JP2018533597A - 第ｖｉｉｉ因子を含有する凍結乾燥ペレットの製造方法 - Google Patents

Abstract

第ＶＩＩＩ因子を含有する凍結乾燥ペレットの製造方法は、ａ）第ＶＩＩＩ因子を含有する溶液の液滴を凍結してペレットを形成する工程；ｂ）ペレットを凍結乾燥する工程を含み、ここで、工程ａ）において、温度制御可能な内壁表面および溶液の凍結温度より低い内部温度を有する冷却塔内への第ＶＩＩＩ因子を含有する溶液の液滴形成によって液滴を形成し、工程ｂ）において、真空チャンバ内に収容されている回転容器内でペレットを凍結乾燥する。

Description

本発明は、第ＶＩＩＩ因子を含有する凍結乾燥ペレットの製造方法であって、ａ）第ＶＩＩＩ因子を含有する溶液の液滴を凍結してペレットを形成する工程およびｂ）ペレットを凍結乾燥する工程を含む方法に関する。

第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は、血漿中に見出されるタンパク質であり、血液凝固をもたらす反応のカスケードにおける補因子として働く。血液中のＦＶＩＩＩ活性の量の不足は、主に男性が罹患する遺伝性疾患である、血友病Ａとして知られる凝固障害をもたらす。血友病Ａは現在、ヒト血漿由来または組換えＤＮＡ技術を用いて製造されたＦＶＩＩＩの治療用製剤で処置されている。そのような製剤は、出血エピソードに対応して（オンデマンド療法）または制御されない出血を防ぐために頻繁で規則的な間隔で（予防法）投与される。

非経口バイオ医薬品を製造および包装するための従来のプロセスは、バルク溶液を製剤化するのに使用される中間体物質の測定された生物学的活性に従ってバルク溶液を製剤化することを含む。多くの場合、特にプロセスの最後に、アッセイを行うためにバルク溶液を凍結し、保存する。この目的のために、凍結した溶液を数日間、さらには数週間保存し得る。その後、最終ユーザーへの配給用に、バイアルなどの最終包装に充填するために、典型的には凍結した中間体溶液を解凍し、バルクにして、バイアルに充填し、次いでバイアル内で凍結乾燥する。

最終包装バイアルに充填される解凍したバルク溶液の量は、中間体溶液のアッセイに基づいて計算される。この計算は、（１）生物学的アッセイの大きな変動ならびに（２）その後の滅菌充填および凍結乾燥プロセスにおける収率低下のために、通常、大きな安全マージンを組み込む。収率低下は、この最初の凍結、保存および解凍工程ならびに次の第二の充填、凍結および乾燥プロセスの間の生成物ストレスに起因する。この計算は、言うまでもなく非常に難しく、完全なプロセスについての製品に依存する経験的知識に基づく。

従来のプロセスでは、凍結乾燥は、通常、温度制御壁を有さない標準的な凍結乾燥チャンバ内で実施される。これらの乾燥機は、残念なことに、乾燥機チャンバに入れたバイアルに均一でない熱伝達を与える。特に、端部に位置するバイアルは、チャンバの壁とプレート／棚の積み重ねとの間の隙間における放射熱交換および自然対流のために、プレートの中央に位置するバイアルよりも強くエネルギーを交換する。このエネルギー分布の不均一性は、端部のバイアルと中央部のバイアルとの間で凍結・乾燥動力学の変動をもたらし、それぞれのバイアルの活性内容物の活性の変動を生じさせ得る。最終製品の均一性を確保するためには、実験室規模と生産規模の両方で広範な開発と検証作業を行う必要がある。

Ｗａｎｇ，Ｄ．Ｑ．，ＭａｃＬｅａｎ，Ｄ．ａｎｄ Ｍａ，Ｘ．（２０１０）ｅｎｔｉｔｌｅｄ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ ｉｎ Ｆｒｅｅｚｅ Ｄｒｙｉｎｇ ｏｆ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ｉｎ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（ｅｄｓ Ｆ．Ｊａｍｅｅｌ ａｎｄ Ｓ．Ｈｅｒｓｈｅｎｓｏｎ），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ，ＵＳＡによる出版物は、組換えＦＶＩＩＩについての特定の凍結乾燥サイクルを開示しているが、依然として凍結乾燥チャンバ内のバイアル位置の関数としての効力変動を認めている。

国際公開第２０１０／０５４２３８Ａ１号は、（ａ）ＦＶＩＩＩ；（ｂ）１種以上の緩衝剤；（ｃ）１種以上の抗酸化剤；（ｄ）１種以上の安定剤；および（ｅ）１種以上の界面活性剤を含有する、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の安定な凍結乾燥医薬製剤について報告しており、前記ＦＶＩＩＩは、ａ）組換えＦＶＩＩＩポリペプチド；ｂ）ａ）の生物学的に活性な類似体、フラグメントまたはバリアントから成る群より選択されるポリペプチドを含み、前記緩衝剤は、約０．１ｍＭから約５００ｍＭの範囲のｐＨ緩衝剤を含み、前記ｐＨは約２．０から約１２．０の範囲内であり、前記抗酸化剤は、約０．００５から約１．０ｍｇ／ｍｌの濃度であり、前記安定剤は約０．００５から約２０％の濃度であり、前記界面活性剤は約０．００１％から約１．０％の濃度であり、前記製剤は塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含まないまたは微量のみのＮａＣｌを含む。

