明細書で使用される場合、「ベクター」なる語は、それに連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子を示す。ベクターは、適切なコントロール要素と結合された場合に複製が可能であり(例えば、複製装置タンパク質をリクルートすることにより複製の開始を可能にするDNA配列である複製起点を含有する)、遺伝子配列を宿主中へまたは宿主間で移動させることができる、プラスミド、ファージベクター、ファージミド、トランスポゾン、コスミド、染色体、人工染色体、エピソーム、ウイルス、ビリオン等のような任意の遺伝的要素を包含する。1つのタイプのベクターは、エピソーム、すなわち、染色体外複製が可能な核酸である。別のタイプのベクターは、宿主細胞の遺伝物質に再結合するように設計される統合的ベクターである。ベクターは、自立複製性および統合的であってもよく、ベクターの特性は細胞環境により異なり得る(すなわち、ベクターは、ある宿主細胞タイプにおいて自立的に複製し、別の宿主細胞タイプにおいて完全に統合的であり得る)。一般に、ベクターは、1または少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位および/または部位特異的組換えのための部位を含有する。外来DNAフラグメントは、切断され、これらの部位で該ベクター中にライゲートされ得る。該ベクターは、形質転換またはトランスフェクト細胞の同定における使用に適切なマーカーを含有し得る。例えば、マーカーは、抗生物質耐性、蛍光性、酵素性、並びに他の特性を提供し得る。第2の例として、マーカーは、栄養要求性欠陥を補足し、または培養培地中にない重要な栄養素を供給し得る。
本明細書で使用する場合、組換え核酸技術、微生物学、遺伝子工学、および分子細胞生物学の分野において使用される他の用語は、適用可能な分野における通常の当業者によって一般に理解されるだろう。
転写ターミネーター
転写は、遺伝子発現の中心的工程であり、故に単一遺伝子または遺伝子群の発現を扱うための強力な選択肢を与え得る。RNAポリメラーゼ(RNAP)がmRNA転写産物の合成を触媒する、mRNA−DNA−RNAポリメラーゼ三重構造が形成されるDNA鋳型上で、転写は起こる。該三重複合体が形成されると、非終結転写休止または遅滞の間、RNAPの解離なしに、1秒あたり100塩基もの取り込みを可能にするのに十分なほど、それは安定である必要がある。従って、伸長RNAPと鋳型DNAおよび結果として生じるRNA転写産物との密接な結合は、数百または数千ヌクレオチドの長さを有するmRNAを製造する能力には不可欠である。
転写は、遺伝子発現の中心的工程であり、故に単一遺伝子または遺伝子群の発現を扱うための強力な選択肢を与え得る。RNAポリメラーゼ(RNAP)がmRNA転写産物の合成を触媒する、mRNA−DNA−RNAポリメラーゼ三重構造が形成されるDNA鋳型上で、転写は起こる。該三重複合体が形成されると、非終結転写休止または遅滞の間、RNAPの解離なしに、1秒あたり100塩基もの取り込みを可能にするのに十分なほど、それは安定である必要がある。従って、伸長RNAPと鋳型DNAおよび結果として生じるRNA転写産物との密接な結合は、数百または数千ヌクレオチドの長さを有するmRNAを製造する能力には不可欠である。
転写開始および並外れて安定な三重複合体の形成後、RNAP酵素は鋳型に沿って移動し、ヌクレオチドを1つずつ取り込み、所望のmRNA鎖を製造する。mRNAの合成および単一遺伝子または転写オペロンのmRNAの放出は、鋳型上の別個の部位で止められなければならない。この過程は、転写終結と呼ばれ、逆の順序であるが転写開始中の事象と似ており、RNAPの解離および転写RNAの放出をもたらす。終結は、鋳型DNA内のよく定義されたシグナルいわゆる転写ターミネーター(transcription terminatorまたはtranscriptional terminator)または単にターミネーターに応答して起こる。ほとんどの生物学的過程のように、終結は、運命を左右する(make−or−break)決定ではなく、故に100%の程度では起こらない。実際、ターミネーターによっては、終結の効率が幅広く異なり、終結効率(TE)において大きな違いがある。実際、終結シグナルは、所与のRNAポリメラーゼに対して非常に特異的である。非終結事象は、ポリメラーゼの読み飛ばし(read through)としても記載される。
固有の転写ターミネーターまたはRho−独立性ターミネーターは、伸長転写産物上での自己アニーリングヘアピン構造の形成を必要とし、mRNA−DNA−RNAポリメラーゼ三重複合体の崩壊をもたらす。天然ターミネーター配列は、二者対称(dyad symmetry)の20塩基対GC−リッチ領域、次いで、RNAに転写して終結ヘアピンおよび7−9ヌクレオチド「Uトラック(U track)」をそれぞれ形成する短いポリ−Tトラクト(poly−T tract)または「Tストレッチ(T stretch)」を含有する。(一般に、二者対称は、その塩基対配列が互いの逆反復であるDNA鎖の2領域を示す。それらはしばしばパリンドロームとして記載される。)天然および合成ターミネーターの研究は、参照により本明細書に組み込まれるChenら,Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints,Nature Methods 10,659-664(2013)において提供される。
終結のメカニズムは、該RNAPとのヘアピン結合相互作用のアロステリック効果による解離の直接的促進と「競争的キネティクス」との組み合わせにより起こると仮説立てられる。該ヘアピン形成は、RNAP失速(stalling)および不安定化を引き起こし、その部位で休止される時間の増加および複合体の安定性減少により、該複合体の解離がその場所で起こる可能性がより高まる。
長期間、ステム構造内でG−C対により仲介されるヘアピンの安定性は、TEに影響するためのヘアピン構造の最も不可欠な部分であると考えられていた。理論的に、ステム構造中への推定上の塩基の挿入は、より高い全AG価をもたらすはずであり、故に全TEが増加するはずである。驚くべきことに、G−C対を挿入することによる熱力学的安定性の増加は、より高いTEをもたらさず、これは該ヘアピン構造の安定性が終結の不可欠な唯一の決定因子ではないことを示している。安定性に加え、ヘアピンの三次元構造は、終結において重要な役割を果たすことが仮定される。最も特徴的な固有ターミネーターについて、ステム構造の第1の閉鎖塩基対から第1の終結位置までの距離は保存される。該不変性は、該三次元構造の重要性に対する推定上の証拠として見ることができる。結論として、該ヘアピンは、伸長ポリメラーゼと相互作用するために、別個の三次元形であると想定されなければならないようである。
一態様において、本明細書において、非天然人工転写ターミネーターが提供される。いくつかの実施形態において、転写ターミネーターは、1以上のステム−ループ配列を包含することができる。いくつかの場合において、ステム−ループ配列は、約7−約200ヌクレオチド長、10−100ヌクレオチド長、15−80ヌクレオチド長、20−50ヌクレオチド長、または30−40ヌクレオチド長であることができる。該ステム−ループ配列は、設計に応じてより短くてもより長くてもよい。
各ステム−ループ内で、1以上のループ構造が設計されることができる。該ループは、該ループの根元の、該ステムと結合している2つのヌクレオチドが相補的である(例えば、A−TまたはG−C)フルループ(full loop)であることができる。一般に、ステムの頂上にあるループはフルループである。該ループの根元の、ステムと結合している2つのヌクレオチドが塩基対を形成しない場合(例えば、AおよびA、TおよびT、AおよびG、TおよびC、等)、該ループはハーフループ(half loop)であることもできる。ステム−ループは、1以上のフルおよび/またはハーフループを有することができる。該ループの根元の、ステムと結合している2つのヌクレオチドを除き、ループのサイズは、宿主がE.coliのような細菌である場合、3−12ヌクレオチド、または4−10ヌクレオチド、または5−8ヌクレオチドのいずれかであることができる。宿主が酵母またはほ乳類細胞である場合、ループサイズはより大きい、例えば、最高15ヌクレオチドまたは最高20ヌクレオチドまたはより大きくてもよい。
ステム部分は、2つの塩基対フラグメントの間で100%相補性を有する必要はない。便宜のため、ステム中の一方のフラグメントを陽性または+フラグメント、もう片方を陰性または−フラグメントと名付ける。いくつかの実施形態において、該ステムは、2つの塩基対フラグメントの間で少なくとも約98%、少なくとも約95%、少なくとも約90%、少なくとも約85%、少なくとも約80%、少なくとも約75%、少なくとも約70%、少なくとも約60%、少なくとも約50%の相補性を有することができる。100%未満の相補性がある場合、陰性フラグメントと比較して、陽性フラグメントは、1以上のミスマッチ、(ループを形成するため連続的に、または非連続的に)1以上の挿入および/または(陰性フラグメント上でループを形成するため連続的に、または非連続的に)1以上の欠失を含有し得る。