国際公開第２００６／００８００６Ａ１号は、バイアルなどの最終容器中のペレット化バイオ医薬品の凍結乾燥、保存、アッセイおよび充填を含む、無菌製造のためのプロセスに関する。凍結乾燥製品の容器を製造するプロセスが開示されており、このプロセスは、生成物の液滴を凍結してペレットを形成する工程、ペレットを凍結乾燥する工程、凍結乾燥ペレットをアッセイする工程および凍結乾燥ペレットを容器に充填する工程を含む。より具体的には、このプロセスは、ａ）生成物の液滴を凍結してペレットを形成する工程であって、生成物の溶液を周波数補助ノズルに通すことによって液滴が形成され、前記液滴を極低温ガスの向流に通すことによって前記液滴からペレットが形成される工程；ｂ）ペレットを凍結乾燥する工程；ｃ）凍結乾燥ペレットを保存し、均質化する工程；ｄ）凍結乾燥ペレットを保存して均質化している間に凍結乾燥ペレットをアッセイする工程；およびｅ）凍結乾燥ペレットを前記容器に充填する工程を含む。

国際公開第２０１３／０５０１５６Ａ１号は、閉鎖条件下での凍結乾燥粒子の製造のためのプロセスラインを記載しており、このプロセスラインは、少なくとも、粒子を形成するための液滴生成および液滴の凍結凝固のためのスプレーチャンバならびに粒子を凍結乾燥するためのバルク凍結乾燥機を含み、凍結乾燥機は、粒子を受け入れるための回転ドラムを含む。さらに、スプレーチャンバから凍結乾燥機への生成物移送のための移送部が設けられている。端から端まで徹底した閉鎖状態で粒子を製造するために、装置および移送部の各々は、凍結乾燥される生成物の無菌性および／または封じ込めを維持する操作に個別に適合されている。

国際公開第２０１３／０５０１６１Ａ１号は、閉鎖条件下での凍結乾燥粒子の製造のためのプロセスラインを開示しており、このプロセスラインは、閉鎖条件下での凍結乾燥粒子のバルク製品製造のための凍結乾燥機、凍結粒子を受け入れるための回転ドラムを含む凍結乾燥機、および回転ドラムを収容する固定真空チャンバを含み、閉鎖条件下での粒子の製造のために、真空チャンバは粒子の処理の間の閉鎖操作に適合されている。ドラムは真空チャンバと開放連通しており、プロセスラインの離れた装置と凍結乾燥機との間の生成物移送のための少なくとも１つの移送部が設けられており、凍結乾燥機と移送部は、別々に閉鎖操作に適合されており、移送部は、温度制御可能な内壁表面を有する。

国際公開第２０１０／０５４２３８Ａ１号 国際公開第２００６／００８００６Ａ１号 国際公開第２０１３／０５０１５６Ａ１号 国際公開第２０１３／０５０１６１Ａ１号

Ｗａｎｇ，Ｄ．Ｑ．，ＭａｃＬｅａｎ，Ｄ．ａｎｄ Ｍａ，Ｘ．（２０１０）ｅｎｔｉｔｌｅｄ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ ｉｎ Ｆｒｅｅｚｅ Ｄｒｙｉｎｇ ｏｆ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ｉｎ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（ｅｄｓ Ｆ．Ｊａｍｅｅｌ ａｎｄ Ｓ．Ｈｅｒｓｈｅｎｓｏｎ），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ，ＵＳＡ

外部からの厳密な分離という条件下で個々のペレットの活性の変動がより少ない第ＶＩＩＩ因子の凍結乾燥ペレットを製造することが望ましく、これは液体窒素のような何らかの極低温ガスを含む。本発明は、このような方法を提供することを目的とする。

この目的は、第ＶＩＩＩ因子を含有する凍結乾燥ペレットの製造方法により、本発明に従って達成され、この方法は、
ａ）第ＶＩＩＩ因子を含む溶液の液滴を凍結してペレットを形成する工程；
ｂ）ペレットを凍結乾燥する工程；
を含み、
工程ａ）において、温度制御可能な内壁表面および溶液の凍結温度より低い内部温度を有する冷却塔内への第ＶＩＩＩ因子を含有する溶液の液滴形成によって液滴を形成し、工程ｂ）において、真空チャンバ内に収容されている回転容器内でペレットを凍結乾燥する。

本発明による方法の操作原理は３つの異なる利点を有する。第一に、本発明の方法では、第ＶＩＩＩ因子含有溶液の噴霧された液滴は、国際公開第２００６／００８００６Ａ１号に記載されているような向流方式で極低温ガスと接触することはないという点に留意すべきである。冷却塔の内部空間に極低温ガスを導入する必要がなく、そのため極低温ガスについての取扱いおよび滅菌工程をすべて省くことができる。

第二に、真空チャンバ内部の回転容器内で凍結乾燥工程を実施することにより、個々のペレットの空間的位置が時間と共に均等に分配される。これにより、均一な乾燥条件が確保され、それゆえラック上の凍結乾燥バイアルの場合のような第ＶＩＩＩ因子の活性の空間的変動が排除される。

第三に、本発明に従って製造されたペレットは、ＦＶＩＩＩポリペプチドが曝される全体のプロセス条件が、平均して先行技術のものよりも穏やかであるため、より少ないマイクロコラプスを示すことが実験的に認められた。ペレットの前記マイクロコラプス発生の減少は、より均一な表面を示すペレットのＲＥＭ写真で可視であり、これらのペレットの後の処理工程においても、やはり改善された取扱い特性をもたらす。

国際公開第２００６／００８００６Ａ１号の開示に関するプロセスとの直接比較は、驚くべきことに、得られた本発明のペレットの表面形態が、国際公開第２００６／００８００６Ａ１号のプロセスから生じたペレットの表面形態よりも有意に均一であること、および国際公開第２００６／００８００６Ａ１号のプロセスのペレットは、先行技術から公知の任意の凍結乾燥プロセスと比較して既に改善された均一性と比表面を有していたが、本発明のプロセスはさらに増加した比表面（ＢＥＴ比表面）を有するペレットを生成することを示した。

凍結乾燥後のペレットの実際の効力は、第ＶＩＩＩ因子の標的効力の８６．２％から８９．９％の間であることが実験的に認められている。

本発明による方法のすべての工程は、無菌条件下でおよび個々の工程間で無菌性を損なうことなく実施することができる。

凍結ペレットの作製は、Ｉｎｏｔｅｃｈ Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄからの「Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」またはＭｅｓｓｅｒ−Ｇｒｉｅｓｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙからの「Ｋｒｙｏｇｅｎ Ｒａｐｉｄ Ｐｅｌｌｅｔｉｚｅｒ」またはＩＱＦＣＲＹＯＧＲＡＮ，Ｃａｎａｄａからの「ＣＲＹＯＧＥＮＩＣ ＰＥＬＬＥＴＩＺＥＲ」などの公知の技術のいずれかを用いて実施することができる。しかしこれらの先行技術は、大部分が、乾燥後にペレットを形成するために液滴を液体窒素中に落とすことに依存する。

次の凍結乾燥工程に起因して、凍結ペレットは狭い粒径を有すると予想される。その後、凍結ペレットは無菌および低温条件下で凍結乾燥機へと輸送され得る。次いで、ペレットは、容器の回転によって乾燥チャンバ内の搬送面に分配される。昇華乾燥は、原則として、ペレットに適したどのような種類の凍結乾燥機においても可能である。昇華蒸気流のための空間、制御された壁温度および乾燥チャンバと凝縮器との間の適切な断面積を提供する凍結乾燥機が好ましい。

本発明による方法において使用できる第ＶＩＩＩ因子バリアントの詳細を以下で述べる。好ましくは、付加的なタンパク質が存在しないベビーハムスター腎臓細胞由来の組換え第ＶＩＩＩ因子を使用する。

本明細書において、「第ＶＩＩＩ因子」または「ＦＶＩＩＩ」または「ｒＡＨＦ」という用語は、無傷のＢドメインの少なくとも一部を有し、天然のＦＶＩＩＩに関連する生物学的活性を示す任意のＦＶＩＩＩ分子を指す。本開示の一実施形態では、ＦＶＩＩＩ分子は完全長ＦＶＩＩＩである。ＦＶＩＩＩ分子は、ＦＶＩＩＬＣをコードするＤＮＡにハイブリダイズすることができるＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質である。そのようなタンパク質は、ドメインＡ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２の間またはこのドメイン内の様々な部位にアミノ酸欠失を含み得る（米国特許第４，８６８，１１２号）。ＦＶＩＩＩ分子は、１つ以上のアミノ酸残基が部位特異的突然変異誘発によって置換されている天然ＦＶＩＩＩの類似体であってもよい。

本開示によれば、「組換え第ＶＩＩＩ因子」（ｒＦＶＩＩＩ）という用語は、組換えＤＮＡ技術によって得られた異種もしくは天然に存在する任意のｒＦＶＩＩＩ、またはその生物学的に活性な誘導体を含み得る。特定の実施形態では、この用語は、上記のタンパク質および本開示のｒＦＶＩＩＩをコードする核酸を包含する。このような核酸には、例えば、限定されることなく、遺伝子、プレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、多型バリアント、対立遺伝子、合成および天然に生じる突然変異体が含まれる。ｒＦＶＩＩＩという用語に包含されるタンパク質には、例えば、限定されることなく、（１）少なくとも約２５個、約５０個、約１００個、約２００個、約３００個、約４００個もしくはそれ以上のアミノ酸（成熟天然タンパク質の２３３２個のアミノ酸の完全長配列まで）の領域にわたって、本明細書で述べる参照核酸もしくはアミノ酸配列によってコードされるポリペプチドと、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％もしくは約９９％超もしくはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する；ならびに／または（２）本明細書で述べる参照アミノ酸配列、その免疫原性フラグメントおよび／もしくはその保存的に改変されたバリアントを含む免疫原に対して生成された抗体、例えばポリクローナルもしくはモノクローナル抗体に特異的に結合する、上記のタンパク質およびポリペプチド、上記の核酸によってコードされるタンパク質、種間ホモログならびに他のポリペプチドが含まれる。

本明細書中で使用される場合、「内因性ＦＶＩＩＩ」は、処置を受けることが意図されている哺乳動物に由来するＦＶＩＩＩを含む。この用語はまた、導入遺伝子または前記哺乳動物中に存在する他の任意の外来ＤＮＡから転写されたＦＶＩＩＩも含む。本明細書中で使用される場合、「外因性ＦＶＩＩＩ」は、前記哺乳動物に由来しないＦＶＩＩＩを含む。

ＦＶＩＩＩ分子は、単一の遺伝子産物から生じるポリペプチドの不均一な分布として天然におよび治療用製剤中に存在する（例えばＡｎｄｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３，２９７９ ２９８３，Ｍａｙ １９８６参照）。本明細書で使用される「第ＶＩＩＩ因子」という用語は、血漿に由来するかまたは組換えＤＮＡ技術の使用を介して作製されるかに関わらず、そのようなすべてのポリペプチドを指し、ＦＶＩＩＩミメティック、ｆｃ−ＦＶＩＩＩコンジュゲート、水溶性ポリマーで化学的に修飾されたＦＶＩＩＩおよびＦＶＩＩＩの他の形態または誘導体を含むが、これらに限定されない。ＦＶＩＩＩを含有する治療用製剤の市販の例には、ＨＥＭＯＦＩＬ ＭおよびＲＥＣＯＭＢ ＩＮＡＴＥ（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，Ｉｌｌ，Ｕ．Ｓ．Ａ．から入手可能）の商品名で販売されているものが含まれる。他の製剤は、主として、分子のＢドメイン部分を欠くＦＶＩＩＩ分子の単一亜集団を含有する。