ある特定の実施形態において、ステム−ループ配列は、長いステムを有する「高い(tall)」ステム−ループまたは短いステムを有する「短い(short)」ステム−ループであることができる。一般に、高いステム−ループは、一方の鎖上で折り畳まれると、RNAポリメラーゼ(RNAP)のサイズの少なくとも2倍(2X)、例えば2X RNAP、3X RNAP、またはそれより長い、またはその間のいずれかのサイズのステムを有することができる。一般に、短いステム−ループは、RNAPのサイズの2倍より短い、例えば1X RNAP、2X RNAP、またはそれより短い、またはその間のいずれかのサイズのステムを有する。RNAPは、約5−10ヌクレオチド長、または約6−9ヌクレオチド長、または約7−8ヌクレオチド長を占めることができ、1X RNAPステムの長さであることができる。従って、2X RNAPステムは、約10−20ヌクレオチド長、約12−18ヌクレオチド長、約14−16ヌクレオチド長、約16−18ヌクレオチド長、約17−19ヌクレオチド長であり得る。3X RNAPステムは、約15−30ヌクレオチド長、約18−27ヌクレオチド長、約21−24ヌクレオチド長、約24−28ヌクレオチド長、または約25−29ヌクレオチド長であり得る。その他も同様である。
いくつかの実施形態において、ターミネーター配列を(十分な終結効率を有したまま)可能な限り短く保ち、大きいインサートに適合するようにベクターの全サイズを最小限にすることが望まれ得る。これらの場合、該高いステム−ループは、3X RNAP以下または2X RNAP以下のステム長を有するように設計されることができる。ベクターサイズがあまり問題でない場合、より長いステム(例えば、3X RNAPまたはより長い)を含むことができる。
転写ターミネーターは、1より多いステム−ループ配列を含むことができる。いくつかの実施形態において、転写ターミネーターは、少なくとも2ステム−ループ、少なくとも3ステム−ループ、少なくとも4ステム−ループ、少なくとも5ステム−ループ、少なくとも6ステム−ループ、あるいはより多いまたはより少ないステム−ループを有することができる。宿主がE.coliのような細菌である場合、ベクターサイズを小さく保つため、該ターミネーターは、3ステム−ループまたはより少ないステム−ループを含み得る。
転写ターミネーターは、1以上の高いステム−ループおよび1以上の短いステム−ループの混合物を含むことができる。各ターミネーター内のステム−ループは、高いおよび短いステム−ループの任意の組み合わせまたは配置であることができる。例えば、該ターミネーターは、5’から3’へ、高いステム−ループの次に短いステム−ループ、その次に高いステム−ループを含むことができる。該ターミネーターは、3つの高いステム−ループを含むこともできる。別の例において、該ターミネーターは、5’から3’へ高−高−短−短−高−高の順序で、6つのステム−ループを有し得る。2つの隣接したステム−ループは、互いに、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも18、または少なくとも20ヌクレオチド離れているように設計されることができる。2つの隣接したステム−ループは、互いに、多くても200、多くても150、多くても100、多くても90、多くても80、多くても70、多くても60、多くても50、多くても40、多くても30または多くても20ヌクレオチド離れているように設計されることができる。
1以上のターミネーターは、コーディング配列の転写に影響するように該コーディング配列に作動可能に連結されることができる。かかる作動可能な連結は、例えば、遺伝子のためのコーディング配列と同じDNA分子上でターミネーターを提供することによることができる。2以上のターミネーターは、前に置かれたコーディング配列の協調した終結を提供するために互いに関連して配置される場合、作動可能に連結されることができる。例えば、インサートは、本明細書に提供されるアンチセンスターミネーター配列の3’および/または転写ターミネーターの5’に配置されることができる。いくつかの実施形態において、ターミネーター配列は、コーディング配列の下流に、すなわち、コーディング配列の3’末端上に配置されることができる。ターミネーター配列は、コーディング配列の上流にあることもできる。該ターミネーターは、例えば、少なくとも1、少なくとも10、少なくとも30、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500ヌクレオチド、該コーディング配列の下流または上流にあるか、または該コーディング配列に直接隣接していることができる。コーディング配列と組み合わせてまたはコーディング配列から独立して、該ターミネーター配列は、10000未満、8000未満、6000未満、5000未満、4500未満、4000未満、3500未満、3000未満、2500未満、2000未満、1500未満、1000未満、750未満、500未満、250未満、100未満ヌクレオチド、該コーディング配列の下流にあることができる。