本開示の出発物質はＦＶＩＩＩであり、これは、ヒト血漿に由来し得るか、または米国特許第４，７５７，００６号；米国特許第５，７３３，８７３号；米国特許第５，１９８，３４９号；米国特許第５，２５０，４２１号；米国特許第５，９１９，７６６号；欧州特許第３０６９６８号に記載されているように、組換え操作技術によって生成され得る。

本開示に有用なＦＶＩＩＩ分子は、完全長タンパク質、タンパク質の前駆体、タンパク質の生物学的に活性なまたは機能的なサブユニットまたはフラグメント、およびそれらの機能的誘導体、ならびに以下で述べるそれらのバリアントを含む。ＦＶＩＩＩへの言及は、そのようなタンパク質のすべての可能性のある形態を包含することを意味し、ＦＶＩＩＩの形態の各々は、無傷の天然Ｂドメイン配列の少なくとも一部または全部を有する。

本開示のｒＦＶＩＩＩをコードするポリヌクレオチドには、限定されることなく、（１）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本明細書で述べる参照アミノ酸配列をコードする核酸およびその保存的に改変されたバリアントに特異的にハイブリダイズするもの；（２）少なくとも約２５個、約５０個、約１００個、約１５０個、約２００個、約２５０個、約５００個、約１０００個またはそれ以上のヌクレオチド（成熟タンパク質の６９９６個のヌクレオチドの完全長配列まで）の領域にわたって、本明細書で述べる参照核酸配列と約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％超またはそれ以上高いヌクレオチド配列同一性を有する核酸配列を有するものが含まれる。

バリアント（または類似体）ポリペプチドには、１つ以上のアミノ酸残基が本開示のＦＶＩＩＩアミノ酸配列に付加されている挿入バリアントが含まれる。挿入は、タンパク質の一方または両方の末端に位置してもよく、および／またはＦＶＩＩＩアミノ酸配列の内部領域内に位置してもよい。いずれかまたは両方の末端に付加的な残基を有する挿入バリアントには、例えば融合タンパク質およびアミノ酸タグまたは他のアミノ酸標識を含むタンパク質が含まれる。一態様では、ＦＶＩＩＩ分子は、特に分子が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌細胞で組換え発現される場合、Ｎ末端Ｍｅｔを含んでいてもよい。

欠失バリアントでは、本明細書で述べるＦＶＩＩＩポリペプチド中の１つ以上のアミノ酸残基が除去されている。欠失は、ＦＶＩＩＩポリペプチドの一方または両方の末端で、および／またはＦＶＩＩＩアミノ酸配列内の１つ以上の残基の除去によって生じさせ得る。それゆえ、欠失バリアントは、ＦＶＩＩＩポリペプチド配列のすべてのフラグメントを包含する。

置換バリアントでは、ＦＶＩＩＩポリペプチドの１つ以上のアミノ酸残基が除去され、代替残基で置換されている。一態様では、置換は本質的に保存的であり、この種の保存的置換は当技術分野で周知である。あるいは、本開示は、非保存的である置換も包含する。例示的な保存的置換は、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７５），ｐｐ．７１−７７］に記載されており、以下で示す。

本発明の実施形態および付加的な態様について以下で説明する。文脈上明確に異なる指示がない限り、これらは自由に組み合わせることができる。

本発明のために、ＦＶＩＩＩポリペプチドの任意の欠失、置換および／または他の変化は、プロセス自体のさらなる変化を必要とせずに処理され得る。しかし、これは、変化が実際のＦＶＩＩＩポリペプチドの構成成分の全体量と比較して実際のＦＶＩＩＩポリペプチドのわずかな画分だけを構成する、ＦＶＩＩＩ製剤に特異的であるので、ポリペプチドが処理されるプロセスに関連する。

このことから、最終的に凍結乾燥された製剤中のＦＶＩＩＩポリペプチド活性のわずかな低下が、最終産物における活性の極めて大きな割合の影響をもたらすので、製剤の一部としての凍結乾燥されたＦＶＩＩＩポリペプチドに対するいかなる潜在的な損傷も回避するプロセスでなければならないことは明らかである。

本発明による方法の一実施形態では、本方法は、工程ｂ）の後に工程ｃ）、ｄ）およびｅ）：
ｃ）凍結乾燥ペレットを保存し、均質化する工程；
ｄ）凍結乾燥ペレットを保存して均質化している間に凍結乾燥ペレットをアッセイする工程；
ｅ）凍結乾燥ペレットを容器に充填する工程
をさらに含む。

保存および均質化工程ｃ）は、凍結乾燥のために使用される真空チャンバ内の回転容器内で実施することもできる。アッセイを行うために、統計的に適切な数の試料を抽出する。その後、別の保存容器を無菌封じ込めに送り込んでもよい。各保存容器の内容物をアッセイした後は、必要なすべての特性、例えば活性成分含有量は既知である。次いで、最終的な容器へのユーザー規定量のペレットの充填プロセスが開始され得る。保存容器は、隔離された充填ラインに移送され、無菌ドッキングステーションにドッキングされる。容器の内容物は、アイソレータ内部で充填機の保管場所に移送される。

本発明による方法の別の実施形態では、工程ａ）において、液滴は、周波数補助ノズルを通すことによる溶液の液滴形成によって形成される。好ましくは、発振周波数は、１０００Ｈｚ以上２０００Ｈｚ以下である。

ノズルが周波数補助型であることとは無関係に、ノズル直径は、１００μｍから５００μｍの範囲、好ましくは２００μｍから４００μｍの範囲、非常に好ましくは３５０μｍから４５０μｍの範囲であり得る。前記ノズル直径は、約２００μｍから約１０００μｍの範囲、好ましくは約４００μｍから約９００μｍの範囲、非常に好ましくは約７００μｍから９００μｍの範囲の液滴サイズをもたらす。

これに関連して「約」のサイズは、得られた液滴のサイズが、分布のｄ_９０値に関して言及されるサイズから±３０％以内しか逸脱しないことを意味する。例えば、約４００μｍという得られた液滴サイズは、分布のｄ_９０値に関して２８０μｍから５２０μｍの間でサイズが変動して生成される液滴と理解される。

形成された液滴は、中央値付近の特定の液滴サイズ分布を示し、これは上記で言及したものとほぼ同じであるはずである。

ノズルが周波数補助型である本発明の実施形態では、中央値付近の変動はより小さい。これらの実施形態では、「約」の意味は、言及したサイズから±３０％以内しか逸脱しない液滴に限定され得る。

上記で言及した例では、約４００μｍの得られた液滴サイズは、分布のｄ_９０値に関して２８０μｍから５２０μｍの間でサイズが変動して生成される液滴と理解することができる。以下で述べる作用を考慮して、液滴を周波数補助ノズルに通すことは、最終的な凍結乾燥ペレットへの潜在的な負の影響をさらに低下させるというさらなる利点がある。

一般に、上記で示したサイズの液滴は、その後の工程ｂ）からｅ）がＦＶＩＩＩ活性のより高い収率で実施され得ることが認められたので、有利である。

これに拘束されることなく、より小さな液滴は、はるかにより大きな表面対体積比のために凍結乾燥工程ｂ）においてあまりにも急速に凍結し、それによって脆弱なＦＶＩＩＩポリペプチドが部分的に破壊されると仮定される。さらに、より小さな液滴は、静電的に帯電する傾向が増大したより小さなペレットをもたらし、一方後者は、このようなペレットのその後の取扱いを損なう。より大きな液滴は均一に凍結せず、凍結乾燥ペレットの外殻におけるＦＶＩＩＩポリペプチドの部分的破壊および液滴の内側部分の不完全な凍結乾燥をもたらし、保存の間にＦＶＩＩＩポリペプチドの部分的破壊を生じさせる。

本発明による方法の別の実施形態では、工程ａ）において、冷却塔の内面は、−１２０℃以下、好ましくは−１５０℃以上−１２０℃以下の温度を有する。好ましくは、温度は−１４０℃以上−１３０℃以下である。

上記で言及した−１４０℃以上−１３０℃以下の温度は、３ｍから４ｍの距離を落ちる間に凍結する、約７００μｍ以上から約９００μｍ以下の範囲の液滴サイズに関して最適化されている。

冷却塔の内面で温度が−１２０℃以下に維持される限り、落下距離および液滴サイズの調整によって本発明の有益な結果を得ることができる。

本発明による方法の別の実施形態では、冷却塔の内面は、内面と熱接触する１つ以上のパイプに冷却剤を通すことによって冷却される。冷却剤は、液体窒素または所望の温度の窒素蒸気であってもよい。

本発明による方法の別の実施形態では、第ＶＩＩＩ因子についての標的用量を確立し、工程ｄ）のアッセイによって凍結乾燥ペレット中の第ＶＩＩＩ因子の活性成分含有量を決定して、標的用量に等しいまたは標的用量を２５％以下だけ上回る用量を提供する量の凍結乾燥ペレットを容器に充填する。好ましくは、標的用量を１０％以下、より好ましくは５％以下だけ上回る。

これは、プロセスがＦＶＩＩＩポリペプチドの活性を低下させないため、充填時に標的用量を著しく上回らないようにするＦＶＩＩＩポリペプチドの穏やかな凍結を可能にする、本発明の直接の結果である。

本発明による方法の別の実施形態では、工程ａ）で得られるペレットは、約２００μｍ以上から約１５００μｍ以下の粒度分布ｄ５０の最大値を有する。約７００μｍ以上から約９００μｍ以下の粒度分布ｄ５０の最大値が好ましい。

２００μｍより小さいサイズのペレットは、これらのペレットでは凍結がより速くなり、凍結乾燥ポリペプチドの損傷をもたらし、したがってより高い標的用量を必要とする効力の損失を生じさせ得るので、あまり好ましくない。さらに、得られる粉末の静電的影響は２００μｍ未満のサイズで著しく増大し、本発明のプロセスの生成物の取扱い特性の低下をもたらし、水蒸気中にペレットが捕獲されることによる収率損失が予想され得る。

１５００μｍを超えるまでのペレットサイズの増大は、上述した設定でのペレットの完全な凍結を危うくし、したがってその後の生成物の全体的な有効性を損ない得る。

本発明による方法の別の実施形態では、工程ａ）における第ＶＩＩＩ因子を含有する溶液は、８重量％以上から１２重量％以下の溶解固形分含有量を有する。９重量％以上から１１重量％以下の溶解固形分含有量が好ましい。

原理的には、約１５から２０重量％のより高い溶解固形分の負荷は、通常、得られるペレットがより容易に凍結され、より堅固に乾燥されると予想されるため、本発明が関与する種類のプロセスでは好ましいと考えられる。

しかし、この場合、処理された固体（ＦＶＩＩＩを含有する）は後で再構成され、ヒトに注入される必要があり、固体は（より高い負荷で）、潜在的な組織損傷および／または注射痛をもたらす注入溶液の不適合なオスモル濃度を生じるか、さもなければ、実際上溶液をもはやほとんど注入不可能にするのを回避するために有意に高い再構成容量が必要となるので、上記の範囲がより良好であると認められる。