いくつかの実施形態において、本開示は、X−Y−Zステム−ループを含む非天然核酸配列を提供し、ここで:Yは、10−30ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり;Xは、3−12ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、その各ヌクレオチドは、X内のいずれか他のヌクレオチドと塩基対合せず;Zは、10−50ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、Yに対して少なくとも70%相補性を有する。Xは、該ステム−ループのループ部分であり、いくつかの実施形態において、3−8ヌクレオチド長、4−6ヌクレオチド長または5−6ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態におけるステム−ループは、AAGCおよび/またはCATC配列を含むことができる。いくつかの例において、該ステム−ループは、配列番号3、4、または6の配列を有することができる。
いくつかの実施形態において、Yは、多くても60%、多くても50%、または多くても40%のG/C含量を有する。Yは、Xに対して5’またはXに対して3’にあり得る。ある特定の実施形態において、Yは、12−18ヌクレオチド長、14−16ヌクレオチド長、16−18ヌクレオチド長、17−19ヌクレオチド長、15−30ヌクレオチド長、18−27ヌクレオチド長、21−24ヌクレオチド長、24−28ヌクレオチド長、または25−29ヌクレオチド長であることができる。いくつかの実施形態において、Yは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30ヌクレオチド長である。
Yの長さは、Yと実質上同じヌクレオチド長を有するように選択され得るZの長さを(相補性によって)決定する。Zは、Yと同じ長さを有することができ、Yとの1以上のミスマッチを有し得る。Zは、Yと比較して1以上の挿入を有することもでき、故に、Yとアニールされた場合、1以上の突起またはループを形成し得る。ヘアピンのステムである実質上相補的なYおよびZの長さは、塩基対中のステム長を決定する。該ステムは、本明細書で記載されるように必ずしも100%相補的ではないが、YおよびZに対する限定された非相補的対向塩基を有することができる。
とりわけ、YおよびZは、それぞれmおよびnヌクレオチド長であることができ、ここで、Yはヌクレオチドy1、y2…ymから構成され、Zはヌクレオチドz1、z2…znから構成される。ヘアピンのステムの終点が相補的であるように、好ましくは、z1はy1に相補的であり、znはymに相補的である。YおよびZは、少なくとも60%相補的、好ましくは少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも82%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも88%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%さえ相補的であることができる。相補性は、最も好ましくは少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または100%である。ミスマッチ、挿入および/または欠失のような非相補性は、可能性であるが、上記の相補性割合を満たすように限定されるべきである。いくつかの限定された非相補性は、1以上の追加のループを形成するように互いに隣接して配置され得る。
さらなる態様は、第1のステム−ループおよび第2のステム−ループを含む転写ターミネーターに関し、ここで、該第1のステム−ループは、本明細書で開示される非天然ステム−ループ核酸配列のいずれか1つを有し、ここで、該第1のステム−ループは、該第2のステム−ループに対し5’にある。いくつかの実施形態において、該第2のステム−ループは、短いステム−ループである。該第2のステム−ループは、本明細書で開示される非天然ステム−ループ核酸配列のいずれか1つを有してもよい。転写ターミネーターは、短いステム−ループであることができ、または本明細書で開示される非天然ステム−ループ核酸配列のいずれか1つを有することができる第3のステム−ループをさらに含むことができる。該開示の例示的ターミネーターは、配列番号2または5の配列を有する。配列番号2または5のターミネーターに対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%配列同一性を有する相同性ターミネーターも、本開示中に包含される。配列番号2および5は、下線が引かれた数個のステム−ループを有する人工最適化ターミネーターを記載する。それらの二次構造をそれぞれ図3および4に示す。