本発明による方法の別の実施形態では、工程ａ）における第ＶＩＩＩ因子を含有する溶液は、溶液１グラムに関して以下の組成を有し、残りは注射用水である：
第ＶＩＩＩ因子 ９９ＩＵ以上１０１ＩＵ以下
スクロース ６８ｍｇ以上７２ｍｇ以下、好ましくは７０ｍｇ以上７１．８ｍｇ以下
ヒスチジン ２ｍｇ以上４ｍｇ以下、好ましくは３ｍｇ以上３．８ｍｇ以下
グリシン ２３ｍｇ以上２６ｍｇ以下、好ましくは２３．５ｍｇ以上２５．７ｍｇ以下
ＮａＣｌ １ｍｇ以上３ｍｇ以下、好ましくは１．５ｍｇ以上２．５ｍｇ以下
ＣａＣｌ_２ ０．２ｍｇ以上０．４ｍｇ以下、好ましくは０．２５ｍｇ以上０．３５ｍｇ以下
ポリソルベート８０ ０．０７ｍｇ以上０．１ｍｇ以下、好ましくは０．０７５ｍｇ以上０．０９５ｍｇ以下。

本発明を、以下の図面および実施例を参照してさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

図１は、本発明による方法のための装置を図式的に示す。 図２は、冷却塔における経時的な温度プロフィールを示す。 図３は、凍結乾燥工程の間の温度および圧力プロフィールを示す。 図４は、凍結乾燥工程の間の別の温度および圧力プロフィールを示す。 図５は、室温（ＲＴ）または２〜８℃での種々の保存時間後の試料の効力発現を示す。 図６は、室温（ＲＴ）または２〜８℃での種々の保存時間後の試料の生成物凝集体／フラグメントの分布を示す。 図７は、本発明に従って製造されたペレットの走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真を２００倍の倍率で示す。 図８は、本発明に従って製造されたペレットの走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真を２０００倍の倍率で示す。 図９は、国際公開第２００６／００８００６Ａ１号に記載された方法に従って製造されたペレットの走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真を２００倍の倍率で示す。 図１０は、国際公開第２００６／００８００６Ａ１号に記載された方法に従って製造されたペレットの走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真を２０００倍の倍率で示す。 図１１は、標準的な凍結乾燥によって製造された凍結乾燥物の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真を２００倍の倍率で示す。 図１２は、標準的な凍結乾燥によって製造された凍結乾燥物の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真を２０００倍の倍率で示す。

図１は、本発明による方法を実施するための装置を図式的に示す。この装置は、主な構成要素として、冷却塔１００と真空乾燥チャンバ２００を含む。冷却塔は、内壁１１０と外壁１２０とを備え、それによって内壁１１０と外壁１２０との間の空間１３０を規定する。

この空間１３０には、冷却手段１４０が配管の形態で収容されている。冷却剤は、図面の矢印で示されているように、冷却手段１４０に出入りすることができる。

冷却手段１４０を流れる冷却液は、内壁１１０の冷却、したがって冷却塔１００の内部の冷却をもたらす。凍結ペレット（クライオペレット）の製造では、液体がノズル１５０を介して冷却塔内に噴霧される。液滴は参照番号１６０で表示されている。

液滴は、それらの下方経路で最終的に凝固（凍結）し、参照番号１７０で表示されている。凍結ペレット１７０は傾斜台１８０を下降し、弁１９０は、ペレットが真空乾燥チャンバ２００に入ることを可能にする。

ここでは図示されていないが、言うまでもなく、傾斜台１８０は、ペレット１７０が閉鎖弁１９０の前に集合している間、ペレット１７０を凍結状態に保つように温度制御されることも可能であり、さらには好ましい。

真空乾燥チャンバ２００の内部には、乾燥される凍結ペレットを収容するために回転ドラム２１０が配置されている。回転は、ペレットへの効率的なエネルギー移動を達成するために水平軸の周りで生じる。熱は、ドラムを通してまたは封入された赤外線加熱器を介して導入され得る。最終的な結果として、参照番号２２０で表示される凍結乾燥ペレットが得られる。

［実施例］
概要−ｒＦＶＩＩＩ製剤の効力の測定
効力は、Ｃｏａｔｅｓｔ（商標）ＦＶＩＩＩキットを用いた発色アッセイを使用して測定した。発色アッセイ法は、色の強度が第ＶＩＩＩ因子活性に比例する２つの連続した工程から成る。第一工程では、第Ｘ因子を、最適量のカルシウムイオンおよびリン脂質の存在下で、３７℃で５分間インキュベートして、第ＩＸａ因子とその補因子である第ＶＩＩＩａ因子によって第Ｘａ因子に活性化する。第Ｘ因子の活性化速度が第ＶＩＩＩ因子の量のみに依存するように、過剰量の第Ｘ因子が存在する。第二工程では、第Ｘａ因子が発色基質を加水分解して発色団を生じ、色強度を４０５ｎｍで測光的に読み取る。アッセイの有効性を、確立された効力の基準に対する線形回帰統計法を用いて確認し、未知の試料の効力を計算する。効力は、国際単位／ｍＬ（ＩＵ／ｍＬ）で報告する。効力を以下で［％］の値として言及する場合、そのような値は、一貫して、ＵＩ／ｍｌ（正規化された値）での「標的効力」のパーセンテージと理解される。明らかにより大きな値の％効力が好ましい。

概要−生成物フラグメント／凝集体の分布を決定するためのサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）
ｒＦＶＩＩＩ製剤の主要成分を、７．８ｍｍ ＩＤ×３０ｃｍ、８ｍｍ粒径；４５０オングストローム細孔径の寸法を有するＴＳＫゲルＧ４０００ＳＷＸＬカラムで流体力学的体積または分子サイズに基づいて領域に分離する。

次いで、それらを２７６ｎｍでの励起後に３４０ｎｍでの蛍光発光に基づいて定量する。定量的結果をこれらの領域の相対ピーク面積％として表す。この手順は、クロマトグラムの特定領域についての結果を報告し、ｒＦＶＩＩＩ凝集体および鎖の完全性を測定するために使用される。

３つの領域（領域１、領域２および領域３）を決定するが、領域２には、凝集せず、断片化もしていないすべてのｒＦＶＩＩＩ分子が集約されているので、領域２（全試料の％として）が最大であることが望ましい。

概要−ＢＥＴによる比表面積
ＢＥＴによる比表面の測定を多点測定で実施し（７７ケルビンでの窒素吸着）、各試料について、２つの独立した量の材料をＢＥＴ容器に充填して、別々に分析した。容器をストッパーでしっかりと閉め、試料調製ステーションに移して、排気し、真空下（＜０．２バール）に３０℃で１６時間前処理して揮発性成分を除去した。その後、試料を窒素で通気し、秤量して、窒素を用いてＤＩＮ ＩＳＯ ９２７７に従って測定した。

概要−走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）測定
試料の調製を窒素雰囲気下にグローブバッグ中で実施し、各々の試料を個別に調製した。試料をホルダー上に置き、金でスパッタリングした。その後、走査電子顕微鏡測定を実施した。

［実施例１］
Ｋｏｇｅｎａｔｅ（登録商標）ＰＦの溶液のクライオペレットを製造した。Ｋｏｇｅｎａｔｅ（登録商標）ＰＦは、血漿タンパク質を含まない組換えヒト第ＶＩＩＩ因子である。溶液１ｇについての処方を以下に示す：

バルク溶液を、本発明による方法に従って壁が冷却された冷却塔内に噴霧した。噴霧ノズルは、直径４００μｍの１つの開口部を有していた。これは、８００μｍの標的液滴サイズに対応する。発振周波数は１３７５Ｈｚ、偏向圧力は０．２バールであり、ポンプは２２ｒｐｍで運転した。３５分の全持続時間後、凍結したペレット８７９．３ｇを回収した（収率９６％）。

冷却塔の内部温度を観測し、その経時的な進行を図２に示す。曲線１０００は冷却塔の上部からのセンサ読み取り値を表し、曲線１０１０は冷却塔の中央部分からのセンサ読み取り値を表し、曲線１０２０は冷却塔の下部からのセンサ読み取り値を表す。温度が−１２６．０℃（上部センサ）、−１２９．７℃（中央センサ）および−１３３．１℃（下部センサ）に達していた１４時４５分に、噴霧操作を開始した。これは、図２ではマーク１０３０で表されている。１５時２０分に、−１３０．７℃（上部センサ）、−１３３．５℃（中央センサ）および−１３５．２℃（下部センサ）の記録温度で噴霧操作を停止した（マーク１０４０）。凍結したペレットを、−５５℃から−５３℃の間の温度を有する冷却した容器に収集した。

［実施例２］
この実施例は、実施例１で得られたクライオペレットの試料の凍結乾燥に関する。ＭｅｒｉｄｉｏｎのＬｙｏＭｏｔｉｏｎ凍結乾燥機をこの工程で使用した。この機械は、クライオペレットが撹拌され、乾燥に供された回転ドラムを含む。

０．９５％の残留水分を有する合計２１．３ｇの凍結乾燥ペレット（収率７２．６％）を単離した。

凍結乾燥工程の温度および圧力プロフィールを図３に示す。曲線１０５０は生成物温度を表し、曲線１０６０は凍結乾燥機の凝縮器温度を表し、曲線１０７０は凍結乾燥機の真空チャンバ内の内圧を表す。

［実施例３］
この実施例は、実施例１で得られたクライオペレットの別の試料の凍結乾燥に関する。ＭｅｒｉｄｉｏｎのＬｙｏＭｏｔｉｏｎ凍結乾燥機をこの工程で使用した。この機械は、クライオペレットが撹拌され、乾燥に供された回転ドラムを含む。

０．７０％の残留水分を有する合計２１．４ｇの凍結乾燥ペレット（収率７３．７％）を単離した。

凍結乾燥工程の温度および圧力プロフィールを図４に示す。曲線１０８０は生成物温度を表し、曲線１０９０は凍結乾燥機の凝縮器温度を表し、曲線１１００は凍結乾燥機の真空チャンバ内の内圧を表す。

結果
得られた生成物の力価アッセイおよびサイズ排除クロマトグラフィ分析を、製造直後のプロセスから採取した試料について以下の表に示す。

各実施例からの２つの試料を、その中の第ＶＩＩＩ因子の効力に関して分析した。標的効力は２５０．０ｍｇ／バイアルであった。バルク溶液の処理および凍結乾燥の間の効力の損失が予想される。８６．２％から８９．９％の間という測定された実際の効力は、バイアル中での従来の凍結乾燥で観察されたものよりもかなり変動が少なかった。ここで、８０．９％から９１．２％の範囲の効力は、乾燥チャンバ内の個々のバイアルの位置に依存して観察され得る。

参考として、以下の表は、実施例２および３の前駆体に関する分析データ（ＩＰＣ値）を示す。

さらに、試料の上記特性を、室温（ＲＴ）および２〜８℃で６か月までの保存について評価した。

図５および６（より低い活性の異なる出発物質から試料を調製した）から、試料の効力またはフラグメント／凝集体組成の有意の変化は生じていないことがわかり、これは、製造されたペレットの特性に関して本発明によるプロセスの堅固さを強調する。

［実施例４］
先行技術との直接比較
実施例１で提供したのと同じ製剤組成を有する第ＶＩＩＩ因子薬剤物質の同一バッチの溶液を調製し、種々の乾燥方法によって処理した。溶液３０００ｍｌを実施例１に従って冷却塔で凍結させ、凍結したペレットを、３１９ｇおよび２６１４ｇのバッチサイズを有する２つの異なる回転凍結乾燥機（ＬｙｏＭｏｔｉｏｎ）で凍結乾燥させた。