ベクター
DNAインサートに作動可能に連結される、本明細書に開示される1以上の転写ターミネーターを含むベクターも本明細書で提供される。1つのベクター中に2以上のターミネーターが包含される場合、各ターミネーターは、他のターミネーターから独立して配置されてよく、例えば、インサートまたはインサートが挿入され得るクローニング部位に作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態において、ステム−ループまたはターミネーターは、その5’および/または3’末端でエンドヌクレアーゼ制限部位が側面に配置されるように設計される。末端制限部位は、ベクターまたは発現カセットのような他の核酸分子中への組み込みのため、ステム−ループまたはターミネーターの容易な操作を可能にする。
DNAインサートに作動可能に連結される、本明細書に開示される1以上の転写ターミネーターを含むベクターも本明細書で提供される。1つのベクター中に2以上のターミネーターが包含される場合、各ターミネーターは、他のターミネーターから独立して配置されてよく、例えば、インサートまたはインサートが挿入され得るクローニング部位に作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態において、ステム−ループまたはターミネーターは、その5’および/または3’末端でエンドヌクレアーゼ制限部位が側面に配置されるように設計される。末端制限部位は、ベクターまたは発現カセットのような他の核酸分子中への組み込みのため、ステム−ループまたはターミネーターの容易な操作を可能にする。
インサートは、任意の天然または合成核酸配列であることができる。いくつかの実施形態において、該インサートは、インビトロ合成されたまたはアセンブルされた核酸である。種々の合成およびアセンブリー戦略は、例えば、PCT公開番号WO2014/151696、WO2014/004393、WO2013/163263、WO2013/032850、WO2012/078312、WO2004/24886、WO2008/027558、WO2010/025310、およびWO2016/064856中に記載され、それらの全ての開示は、参照により全内容が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、1以上の標的核酸の合成またはアセンブリー後、それらはベクター中へ個々にクローン化されることができ、またはかかるクローニングは平行して多重化様式で実施されることができる。
ベクターは、容易な操作に適切な形式で、例えば、限定された長さで提供されるべきである。いくつかの実施形態において、該ベクターは、最高30,000nt(ヌクレオチド)、最高25,000nt、最高20,000nt、最高15,000nt、最高12,500nt、最高10,000nt、最高9,000nt、最高8,000nt、最高7,000nt、最高6,000ntを含む。
ベクターは、該ターミネーターの他に、複製起点、選択可能なマーカーまたは抗生物質耐性遺伝子配列、DNAインサートの挿入のための多重クローニング部位、および/またはプロモーターのような1以上の遺伝子構成要素を含むことができる。該プロモーターは、該ターミネーターに作動可能に連結されることができる。該ターミネーターの側面に位置する制限部位および/またはターミネーターの上流のクローニング部位、または該ターミネーターの上流のインサートも包含されることができる。かかるベクターは、作動可能に連結したインサートの転写の間、機能的に高い転写率を可能にする。該ターミネーターは、(インサートが挿入され得る)多重クローニング部位の転写産物の終結のために作動可能に配置され得る。「多重クローニング部位」なる語は、制限酵素のための少なくとも2つの部位を含む部位を示すが、好ましくは、種々の制限酵素のための多数の部位を含む。
一実施形態におけるベクターは配列番号1の配列を有する。図1および2は例示的ベクターのスキームである。
とりわけ、図1は、オープンリーディングフレーム(ORF)、選択可能なマーカー(例えば、ampすなわちアンピシリン耐性)、1以上の他の遺伝子(またはORF)、pBR322起点および数個の固有制限部位を含有する2017bp長のベクターを説明する。図2は、図1と同じベクターの簡易化されたスキームであり、2つのターミネーター(「T」)の相対位置を示す。
別の態様は、本明細書で開示されるベクターを含む操作された宿主細胞に関する。宿主細胞は、培養下で生育され、拡大され得る。宿主細胞は、1以上の目的のRNAまたはポリペプチド(例えば、治療用、産業用、農業用、および/または医療用タンパク質)を発現させるために使用され得る。発現されたポリペプチドは、天然ポリペプチドまたは非天然ポリペプチドであり得る。該ポリペプチドは、その後の使用のために単離または精製され得る。あるいは、インビトロ発現系が使用され得る。
ベクターを操作する方法に関するさらなる態様は、ベクターにおいて本明細書で開示されるいずれかの転写ターミネーターを提供することを含み、ここで、該転写ターミネーターは、DNAインサートに作動可能に連結するように操作される。
(a)DNAインサートに作動可能に連結するように操作された、本明細書で開示されるいずれかの転写ターミネーターを提供すること;(b)該DNAインサートの転写を可能にすること;および(c)該転写ターミネーターで該DNAインサートの転写を終結させることを含む、DNAインサートの転写を終結させる方法も本明細書で提供される。
本開示の種々の態様は、単独で、組み合わせて、または前述において記載される実施形態においてとりわけ議論されるわけではない様々な配置で用いられてよく、故に、その適用において、前述の記載中で示される、または図面中で説明される構成要素の詳細および配置に限定されない。例えば、一実施形態において記載される態様は、他の実施形態において記載される態様と任意の方法で組み合わせ得る。
下記の実施例は、本開示の代表として示される。これらの実施例は、それ自体、開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきでなく、他の均等な実施形態は、本開示、図面および添付の特許請求の範囲を考慮すると明らかであるだろう。
実施例
転写ターミネーターを有する低コピーカルベニシリン(carbenicillin)ベクターが設計される。ベクターマップを図1および2に説明する。配列を配列番号1に示し、ここで2つのターミネーターに下線が引かれる。ミニプレップ(miniprep)において、約2.5μgのプラスミド(ベースベクターw/o挿入)を10mLの培養物から回収した。該ターミネーターは、配列番号2および5の配列を有し、それらの二次構造を図3および4に示す。該ステム−ループは、配列番号2および5において下線が引かれる。3つの高いステム−ループは、配列番号3、4および6の配列を有する。
転写ターミネーターを有する低コピーカルベニシリン(carbenicillin)ベクターが設計される。ベクターマップを図1および2に説明する。配列を配列番号1に示し、ここで2つのターミネーターに下線が引かれる。ミニプレップ(miniprep)において、約2.5μgのプラスミド(ベースベクターw/o挿入)を10mLの培養物から回収した。該ターミネーターは、配列番号2および5の配列を有し、それらの二次構造を図3および4に示す。該ステム−ループは、配列番号2および5において下線が引かれる。3つの高いステム−ループは、配列番号3、4および6の配列を有する。
均等
本開示は、とりわけ、合成転写ターミネーターを使用する改良されたクローニング効率のための新規な方法およびシステムを提供する。本開示の特定の実施形態が議論されてきたが、本明細書は、説明するためのものであり、限定するものではない。該開示の多くのバリエーションは、本明細書のレビューに際して当業者に明らかになるであろう。該開示の全範囲は、その均等なものの全範囲と合わせた特許請求の範囲、およびかかるバリエーションと合わせた本明細書の参照により決定されるべきである。
本開示は、とりわけ、合成転写ターミネーターを使用する改良されたクローニング効率のための新規な方法およびシステムを提供する。本開示の特定の実施形態が議論されてきたが、本明細書は、説明するためのものであり、限定するものではない。該開示の多くのバリエーションは、本明細書のレビューに際して当業者に明らかになるであろう。該開示の全範囲は、その均等なものの全範囲と合わせた特許請求の範囲、およびかかるバリエーションと合わせた本明細書の参照により決定されるべきである。
参照による組み込み
「127662015201SequenceListing.txt」という名称の、2016年11月29日に作成された、4,285バイトのサイズを有する、EFS−Webを介して本明細書で提示されるASCIIテキストファイルは、参照により全内容が本明細書に組み込まれる。