溶液の別個の部分を、国際公開第２００６／００８００６Ａ１号に記載されている方法に従って処理した。全部で１２００ｍｌの溶液を、４００μｍのノズルを通して２００ｍｌずつ噴霧し、約１６．５ｇ／分の速度で、９００Ｈｚの周波数で噴霧した。ノズルの約２５ｃｍ下に配置された、液体窒素を満たした隔離された容器中で液滴を凍結し、プロセス全体を通して撹拌した。各部分の噴霧完了後、予冷した篩を通して液体窒素を注ぐことによって凍結ペレットを取り出し、低温で保存した。すべての部分が収集されれば、Ｖｉｒｔｉｓ Ａｄｖａｎｔａｇｅ Ｐｒｏ凍結乾燥機の予冷した棚上のプラスチックホイルで裏打ちした２つのラックに入れ、凍結乾燥した。一次乾燥を−１０℃の棚温度で６０時間にわたって実施し、続いて二次乾燥を２５℃で８時間実施した。乾燥の完了後、乾燥したペレットを直ちにガラス瓶に移し、しっかりと閉じた。その後、ペレット２５０ｍｇを窒素雰囲気下で１０ＲタイプＩガラスバイアルに量り分けた。

溶液の第三の別個の部分を１０ＲタイプＩガラスバイアルに充填し、従来のバイアル凍結乾燥機で凍結乾燥した。全部で４８８のバイアルに、バイアル当たり２．５ｍｌの溶液（全部で１２４１ｇの溶液）を満たし、半分栓をして、ＨＯＦ凍結乾燥機に充填した。溶液を−４５℃に凍結させ、一次乾燥を−２０℃で実施し、続いて２５℃で二次乾燥工程を実施した。完全な凍結乾燥プロセスにはおよそ６５時間必要であった。凍結乾燥機内でバイアルに栓をし、取り出し直後に密封した。

実施例１による第一の処理からの試料、国際公開第２００６／００８００６Ａ１号に記載されたように処理した試料および従来のバイアル凍結乾燥プロセスからの試料という３種の試料すべてを、その後、ＢＥＴによる比表面積および走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）測定に供した。

本発明に従って製造されたペレットは、投与用液体中の凍結乾燥固体の再構成を改善する、より高い比表面積、およびこれらのペレットの後の処理工程における取扱い特性を改善する、より均一な形態を示すことがわかる。

ＢＥＴによるそれぞれの比表面積は以下のように要約される：

本発明によって製造されたペレットの比表面積は、同様の先行技術のプロセス（国際公開第２００６／００８００６Ａ１号など）に従って製造されたペレットの比表面積よりも、および特に標準的な凍結乾燥と比較して、有意に大きいことが明らかである。

Claims (10)

1. 第ＶＩＩＩ因子を含有する凍結乾燥ペレットの製造方法であって、
   ａ）第ＶＩＩＩ因子を含有する溶液の液滴を凍結してペレットを形成する工程；
   ｂ）前記ペレットを凍結乾燥する工程；
   を含み、
   工程ａ）において、温度制御可能な内壁表面（１１０）および前記溶液の凍結温度より低い内部温度を有する冷却塔（１００）内への第ＶＩＩＩ因子を含有する前記溶液の液滴形成によって前記液滴を形成すること、ならびに
   工程ｂ）において、真空チャンバ（２００）内に収容されている回転容器（２１０）内で前記ペレットを凍結乾燥すること
   を特徴とする方法。
2. 工程ｂ）の後に、工程ｃ）、ｄ）およびｅ）：
   ｃ）前記凍結乾燥ペレットを保存し、均質化する工程
   ｄ）前記凍結乾燥ペレットを保存して均質化している間に前記凍結乾燥ペレットをアッセイする工程；
   ｅ）前記凍結乾燥ペレットを容器に充填する工程
   をさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 工程ａ）において、前記液滴を、前記溶液を周波数補助ノズルに通すことによる液滴形成によって生成する、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記発振周波数が１０００Ｈｚ以上２０００Ｈｚ以下である、請求項３に記載の方法。
5. 工程ａ）において、前記冷却塔（１００）の内面（１１０）が−１２０℃以下の温度を有する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記冷却塔（１００）の内面（１１０）が、前記内面（１１０）と熱接触する１つ以上のパイプ（１４０）に冷却剤を通すことによって冷却される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
7. 第ＶＩＩＩ因子についての標的用量を確立し、工程ｄ）のアッセイによって前記凍結乾燥ペレット中の第ＶＩＩＩ因子の活性成分含有量を決定して、前記標的用量に等しいまたは前記標的用量を２５％以下だけ上回る用量を提供する量の凍結乾燥ペレットを前記容器に充填する、請求項２から６のいずれか一項に記載の方法。
8. 工程ａ）で得られた前記ペレットが、２００μｍ以上１５００μｍ以下の粒度分布ｄ５０の最大値を有する、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
9. 工程（ａ）における第ＶＩＩＩ因子を含有する前記溶液が、８重量％以上から１２重量％以下の溶解固形分含有量を有する、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
10. 工程ａ）における第ＶＩＩＩ因子を含有する前記溶液が、前記溶液１グラムに関して以下の組成：
    第ＶＩＩＩ因子 ９９ＩＵ以上１０１ＩＵ以下
    スクロース ６８ｍｇ以上７２ｍｇ以下
    ヒスチジン ２ｍｇ以上４ｍｇ以下
    グリシン ２３ｍｇ以上２６ｍｇ以下
    ＮａＣｌ １ｍｇ以上３ｍｇ以下
    ＣａＣｌ_２ ０．２ｍｇ以上０．４ｍｇ以下
    ポリソルベート８０ ０．０７ｍｇ以上０．１ｍｇ以下
    を有し、残りが注射用水である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法

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