「127662015201SequenceListing.txt」という名称の、2016年11月29日に作成された、4,285バイトのサイズを有する、EFS−Webを介して本明細書で提示されるASCIIテキストファイルは、参照により全内容が本明細書に組み込まれる。
本明細書に言及される全ての出版物、特許、および配布データベースエントリーは、あたかも個々の出版物または特許が出典明示により特別かつ個々に組み込まれることが示されていたかのごとく、出典明示により、全内容が本明細書に組み込まれる。
Claims (23)
- X−Y−Zステム−ループを含む非天然核酸配列であって、ここで:
Yは、10−30ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり;
Xは、3−12ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、ここで、各ヌクレオチドは、X内のいずれか他のヌクレオチドと塩基対合せず;
Zは、10−50ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、Yに対して少なくとも70%相補性を有する、非天然核酸配列。 - Yが、多くても60%、好ましくは多くても50%、より好ましくは多くても40%のG/C含量を有する、請求項1に記載の非天然核酸配列。
- Yが、Xに対して5’にあるように操作される、請求項1に記載の非天然核酸配列。
- Yが、Xに対して3’にあるように操作される、請求項1に記載の非天然核酸配列。
- Yが、12−18ヌクレオチド長、または14−16ヌクレオチド長、または16−18ヌクレオチド長、または17−19ヌクレオチド長、または15−30ヌクレオチド長、または18−27ヌクレオチド長、または21−24ヌクレオチド長、または24−28ヌクレオチド長、または25−29ヌクレオチド長である、請求項1−4のいずれか一項に記載の非天然核酸配列。
- Xが、3−8ヌクレオチド長、好ましくは4−6ヌクレオチド長、より好ましくは5−6ヌクレオチド長である、請求項1−4のいずれか一項に記載の非天然核酸配列。
- Zが、Yと同じ長さを有し、Yとの1以上のミスマッチを有する、請求項1−4のいずれか一項に記載の非天然核酸配列。
- Zが、Yと異なる長さを有し、Yと比較して1以上の挿入または欠失を有する、請求項1−4のいずれか一項に記載の非天然核酸配列。
- AAGCを含む、請求項1−4のいずれか一項に記載の非天然核酸配列。
- CATCを含む、請求項1−4のいずれか一項に記載の非天然核酸配列。
- 配列番号3、4または6の配列を有する、請求項1−4のいずれか一項に記載の非天然核酸配列。
- 第1のステム−ループおよび第2のステム−ループを含む転写ターミネーターであって、該第1のステム−ループが請求項1−4のいずれか一項に記載の非天然核酸配列を有し、該第1のステム−ループが第2のステム−ループに対して5’にあるように操作される、転写ターミネーター。
- 第2のステム−ループが短いステム−ループである、請求項12に記載の転写ターミネーター。
- 第2のステム−ループが請求項1−4のいずれか一項に記載の非天然核酸配列を有する、請求項12に記載の転写ターミネーター。
- さらに第3のステム−ループを含む、請求項12に記載の転写ターミネーター。
- 第3のステム−ループが短いステム−ループである、請求項15に記載の転写ターミネーター。
- 第3のステム−ループが請求項1−11のいずれか一項に記載の非天然核酸配列を有する、請求項15に記載の転写ターミネーター。
- 配列番号2または5の配列を有する、請求項12に記載の転写ターミネーター。
- 転写ターミネーターがDNAインサートに作動可能に連結される、請求項12に記載の転写ターミネーターを含むベクター。
- 配列番号1の配列を有する、請求項19に記載のベクター。
- 請求項19または20に記載のベクターを含む操作された細胞。
- 転写ターミネーターがDNAインサートに作動可能に連結するように操作されている、ベクターにおいて請求項12に記載の転写ターミネーターを提供することを含む、ベクターを操作する方法。
- DNAインサートの転写を終結させる方法であって、
a.該DNAインサートに作動可能に連結するように操作された、請求項12に記載の転写ターミネーターを提供すること;
b.該DNAインサートの転写を可能にすること;および
c.該転写ターミネーターで該DNAインサートの転写を終結させることを含む方法。
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